Tecnologia do DNA Recombinante

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BIOTECNOLOGIA
Profa. Ms. Geísa Paes
TECNOLOGIA DO DNA RECOMBINANTE
Profa. Ms. Geísa Paes
1. Clonagem
2. Enzimas de restrição
3. Vetores de clonagem
4. Transformação celular 
TECNOLOGIA DO DNA RECOMBINANTE
TECNOLOGIA DO DNA RECOMBINANTE
Tecnologia do DNA recombinante
Conjunto de técnicas que permitem a manipulação de 
moléculas de DNA específicas (ou parte dela – gene), 
considerando as propriedades do DNA. 
TECNOLOGIA DO DNA RECOMBINANTE
 O que é um DNA recombinante?
 DNA recombinante é uma molécula de DNA que recebeu um 
fragmento (ou gene) de outro organismo. 
 A técnica central da tecnologia do DNA recombinante é a clonagem 
molecular que permite pegar um “pedaço” do DNA e combiná-lo com 
outro, produzindo muitas cópias de diferentes combinações 
genéticas.
CLONAGEM
 A clonagem molecular é um método que permite fazer várias
cópias idênticas (clones) de um “pedaço” específico de DNA.
 O DNA de interesse chamado de inserto é ligado a uma outra
molécula de DNA chamada de vetor para formar o que chamamos
de DNA recombinante.
CLONAGEM
Plasmídeo: são moléculas de
DNA circular presentes em
bactérias, que se replicam
separadamente do cromossomo
bacteriano e são utilizados como
vetores de clonagem.
CLONAGEM
Primeiro temos que cortar e abrir o plasmídeo que será 
utilizado como o nosso vetor para "inserir" o gene de 
interesse. Esse processo baseia-se em enzimas de restrição
que cortam o DNA e na DNA ligase que “une” o DNA. 
Posteriormente devemos inserir o plasmídeo na bactéria e 
utilizar a seleção por antibiótico para identificar as 
bactérias que “pegaram” o plasmídeo. Finalmente cultivar 
lotes de bactérias portadoras de plasmídeo e usá-las como 
"fábricas" para fazer a proteína e colher a proteína das 
bactérias e purificá-la.
ENZIMAS DE RESTRIÇÃO
 O que é uma enzima de restrição?
Uma enzima de restrição ou 
endonuclease de restrição é 
um tipo de nuclease que cliva 
fita dupla de DNA sempre que 
identificar uma sequência
particular de nucleotídeos que 
seja o sítio de restrição da 
enzima.
ENZIMAS DE RESTRIÇÃO
 Função natural: proteger o DNA bacteriano do DNA
exógeno.
ENZIMAS DE RESTRIÇÃO
 Reconhecem sequencias polindrômicas de DNA: Tem um
eixo de simetria e a sequência de bases de uma fita é a
mesma da fita complementar, quando lida na direção
oposta.
 Tipos de 
corte:
VETORES DE CLONAGEM
 Após o isolamento de uma informação genética, por exemplo, 
um fragmento de DNA obtido pela clivagem com enzimas de 
restrição, este fragmento deverá ser inserido numa outra 
molécula de DNA diferente, capaz de amplificar aquela 
informação genética em centenas de cópias. Este processo de 
amplificação é obtido através do uso de moléculas de DNA que 
são os chamados vetores de clonagem molecular. 
VETORES DE CLONAGEM
 Características essenciais:
 Origem de replicação
 Sítio múltiplo de clonagem
Marca seletiva
VETORES DE CLONAGEM
VETORES DE CLONAGEM
Plasmídeos: DNA circular; fita dupla; ocorrem naturalmente
em bactérias e leveduras; clonagem de fragmentos de até 9Kb.
Bacteriofágos: vírus que infectam bactérias; clonagem de 
fragmentos de 9 Kb a 15 Kb
Cosmídeos: híbridos entre plasmídeos e bacteriofágos; 
clonagem de fragmentos de até 35 Kb.
TRANSFORMAÇÃO CELULAR
 O processo de transformação consiste na introdução
do DNA recombinante em células hospedeiras, como
por exemplo, bactérias, podendo então ser replicado.
As células hospedeiras copiam o DNA do vetor
juntamente com o próprio DNA, criando múltiplas cópias
do DNA inserido.
TRANSFORMAÇÃO CELULAR
 Choque térmico: preparação 
das células para torná-las 
competentes, por tratamento 
com cloreto de cálcio que 
atuam neutralizando as cargas 
negativas da membrana e do 
DNA criando poros na 
membrana para que o DNA 
alcance o interior da célula.
TRANSFORMAÇÃO CELULAR
 Eletroporação: As células são 
submetidas à alta voltagem (choque 
elétrico) que provoca uma 
desestabilização da membrana externa e 
a formação de poros, possibilitando a 
entrada do DNA para o interior da 
célula. 
Profa. Ms. Geisa Paes _ geisapaes@gmail.com
UM FORTE ABRAÇO E ATÉ A PRÓXIMA AULA!!!