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527 VENTILAÇÃO MECÂNICA Papel do sistema renina-angiotensina na lesão pulmonar induzida por ventilador: um estudo in vivo em modelo de rato Jih-Shuin Jerng, Yu-Chiao Hsu, Huey-Dong Wu, Hong-Zhen Pan, Hao-Chien Wang, Chia-Tung Shun, Chong-Jen Yu, Pan-Chyr Yang . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Tórax2007;62:527–535. doi: 10.1136/thx.2006.061945 Fundo:A ventilação mecânica prejudicial pode causar uma reação pró-inflamatória nos pulmões. Evidências recentes sugerem uma associação do sistema renina-angiotensina (SRA) com inflamação pulmonar. Um estudo foi realizado para investigar o papel patogênico do SRA na lesão pulmonar induzida pelo ventilador (LPIV) e para determinar se a LPVI pode ser atenuada pela inibição da enzima conversora de angiotensina (ECA). Métodos:Ratos Sprague-Dawley machos foram ventilados mecanicamente por 4 h com volumes correntes baixos (7 ml/kg) ou altos (40 ml/kg); ratos não ventilados foram utilizados como controle. A lesão e a inflamação pulmonares foram medidas pelo escore de lesão pulmonar, vazamento de proteínas, atividade de mieloperoxidase, níveis de citocinas pró-inflamatórias e fator nuclear (NF)-kAtividade B. A expressão dos componentes do RAS também foi avaliada. Alguns ratos foram pré-tratados com o inibidor da ECA captopril (10 mg/kg) por 3 dias ou receberam uma infusão concomitante com losartan ou PD123319 (antagonista do receptor da angiotensina II tipo 1 ou tipo 2) durante a ventilação mecânica para avaliar possíveis efeitos protetores na VILI. Resultados:No grupo de alto volume (n = 6) o escore de lesão pulmonar, concentração de proteínas no lavado broncoalveolar, citocinas pró-inflamatórias e NF-kAs atividades B foram significativamente aumentadas em comparação com os controles (n = 6). Os níveis de angiotensina II no tecido pulmonar e os níveis de mRNA do angiotensinogênio e dos receptores de angiotensina II tipo 1 e tipo 2 também aumentaram significativamente no grupo de alto volume. O pré-tratamento com captopril ou infusão concomitante com losartana ou PD123319 no grupo de alto volume atenuou a lesão e inflamação pulmonar (n = 6 para cada grupo). Conclusões:O RAS está envolvido na patogênese da lesão pulmonar induzida pelo ventilador. O inibidor da ECA ou os antagonistas do receptor da angiotensina podem atenuar a VILI neste modelo de rato. Veja o final do artigo para afiliações dos autores . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Correspondência para: Professor PC Yang, Departamento de Interno Medicina, Hospital Universitário Nacional de Taiwan, No 7 Chung- Shan South Road, Taipé 100, Taiwan; pcyang@ha.mc.ntu.edu.tw Recebido em 14 de março de 2006. Aceito em 22 de novembro de 2006 Publicado on-line primeiro 17 de janeiro de 2007 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Ma ventilação mecânica (VM) é indispensável no manejo de pacientes críticos com insuficiência respiratória.1 2No entanto, a VM também pode submeter os pulmões a um estresse de alongamento anormal substancial, resultando em alterações estruturais, troca gasosa prejudicada e ativação do processo inflamatório, levando à lesão pulmonar induzida pelo ventilador (VILI) e risco significativo para os pacientes.3Considera-se que células inflamatórias e mediadores pró-inflamatórios desempenham um papel importante na patogênese da VILI.4 5A evidência que apoia a capacidade de indução de inflamação da ventilação prejudicial também é fornecida pela descoberta de que o estresse mecânico pode ativar o processo inflamatório através do fator nuclear (NF)-kvia B e isso pode ser atenuado pelos glicocorticóides.6No entanto, o mecanismo exato pelo qual a VM desencadeia o processo inflamatório permanece obscuro. Recentemente, o envolvimento do sistema renina-angiotensina (SRA) na patogênese e evolução das respostas inflamatórias tem recebido atenção. Com base em vários estudos experimentais, o SRA é considerado um mediador chave da inflamação.7Além disso, a angiotensina II, o factor chave do SRA, demonstrou em vários estudos in vitro activar um processo inflamatório através da regulação positiva da síntese de citocinas e quimiocinas pró- inflamatórias através do tipo 1 (AT1) e do tipo 2 (AT2). receptores de angiotensina II e subsequente ativação do NF-kCaminho B.7–9A infusão sistêmica de angiotensina II também ativa o NF-kB in vivo em rins de ratos.10Por outro lado, o RAS está envolvido na morte celular. Angiotensina II induz apoptose de células endoteliais pulmonares11e células epiteliais alveolares.12A apoptose pode ser anulada por antagonistas dos receptores da angiotensina ou outros bloqueadores da angiotensina II.13Além disso, a angiotensina II também desempenha um papel importante na resposta fibrótica à lesão pulmonar aguda por induzindo fator transformador de crescimentoaexpressão nos pulmões. 