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Tópico 05 Biologia Molecular e Biotecnologia Biologia Molecular na Genética Forense 1. Introdução As impressões digitais eram as técnicas de identificação fundamentais para se desvendar crimes. Com a publicação de um artigo em uma revista científica mundialmente respeitada, a Nature, a genética forense começou a se desenvolver. Nesse artigo, os autores afirmavam que existiam regiões do DNA que permitiam a identificação de uma pessoa com 100% de certeza. Hoje são essas moléculas biológicas que são analisadas no local do crime e que permitem chegar a um suspeito – além disso, a molécula de DNA é estável por anos. A análise pode utilizar qualquer tipo de tecido ou fluído biológico, pois esse material contém o DNA. Essas técnicas têm ajudado a justiça a identificar os criminosos. Vamos entender como elas funcionam nesse tópico. 2. Perfil Genético A molécula de DNA é bastante conservada entre os indivíduos, o que significa que o DNA da espécie humana é 99,9% idêntico para todos os seres humanos. Apenas 0,1% nos difere uns dos outros. O 0.1 % corresponde a mais ou menos 3 milhões de pares de bases, denominadas polimorfismos. Polimorfismo na verdade são as variações no código genético encontradas intraespécies, ou seja, dentro de uma mesma espécie (LODISH et al., 2014, ZAHA et al., 2014). No polimorfismo, as bases que variam devem ser suficientemente comuns para gerar uma probabilidade razoavelmente alta, em que os genomas de dois indivíduos escolhidos ao acaso possam diferir em um sítio determinado; uma probabilidade de 1%, que é normalmente usada como ponto de corte. Por exemplo, dois genomas humanos, escolhidos aleatoriamente da população mundial, apresentarão diferenças em aproximadamente 2,5 × 10 desses sítios (1 a cada 1.300 pares de nucleotídeos) (JOHNSON et al., 2017). O polimorfismo pode ser de um único nucleotídeo (SNPs, single-nucleotide polymorphisms) e acontece devido a mutações em um ponto na sequência genômica. Isso significa que, nesse ponto, uma grande proporção da população humana possui um nucleotídeo, enquanto outra parte substancial da população possui outro. Os polimorfismos aparecem em locais específicos do DNA, os lócus. Dentro dos lócus existem os alelos, que são formados por mutações de um mesmo gene. Os alelos são sequências repetidas, elas ocorrem em uma fração de DNA. Essas repetições aparecem em todos os indivíduos e essas sequências repetidas estão arranjadas consecutivamente no genoma (em tandem, repetições adjacentes umas às outras) (LODISH et al., 2014, ZAHA et al., 2014). No entanto, as sequências repetidas diferem entre si, pelo número de repetições e no comprimento dos arranjos das sequências repetidas. As diferenças no comprimento dos arranjos são o resultado da recombinação de material genético durante a meiose. Essa recombinação leva a perfis desiguais, fazendo com que alguns arranjos consecutivos sejam únicos em cada indivíduo. Em humanos, as repetições ocorrem em regiões relativamente pequenas, de 1 a 5 kb, formadas por 20 a 50 unidades de repetição, cada uma contendo de 14 a 100 pares repetidos sequencialmente, em loci cromossômicos específicos, formando os minissatélites ou repetição em tandem de número variável (VNTR – “variable number of tandem repeats”). Veja na imagem abaixo de um gel de eletroforese de fragmentos de DNA que alelos de região de minissatélites possuem comprimentos variados mesmo em 6 indivíduos diferentes. Nesta imagem 6 temos nas laterais os marcadores, padrão de DNA e amostras de diferentes indivíduos. Variação no comprimento de alelos em região de minissatélite (VNTR) de 6 indivíduos. Outro tipo de polimorfismo é o de sequências curtas repetidas em tandem (STR-short tandem repeats) ou microssatélites. Eles são formados por regiões de 1 a 13 pares de bases. Apresentam repetições com unidade básica de 2-6 pares de base, com variações. Essas sequências