Unidad 3 Coloraciones

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OBSERVACIÓN MICROSCÓPICA DE LOS MICROORGANISMOS
Objetivos 
*Reconocer las características de las bacterias en estudio en base a las distintas coloraciones. 
 *Interpretar las observaciones al microscopio 
Existe una gran dificultad para observar con el microscopio óptico a los microorganismos en su estado natural, por el tamaño y por la falta de contraste entre la célula y el medio que la rodea. La utilización de colorantes aumenta el contraste entre la bacteria y el medio que la rodea, beneficiando la observación microscópica de bacterias y/o distintos componentes estructurales como, entre otros: flagelos, esporas, cápsulas, paredes celulares. 
Conceptos de microscopía para repasar
Poder de resolución del microscopio óptico: es la capacidad que posee un objetivo para distinguir la distancia mínima entre dos puntos del objeto para que se puedan visualizar como dos puntos separados. 
El poder de resolución en un microscopio óptico es de 0.2 µm mientras que el del ojo humano es de aproximadamente 0.2 mm, por lo que se requiere de una amplificación entre 1000-1400x para poder observar bacterias. 
Para aprovechar esta ventaja de los microscopios, se han desarrollado técnicas tintoriales que destacan las características morfológicas de los microorganismos.
Principales colorantes utilizados en bacteriología
Los colorantes utilizados en general son derivados de la anilina. Los que generalmente se utilizan en un laboratorio microbiológico son: 
· Los colorantes básicos (cationes): son moléculas cargadas positivamente que se combinan con los constituyentes celulares cargados negativamente, tales como los ácidos nucleicos y los polisacáridos ácidos.
· Los colorantes ácidos (aniones): son moléculas cargadas negativamente que se combinan con los constituyentes celulares cargados positivamente, por ejemplo: proteínas. 
Funciones de los colorantes
1. Permiten hacer visibles a organismos microscópicos y transparentes.
2. Revelan su forma, tamaño y agrupaciones. 
3. Permiten observar estructuras internas y externas de las células.
4. Producen reacciones químicas específicas. 
Aumento del poder colorante
Intensificantes 
La reacción de coloración puede hacerse más rápida e intensa con el uso de intensificantes, como por ejemplo el oxalato de amonio utilizado en la coloración de Gram, que intensifica al cristal violeta.
Mordientes
Hace más sólida la unión entre el colorante y el sustrato a teñir. Por ejemplo el iodo (Lugol) en la tinción de Gram, el ácido tánico para la coloración de flagelos y pared celular. 
También el calor es un mordiente físico, se utiliza en la coloración de Ziehl-Neelsen.
 
OBSERVACIÓN MICROSCÓPICA DE MICROORGANISMOS EN FRESCO
 Consiste en examinar el material en estudio sin ningún artificio de fijación o coloración, observándose los microorganismos en su estado natural, vivos.
Técnica utilizada: entre porta y cubreobjetos
Finalidad: la observación en fresco, se realiza para la observación de movilidad microbiana. No obstante podemos obtener datos sobre morfología, agrupaciones y densidad microbiana. 
OBSERVACIÓN ENTRE PORTA Y CUBREOBJETOS (¡!)
Técnica
· Se homogeniza el cultivo, se esteriliza el ansa, se enfría al abrigo de la llama.
· Se toma una gota de cultivo.
· Se deposita la gota, sobre un portaobjetos limpio y desengrasado.
· Se esteriliza el ansa. 
· Se coloca el cubreobjetos, apoyándolo sobre el porta en un ángulo de 45º, dejándolo caer suavemente sobre la gota. 
Inconvenientes:
- La observación debe realizarse inmediatamente luego de prepararla, pues el líquido de la suspensión se evapora.
- Pueden originarse corrientes de líquido por capilaridad, dificultando la observación.
Nota: al observar, no confundir la movilidad microbiana con el movimiento Browniano, ni el movimiento en masa. 
 