14Portanto, é provável que o SRA esteja altamente envolvido no desenvolvimento de lesão pulmonar com comprometimento da função pulmonar. Um artigo recente apoia o conceito de que a enzima de conversão da angiotensina (ECA) agrava a insuficiência pulmonar aguda grave induzida pela aspiração ácida e mostrou que os ratos com deficiência do gene da ECA reduziram significativamente a doença. considera-se, portanto, que, em condições que podem levar à inflamação pulmonar, como a ventilação de alto volume, o SRA pode desempenhar um papel importante no desenvolvimento da inflamação pulmonar. No entanto, o papel do SRA na activação do processo inflamatório associado à VILI e na sua patogénese molecular e o papel potencial de agentes terapêuticos anti-inflamatórios específicos permanecem incertos. Portanto, investigamos o envolvimento do RAS na VILI. Neste estudo demonstramos que o SRA desempenha um papel importante no desenvolvimento da LPIVM e que o pré-tratamento com um inibidor da ECA ou o tratamento concomitante com antagonistas dos receptores da angiotensina pode atenuar a lesão pulmonar neste modelo animal. 15Isto Abreviações:ECA, enzima conversora de angiotensina; ECA2, enzima conversora de angiotensina 2; AT1, AT2, receptores de angiotensina II tipos 1 e 2; LBA, lavado broncoalveolar; JNK1, quinase 1 c-Jun N-terminal; MIP-2, proteína inflamatória de macrófagos; MPO, mieloperoxidase; VM, ventilação mecânica; NF-kB, fator nuclear- kB; PCNA, antígeno nuclear de células em proliferação; PEEP, pressão expiratória final positiva; SRA, sistema reninangiotensina; RT-PCR, transcrição reversa e reação em cadeia da polimerase; TNFa,fator de necrose tumorala;VILI, lesão pulmonar induzida por ventilador www.thoraxjnl.com Tórax: publicado pela prim eira vez com o 10.1136/thx.2006.061945 em 18 de janeiro de 2007. Baixado dehttp://tórax.bm j.com /em 18 de janeiro de 2021 por convidado. Protegido por direitos autorais. Traduzido do Inglês para o Português - www.onlinedoctranslator.com https://www.onlinedoctranslator.com/pt/?utm_source=onlinedoctranslator&utm_medium=pdf&utm_campaign=attribution 528 Jerng, Hsu, Wu, e outros tabela 1Oligonucleotídeo usado como primer para RT-PCR em tempo real Nome do gene Oligonucleotídeo Seqüência Posição Amplicão Agt Primer avançado Primer reverso Primer avançado Primer reverso Primer avançado Primer reverso Primer avançado Primer reverso Primer avançado Primer reverso GTGGAGGTCCTCGTCTTCCA GTTGTAGGATCCCCGAATTTCC CGGTTTTCATGAGGCTATTGGA TCGTAGCCACTGCCCTCACT ACCCTTCTTACATCAGCCCTACTG TGTCCAAAACCTACCCCACATAT GAAGCCAGAGGACCATTTGG CACTGAGTGCTTTCTCTGCTTCA GCCAACATTTTATTTCCGAGATG TTCTCAGGTGGGAAAGCCATA 1239–1258 1346–1325 3080–3101 3181–3162 755–778 828-806 1260–1279 1360–1338 528–550 608–588 108 Ás 102 Ás2 74 Agtr1 101 Agtr2 81 Ag,angiotensinogênio;Ás,enzima conversora de angiotensina;Ás2,enzima conversora de angiotensina 2;Agtr1,receptor de angiotensina IItipo 1;Agtr2,receptor de angiotensina II tipo 2. MÉTODOS Preparação animal, protocolo de ventilação mecânica e tratamento medicamentoso Todos os experimentos foram realizados após aprovação do Comitê Institucional de Animais da Faculdade de Medicina da Universidade Nacional de Taiwan. Ratos Sprague-Dawley machos pesando 200-250 g foram anestesiados por injeção intraperitoneal de uretano (1,3 g/kg). A traqueostomia foi realizada e o tubo de traqueostomia foi então conectado a um ventilador volume controlado para pequenos animais (New England Medical Instruments Inc, Medway, Massachusetts, EUA). A VM foi aplicada usando métodos modificados do protocolo descrito anteriormente.16 17Os animais foram divididos nos seguintes três grupos experimentais: (1) controles não ventilados; (2) tratados com VM com volume corrente alto (40 ml/kg de volume corrente, 3 cm H2O de pressão expiratória final positiva (PEEP), 20 respirações/min, ar ambiente); (3) tratados com VM com baixo volume corrente (7 ml/kg de volume corrente, 3 cm H2O de PEEP, 100 respirações/min, ar ambiente). O grupo controle recebeu apenas injeção intraperitoneal de uretano. A ventilação mecânica foi aplicada por 4 horas e o pico de pressão nas vias aéreas e a pressão arterial média foram monitorados durante todo o período. A gasometria arterial foi realizada utilizando um analisador portátil (i-STAT, Abbott Laboratory, Abbott Park, Illinois, EUA). Após ventilação, os animais receberam uma dose letal de pentobarbital intraperitoneal e depois, após lavagem dos vasos pulmonares com injeção intracardíaca de solução salina normal, os pulmões foram removidos em bloco. Como controle positivo para lesão e inflamação pulmonar, outro grupo de ratos não ventilados recebeuE. coli lipopolissacarídeo instilado transtraquealmente (0,2 mg/100 g de peso corporal dissolvido em 0,5 ml de solução salina tamponada com fosfato (PBS)). Grupos adicionais de ratos receberam pré-tratamento com captopril antes da VM ou foram tratados com losartana ou PD123319 durante a VM. Para o grupo tratado com captopril, 50 mg/kg de captopril (Sigma Chemical, St Louis, Missouri, EUA) foram adicionados à água potável (500 mg/l) durante os 3 dias anteriores à ventilação mecânica. No grupo tratado com losartana, losartana (10 mg/kg) (doação da Merck & Co Inc, Whitehouse Station, Nova Jersey, EUA) foi injetada por via intravenosa através de uma bomba durante as 4 horas de VM; no grupo tratado com PD123319, foi injetado PD123319 (10 mg/kg; Sigma Chemical). Todos os animais medicados foram submetidos às mesmas estratégias ventilatórias descritas acima. avaliação histológica. Cada seção pulmonar foi avaliada quanto à lesão pulmonar por um patologista certificado usando critérios publicados anteriormente.18Resumidamente, os itens de pontuação incluíram: (1) congestão capilar alveolar; (2) hemorragia; (3) infiltração ou agregação de neutrófilos no espaço aéreo ou na parede do vaso; e (4) espessura da formação da parede alveolar/membrana hialina. Cada item foi classificado de acordo com a seguinte escala de cinco pontos: 0 = dano mínimo (pouco); 1 =dano leve; 2 =dano moderado; 3 = dano grave; e 4 = dano máximo. A soma média da pontuação de cada campo foi comparada entre os grupos. Ensaio de mieloperoxidase A atividade da mieloperoxidase (MPO) no parênquima pulmonar, utilizada como enzima marcadora para infiltração de neutrófilos no pulmão, foi avaliada de acordo com os métodos descritos anteriormente. 