repetidas seriam, por exemplo, CAC. Os polimorfismos utilizados para diferenciar indivíduos em genética forense são as regiões compostas pelos minis (VNTRs) e microssatélites (STR). VNTRs e STR estão em lócus específico nos cromossomos e possuem alelos característicos. Na rotina laboratorial, os microssatélites são utilizados mais frequentemente, porque eles possuem unidades de repetição de menor tamanho, o que auxilia a amplificação de amostras degradadas. Para diferenciar indivíduos, é importante selecionar regiões (lócus) do cromossomo onde elas são hipervariáveis, ou altamente polimórficas. Assim, vai existir uma pequena probabilidade de que duas amostras com perfis iguais possam ter origem em indivíduos diferentes. Como existe uma variedade de diferentes lócus no genoma, quanto mais lócus testados, maior a chance de diferenciar os indivíduos com maior certeza. Os marcadores possuem a qualidade de identificar o indivíduo por um padrão de fragmentos que lhe será particular. Cada variação de repetição é chamada de alelo. Herdamos alelos do pai e alelos da mãe. Um microssatélite muito comum é do alelo 9.3 dos lócus TH01, gene tirosina hidroxilase humana. A STR é composta por nove unidades de repetição completas e uma unidade incompleta, constituída por três nucleotídeos (TC/AT) com variações no número de alelos. Veja na tabela abaixo comprimentos de alguns alelos localizados no cromossomo, lócus TH01. Lócus Número de Alelos Tamanho em pares de base THO1 11 203 THO1 10 199 THO1 8 191 THO1 7 187 THO1 5 179 O gene da tirosina hidroxilase humana está localizado no cromossomo humano número 11, NC_000011.10. No banco de dados para informação biotecnológica, a identificação desse marcador é D00269. Os alelos do cromossomo 11, TH01 variam de 3 a 14 na população e a unidade de repetição é TC/AT (pubmed, 2020). Vamos entender um pouco mais como marcadores genéticos SRT, como os do cromossomo 11, podem ajudar a diferenciar indivíduos. 3. 3 identificação humana por microsatélites (str) Após o sequenciamento do genoma humano ficou evidente que apenas 0,1% das sequências do DNA pode nos diferir uns dos outros (LODISH et al., 2014, ZAHA et al., 2014). Dentre esse 0,1% de sequências variáveis, polimorfismo, marcadores do tipo STR (STR-short tandem repeats), sequências curtas repetidas em tandem foram escolhidos como critério para diferenciar um ser humano do outro, como já comentamos aqui. Isso porque eles preenchem requisitos para isso. Entre esses importantes requisitos está o fato de que as sequências STRs não foram associadas a doenças, essas sequências possuem alto nível de formação de alelos aleatórios, permitem grande poder de discriminação entre indivíduos, alta frequência de resultados bem-sucedidos e alta reprodutibilidade. Baseados nesses critérios, o FBI (Federal Bureau of Investigation) elegeu marcadores moleculares do tipo STR a serem utilizados como marcadores para diferenciar os indivíduos. Esses marcadores foram listados em uma base de dados americana, constituindo o CODIS – Combined DNA Index System copilados pelo índice Forense (Brasil). Veja na figura abaixo como esses codis estão relacionados a seus loci no cromossomo. Índice forense (CODIS). O objetivo do CODIS (índice forense) é a identificação de vítimas e suspeitos quando evidências biológicas (sangue, suor, saliva, sêmem, etc.) são recuperadas da cena do crime. As correspondências feitas entre perfis no índice forense podem vincular cenas de crimes, possivelmente identificando infratores em série. As correspondências feitas entre os índices forenses fornecem aos investigadores a identidade dos suspeitos. Analistas de DNA qualificados, que trabalham em laboratórios credenciados pela justiça, extraem DNA das amostras recolhidas nas cenas do crime. O PCR (reação em cadeia da polimerase) é a técnica utilizada para amplificação dos STRs. Os resultados são comparados com os bancos de dados que compartilham perfis