informe de biuret ultimo

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Determinación De Proteínas En Alimentos Por Espectofometria Usando El Reactivo De Biuret
2019
Autor (s): 
Ramiro Amari
Alexander Enríquez
Keyla Yela 
Gianella Ochoa
Silvia Torres
Edwin Armijos 
Andrés Castillo
TÍTULO
Determinación de proteínas en alimentos por espectrofotometría usando el reactivo de Biuret. 
OBJETIVOS
· Determinar espectrofotométricamente la concentración de proteína en diferentes muestras de alimentos.
· Observar cualitativamente y cuantificar el contenido de proteínas mediante la prueba de BIURET
· Construir una curva de calibración para la cuantificación de proteína, en cada muestra de alimentos. 
· Concluir a partir del coeficiente de regresión R2, si los datos obtenidos son confiables. 
MARCO TEÓRICO
Existen diferentes métodos para la cuantificación de proteínas. Muchos de estos métodos se basan en: a) la propiedad intrínseca de las proteínas para absorber luz, b) para la formación de derivados químicos, ó c) la capacidad que tienen las proteínas de formar complejos. (Teijón Rivera, 2005)
Entre los métodos que se basan en la formación de complejos colorimétricos entre las proteínas y reactivos específicos se encuentran el método de Biuret, el principio del método es la determinación de la proteína de una muestra de alimento mediante la formación de un complejo coloreado (violeta) entre el Cu2+ y los grupos NH de los enlaces peptídicos en medio básico. 1Cu2+ se acompleja con 4 NH. La intensidad de coloración es directamente proporcional a la cantidad de proteínas (enlaces peptídicos). La cual se determina la absorbancia del compuesto coloreado mediante espectrofotometría UV a 545 nm de longitud de onda. (Lopez, 2003)
Se llama desnaturalización de las proteínas a la pérdida de las estructuras de orden superior (secundaria, terciaria y cuaternaria), quedando la cadena polipeptídica reducida a un polímero sin ninguna estructura tridimensional fija. (Villaverde, 2007)
Los agentes que provocan la desnaturalización de una proteína se llaman agentes desnaturalizantes. Se distinguen agentes físicos (calor) y químicos (detergentes, disolventes orgánicos, ácidos, bases, sales). (Mahe S, 1996)
Como en algunos casos el fenómeno de la desnaturalización es reversible, es posible precipitar proteínas de manera selectiva mediante cambios en la polaridad del disolvente, la fuerza iónica, el pH, la temperatura entre otros.
Cualquier factor que modifique la interacción de la proteína con el disolvente disminuirá su estabilidad en disolución y provocará la precipitación. (Schwarzer & P, 2005)
Si la precipitación se realiza por la acción de ácidos, se le llama caseína ácida. A este pH (punto isoeléctrico) las caseínas se encuentran en su punto de menor solubilidad debido a la reducción de las repulsiones intermoleculares, por lo que precipitan (coloquialmente, se dice que coagulan). (Park YW, 2007)
La caseína (del latín caseus, "queso") es una fosfoproteína (un tipo de heteroproteína) presente en la leche y en algunos de sus derivados (productos fermentados como el yogur o el queso). En la leche, se encuentra en la fase soluble asociada al calcio (fosfato de calcio) en un complejo que se ha denominado caseinógeno. Las proteínas englobadas en lo que se denomina caseína tienen una característica común: precipitan cuando se acidifica la leche. Por ello, a la caseína también se le suele denominar proteína insoluble de la leche. (J., 1991)
MEDIDAS DE SEGURIDAD
	NOMBRE DEL REACTIVO:
	ACIDO CLORHIDRICO LIQUIDO
	FÓRMULA:
	HCl
	DESCRIPCIÓN:
	Líquido incoloro o ligeramente amarillo. Corrosivo e higroscópico. Puede ocasionar severa irritación al tracto respiratorio o digestivo, con posibles quemaduras. Puede ser nocivo si se ingiere. Produce efectos fetales de acuerdo con estudios con animales. Puede ser fatal si se ingiere o se inhala. Puede ser sensibilizador.