19 20 Medição de proteína no líquido de lavagem broncoalveolar O lavado broncoalveolar (LBA) foi realizado conforme descrito anteriormente.21A proteína total no fluido BAL foi determinada usando um kit comercial de ensaio de proteína BCA (Pierce, Rockford, Illinois, EUA) de acordo com o protocolo do fabricante, conforme descrito anteriormente.22 Extrato de RNA tecidual e transcrição reversa e reação em cadeia da polimerase (RT-PCR) O RNA total do pulmão direito de ratos após 4 h após o tratamento foi isolado utilizando o reagente TRIzol (Invitrogen, Carlsbad, Califórnia, EUA). Fator de necrose tumoral (TNF)ae os níveis de mRNA da proteína inflamatória de macrófagos (MIP) -2 no tecido pulmonar foram examinados pela transcrição reversa e reação em cadeia da polimerase (RT-PCR), conforme descrito em outro lugar. Os iniciadores oligonucleotídicos específicos do gene para TNFa, MIP-2 e gliceraldeído-3-fosfotato desidrogenase (GAPDH) foram descritos anteriormente. 23 23 Íon de reação em cadeia de íon-polimerase com transcrição reversa em tempo real A RT-PCR em tempo real para medir quantitativamente os níveis de mRNA para componentes RAS foi realizada em um detector de sequência ABI PRISM 7500 (PE Applied Biosystems Inc). Iniciadores oligonucleotídicos para angiotensinogênio de rato, ECA, enzima conversora de angiotensina 2 (ACE2) e os receptores AT1 e AT2 foram projetados a partir dos bancos de dados GenBank (NM 012544 e NM 134432; tabela 1) usando Primer Express (PE Applied Biosystems Inc, Foster City, Califórnia, EUA). 24 Estudos histológicos Os pulmões esquerdos (n = 6 para cada grupo) foram removidos imediatamente após os animais serem mortos e fixados com uma mistura de glutaraldeído 2% e paraformaldeído 2% em tampão cacolate 0,1 M, pH 7,4, por mais de 24 horas, desidratados com um série de álcool graduada e embebida em parafina a 52 C̊. Os cortes foram preparados e corados com hematoxilina e eosina para Medição dos níveis de angiotensina II no tecido pulmonar Um kit EIA de angiotensina (Peninsula Laboratories, San Carlos, Califórnia, EUA) foi utilizado para medir os níveis de angiotensina II no tecido pulmonar de acordo com as instruções do fabricante, conforme descrito em outro local. 25 www.thoraxjnl.com Tórax: publicado pela prim eira vez com o 10.1136/thx.2006.061945 em 18 de janeiro de 2007. Baixado dehttp://tórax.bm j.com /em 18 de janeiro de 2021 por convidado. Protegido por direitos autorais. Papel do sistema renina-angiotensina na lesão pulmonar induzida pelo ventilador 529 A B NC figura 1 pressão, (B) pressão arterial média, (C) tensão arterial de dióxido de carbono (PaCO2) e (D) tensão arterial de oxigênio (PaO2) em diferentes grupos de animais (n = 6 para cada grupo). O pico de pressão nas vias aéreas foi menor nos grupos ventilados com baixo volume do que nos grupos ventilados com alto volume (p<0,001). O pré- tratamento com captopril não alterou o pico de pressão nas vias aéreas. A pressão arterial média foi menor nos animais pré-tratados com captopril (p<0,001 ao final da ventilação mecânica). PaiCO2e paiO2 foram semelhantes entre os diferentes grupos e não mudaram significativamente após 4 horas de ventilação mecânica. AT, ventilação de alto volume; VE, ventilação de baixo volume; CAPHV, pré- tratamento com captopril seguido de ventilação de alto volume; CAPLV, pré-tratamento com captopril seguido de ventilação de baixo volume; NC, grupo controle não ventilado. Alteração no pico (A) das vias aéreas Alta tensão LV Alta tensão LV 40 CAPHV CAPLV 120 CAPHV CAPLV 30 100 20 80 10 60 0 40 0 1 2 3 4 0 1 2 3 4 Hora Hora C D 10 0 hora 4 horas 18 16 148 12 10 8 6 4 2 0 6 4 2 0 Alta tensão LV CAPHV CAPLV Alta tensão LV CAPHV CAPLV Figura 2Coloração com hematoxilina e eosina de seções pulmonares de (A) grupo não ventilado, (B) grupo de ventilação de baixo volume, (C) grupo de ventilação de alto volume e (D) grupo pré-tratado com captopril seguido de ventilação de alto volume. Ampliação original6200. A B C D www.thoraxjnl.com Pa O 2(k Pa ) Pr es sã o m áx im a da s vi as a ér ea s (c m H 2Ó ) Pr es sã o ar te ria l m éd ia (m m H g) Pa O 2(k Pa ) Tórax: publicado pela prim eira vez com o 10.1136/thx.2006.061945 em 18 de janeiro de 2007. Baixado dehttp://tórax.bm j.com /em 18 de janeiro de 2021 por convidado. Protegido por direitos autorais. 