de condenados (banco de dados da justiça). Veja na tabela abaixoas atuais STR utilizadas para identificação e separação entre os indivíduos: Marcador (STR) Repetições D2S1338 [TGCC][TTCC] D3S1358 [TCTG][TCTA] D5S817 AGAT No Brasil, existe uma rede de laboratórios de referência que fazem a comparação dos resultados de PCR com o banco de dados de suspeitos. Você pode ler um pouco mais sobre o assunto na página oficial do governo brasileiro no site que separamos abaixo: Clique aqui https://www.justica.gov.br/news/collective-nitf-content-1560344233.12 Marcador (STR) Repetições D7S820 GATA D8S1179 [TCTA][TCTG] D13S317 TA/TC D16S539 GATA D18S51 AGAA D19S433 AAGG D21S11 [TCTA][TCTG] CSF1P0 TAGA FGA CTTT TH01 TCAT TPOX GAAT VWA [TCTG][TCTA] D1S1656* CCTA[TCTA] D2S441* A[TCTA] D2S1338* GGAA D10S1248* [GGAA]GTAA D12S391* AGAT D19S433* CCTT D22S1045* [ATT]ACT Amilogenina 106pb/112pb Os marcadores STRs são marcadores autossômicos, ou seja, que não são responsáveis pela determinação do sexo. O marcador sexual utilizado é o do gene da amilogenina, que está expresso na polpa dentária. Esse gene permite discriminação de gênero, sendo AMEL X para indivíduo feminino (106 pb), e AMEL Y para indivíduo masculino (112 pb). Assista ao vídeo abaixo para entender como a genética forense ajuda a desvendar crimes: Os mesmos marcadores utilizados na genética forense podem ter outras aplicações, como determinação de paternidade, diferenciar gêmeos (zigozidade), rastreabilidade de descendência. Vamos aprender um pouco sobre como esses testes funcionam! 4. Teste de paternidade As sequências das repetições curtas de microssatélites (STR short tandem repeted) são usadas para determinação da paternidade. Os indivíduos herdam um número diferente de repetições, pela recombinação dos cromossomos, a partir de sua mãe e de seu pai. Sendo assim, essa herança pode ser um marcador genético para exclusão de paternidade ou probabilidade de paternidade, porque dois indivíduos sem parentesco raramente terão o mesmo par de sequências (STR) em um determinado lócus (LODISH et al., 2014, ZAHA et al., 2014). Para fazer o teste de paternidade, amostras de sangue ou saliva da mãe, da criança e dos possíveis pais são retiradas. A PCR utiliza iniciadores que são generalizados, ou seja, reconhecem sequências únicas em cada lado de um determinado lócus STR usado para identificação humana. Então, na PCR haverá amplificação dos alelos, sendo característicos para cada Genética Forense - Perícia Criminal - ASBAC Genética Forense - Perícia Criminal - ASBAC …… https://www.youtube.com/watch?v=8CHuDpdBDuM indivíduo. Veja no esquema abaixo como um suposto teste de paternidade pode parecer. Esquema de comparação de alelos em teste de paternidade Vamos analisar o esquema acima. A primeira coluna corresponde aos alelos amplificados da mãe. Irá funcionar como padrão positivo. A mãe é adotada como certeza, pois ela gera o filho. A segunda coluna representa os alelos da criança. As colunas 1, 2 e 3 possuem perfis de supostos pais. Após comparação dos fragmentos na eletroforese, e sabendo que os alelos são doados pelo pai e pela mãe, podemos concluir que o possível pai, nesse caso, é o do perfil 1, pois possui 4 bandas (alelos) semelhantes ao filho. Esse mesmo princípio funciona para determinar relações entre parentes. Parentes apresentam perfis de alelos semelhantes. A probabilidade estatística é uma ferramenta que ajuda na definição dessas relações (LODISH et al., 2014, ZAHA et al., 2014). Marcadores genéticos são muito importantes também para diferenciar indivíduos com genomas com maior identidade, como no caso dos gêmeos. Vamos entender como isso funciona! 