Para observar el preparado
· Utilizar objetivos secos y el condensador bajo. 
· Obtener el foco del preparado con el objetivo de 10X y pasar luego al objetivo de 45X. 
COLORACIÓN VITAL
Es una variación de la técnica entre porta y cubreobjetos: consiste en agregar una gota de un colorante vital a la gota de la suspensión microbiana. 
Colorantes vitales: azul de metileno (1:10.000), verde Jano, rojo neutro, etc. Estos colorantes, teñirán ligeramente a los microorganismos, por concentrarse sobre el soma de los mismos, pudiéndose observar la morfología, agrupaciones y movilidad.
Pasos a seguir para realizar una coloración 
En la mayoría de las técnicas de tinción, antes de aplicar los colorantes, se realizan tres pasos:
1. Extendido: En el centro del portaobjetos, limpio y desengrasado, se marca un círculo con lápiz demográfico. Se invierte el portaobjetos y se deposita con un ansa una gota del material, extendiéndolo en capa delgada y uniforme. Si el material proviene de un cultivo sólido, se suspende una colonia en una gota de agua o solución salina estéril, previamente colocada sobre el portaobjetos, y se hace el extendido de la gota.
2. Secado: Se toma el portaobjetos con el extendido y se lo sostiene por encima de la llama del mechero a unos 20 cm. hasta el secado completo de la preparación.
3. Fijación: Se busca que los microorganismos queden adheridos al portaobjetos y no sean arrastrados con el lavado. Se pasa el preparado directamente por la zona azul de la llama del mechero Bunsen 4 veces. La fijación puede ser 
a. Física: calor
b. Química: por medio de alcoholes. 
La fijación ocurre por la coagulación de las proteínas bacterianas sobre el portaobjetos. 
 
COLORACIONES SIMPLES
Se emplea un solo colorante, como el azul de metileno, fucsina básica (1:10), tinta china.
Finalidad: observar morfología y agrupaciones bacterianas.
Técnica ES FALSO:
1. Extender 
2. Secar
3. Fijar
4. Aplicar azul de metileno (u otro colorante)
5. Lavar
6. Secar y 
7. Observar con objetivo de inmersión 
 