530 Jerng, Hsu, Wu, e outros A B Figura 3 para os grupos controlenão ventilado, ventilação de baixo volume (LV) e ventilação de alto volume (AV) (n = 6 para cada grupo). O escore de lesão pulmonar nos grupos HV foi maior que no grupo controle (**p,0,001) e foi reduzido pelo captopril (*p,0,001). A diferença no escore de lesão pulmonar entre os grupos VE e controle não foi significativa (p = 0,09). (B) A atividade da mieloperoxidase (MPO) foi aumentada pela HV (**p = 0,002) e foi atenuada pelo captopril pré-tratamento (**p = 0,002, n = 3 para cada grupo). (C) A concentração de proteínas no líquido do lavado broncoalveolar (LBA) foi aumentada no grupo HV (*p = 0,008) e foi atenuada pelo captopril (*p = 0,027, n = 3 para cada grupo). (A) Escores de lesão pulmonar patológica 3,0 2,5 5 4 3 2 1 Captopril (_) Captopril (+) * * 2,0 1,5 1,0 0,5 0 * * * * 0 NC LV Alta tensão Ao controle LV Alta tensão C1,0 0,8 0,6 0,4 0,2 * * * 0 NC LV Alta tensão Análise de Western Blot para NF-kB e eu-kB Western blotting foi usado para avaliar a ativação de NF-kB no tecido pulmonar. Anticorpos policlonais contra o componente p65 do NF-kB (Santa Cruz, Santa Cruz, Califórnia, EUA), I- kB ou inibidor fosforilado-kB (eu-kB) (ambos da Cell Signaling, Beverly, Massachusetts, EUA) foram utilizados de acordo com os métodos descritos em outro lugar. Anticorpos para antígeno nuclear de células em proliferação (PCNA) ou c-Jun N-terminal quinase 1 (JNK1) foram usados para detectar essas proteínas, usadas como controles de carga para o respectivamente. Análise de Western blot para os componentes RAS e receptores AT1 e AT2 Western blotting foi utilizado para avaliar a expressão proteica dos componentes do SRA no tecido pulmonar. Anticorpos policlonais contra receptores ACE, ACE2 e AT1 e AT2 (Santa Cruz) foram utilizados de acordo com os métodos descritos anteriormente. Análise estatística Todos os dados contínuos são expressos como valores médios (DP). , As comparações das variáveis contínuas entre os grupos foram realizadas por meio dotteste e análise de variância unidirecional A GAPDH TNFa Figura 4Efeito da ventilação mecânica na expressão de citocinas pró-inflamatórias em pulmões de ratos. (A) Evolução temporal das alterações nos níveis de mRNA pulmonar do fator de necrose tumoral (TNF)ae proteína inflamatória de macrófagos (MIP)-2 em um rato tratado por 4 h com ventilação de alto volume (HV). Os níveis de ambos atingiram o pico às 4 h. (B) e (C) Expressões de TNFa (p = 0,03) ou mRNA de MIP-2 (p = 0,006) foram aumentados no pulmão no grupo HV em comparação com o grupo controle (n = 3 para cada grupo; os aumentos foram atenuados pelo captopril (**p = 0,045 para TNFa; **0,045 para MIP-2). (D) O nível de MIP-2 no tecido pulmonar foi aumentado pela ventilação HV (*p = 0,001) e foi significativamente reduzido pelo pré-tratamento com captopril (**p = 0,002; n = 3 para cada grupo). (E) O nível sérico de MIP-2 foi significativamente aumentado pela HV (*p = 0,01) e foi reduzido pelo pré-tratamento com captopril (**p = 0,02, n = 3 para cada grupo). PMI 2 (h) 0 1 2 3 4 24 48 72 B Captopril (_) Captopril (+) C 4 6 5 4 3 * * 3 2 * ** * 21 1 00 NC LV Alta tensão NC LV Alta tensão D E 1000 800 160 ** 120 600 400 200 0 * ** * 80 40 0 NC LV Alta tensão NC LV Alta tensão www.thoraxjnl.com Pu lm ão M IP 2 (p g/ g pu lm ão ) TN Fa ní ve l d e m RN A (a um en to d e do br a) Po nt ua çã o de le sã o pu lm on ar Pr ot eí na fl ui da B AL (μ g/ μe u) At iv id ad e M PO (u ni da de /m in ) So ro M IP 2 (p g/ m l) N ív el d e m RN A M IP 2 (a um en to d e do br a) Tórax: publicado pela prim eira vez com o 10.1136/thx.2006.061945 em 18 de janeiro de 2007. Baixado dehttp://tórax.bm j.com /em 18 de janeiro de 2021 por convidado. Protegido por direitos autorais. Papel do sistema renina-angiotensina na lesão pulmonar induzida pelo ventilador 531 Figura 5Efeito do captopril na ativação do fator nuclearkB (NF-kB) em pulmões de ratos induzidos por ventilação mecânica. (A) Achados representativos de Western blots após 4 h de tratamento. (B – E) Níveis relativos de proteínas medidos por densitometria dos blots. A ventilação de alto volume diminuiu o citosol NF-kB (p,0,001) e I-kB (p<0,001) e aumentou o NF- nuclearkB (p = 0,001) e fósforo do citosol-I-kNíveis B (p,0,001). O pré- tratamento com captopril aumentou o NF- do citosolkB (p = 0,01) e I- kB (p = 0,001) e diminuição dos níveis nucleares de NF-kB (p = 0,005), bem como fósforo-I-kNíveis B (p,0,001). Ctrl, grupo de controle não ventilado; JNK1, c- Jun Nterminal quinase 1; PCNA, antígeno nuclear de células em proliferação; NC, controles normais; AT, ventilação de alto volume; VE, ventilação de baixo volume. utilizando o software SPSS 10 (SPSS Inc, Chicago, Illinois, EUA). Um valor de p <0,05 foi considerado significativo. Uma descrição detalhada dos Métodos está disponível no suplemento online em http://thorax.bmj.com/supplemental. preservado. A infiltração de neutrófilos no grupo de alto volume foi atenuada pelo pré-tratamento com captopril (fig. 2D). Os escores de lesão pulmonar patológica foram compatíveis com os dados histológicos, pois a ventilação de alto volume aumentou o escore de lesão pulmonar em comparação com os controles não ventilados, e o efeito foi significativamente atenuado pelo pré-tratamento com captopril (fig. 3A). Não houve diferença significativa entre as pontuações do grupo de ventilação de baixo volume e dos controles ou entre os grupos de ventilação de baixo volume com ou sem pré- tratamento com captopril. A Figura 3B mostra que a VM de alto volume aumentou significativamente a atividade da MPO e esse efeito foi significativamente atenuado pelo pré-tratamento com captopril. Não houve diferença significativa na atividade da MPO entre o controle não ventilado e os grupos com ventilação de baixo volume. A ventilação de alto volume também aumenta o vazamento de proteínas para o espaço alveolar, e isso foi reduzido pelo pré-tratamento com captopril (p<0,05; fig. 3C). RESULTADOS Alterações fisiológicas durante a VM A pressão de pico nas vias aéreas foi maior no grupo