5. Polimorfismos de nucleotídeo único (snp) Os marcadores de polimorfismo STR são suficientes para diferenciar todos os indivíduos (LODISH et al., 2014, ZAHA et al., 2014). No entanto, essa regra tem uma exceção, os gêmeos monozigóticos. Nesse caso, marcadores usados são os de polimorfismos de nucleotídeo único (SNP- Single Nucleotide Polymorphism), devido à baixa frequência de polimorfismo desses indivíduos. Veja na figura abaixo o que seria polimorfismo de nucleotídeo único. Observe que na sequência em destaque apenas um dos nucleotídeos é diferente. Polimorfismo de nucleotídeo único Os marcadores de repetição simples (STR) apenas confirmam a monozigozidade (MZ) desses indivíduos. Se aparecer um único nucleotídeo diferente entre as bases do genoma desses indivíduos, será suficiente para diferenciá-los. A identificação por SNP se faz quando os indivíduos possuem o mesmo gênero, monozigóticos (MZ), pois gêmeos de gênero diferentes são consequentemente dizigóticos (DZ) (LODISH et al., 2014). Para isso, se faz necessária a análise de todo o genoma dos gêmeos. A técnica mais empregada é o de microarranjos. O DNA genômico (DNA completo) será analisado para identificar uma única base nucleotídica diferente. Na rotina, essa técnica só é utilizada em casos específicos, por exemplo, gêmeos suspeitos de um crime, porque os SNPs possuem somente 2 alelos, em contraste com os vários alelos encontrados nos STRs. Seria necessário o estudo de pelo menos 50 SNPs para se ter o poder estatístico discriminatório conseguido pelas análises de STRs. A análise de SNP também pode ser complicada pela contaminação das amostras, e da possibilidade de muitos SNPs não serem informativos. Veja um pouquinho sobre o relato de um crime verídico envolvendo gêmeos idênticos (MZ) no site da revista BBC Brasil: Até agora vimos como os marcadores podem diferenciar indivíduos usando DNA nuclear, vamos entender quando usar DNA mitocondrial para análise forense de DNA! 6. Marcadores de dna mitocondrial Quando o material biológico recolhido na cena de um crime se encontra degradado, ou, principalmente, quando não apresenta Veja um pouquinho sobre o relato de um crime verídico envolvendo gêmeos idênticos (MZ) no site da revista BBC Brasil: Clique aqui https://www.bbc.com/portuguese/noticias/2014/01/140115_dna_gemeos_criminosos_teste_fn DNA nuclear suficiente, como nos fragmentos de cabelo sem bulbo, o DNA mitocondrial é usado para identificação humana. A mitocôndria possui DNA próprio, constituído de uma molécula circular (ZAHA et al., 2014). Esse DNA possui 37 genes. Destes, 13 codificam para proteínas, 2 codificam moléculas de rRNA e 22 genes para tipos de tRNA. No entanto, existe uma região não codificante, conhecida como região D-loop. Essa região contém aproximadamente 1.122 pares de bases, sendo dividida em regiões hipervariáveis I, II e III (HV I, II e III), constituindo essas regiões hipervariáveis os polimorfismos usados para identificação de indivíduos. Veja na imagem como os genes estão representados no cromossomo mitocondrial. DNA mitocondrial Nesse caso, também a identificação de marcadores polimorfismos de nucleotídeo único SNP (Single Nucleotide Polymorphism) é útil para separar os genótipos dos indivíduos. Geralmente, na genética forense, a análise de DNA mitocondrial se dá por extração do DNA, amplificação via PCR (reação em cadeia da polimerase) de fragmentos, seguida de sequenciamento dos fragmentos de DNA. A avaliação do DNA mitocondrial ainda permite rastrear a origem materna do indivíduo. Isso porque ele é transmitido às gerações seguintes pela chamada herança citoplasmática, exclusiva das mulheres, formando uma matrilinhagem (ZAHA et al., 2014). Sendo assim, é possível montar a árvore filogenética de populações ou de indivíduos usando o DNA mitocondrial. A interpretação dos seus perfis permite determinar a genealogia materna e, em maior abrangência, determinar a origem da população, pois esse DNA permite remontar a um ancestral único comum feminino, conhecido como “Eva mitocondrial”. Hoje é possível encontrar esse tipo de análise disponível para qualquer um, por um preço bem razoável. Vamos ver que marcadores sexuais também podem ser usados para identificação de pessoas. 