microbiología en neumologia

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INTRODUCCIÓN
Las técnicas de diagnóstico microbiológico han
experimentado en los últimos años un considerable
desarrollo, esto se ha hecho especialmente patente
en el estudio de la patología pulmonar infecciosa
dada la complejidad diagnóstica que presenta:
- dificultad para obtener muestras representati-
vas del foco infeccioso
- los microorganismos implicados en el proceso
pueden ser muy diferentes
- creciente desarrollo de cepas resistentes a la
terapia antibiótica
- presencia de gérmenes comensales en las vías
respiratorias
- pacientes inmunodeprimidos con el consi-
guiente auge de la tuberculosis e infecciones
oportunistas
Ha sido, por lo tanto, necesario el desarrollo de
nuevas técnicas diagnósticas, la mejora de las ya
existentes y la puesta en marcha de técnicas ins-
trumentales que nos permitan un óptimo acceso
al foco de estudio para mejorar la calidad de la
muestra obtenida1.
La obtención de las muestras (Tabla I) puede
llevarse a cabo mediante técnicas no invasivas
(esputo, líquido pleural, sangre y orina) e invasivas
(punción transtraqueal, fibrobroncoscopia, punción
transtorácica y biopsia pulmonar).
Éstas últimas conllevan una mayor rentabilidad
diagnóstica que las no invasivas pero también un
mayor número de complicaciones por lo que deben
reservarse para pacientes graves en los que no haya-
mos podido conseguir una orientación diagnóstica
con las técnicas habituales.
TÉCNICAS DE DIAGNÓSTICO
MICROBIOLÓGICO EN NEUMOLOGÍA
1. Técnicas no invasivas
1.1 Análisis del esputo
Para que sea de utilidad la muestra obtenida
debe proceder del tracto respiratorio inferior evi-
tando la contaminación orofaríngea. 
Tanto los resultados de la sensibilidad (60-
100%),como de la especificidad (14-100%) deri-
vados de este tipo de muestra son muy variables.
En ocasiones será necesario recurrir a técnicas
de inducción de esputo con suero fisiológico para
obtener una buena muestra2.
- Tinción de GRAM: permite el examen directo del
esputo; tiene valor orientativo en el diagnóstico
de infecciones bacterianas, es una técnica rápi-
da y sencilla. Se considera que el material es
representativo si se visualizan > 10 leucocitos
PMN y< 25 células de descamación por campo.
Microbiología en Neumología
N. Avisbal Portillo, Mª V. Hidalgo Sanjuán, J.L. Velasco Garrido, M. Vidal Díaz
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- Tinción de Zhiehl-Neelsen: debe realizarse ante
sospecha de etiología tuberculosa, su rentabi-
lidad aumenta con el número de muestras reco-
gidas (por regla general tres)2,3.
Se requieren al menos 10.000 BAAR / ml para
que puedan ser visualizados poresta técnica.
No permite diferenciar M.tuberculosis de otras
micobacterias.
Es una técnica fácil y rápida de realizar.
- Tinción de auramina: permite la visión directa
del mycobacterium mediante un microscopio
de fluorescencia utilizando como colorante un
fluorocromo como la auramina, tiene una efi-
cacia similar a la tinción de Zhiehl – Neelsen
aunque su principal ventaja es su mayor rapi-
dez, por lo que su utilización está justificada en
aquellos laboratorios que realicen más de 10
exámenes microscópicos diarios.
- Blanco de calcofluor: para hongos
- Tinta china: análisis en fresco para criptococos.
- Cultivo de esputo: su rentabilidad depende de
la calidad de la muestra obtenida. Tiene una
sensibilidad entre 45-60% cuando se realiza
conjuntamente con la tinción de GRAM y un
60% de especificidad en el diagnóstico del
agente etiológico responsable de la neumonía
adquirida en la comunidad. Su utilidad es limi-
tada en el caso del neumococo3.