VM de alto volume do que no grupo VM de baixo volume (fig. 1A), mas não se alterou significativamente ao longo do curso da VM. A pressão arterial média diminuiu acentuadamente durante a VM em ratos pré-tratados com captopril (fig. 1B) em comparação com os grupos de VM de alto e baixo volume. Os dados da gasometria arterial foram semelhantes nos grupos VM no início da VM e não mostraram alteração significativa após 4 horas de VM (fig. 1C, D). Efeito da ventilação de alto volume na lesão pulmonar e na infiltração de neutrófilos em pulmões de ratos e na atenuação por captopril Estudos histológicos mostraram que a infiltração de células inflamatórias não foi significativa nos pulmões do grupo controle (fig. 2A) ou do grupo de ventilação de baixo volume (fig. 2B), mas a ventilação de alto volume resultou em lesão pulmonar leve com leve infiltração de neutrófilos (fig. 2C). ). A arquitetura alveolar era geralmente Efeito do captopril na expressão pulmonar de citocinas e quimiocinas pró-inflamatórias induzidas por ventilação de alto volume No grupo de ventilação de alto volume, os níveis de mRNA do TNFa e a PImáx-2 aumentou progressivamente até 4 horas, depois diminuiu gradualmente após a cessação da VM (fig. 4A). O grupo de ventilação de alto volume apresentou níveis significativamente mais elevados de TNFae www.thoraxjnl.com Tórax: publicado pela prim eira vez com o 10.1136/thx.2006.061945 em 18 de janeiro de 2007. Baixado dehttp://tórax.bm j.com /em 18 de janeiro de 2021 por convidado. Protegido por direitos autorais. 532 Jerng, Hsu, Wu, e outros A C Figura 6 a expressão de componentes do sistema reninangiotensina. (A) Enzima imunoensaio para angiotensina II de tecido pulmonar (n = 6 para cada grupo). A ventilação de alto volume (HV) aumentousignificativamente angiotensina II (**p = 0,007), enquanto a ventilação de baixo volume (LV) não (*p = 0,69). (B) Reversão quantitativa em tempo real transcrição e reação em cadeia da polimerase (RT- PCR) para níveis de mRNA para angiotensinogênio, enzima conversora de angiotensina (ECA) e receptores de angiotensina II tipos 1 e 2 (AT1 e AT2) (n = 3 para cada grupo). O mRNA do angiotensinogênio (p = 0,01), AT1 (p<0,001) e AT2 (p = 0,008) foi aumentado pela HV enquanto o mRNA da ECA foi diminuído (p = 0,002). (C) Western blotting para ACE, AT1 e AT2. As diferenças nos níveis de tecido pulmonar para ECA (p = 0,85) e AT1 (p = 0,089) não foram significativas entre os grupos controle e HV, mas o nível de AT2 foi significativamente aumentado no grupo HV (**p = 0,002). Efeito da ventilação mecânica sobre NC LV Alta tensão 30 25 20 ÁS bactina LV Alta tensão * * 1,5 * 1,0 0,5 0,0 15 10 5 NC NC LV LV Alta tensão Alta tensão0 0 1 2 Hora 3 4 EM 1 bactinaB 1,5 3 1,5 1,0 1,0 0,5 0,0 * * 2 NC LV Alta tensão 1 0,5 NC LV Alta tensão 0 0,0 Controle LV Alta tensão Controle LV Alta tensão AT2 bactina 1,5 1,0 0,5 0,0 4 3 * * 3 * * NC LV Alta tensão 2 2 1 0 1 0 Controle LV Alta tensão Controle LV Alta tensão mRNA de MIP-2 do que grupos de controle; esses aumentos foram significativamente atenuados pelo pré-tratamento com captopril (fig. 4B, C). A mesma tendência também foi demonstrada para os níveis de proteína MIP-2 pulmonar e sérica por ELISA (fig. 4D, E). Efeito do captopril na translocação de NF-kB em ratos com inflamação pulmonar induzida por ventilação de alto volume A Figura 5 mostra descobertas representativas para NF-kAtividade B após 4 h de tratamento. A fração citosólica de NF-kB foi marcadamente diminuída nos grupos tratados com ventilação de alto volume e lipopolissacarídeos, com um aumento simultâneo e distinto no NF- nuclearkB (fig. 5), mostrando que a translocação nuclear desse fator foi induzida por VM lesiva ou lipopolissacarídeo. Além disso, a translocação de NF-kB no grupo de ventilação de alto volume foi significativamente, mas não completamente, atenuada pelo pré-tratamento com captopril. Nas manchas de proteínas citosólicas, a quantidade de I-kB também foi diminuído pela VM de alto volume, com aumento simultâneo de I- fosforilada.kB. Este aumento em I-kA fosforilação de B também foi atenuada pelo pré-tratamento com captopril. A 1,25 1,00 0,75 0,50 0,25 0,00 * NC LV Alta tensão B NC LV Alta tensão Coração Rim ACE2 bactina Efeito da ventilação mecânica de alto volume na expressão de componentes do SRA O nível de angiotensina no tecido pulmonar aumentou progressivamente no grupo de alto volume, mas não no grupo de baixo volume, durante as 4 horas de VM (fig. 6A). A RT-PCR quantitativa em tempo real do tecido pulmonar mostrou que a ventilação de alto volume aumentou os níveis de mRNA para o angiotensinogênio e os receptores AT1 e AT2, mas não teve efeito significativo nos níveis de mRNA da ECA (fig. 6A). Os níveis proteicos da ECA, AT1 e AT2 foram semelhantes entre os grupos. Também avaliamos os níveis de mRNA e proteína de ACE2 nos pulmões (fig. 7). A expressão de mRNA da ACE2 foi significativamente diminuída pela ventilação de alto volume, mas não pela ventilação de baixo volume (fig. 7A). Os níveis pulmonares da proteína ACE2 dos ratos eram muito baixos em comparação com os níveis nos rins ou no coração (fig. 7B). A diferença entre os grupos não foi significativa. 