7. Marcadores situados nos cromossomos sexuaisOs cromossomos sexuais são denominados X e Y. As mulheres possuem dois cromossomos X, (XX). O gênero masculino possui somente um, XY. O nível de atividade gênica produzida por um único cromossomo X é suficiente para a espécie humana. Homens têm essa dosagem normal, pois eles possuem apenas um cromossomo X. As mulheres têm a mesma dosagem por um motivo diferente, elas desligam um de seus dois cromossomos X em um processo chamado inativação do X. Nesse processo, um cromossomo X é compactado para formar uma estrutura pequena e densa chamada de corpúsculo de Barr, durante o período embrionário (JOHNSON et al., 2017). Essa característica de inativação é transferida a todas as células femininas. O cromossomo X possui regiões polimórficas que podem ser usadas como marcadores para identificação de indivíduos, para diferenciar, por exemplo, entre duas possíveis genitoras, nos casos mais complicados de identificação humana. Esses marcadores do cromossomo X também possuem a característica de serem sequências curtas repetidas em tandem (STRs). Os STRs de cromossomo X possuem maior poder de exclusão entre candidatos do que os STR autossômicos. Alguns marcadores STRs do cromossomo X são: DXS6809 e GATA172D05, DXS8378, DXS7133 e DXS7423. Já os indivíduos masculinos possuem dois alelos em cada marcador autossômico, mas somente um alelo em cada marcador sexual do seu cromossomo X, porque o pai transfere para sua filha 100% do seu perfil haplotípico do cromossomo X. Indivíduos do sexo masculino não herdam o cromossomo X do pai, e sim, da mãe, aumentando o poder de exclusão desses marcadores quando comparado aos autossômicos em indivíduos masculinos. Da mesma forma, o cromossomo Y possui regiões polimórficas que podem ser usadas como marcadores. As STRs do cromossomo Y (SRY) são herdadas exclusivamente do pai, servindo, por isso, como marcador para determinar a ancestralidade paterna. Além disso, o cromossomo Y é incapaz de se recombinar com o cromossomo X, e possui uma região que é chamada de região não recombinante do cromossomo Y (NRY). Adicionalmente, as STRs do cromossomo Y, o polimorfismo de nucleotídeo único da região não recombinante, Y (NRY), também ajudam a traçar as linhas ancestrais paternas (LODISH et al, 2001, JOHNSON et al., 2017). Os marcadores do cromossomo Y são usados para obtenção de perfil exclusivamente masculino, quando há vários doadores de esperma. Eles também ajudam a melhorar a separação dificultada de frações de amostras masculina e feminina em casos de crimes sexuais, em que há misturas de diversos tipos de fluidos corporais que não sejam sêmen. Separamos uma leitura sobre a utilização do cromossomo X na genética forense. Agora que já vimos os STRs autossômicos, os polimorfismos de DNA mitocondrial e os marcadores da região não codificadora do cromossomo Y, você poderá aprofundar esse conhecimento lendo o estudo que separamos. Nesse estudo, a ancestralidade brasileira foi estudada utilizando esses marcadores. A comprovação de ancestralidade é possível graças às técnicas de biologia molecular. Vamos estudar agora um pouco sobre algumas das técnicas empregadas na genética forense. 8. Polimorfismo de restrição (rflp) A primeira técnica de análise de DNA foi baseada no perfil de restrição de um fragmento de DNA. Esse DNA era tratado com enzimas de restrição. Com isso, se o DNA for digerido com uma Aplicabilidade do cromossomo X no DNA forense Clique aqui (LEITE; MACHADO; BARCELOS, 2017). Brasil e a idiossincrasia da miscigenação, leia o artigo para entender a ancestralidade brasileira: Clique aqui (TARAZONA-SANTOS et al., 2016). https://portalseer.ufba.br/index.php/cmbio/article/view/15078 https://www.arca.fiocruz.br/bitstream/icict/26745/2/Santos%20ET%20Brasil%20e%20a%20....pdf enzima de restrição, que corte dentro das sequências vizinhas dos loci da região hipervariável, teremos comprimentos de