COLORACIONES COMPUESTAS 
Se utiliza más de un colorante. Se clasifican en:
· Diferenciales: GRAM y Ziehl-Neelsen o ácidoalcohol-resistentes (AAR).
· Especiales: 
· Wirtz: Esporas
· Leifson: Flagelos
· Anthony o Tinta china (por tinción negativa): Cápsula
· Pared Celular:
· Membrana:
Las primeras dos se realizan en tres pasos:
1- Aplicación del colorante primario
2- Mordiente y decoloración
3- Aplicación del colorante de contraste.
 COLORACIÓN DE GRAM
Gram descubrió que las bacterias se podían dividir en dos grandes grupos: el de las Gram positivas y el de las Gram negativas. Esta separación indica diferencias fundamentales de la pared celular de las bacterias.
Existen diversas teorías que tratan de explicar la reacción a la coloración:
Teoría química: El cristal violeta más el iodo de la solución de Lugol con proteínas de la célula, formarían un complejo de unión a las proteínas en las bacterias Gram positivas.
Teoría del ribonucleato de magnesio: El ribonucleato de Magnesio, proteína específica de la célula, determina la Gram positividad, puesto que las bacterias Gram negativas carecen de ribonucleto de Mg.
Punto isoeléctrico: En la zona isoeléctrica característica de cada especie bacteriana, es muy escasa la tendencia a retener cualquier colorante. Las bacterias Gram positivas tienen un pI ligeramente inferior al de las Gram negativas. El cristal violeta, utilizado en la tinción de Gram, está solubilizado en oxalato de amonio, llevando la solución (cristal violeta-oxalato de amonio) a pH 7, por lo tanto es mayor la retención del colorante en las Gram positivas que en las Gram negativas.
Teoría de la permeabilidad: Si recordamos la constitución de la pared celular (PC) de las bacterias, las grampositivas poseen una PC gruesa, constituidas el 80%-90% por peptidoglicano. En cambio, la PC de las gramnegativas, es más delgada, donde un 10% - 20% es peptidoglicano rodeado por una membrana externa compuesta de fosfolípidos, lipopolisacáridos y lipoproteínas. 
Estas teorías fundamentan la coloración de Gram; nosotros trabajaremos con la técnica de Gram modificada por Hucker. 
COLORACIÓN GRAM MODIFICADA POR HUCKER (¡!)
Técnica
E-S-F
4- Cristal violeta: 1 minuto (coloranteprimario)
5- Lavar
6- Lugol: 1 minuto (mordiente)
7- Lavar 
8- Alcohol: 20 segundos (decoloración)
9- Lavar 
10- Safranina. 1 minuto (colorante de contraste) 
11- Lavar, secar y observar con objetivo de inmersión. 
El tiempo de decoloración es el paso más importante de la coloración, pues arrastra o no el colorante primario.
Resultado 
Las bacterias Gram positivas toman el colorante primario, el cristal violeta y aparecen teñidas de violeta, las Gram negativas toman el colorante de contraste, la safranina y aparecen de color rosado. 
Algunas bacterias pierden la afinidad tintorial con el tiempo, otras pueden ser gramvariables, como ocurre en el género Listeria. 
COLORACIÓN DE ZIEHL Y NEELSEN (AAR) (¡!)
Fundamento
Algunas bacterias se caracterizan por contener alta concentración de lípidos (hasta el 40% de la materia seca). El que se encuentra con mayor proporción es el ácido micólico, que les confiere la propiedad de resistir la decoloración con alcohol-ácido. Esto sería porque la fucsina fenicada (colorante primario) es más soluble en los lípidos de la pared bacteriana que en el alcohol ácido.
La Flia. Mycobacteriaceae son un ejemplo de bacterias AAR.
Coloración de Ziehl - Neelsen
Técnica
E-S-F
4- Fucsina fenicada: 10 minutos
5- Aplicar calor (mordiente físico) hasta que la fucsina desprenda vapores blancos. 
6- Lavar
7-.Decolorar (alcohol-ácido clorhídrico)
8- Lavar
9- Azul de metileno. 3 minutos
10-Lavar, secar y observar.
Esta coloración presenta dos mordientes: uno físico (el calor) y otro químico (el (acido fénico incluido en la fucsina)
Resultado
Las bacterias AAR se tiñen de rojo (fucsina), en cambio, las bacterias no AAR, se decoloran y toman el colorante de contraste, azul de metileno, apareciendo teñidas de azul.
COLORACIONES ESPECIALES 
Son las que nos permiten visualizar determinadas estructuras de las bacterias: cápsulas, esporas, pared celular, flagelos, membrana celular. 
 
COLORACIÓN DE ESPORAS
Por su estructura y composición química, son difíciles de teñir. 
Técnica de Wirtz (¡!) (modificada por Schaeffer y Fulton) 
E-S-F 
4. Verde de Malaquita, 5 minutos 
5. Calor hasta desprendimiento de vapores 
6. Lavar 
7. Safranina acuosa al 0,05%, 1 minuto 
8. Lavar, secar y observar. 
Resultado: Las esporas se observan teñidas de color verde y la membrana externa rosada. 
COLORACIÓN DE CÁPSULAS 
 Técnica de Anthony (modificada por Hiss)
Las cápsulas son frágiles y no se tiñen con métodos habituales 
E-S 
3- NO FIJAR (se destruye la cápsula por calor) 
4- Cristal violeta acuoso. 2 minutos 
5- Lavar con sulfato de cobre 
6- Secar y observar
Resultado 
Las bacterias se observan de color violeta y las cápsulas de color celeste pálido.
Otras coloraciones para observar cápsulas, pueden ser: Giemsa, Jhone, Hiss.
La Tinción simple-negativa, se logra mediante una mezcla de tinta china con el cultivo bacteriano. 
Técnica 
1) Colocar una gota de tinta china con el ansa en el centro del
portaobjetos. 
2) Seleccionar una colonia 
3) Disolver en la gota de tinta china
4) Colocar un cubreobjetos
5) Observar con objetivo seco 
COLORACIÓN DE FLAGELOS 
Técnica de Leifson
Se deben emplear cultivos de 18 hs. 
La fucsina precipita alrededor de los flagelos al evaporarse el alcohol. 
 