- Cultivo de M. tuberculosis: permite el diag-
nóstico de confirmación de la enfermedad,es
un procedimiento mucho más sensible que la
microscopía, y consigue mayor rentabilidad en
caso de muestras paucibacilares (son suficientes
10 BAAR / ml de esputo). Pueden utilizarse
tanto medios sólidos como líquidos. Los medios
sólidos son los más conocidos como el de
Lowenstein-Jensen (medio con base de huevo),
o el cultivo 7H10-7H11 de Midelbrook (semi-
sintético con base de ágar). Algunas micobac-
terias requieren suplementar los medios de cul-
tivo con factores de crecimiento especiales (san-
gre, citrato amónico, hemina…)
El tiempo de crecimiento del bacilo una vez
sembrado, oscila entre 3-6 semanas de ahí que
se hallan desarrollado sistemas de detección
más rápidos como los radiométricos (BACTEC)
que permiten determinar la actividad metabó-
lica del mycobacterium entre 15- 20 días, pre-
senta mayor sensibilidad que los cultivos tra-
dicionales así como la posibilidad de identifi-
car M. tuberculosis en 4-5 días y realizar anti-
biograna en 3-6 días2,3.
Su principal inconveniente es que el sistema
BACTEC requiere trabajar con 14 C por lo que
necesita permisos especiales para su manipu-
lación.
Se han investigado métodos de cultivo no radio-
métricos como los bifásicos (MB-Septi- Check®)
como alternativa pero presentan la desventaja
de ser más lentos que BACTEC®.
- Inmunofluorescencia directa (IFD): demuestra
la presencia de antígenos mediante anticuer-
pos específicos marcados con fluoresceína, con
el empleo de anticuerpos monoclonales ha
mejorado la especificidad de la técnica que de
por sí es elevada, la sensibilidad varía según el
tipo de muestra utilizada, siendo más alta cuan-
do se utiliza una técnica invasiva.
Es útil para la detección de L. pneumophila,
Chlamydia pneumoniae y virus respiratorios
entre otros3.
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1. No invasivas:
- esputo
- sangre
- suero 
- orina
- líquido pleural
2. Invasivas
- Punción transtraqueal
- Fibrobroncoscopia:
• Broncoaspirado
• Catéter telescopado con cepillo protegido
• Lavado broncoalveolar
• Biopsia transbronquial
• Punción transbronquial espirativa
- Punción aspiración transtorácica
- Biopsia pulmonar
Tabla I. Tipos de muestras para diagnóstico micro-
biológico en Neumología1.
1.2 Hemocultivo
De uso obligado en pacientes diagnosticados
de neumonía que requieran ingreso hospitalario.
Suele ser positivo tan sólo en un 15-25% de los
casos ya que por regla general los pacientes han
recibido terapia antibiótica previamente y las bac-
teriemias en las neumonías son transitorias. 
Los hemocultivos deben realizarse lo más pre-
cozmente posible y durante un pico febril, la can-
tidad mínima de sangre requerida es de 10cc y la
siembra debe realizarse tanto en medio aerobio
como anaerobio.
Se han desarrollado, así mismo, técnicas que
permiten la detección de micobacterias en sangre,
las más eficaces son las de lisis –centrifugación y
las radiométricas. Son más útiles en caso de pacien-
tes inmunodeprimidos.
1.3 Técnicas serologicas
Consisten en la detección de Anticuerpos espe-
cíficos en el suero del paciente.
Tienen gran valor epidemiológico, pero son
poco útiles como orientación terapeúticaya que son
técnicas de resultado tardío; se requieren dos mues-
tras, una en la fase aguda y otra en la de convale-
cencia (a los 14 -21 días), siendo necesario detec-
tar seroconversión entre una y otra.
Se considera positiva cuando el título de la fase
de convalecencia es cuatro veces superior al de
la fase aguda.
Las técnicas más utilizadas son: fijación del
complemento, inmunofluorescencia indirecta y Enzi-
moinmunoensayo (ELISA).
La técnica de fijación del complemento ha sido
la más utilizada en el serodiagnóstico de infeccio-
nes respiratorias sin embargo es poco sensible y
requiere altas concentraciones de antígenos, es una
técnica larga con resultados inespecíficos con mucha
frecuencia. 
Ha sido el diagnóstico más establecido en labo-
ratorios de referencia para el diagnóstico de neu-
monías víricas, se utiliza para el diagnóstico, con
fines epidemiológicos de gérmenes como Myco-
plasma, Legionella, Chlamydia y Coxiella.
La técnica de ELISA presenta mejor sensibili-dad y especificidad. La prueba es menos efectiva
para virus por mala reproductibilidad así como fal-
sos positivos y negativos. Su mayor utilidad radica
en el diagnóstico de Micplasma pneumoniae y
Coxiella burnetti, tanto para detectar IgG como Ig
M(2,3).