fragmentos de DNA diferentes. Esse comprimento depende do número de repetições nos loci, que varia entre 15 e 70. Mutações que alterem as sequências no DNA de um indivíduo acabam levando à perda de sítios de restrição (ZAHA et al., 2014, JOHNSON et al., 2017). Esse perfil de restrição dos fragmentos é chamado de impressão digital do DNA. Veja na imagem abaixo um perfil de restrição do DNA. Impressão digital do DNA Observe na figura que foram testados 6 loci. Como existe uma variedade de diferentes loci no genoma, o padrão de fragmentos produzidos por eles é essencialmente único para cada indivíduo. Quanto mais loci testados, maior a chance de se diferenciar os indivíduos com maior certeza (porque esses testes também contam com análises de estatística, avaliação de probabilidades). Existe na figura um padrão de peso molecular para distinguir o tamanho dos fragmentos. Além disso, os alelos de uma amostra conhecida servem como um padrão de referência para se comparar com uma amostra questionável, porque esses alelos tomados como padrão migram no gel com tamanho conhecido. Os primeiros mapas genéticos baseados em DNA foram de marcadores de RFLP no ano de 1989. Análises por RFLP de DNA mitocondrial e ribossômico têm sido utilizadas para avaliar a genética de populações, levantamentos biogeográficos e filogenéticos. Essa técnica permite resultados estáveis e reprodutíveis, cobertura ampla do genoma e a possibilidade de utilização de sondas (ZAHA et al., 2014). No entanto, ela tem sido substituída por técnicas mais modernas, uma vez que o desenvolvimento de sondas requer estudo prévio, acaba sendo caro e não permite automatização das etapas. Não existe uma biblioteca (banco) de sondas. Vamos entender um pouco sobre as modernas técnicas empregadas em genética forense. 9. Pcr multiplex para detecção de SRTs A PCR é o padrão ouro da genética forense. Para isso, os iniciadores (primers) são escolhidos baseados em sequências que estão ao lado das sequências STRs (sequências curtas repetidas em tandem). Além dos primers, sondas marcadas com fluoróforos são utilizadas. Quando as sondas hibridizam com a sequência amplificada de interesse, emitem um sinal que será captado por um detector acoplado ao PCR quantitativo em tempo real (qPCR) (ZAHA et al., 2014). A partir de DNA extraído da amostra previamente, é realizada a PCR seguindo os passos padrão que são desnaturação, anelamento do primer, alongamento do fragmento e repetição dos ciclos. Várias sequências STR poderão ser detectadas ao mesmo tempo. Empregando-se várias sondas ao mesmo tempo, esse PCR passa a se chamar de PCR multiplex. Veja na imagem abaixo como uma sonda permite a emissão de fluorescência. Sonda para PCR. Vamos entender como a emissão de fluorescência ocorre. As reações de qPCR envolvem sondas marcadas com corante fluorescente, que complementam e reconhecem a sequência de DNA de interesse, que fica entre os dois iniciadores. Um corante “repórter” (R) é fixado na extremidade 5“ da sonda fluorescente enquanto um corante ”extintor“ (Q) é fixado na extremidade 3”. Antes de as cadeias de DNA serem estendidas pela polimerase, o inibidor absorve completamente a fluorescência do repórter. À medida que a polimerase começa a estender a fita, a extremidade 5“ da sonda é degradada pela polimerase, devido à sua atividade de exonuclease. O corante repórter é liberado a partir da extremidade 5” e não é mais extinto, permitindo assim a detecção de fluorescência (ZAHA et al., 2014). Como as sequências STR foram determinadas em estudos prévios, já existem no mercado kits com as sondas que se hibridizam a sequências STRs. Esses kits possuem também os outros componentes para PCR como a enzima polimerase, para tornar a técnica mais rápida. Para cada STR, um fluoróforo é utilizado, permitindo a identificação específica destes. A hibridização é detectada em tempo real, qPCR, por possuir várias sondas de uma vez, esse PCR é conhecido