25 20 15 10 5 0 NC LV HV Coração Rim Figura 7Expressão de mRNA e proteína da enzima conversora de angiotensina 2 (ACE2) em tecido pulmonar de rato. (A) Transcrição reversa em tempo real e reação em cadeia da polimerase (RT-PCR) mostram que a expressão de mRNA de ACE2 foi significativamente diminuída por alto volume (HV) (p<0,001), mas não por baixo volume (LV) (p = 0,067) ventilação (n = 6 para cada grupo). (B) Os níveis pulmonares da proteína ACE2 dos ratos foram muito baixos em comparação com o nível no rim ou coração (grupo controle (NC) pulmão vs rim, p = 0,007; pulmão vs coração, p = 0,017). A diferença entre os grupos não foi significativa. (HV vs NC, p = 0,90, n = 3 para cada grupo). www.thoraxjnl.com AR N m d e AT 1 (a um en to d e do br a) m RN A do a ng io te ns in og ên io (a um en to d e do br a) N ív el d e an gi ot en si na II p ul m on ar (p g/ g pu lm ão ) AR N m d e AC E2 (p ro po rç ão ) AC E2 (p ro po rç ão ) AR N m d e EC A (a um en to d e do br a) AR N m d e AT 2 (a um en to d e do br a) AT 2 (ra zã o) EM 1 (ra zã o) ÁS (ra zã o) Tórax: publicado pela prim eira vez com o 10.1136/thx.2006.061945 em 18 de janeiro de 2007. Baixado dehttp://tórax.bm j.com /em 18 de janeiro de 2021 por convidado. Protegido por direitos autorais. Papel do sistema renina-angiotensina na lesão pulmonar induzida pelo ventilador 533 Figura 8Efeitos do losartan e PD123319 na lesão pulmonar induzida pelo ventilador. (A) As pressões arteriais médias foram significativamente diminuiu pelo losartan (grupos de ventilação de alto volume (HV), p<0,001), mas não pelo PD123319 (p = 0,23 entre os grupos HV; n = 6 para cada grupo). (B) O aumento na concentração de proteína líquida no LBA por HV foi significativamente diminuído pelo losartan (*p = 0,03) e pelo PD123319 (*p = 0,03; n = 3 para cada grupo). (C) O aumento nos níveis de mRNA da proteína inflamatória de macrófagos (MIP) -2 induzido por HV foi atenuado pelo losartan e pelo PD123319. O experimento foi repetido três vezes com resultados similares. (D) O ensaio de mieloperoxidase (MPO) mostra uma redução significativa na atividade de MPO induzida por HV pelo losartan (*p = 0,004) e pelo PD123319 (*p = 0,014). LOSHV, ventilação de alto volume com infusão de losartana; LOSNC, controle não ventilado com infusão de losartana; PDNC, controle não ventilado com tratamento PD123319; PDHV, ventilação de alto volume com tratamento PD123319; LBA, lavado broncoalveolar. Efeitos do bloqueio do receptor de angiotensina II na expressão de quimiocina pró-inflamatória induzida por ventilação de alto volume Durante a ventilação mecânica, a diminuição da pressão arterial tornou- se mais profunda no grupo tratado com losartan, mas não nos ratos tratados com PD123319 (fig. 8A). A infusão concomitante de losartana ou PD123319 durante a VM atenuou o vazamento de proteína no líquido LBA (fig. 8B). O aumento nos níveis de mRNA de MIP-2 no tecido pulmonar induzido pela ventilação de alto volume foi atenuado pela infusão concomitante de losartan ou PD123319 (fig. 8C). O aumento na atividade da mieloperoxidase do tecido pulmonar pela ventilação de alto volume também foi atenuado pelo losartan e pelo PD123319 (fig. 8D). Os fatores associados ao desenvolvimento de lesão pulmonar induzida pelo ventilador podem incluir as espécies de animais utilizados no estudo, a conformidade do sistema respiratório e a tolerância do animal ao protocolo de VM. Uma das principais características do desenho do nosso estudo foi que utilizamos um volume corrente muito alto (40 ml/kg) para causar lesão pulmonar, conforme relatado na literatura. Em estudos experimentais, à medida que o volume corrente é aumentado para exercer um efeito patogênico, a frequência respiratória geralmente é reduzida para manter constantes os dados da gasometria arterial, como no presente estudo. Em outros estudos, foi adicionado dióxido de carbono adicional ao ar respirável para compensar a hipocapnia induzida pela hiperventilação no grupo de alto volume corrente, enquanto a frequência respiratória foi mantida. Na nossa experiência, descobrimos que os ratos não toleravam uma frequência respiratória elevada devido ao grave comprometimento hemodinâmico (dados não mostrados). Esse achado provavelmente se deveu ao grave aprisionamento aéreo, que aumentou acentuadamente a pressão intratorácica e comprometeu o retorno venoso. Portanto,não podemos excluir um efeito confuso da frequência respiratória na lesão pulmonar causada pela VM. O protocolo utilizado neste estudo foi baseado naqueles utilizados por Whiteheade outros16e Ricardoe outros,17em que um volume corrente muito elevado (cerca de 40 ml/kg) foi utilizado para criar uma inflação prejudicial dos alvéolos. A razão para utilizar este volume corrente extremamente elevado foi que os ratos têm boa complacência do sistema respiratório, e a ventilação com este grande volume não causa um aumento muito grande na pressão de platô nas vias aéreas. Outra consideração é que este tratamento pode mimetizar algumas condições clínicas extremas, como a síndrome do desconforto respiratório do adulto (SDRA), na qual o número de alvéolos funcionais remanescentes pode ser tão baixo que a ventilação com um volume mais DISCUSSÃO Neste estudo, relatamos duas novas descobertas. Primeiro, o RAS é ativado por VM de alto volume corrente no modelo animal in vivo. A distensão excessiva das unidades pulmonares pela ventilação de alto volume resultou na expressão regulada positivamente dos componentes do SRA e dos receptores AT1 e AT2 e no aumento da produção pulmonar de angiotensina II. Em segundo lugar, o RAS desempenha um papel importante na VILI de alto volume. O tratamento com inibidor da ECA ou antagonista do receptor da angiotensina atenuou a LPIVM, com supressão da expressão de citocinas e NF-kAtividade B nos pulmões. Acreditamos, portanto, que o RAS está ativamente envolvido na patogênese da VILI. Embora estudos clínicos e experimentais anteriores tenham demonstrado que um volume corrente elevado resulta em lesões pulmonares, as consequências da ventilação de alto volume em modelos animais in vivo, como visto no presente relatório, podem ser muito mais complexas. 