	PRECAUCION:
	Se trabaja con este producto dentro de la Campana de Gases del Laboratorio. 
	NOMBRE DEL REACTIVO:
	SULFATO DE COBRE PENTAHIDRATADO
	FÓRMULA:
	CuSO4.5H2O
	DESCRIPCIÓN:
	Este producto es muy nocivo para el ambiente.
	PRECAUCION:
	Se trabaja con este producto dentro de la Campana de Gases del Laboratorio.
	NOMBRE DEL REACTIVO:
	YODURO DE POTASIO
	FÓRMULA:
	KI
	DESCRIPCIÓN:
	Puede causar irritación en el tracto respiratorio. Los síntomas pueden incluir tos y dificultad para respirar.
	PRECAUCION:
	Trabajar normalmente en el lugar del laboratorio establecido. 
	NOMBRE DEL REACTIVO:
	HIDRÓXIDO DE SODIO
	FÓRMULA:
	NaOH
	DESCRIPCIÓN:
	Este compuesto no es inflamable, sin embargo, puede provocar fuego si se encuentra en contacto con materiales combustibles. Por otra parte, se generan gases inflamables al ponerse en contacto con algunos metales. Es soluble en agua generando calor.
	PRECAUCION:
	Trabajar normalmente en el lugar del laboratorio establecido.
	NOMBRE DEL REACTVIO:
	NaEDTA
	FÓRMULA:
	((HOCOCH2)2NCH2)2
	DESCRIPCIÓN:
	Causa irritación en los ojos, corrosivo al aluminio, contiene cantidades pequeñas de impurezas
	PRECAUCION:
	Trabajar normalmente en el lugar del laboratorio establecido.
	NOMBRE DEL REACTIVO:
	BIURET
	FÓRMULA:
	C₂H₅N₃O₂
	DESCRIPCIÓN:
	Corrosión o irritación cutáneas
	PRECAUCION:
	Trabajar normalmente en el lugar del laboratorio establecido.
MATERIALES
· 5 Vasos de precipitado de 50 mL. 
· 1 balón de aforo de 25 mL 
· 3 Embudos. 
· 1 pipeta de 5 mL 
· 3 Pipetas de 1 mL. 
· 3 papel filtro 
· 1 Pera de succión de tres vías. 
· 5 tubos de ensayo 
· 1 Gradilla para tubos 
· 1 Piseta 
· 1 Espátula 
· 1 varilla de agitación 
· 1 probeta de 25 ml
Muestras:
· Leche cruda 
· Leche pasteurizada 
· Lecha de soya 
· Clara de huevo 
EQUIPOS
· Espectrofotómetro UV. 
· Balanza analítica
· Centrifugadora
REACTIVOS
· Sulfato Cúprico CuSO4.5H2O. 
· Ácido Etilendiamina tetraacético di sódico NaEDTA 
· Hidróxido de Sodio 
· Yoduro de potasio 
· Ácido clorhídrico concentrado. 
· Agua destilada
DESCRIPCIÓN DEL PROCEDIMIENTO
Reactivo de Biuret: Disolver 3,8 g de CuSO4.5H2O y 6,7 g NaEDTA en 700 ml de H2O. Mientras se agita añadir 200 ml de NaOH 5N y luego 1 g de K I como estabilizante. Esto para preparar 1000ml del reactivo. Se mezclan ambas soluciones y se ponen en un matraz cubierto para evitar la acción de la luz. Se guarda el reactivo en un frasco color ámbar. (Lopez, 2003)
Nosotros preparamos 250 ml de reactivo para el desarrollo de este proyecto y los cálculos son los siguientes: 
Sulfato de cobre penta-hidratado:
Sal di hidratada de Sodio
Yoduro de Potasio: 
Para la preparación de la solución de Hidróxido de Sodio 5N:
Primeramente, iniciamos con la muestra de leche pasteurizada 2 ml y colocamos 1 ml del reactivo de Biuret la coloración que dio fue morado, pero tenía sólidos en suspensión y esto no podía leerse en el espectrofotómetro, diluimos 1 ml de la leche para diluir en un balón de aforo de 100 ml pero al añadir 1 ml del reactivo de Biuret la coloración fue azulada, probamos diluyendo 2,5 ml de la leche en un balón de aforo de 100 y colocando el reactivo de Biuret nos dio azulado un levemente más fuerte que la anterior, pero con agua destilada nos dio un color verdoso, como estándar al sulfato de amonio, tomando 1 ml de este reactivo y se aforo en un balón de 100 ml colocamos 1 ml de este estándar pero no sirvió debido que el sulfato de amonio no se utiliza como estándar . 
Después de consultar en bibliografía, se llevó tres diferentes tipos de leches: cruda, pasteurizada y de soya. Lo primero que se realizo fue verter las leches, cada una en un vaso de precipitación de 100 ml y se filtraron con un embudo de vidrio un cantidad aproximadamente de 50 ml de cada muestra. 