1.4 Orina: determinación de antigenuria
- Antígeno neumocócico urinario: detecta antí-
genos capsulares por técnicas de coaglutina-
ción, aglutinación con partículas de látex (LA),
radioinmunoensayo (RIA), fluorescencia direc-
ta, enzimoinmunoensayo (EIA)…
La prueba tiene una alta especificidad pero baja
sensibilidad (0-58%).
Estos inconvenientes se obvian con una técni-
ca más reciente, la inmunocromatografía de
membrana que detecta el antígeno polisacá-
rido C de membrana neumocócico, con resul-
tados disponibles en unos 15 minutos.
La técnica es cara y puede dar falsos positi-
vos en EPOC, por lo que en la actualidad es
complementaria pero no de primera línea en
el diagnóstico de la neumonía neumocócica4.
- Antígeno urinario de Legionella: Legionella es
un patógeno obligado que no coloniza la vía
aérea por lo que su aislamiento es sinónimo
de infección.
El cultivo de esputo tiene una sensibilidad entre
el 50-80% y una especificidad del 100% pero
presenta como principal inconveniente que su
máximo rendimiento no se obtiene hasta los
7-9 días, por lo que no se considera una buena
técnica para diagnóstico rápido.
Al menos el 80% de los pacientes con legio-
nellosis excretan antígenos por orina, de ellos
el 70-80% es producida por L. pneumophila
serogrupo 1. La antigenuria aparece dentro de
los 3 días desde el comienzo de los síntomas
y puede mantenerse hasta 60 días después de
su aparición.
Los técnicas más empleadas son radioinmu-
noensayo (RIA) y enzimoinmunoensayo (EIA),
ambas con una buena sensibilidad y una espe-
cificidad que se acerca al 100%, así como alto
valor predictivo positivo, sin embargo EIA no
tiene riesgo de radiación, es más barato y más
29Microbiología en Neumología
sencillo. Como principales inconvenientes están
diseñados sólo para la detección del serogru-
po 1 de L. pneumophila y la antigenuria per-
sistente puede dificultar el diagnóstico de las
recurrencias.
En los últimos años se ha introducido un test
de inmunocromatografía de membrana para
el serotipo 1, el test es rápido y sencillo pero
parece tener una menor sensibilidad que el
EIA4,5.
1.5 Técnicas de amplificación genética
Todos los microorganismos poseen en sus áci-
dos nucleicos secuencias de nucleótidos propias
que les permiten distinguirlos de los demás, la detec-
ción de estas secuencias de DNA o RNA específi-
cas permite realizar el diagnóstico de una enfer-
medad infecciosa.
- Sondas genéticas: se comercializaron en la déca-
da de los 80, consisten en un fragmento de ácido
nucleico marcado (con isótopos radiactivos o sus-
tratos cromógenos) que poseee una secuencia
de bases complementaria a la del genoma del
microorganismo. Presentan muy buena especi-
ficidad pero baja sensibilidad 
Se han utilizado para identificación de micobac-
terias, L: pneumophila, virus…
En la actualidad han sido superadas por otras téc-
nicas.
- Reacción en cadena de la polimerasa (PCR)6: Per-
mite sintetizar por vía enzimática millones de copias
de un fragmento específico de DNA. El método
consta de 3 etapas: extracción del DNA, amplifi-
cación y análisis del producto final. En la primera
etapa mediante métodos preferentemente enzi-
máticos selibera el ADN que contienen todas las
células presentes en la muestra, posteriormente
se incorpora a la muestra una enzima, la polime-
rasa, y unos fragmentos de DNA denominados
iniciadores o primers que son específicos y com-
plementarios de un segmento de DNA del ger-
men a estudio (DNA diana) y se instauran unos
ciclos térmicos predefinidos. En cada ciclo se pro-
duce la separación de las cadenas de DNA, el aco-
plamiento con los iniciadores, si existe DNA diana,
y la duplicación de las cadenas. Unicamente las
cadenas de DNA presentes en la muestra y com-
plementarias a los iniciadores sufrirán el proceso
de amplificación. El número final de cadenas de
DNA se incrementará exponencialmente en cada
ciclo en función al número de ciclos realizados.
La técnica es altamente sensible y suministra resul-
tados de forma muy precoz, en tan sólo unas
horas, pero presenta falsos positivos en pacien-
tes no infectados sino colonizados y como resul-
tado de contaminación de la muestra durante su
manipulación.