2 6 26 www.thoraxjnl.com Tórax: publicado pela prim eira vez com o 10.1136/thx.2006.061945 em 18 de janeiro de 2007. Baixado dehttp://tórax.bm j.com /em 18 de janeiro de 2021 por convidado. Protegido por direitos autorais. 534 Jerng, Hsu, Wu, e outros o volume corrente normal é considerado um volume muito grande. Não encontramos evidências histológicas evidentes de ruptura alveolar nos pulmões de ratos ventilados com volume corrente de 40 ml/kg, portanto o achado de infiltração de neutrófilos nos pulmões não pode ser explicado por ruptura celular relacionada ao estresse ou morte celular. A ativação das células pulmonares, a chamada mecanotransdução, pode, em vez disso, desempenhar um papel importante no desenvolvimento de lesão pulmonar neste modelo. Outro ponto no desenho do nosso estudo é que os volumes minuto dos grupos de baixo e alto volume foram diferentes. A razão para a escolha dessas configurações foi que os dados da gasometria arterial foram semelhantes nos dois grupos durante a ventilação. O SRA tem sido considerado um mediador da inflamação e pode, portanto, desempenhar um importante papel patogênico no processo inflamatório associado à VILI. Houve relatos anteriores de que o EAR pulmonar e a angiotensina II estão associados a diversas condições fisiopatológicas. relatórios que apoiam o papel ativo da angiotensina na inflamação e lesão pulmonar envolveram estudos em células cultivadas. Imaie outros 15mostraram recentemente, em um estudo in vivo, que a ECA é um importante regulador da lesão pulmonar induzida por ácido. Nossas descobertas podem fornecer mais evidências in vivo para o envolvimento do RAS na VILI. O papel patogênico do EAR no processo inflamatório e VILI é fortemente apoiado pelo fato de que o pré- tratamento com captopril atenuou a inflamação pulmonar, suprimiu o TNFae expressão MIP-2 e NF-kAtividade B e redução dos níveis sanguíneos de angiotensina II. Com base nesses achados, acreditamos que a inibição da ECA pode ser benéfica em animais ventilados com volumes correntes elevados e prejudiciais. Nossas descobertas também fornecem suporte para a proposta de que NF- kA via B é a via de resposta a jusante para a ação da angiotensina II30no processo de inflamação, pois a inibição da ECA atenuou a translocação nuclear de NF-kB. No entanto, o RAS também pode ser influenciado por NF-kB, como inibição de NF-kB também atenua a atividade do RAS.31Além disso, NF-kB é necessário para a regulação positiva do mRNA do receptor AT1 em fibroblastos cardíacos de ratos tratados com TNFaou interleucina-1b. Juntamente com nossas descobertas, esses resultados sugerem que um sistema de feedback positivo pode estar presente, e isso possivelmente explica por que a VM de alto volume desencadeia o EAR e por que a inflamação pulmonar induzida pelo ventilador mediada pelo RAS se desenvolveu rapidamente em nosso estudo com modelo animal. Além disso, foi demonstrado que a angiotensina II está associada à apoptose e ao processo fibrogênico na lesão pulmonar,14mas se estes estão associados à VILI requer uma investigação mais aprofundada. Nossa descoberta de que o tratamento com captopril atenuou a VILI e o processo inflamatório no modelo animal pode ter importantes implicações clínicas. Agentes terapêuticos que bloqueiam a produção (inibidores da ECA) ou a ação (antagonista do receptor da angiotensina II) da angiotensina II podem ser utilizados como agentes antiinflamatórios para o tratamento ou prevenção da LPIVM. A ativação do NF-kB associada à VILI é parcialmente bloqueada por corticosteróides.6Embora existam poucos relatos sobre o papel do tratamento com inibidores da ECA nas doenças inflamatórias pulmonares, um relatório recente mostrou que o tratamento com inibidores da ECA está associado a um risco 19% menor de pneumonia, e o efeito é mais significativo em pacientes asiáticos que têm uma taxa de pneumonia de 47%. redução de risco.33Em nosso estudo, a ação inflamatória pulmonar da angiotensina II poderia ser mediada pelos receptores AT1 e AT2. No estudo de Imaie outros,15o receptor AT1 promoveu doenças pulmonares, enquanto o receptor AT2 melhorou a função pulmonar. No entanto, outro estudo mostrou que o NF-kB pode ser inativado pela administração de inibidor da ECA ou bloqueio do receptor AT1/AT2. No nosso modelo animal a dose de PD123319 foi relativamente alta (42eug/kg/min), então é possível que o receptor AT1 também possa ser afetado pelo PD123319.35O papel do receptor AT2 na patogênese da VILI requer, portanto, mais estudos. Nosso as descobertas de que o bloqueio do receptor AT2 poderia atenuar a VILI podem fornecer mais informações sobre os complexos mecanismos de lesão pulmonar. A principal limitação deste estudo é que ele se concentrou nos efeitos de curto prazo da VM prejudicial e faltam dados sobre os efeitos de longo prazo. No entanto, demonstramos que a inflamação ativa nos pulmões