Se cogió una muestra de leche, en este caso se cogió 5ml de leche pasteurizada en 4 tubos de ensayo y se colocó 2ml de HCl, para posteriormente colocarlos en la maquina centrifuga. Los pesos de los tubos deben ser iguales para que así la maquina funcione de manera estable. La función de la maquina centrifuga es acelerar la fuerza de la gravedad, donde la parte solida quedara al fondo
y la parte liquida (las grasas, proteínas) quedaran arriba, de esta manera sabremos que se separaron, caso contrario se repite el proceso. En nuestro caso se realizaron cuatro veces para así tener más sólidos. Cada centrifugada se realizó en tiempo de 15 min. Cada vez se presionaba los sólidos para enviarlos al fondo y se removía el líquido para conservar la parte sólida, pero no se obtuvo el precipitado a pesar que se hicieron cuatro repeticiones. 
Se cogió con 1 ml de leche cruda y un 1ml de leche y se colocaron en un baño María durante 5 minutos a 70°C, sin embargo, se los tuvo que remover debido a que el color morado (el color ideal) estaba cambiando a un color café verdoso. Se los hizo enfriar para ver si regresaban a su color original, sin embargo, no hubo ningún cambio y del desecho debido que se desnaturalizaron, por lo que perdieron las proteínas. Realizamos el mismo procedimiento, pero esta vez se usó leche de soya sin calentar conservando así el color morado y se la diluyo para así tener un color más claro, luego se realizó el proceso de filtración con ella, sin embargo, no se obtuvo el color deseado ya que aún estaba oscura para usarla en el espectrofotómetro e iba a salir una absorbancia muy elevada y no iba a ser la real. 
Se prepararon dos blancos, donde se colocó 1ml de agua destilada y 2ml de Biuret en ambos y se colocó a uno de ellos en el baño María durante 5 minutos, El cual se decidió que el blanco calentado ira al espectrofotómetro por su color más claro.
Debido a que la intensidad de las muestras no eran las apropiadas, en un balón de aforo de 100 ml se cogió leche cruda (como muestra), se aforo y se cogió 1 ml de esta disolución, junto a 2 ml de biuret, donde se lo agito y se observó un color azul claro. Este proceso se lo realizo nuevamente, esta vez con leche pasteurizada y se realizó el proceso dos veces, la primera muestra se la calentó y la segunda sin calentar. Sin embargo, debido a que todos salieron con color azul claro, lo que representa que no tienen proteínas, se las desecho posteriormente.
Debido a que no hubo los resultados deseados, se usó la clara de un huevo, la cual se la coloco en una capsula de porcelana, se le añadió reactivo de Biuret la cual hizo que cambiara de color a morado, la razón fue para comprobar si existe proteína y si el reactivo de Biuret estaba bien preparado y se la colocó en 5 tubos de ensayo con diferentes pesos. El proceso de pesar, se lo realizo en un vaso de precipitación de 100 ml junto con un tubo de ensayo. Los pesos deben ser menores a uno. 
En cada tubo de ensayo se les coloco agua destilada para tener todos, un volumen de 2 ml y se les coloco 2 ml de reactivo de Biuret a cada uno y se los agito. Posteriormente se usó el espectrofotómetro para determinar la absorbancia. 
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
Los pesos de las muestras de la clara de huevo fueron los siguientes: 
	MUESTRAS
	PESO
	Tubo de ensayo # 1
	0,06 gr
	Tubo de ensayo # 2
	O,16 gr
	Tubo de ensayo # 3
	0,37 gr
	Tubo de ensayo # 4
	0,56 gr
	Tubo de ensayo # 5
	0,88 gr
A estas muestras se les coloco reactivo de biuret y se las leyó en el espectrofotómetro y los resultados fueron:
	MUESTRAS
	ABSORBANCIA
	Blanco
	0,380
	Muestra # 1
	0,492
	Muestra # 2
	0,538 
	Muestra # 3
	0,612 
	Muestra # 4
	0,596 
	Muestra # 5
	0,630 
Descartamos los dos últimos datos debido que la curva de calibración debe representar un carácter lineal, esto se debe que las muestras al ser leídas en el espectrofotómetro tenían sólidos en suspensión y las absorbancias son erróneas por ese motivo se los descarta. 
Construimos la curva de calibración, mediante el método de mínimos cuadrados:
	