como multiplex, pois gera vários sinais. Veja na imagem abaixo um perfil de PCRmultiplex. Identificação humana por PCR multiplex. O gráfico é construído para o DNA da amostra, comparando a presença de fluorescência (eixo y) com o número do ciclo (eixo x) do processo qPCR. Isso é então comparado a uma curva padrão do limiar de fluorescência do ciclo (eixo y) versus o log das concentrações conhecidas de DNA (eixo x). Ao comparar os dados da amostra com a curva padrão, pode-se extrapolar a concentração de DNA na amostra (ZAHA et al., 2014). Foram analisados para esse perfil da imagem DNA de três indivíduos. Os marcadores utilizados para esse PCR multiplex foram: D8S1179, D21S11, D7S820, CSF1PO (marcados com sonda azul, abaixo há o número de alelos). D3S1358, TH01, D13S317, D16S539, D2S1338 (marcados em verde, com número de alelos abaixo). D19S433, vWA, TPOX, D18S51, D6S818, FGA (marcados em cinza, com respectivos números de alelos). Ainda, marcadores para determinação de gênero, cromossomos X e Y (marcados em vermelho, com respectivos alelos). Cada pico corresponde ao alelo amplificado. Essa técnica é muito mais precisa que a impressão digital cromossômica. Existem no Brasil 18 laboratórios credenciados pela justiça para fazerem os testes de perfis genéticos nos estados de AM, AP, BA, CE, ES, GO, MA, MG, MS, MT, PA, PB, PE, PR, RJ, RS, SC e SP, e o laboratório distrital (Distrito Federal) e o laboratório da Polícia Federal fazem parte da rede de laboratórios autorizados (BRASIL, 2020). Esse perfil de suspeitos obtido no qPCR é comparado com perfis de condenados em banco de dados para obtenção do candidato mais provável. Vamos entender como os bancos de dados funcionam! 10. Banco nacional de perfis genéticos O banco de dados serve de apoio para a genética forense, porque nele estão contidos perfis de condenados. No Brasil, o Banco Nacional de Perfis Genéticos possui atualmente 17.361 perfis de condenados cadastrados. Em relação ao número de perfis cadastrados em 2020, houve um crescimento de 165% se comparado ao de 2018. Isso se deve ao avanço de aplicações de técnicas de biologia molecular automatizadas (BRASIL, 2020). Veja na figura abaixo a representação dos perfis genéticos brasileiros cadastrados por estado. Contribuição relativa (%) de cada laboratório para o Banco Nacional de Perfis Genéticos (BNPG), (2020). Os dados podem também fornecer a distribuição dos perfis genéticos brasileiros por categoria. Veja na imagem abaixo. Distribuição das categorias de perfis genéticos existentes no Banco Nacional de Perfis Genéticos (BNPG), (2020). As evidências biológicas (sangue, fluidos corporais como suor, sêmem, cabelo, ossos, dentes) devem ser coletadas de forma a garantir o adequado manuseio e acondicionamento. A quantidade de DNA na amostra pode ser pequena, mas com as técnicas adequadas elas serão amplificadas para sua identificação. No entanto, as evidências biológicas podem vir a ser degradadas por fungos e bactérias (BORZANI et al., 2001). Normalmente, a umidade é um fator que pode favorecer esse tipo de degradação. Portanto, seu manuseio deve ser o melhor possível para evitar o levantamento de dúvidas a sua correta identificação. Além disso, deve ser levado em consideração o fato de que amostras de DNA adicionais também podem estar presentes no local do crime, sendo estranhas ao criminoso ou à vítima, e devem ser evitadas cuidadosamente. Isso porque sendo as técnicas de biologia molecular muito sensíveis, elas também vão ampliar os fragmentos das amostras que não são dos criminosos, podendo ter implicações graves se forem interpretadas de maneira incorreta. 