pode se desenvolver precocemente na VM prejudicial e acreditamos que, se esses ambientes prejudiciais fossem usados por um período mais longo, a inflamação e a lesão seriam ainda mais agravadas. Embora a inflamação tenha sido atenuada por um inibidor da ECA ou antagonista dos receptores da angiotensina, não sabemos as consequências a longo prazo do tratamento medicamentoso, especialmente no cenário clínico em que o tratamento com estes agentes pode causar hipotensão, o que é claramente indesejável em pacientes gravemente enfermos . Outra limitação é que este estudo envolveu VM prejudicial como um puro insulto aos pulmões originalmente saudáveis. Isto pode ser diferente da maioria dos cenários clínicos em que os pacientes podem sofrer outros insultos iniciais, como pneumonia, sepse ou mesmo SDRA, antes de receberem VM. As atividades locais de ACE e ACE2 também não foram medidas neste estudo. Mais investigações são necessárias para elucidar o mecanismo detalhado de ação do RAS na VILI. 7 27–29Maioria 12 13 Uma descrição detalhada dos Métodos está disponível no suplemento on-line em http://thorax.bmj.com/ suplementar . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Afiliações dos autores Jih-Shuin Jerng, Yu-Chiao Hsu, Hong-ZhenPan, Hao-Chien Wang, Chong-Jen Yu, Pan-Chyr Yang,Departamento de Medicina Interna, Hospital Universitário Nacional de Taiwan, Taipei, Taiwan Huey Dong Wu,Departamento de Diagnóstico Integrado e Terapêutica, Hospital Universitário Nacional de Taiwan, Taipei, Taiwan Chia-Tung Shun,Departamento de Medicina Forense, Hospital Universitário Nacional de Taiwan, Taipei, Taiwan Hao Chien Wang,Departamento de Medicina Interna, Far Eastern Memorial Hospital, Pan-Chiao, Taipei, Taiwan 32 Este estudo foi apoiado por doações do Hospital Universitário Nacional de Taiwan (NTUH-94S97) e do Conselho Nacional de Ciência (NSC93-2314- B-002-223), Taiwan. Interesses conflitantes: Nenhum. REFERÊNCIAS 1 WareLB,Matthay MA. A síndrome da dificuldade respiratória aguda.N Engl J Med 2000; 342:1334–49. 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Baixado dehttp://tórax.bm j.com /em 18 de janeiro de 2021 por convidado. Protegido por direitos autorais. Papel do sistema renina-angiotensina na lesão pulmonar induzida pelo ventilador 535 12 Wang R,Alam G, Zagariya A,e outros.A apoptose de células epiteliais pulmonares em resposta ao TNF-alfa requer geração de novo de angiotensina II.J Cell Physiol 2000; 185:253–9. Wang R,Zagariya A, Ibarra-Sunga O,e outros.A angiotensina II induz apoptose em células epiteliais alveolares humanas e de ratos.Am J Physiol1999;276:L885–9. Marshall RP,Gohlke P, Câmaras RC,e outros.Angiotensina II e a resposta fibroproliferativa à lesão pulmonar aguda.Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol2004;286:L156–64. Imai Y,Kuba K, Rao S,e outros.A enzima conversora de angiotensina 2 protege contra insuficiência pulmonar aguda grave.Natureza2005;436:112–6. WhiteheadTC,Zhang H, Mullen B,e outros.Efeito da ventilação mecânica na resposta de citocinas ao lipopolissacarídeo intratraqueal.Anestesiologia 2004;101: 52–8. 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Foi demonstrado que o aumento da expressão do gene RRM1 (subunidade reguladora da ribonucleotídeo redutase) reduz metástases, inibe o desenvolvimento de tumores pulmonares e prolonga a sobrevivência. Dados semelhantes foram mostrados para ERCC1 (grupo 1 de complementação cruzada de reparo por excisão). O grupo de estudo consistiu de 187 pacientes submetidos a toracotomia para ressecção de câncer de pulmão de células não pequenas em estágio 1 e que não receberam outro tratamento. A expressão de RRM1, ERCC1 e PTEN (fosfatase e homólogo de tensina) foi medida com um novo sistema totalmente automatizado e quantitativo, e os resultados genéticos comparados com os resultados clínicos. A expressão de RRM1 correlacionou-se com a expressão de ERCC1, mas não com PTEN. A taxa média de sobrevida livre de doença e global excedeu 120 meses para pacientes com alta expressão de RRM1 (escore de expressão gênica 0,40,5) em comparação com 54,5 meses de sobrevida livre de doença e 60,2 meses de sobrevida global para aqueles com baixa expressão do gene. Pacientes com coexpressão de RRM1 e ERCC1 foram divididos em quatro grupos de acordo com alta e baixa expressão das proteínas. Significativamente, dos pacientes submetidos a cirurgia de câncer de pulmão potencialmente curativa, 30% com alta expressão de ambas as proteínas tiveram um bom resultado em 10 anos. Os autores concluíram que a expressão elevada destes genes se correlacionou com um resultado favorável na doença inicial, mas aludiram que os mesmos marcadores foram reconhecidos como prevendo a resistência tumoral aos agentes de platina e à gemcitabina na doença avançada. Isto identificou duas áreas principais de gestão. Aqueles com doença ressecada em estágio inicial que podem não precisar de quimioterapia adjuvante e aqueles que provavelmente não se beneficiarão de agentes quimioterápicos convencionais no câncer avançado. Jenny Cosgrove Oficial Sênior da Câmara, Hospital Mater Infirmorum, Belfast; jenny.c@doctors.org.uk www.thoraxjnl.com Tórax: publicado pela prim eira vez com o 10.1136/thx.2006.061945 em 18 de janeiro de 2007. Baixado dehttp://tórax.bm j.com /em 18 de janeiro de 2021 por convidado. Protegido por direitos autorais.
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