	Concentración (g/ml) Xi 
	Absorbancia 
	Abs corregida Yi 
	Xi^2
	Yi^2
	Xi*Yi
	
	0,03
	0,492
	0,112
	0,0009
	0,0125
	0,0034
	
	0,08
	0,538
	0,158
	0,0064
	0,0250
	0,0126
	
	0,185
	0,612
	0,232
	0,0342
	0,0538
	0,0429
	Sumatoria 
	0,295
	1,642
	0,502
	0,0415
	0,0913
	0,0589
	Promedio 
	0,0983
	0,5473
	0,1673
	0,0138
	0,0304
	0,0196
Pendiente 
Intercepto:
Desviación estándar de la regresión:
Desviación estándar de la pendiente:
Desviación estándar del intercepto:
Desviación estándar de los resultados obtenidos de la curva
La desviación vertical de cada punto con respecto a la línea recta 
0,022
La suma total de los cuadrados :
	
El coeficiente de determinación:
Utilizando la herramienta de Excel se pudo comprobar que los cálculos realizados fueron correctos y se cumple con un r^2 de 0,99. 
Discusión de resultados 
En el desarrollo de este proyecto, utilizamos la leche en diferentes presentaciones como lo es: cruda, pasteurizada y soya, debido a su contenido de proteínas, empleando el reactivo de Biuret en estas muestras, no se obtuvo el color morado deseado, debido que la leche no tiene un alto contenido de proteínas, además el estándar utilizado no fue el apropiado para que reaccione con la proteína de las muestras. Los colores en estas muestras fueron azul y verdosos, pero los colores debían ser morados, Se utilizó la clara de huevo debido que tiene alto contenido de proteínas, comparado con la leche, y a su vez se pudo comprobar si el reactivo de Biuret está bien preparado, entonces la intensidad de color fue morada. Con la muestra de leche pasteurizada colocándole dos 2ml de HCl, se hizo la desnaturalización de la caseína, utilizamos el centrifugador para acelerar la fuerza de gravitación y la caseína, quede en el fondo o se precipite, pero no tuvimos resultado en las repeticiones que hicimos. En la curva de calibración tuvimos que descartar datos debido de las absorbancias son incorrectas y no representan carácter lineal. 
EXPEACTATIVAS A REALIZARSE 
· Determinar de una manera cuantitativa las propiedades de los distintos alimentos, utilizando un estándar adecuado para dicha práctica
· Investigar cual debería ser el estándar propio para los alimentos a utilizar, ya que este es un factor de gran importancia al momento de realizar la practica propuesta
· Para que puedan ser leídas las diferentes muestras en el espectrofotómetro utilizaremos el método más adecuado, el cual puede ser la filtración o de sedimentación, así nuestra lectura de curva será más factible y correcta
CONCLUSIONES
En nuestro proyecto, se pudo determinar cualitativamente el contenido de proteínas en las diferentes muestras de alimentos que hemos tomado, construimos la curva de calibración para comprobar la relación lineal de los resultados, se puede concluir que el coeficiente de regresión de nuestro ensayo fue 0,99 donde los datos obtenidos fueron confiables. 
RECOMENDACIONES
· Usar muestras de alimentos con alto contenido de proteína. 
Preservar el reactivo de Biuret en un frasco ámbar para evitar la acción de la luz y en un lugar fresco. 
· Filtrar las muestras para que no exista sólidos en suspensión, al momento de leer en el espectrofotómetro. 
· Consultar la longitud de onda para leer la muestra. 	
BIBLIOGRAFIA
J., A. (1991). Ciencia y tecnología de la leche. Zaragoza.: Editorial Acribia, S.A. .
Lopez, F. (2003). Principios de Química. Editorial Médica Panamericana.
Mahe S, R. N. (1996). Gastrojejunal kinetics and the digestion of 15Nbeta-lactoglobulin and casein in humans: the influence of the nature and quantity of the protein. USA.
Park YW, J. M. (2007). Physico-chemical characteristics of goat and sheep milk. England.
Schwarzer, D., & P, C. (2005). Protein semisynthesis and expressed protein ligation: chasing a protein's tail. USA.
Teijón Rivera, J. M. ( 2005). Fundamentos de bioquímica estructura. Mexico: Alfaomega. p. 72.
Villaverde, C. (2007). Fundamentos de bioquímica metabólica. Mexico.
ANEXOS
I PARTE (Muestras de leche)
 
II PARTE (Clara de huevo)
 
Curva de Calibracion 
0.03	0.08	0.185	0.11199999999999999	0.15800000000000003	0.23199999999999998	Concentracion g/ml 
Absorbancia 
	Práctica de Análisis Químico e Instrumental
	8