Coloración de membrana citoplasmática 
Se pueden utilizar distintas tinciones, como: Giemsa, solución iodoiodurada, etc.
Coloración de pared celular 
Hay una tinción, también se puede realizar una plasmólisis y luego colorearla.
Coloración de núcleo 
Se pueden teñir con la tinción de Feulgen, es específica para ADN.
Tincion de rickettsias 
Son Gram (-), Giemsa, Macchiavello, Castañeda.
Tinción de micoplasmas 
Son Gram (-), Giemsa.
 
OBSERVACIÓN MICROSCÓPICA DE HONGOS
Observación entre porta y cubreobjetos 
Se realizan preparaciones directas de las muestras en fresco con o sin líquidos de montaje y clarificación. En los montajes en fresco, la adición de KOH al 40% y dimetil-sulfóxido (DMSO) permiten la clarificación de la muestra, mientras que la adición de glicerol, mejora la conservación de las estructuras fúngicas.
Observación microscópica se realiza enfocando el preparado con objetivo seco 10X seguido con el de 40X; si es necesario, con aceite de inmersión. 
 Tinción simple-negativa: se logra mediante una mezcla de tinta china con el cultivo de hongos (Criptococcus neoformans)
Con cinta adhesiva: se coloca sobre la colonia un trozo de cinta adhesiva transparente, ejerciendo cierta presión, se retira, se adhiere a un porta y se observa.
Tinciones de Hongos
Los hongos y levaduras son Gram positivos, se emplean también colorantes como el azul de algodón, azul de lactofenol, o azul de metileno alcalino para observar estructuras internas.
Tinción con Azul de algodón o azul de lactofenol.
El azul de lactofenol tiene tres características que lo hacen especial para observar las estructuras internas de los hongos obtenidos en los cultivos por aislamiento.
· El fenol inactiva las enzimas líticas de la célula e impide que ésta se rompa; de igual forma, destruye las bacterias acompañantes. Actúa además como mordiente cuando se usa en combinación con colorantes. 
· El ácido láctico conserva las estructuras fúngicas al crear una película protectora, provocado por un cambio de gradiente osmótico entre el interior y el exterior de dicha estructura. 
· El azul de algodón tiñe el citoplasma y la quitina presente en las células fúngicas, mientras que el glicerol mantiene húmeda la preparación. 
· Una vez preparado el colorante, se debe colocar la muestra microbiológica en un portaobjetos por medio de una impronta (proceso en el cual se coloca una impresión de la muestra sobre una estructura utilizando una cinta adhesiva transparente). 
Técnica
 1) Sobre un porta limpio y seco se depositan 2 gotas de azul de lactofenol .
2) Cortar un trozo de cinta adhesiva, pegarla en el extremo del ansa estéril. 
3) Con cuidado pasar la zona adhesiva de la cinta por la superficie del hongo. 
4) Pegar la cinta en el portaobjetos que tiene el colorante retirando con cuidado el ansa. 
5) Añadir una gota de colorante sobre la cinta.
6) Cubrir la preparación con un cubreobjetos.
7) Observar con objetivo 40X. 
Bioseguridad : Trabajar con campana de siembra.
OBSERVACIÓN DE VIRUS: Se realiza por microscopía electrónica
Microscopio electrónico de transmisión (MET)
El microscopio electrónico de transmisión (MET) tiene un límite de resolución de cerca de 2 nm. Esto es debido a limitaciones del lente usado para enfocar electrones hacia la muestra. Un MET permite observar las réplicas de células muertas, después de haber sido fijadas y teñidas con iones de metales pesados.
Los electrones son dispersados cuando pasan a través de una fina sección del espécimen, y luego detectados y proyectados hacia una imagen sobre una pantalla fluorescente.
 
Microscopio electrónico de barrido (MEB)
El microscopio electrónico de barrido (MEB) también tiene un limite de 2nm. Al igual que el MET, el MEB permite observar células muertas, después de haber sido fijadas y teñidas con iones de metales pesados. Con esta técnica los electrones son reflectados sobre la superficie del espécimen.