Las muestras para estudio pueden obtenerse del
esputo, lo que conlleva un alto riesgo de conta-
minación por flora saprofita, por lo que se consi-
deran más útiles las muestras sanguíneas y las
respiratorias obtenidas por técnicas invasivas.
Se han realizando estudios para valorar su efi-
cacia en el diagnóstico de la neumonía adqui-
rida en la comunidad tanto neumocócica como
no neumocócica, con una sensibilidad del 73%
para las neumonías neumocócicas bacteriémi-
cas, frente al 48% para las no bacteriémicas6.
Las técnicas de amplificación genética más des-
arrolladas en los últimos años han sido las desti-
nadas a detección de Mycobacterium tubercu-
losis7. 
Entre ellas destacan el sistema Amplicor TB R de
Roche con una sensibilidad, especificidad y valor
predictivo positivo y negativo de 97,6%, 100%,
100% y 90,9% respectivamente para muestras
con cultivo positivo.
Posteriormente se han creado técnicas de segun-
da generación como el Gen Probe 
Amplified MTDR que utiliza la amplificación del
RNA ribosomal que ha mejorado su sensibilidad
con respecto al cultivo manteniendo una exce-
lente especificidad para el diagnóstico de M.
tuberculosis; no requiere instrumental muy sofis-
ticado y puede llevarse a cabo de rutina en la
mayoría de los laboratorios clínicos, permitien-
do la realización de 50 muestras en 5 horas8,9.
2. Técnicas invasivas
Están indicadas en situaciones de gravedad o
en ausencia de respuesta a tratamiento empírico
correcto.
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2.1 Punción transtraqueal: 
Es una técnica que se encuentra en declive en
la actualidad, tiene dependiendo de las series una
sensibilidad entre 60-100% y una especificidad del
14 -100%. Esta especificidad es menor en pacien-
tes EPOC o en situaciones que predisponen a la
aspiración.
Sus principales contraindicaciones son: diáte-
sis hemorrágica, tos incontrolable y falta de cola-
boración.
Entre sus principales complicaciones cabe des-
tacar la hemoptisis grave y el enfisema subcutáneo.
2.2 Técnicas fibrobroncoscópicas
- Broncoaspirado (BAS): una de sus principales
indicaciones es el diagnóstico de tuberculosis
pulmonar. En el diagnóstico de infecciones bac-
terianas su inconveniente más importante es
la contaminación con flora de la vía aérea supe-
rior.
- Catéter telescopado de doble luz con cepillo
protegido: su principal indicación es el diag-
nóstico de las neumonías en pacientes some-
tidos a ventilación mecánica y de las neumo-
nías comunitarias graves en pacientes con fac-
tores de riesgo. La técnica tiene escasas com-
plicaciones y contraindicaciones, pero su prin-
cipal desventaja es que explora un territorio pul-
monar muy pequeño.
El punto de corte establecido en cultivos cuan-
titativos es > 103 ufc/ml.
- Lavado broncoalveolar (LBA): muy útil para el
diagnóstico de infecciones oportunistas en
inmunodeprimidos, a pesar de su baja espe-
cificidad tiene la ventaja de que explora un terri-
torio pulmonar amplio. El punto de corte en
cultivos cuantitativos para distinguir entre infec-
ción y colonización es de 104ufc/ml. 
La administración previa de antibióticos invali-
da tanto este resultado como el del catéter
telescopado.
La realización de LBA protegido mejora tanto la
sensibilidad como la especificidad de la técnica.
La sensibilidad de las pruebas endoscópicas
oscila, según el procedimientoempleado 
Entre 55-95% y la especificidad del 90%. 
2.3 Técnicas percutáneas: 
- Punción transtorácica espirativa (PTA): en la
actualidad se realiza con aguja ultrafina de cali-
bre 25. Tiene una sensibilidad del 50-60%,que
aumenta si el paciente no ha sido previamen-
te tratado con antibióticos, y una especificidad
entre el 90-100%.
Es una técnica muy útil en pacientes neutro-
pénicos, receptores de transplantes e infecta-
dos por VIH.
Sus complicaciones más frecuentes son la
hemoptisis y el neumotórax. 
Son contraindicaciones el enfisema bulloso y
la ventilación mecánica.
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