11. Conclusão Este tópico procurou mostrar que, como humanos, somos 99.9% idênticos quando comparamos nossas sequências de DNA, ou seja, o que nos faz diferentes é apenas 0.1%. As bases nitrogenadas do DNA que constituem as sequências diferentes formam os polimorfismos e estes são usados como marcadores para identificação de indivíduos na genética forense. Os marcadores podem estar localizados em regiões de repetição em tandem de número variável (VNTR), minissatélites, ou em sequências curtas repetidas, (SRTs), os microssatélites. Os STR são os marcadores mais comuns para identificação humana. Eles possuem grande poder de discriminação entre indivíduos, alta frequência de resultados bem-sucedidos e alta reprodutibilidade. Baseados nesses critérios, esses marcadores estão listados em uma base de dados o índice Forense (Brasil). Os mesmos marcadores utilizados na genética forense podem ter aplicações como determinação de paternidade, identificar marcadores para diferenciar gêmeos (zigozidade), determinação de gênero, rastreabilidade de descendência. Os indivíduos normalmente herdam um número diferente de repetições em cada lócus proveniente de sua mãe e de seu pai. Sendo que o DNA mitocondrial permite rastrear a origem materna do indivíduo. Já para diferenciar os gêmeos monozigóticos, os marcadores devem ser o polimorfismo de nucleotídeo único SNP (Single Nucleotide Polymorphism), pois esses indivíduos possuem baixa frequência de polimorfismo. Os cromossomo X e Y possuem regiões polimórficas STR que podem ser usadas como marcadores para identificação de indivíduos. O polimorfismo de nucleotídeo Y (NRY) é utilizado para traçar as linhas ancestrais paternas. Os marcadores combinados, STRs autossômicos, os polimorfismos de DNA mitocondrial e região não recombinante do cromossomo Y (NRY) permitem rastrear a origem populacional. Laboratorialmente, a primeira técnica de análise de DNA foi baseada no perfil de restrição de um fragmento de DNA. Hoje, o PCR é o padrão ouro da genética forense. Várias sequências STR poderão ser amplificadas ao mesmo tempo no qPCR multiplex. Os perfis obtidos nas amplificações dos marcadores polimórficos são comparados com perfis de criminosos condenados, guardados em banco de dados. 12. Referências BORZANI, Walter et al. Biotecnologia industrial: volume I: fundamentos. São Paulo, SP: E. Blücher, 2001. xxix, 254 p. ISBN 8521202784 (v.1). JOHNSON, Alberts et al. Biologia molecular da célula. 6 ed. Porto Alegre RS: Artmed, 2017. 1464 p., ISBN 978-85-8271-423- 2. LODISH, Harvey F et al. Biologia celular e molecular. 7.ed. Porto Alegre, RS: Artmed, 2014. xxxiv, 1210 p., ISBN 9788582710494. TARAZONA-SANTOS, E. et al. Brasil E a Idiossincrasia Da Miscigenação. Revista da Universidade Federal de Minas Gerais, v. 22, n. 1.2, p. 232–249, 2016. ZAHA, Arnaldo et al. Biologia molecular básica. 5. ed. Porto Alegre: Artmed, 2014. 407 p. ISBN 978-85-8271-058-6. Base de dados para informação biotecnológica (ncbi), (National Center for Biotechnology Information Search database), 2020. <https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome>. YouTube. (2015). Genética Forense – Perícia Criminal. Perícia Criminal ASBAC Sindicato. 15min41. Disponível em: <https://www.youtube.com/watch?v=8CHuDpdBDuM>. BRASIL. Ministério da justiça e segurança pública [2020]. Disponível em: https://www.justica.gov.br/news/collective-nitf- content-1560344233.12. BBC NEWS BRASIL. Novo teste “diferencia” gêmeos e pode solucionar casos de estupro e paternidade. Disponível em: https://www.bbc.com/portuguese/noticias/2014/01/140115_dn a_gemeos_criminosos_teste_fn. Parabéns, esta aula foi concluída! O que achou do conteúdo estudado? https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome https://www.youtube.com/watch?v=8CHuDpdBDuM https://www.justica.gov.br/news/collective-nitf-content-1560344233.12 https://www.justica.gov.br/news/collective-nitf-content-1560344233.12 https://www.bbc.com/portuguese/noticias/2014/01/140115_dna_gemeos_criminosos_teste_fn https://www.bbc.com/portuguese/noticias/2014/01/140115_dna_gemeos_criminosos_teste_fn Mínimo de caracteres: 0/150 Péssimo Ruim Normal Bom Excelente Deixe aqui seu comentário Enviar
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