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2 Universidad Nacional Autónoma de México Dr. Enrique Luis Graue Wiechers Rector Dr. Leonardo Lomelí Vanegas Secretario General Ing. Leopoldo Silva Gutiérrez Secretario Administrativo Dr. Alberto Ken Oyama Nakagawa Secretario de Desarrollo Institucional Lic. Raúl Arcenio Aguilar Tamayo Encargado del despacho de la Secretaría de Atención a la Comunidad Universitaria Dra. Mónica González Contró Abogada General 3 Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia Dr. Francisco Suárez Güemes Director Dr. José Ángel G. Gutiérrez Pabello Secretario General LAE José Luis Espino Hernández Secretario Administrativo Dr. Francisco A. Galindo Maldonado Secretario de Vinculación y Proyectos Especiales Dr. Froylán Ibarra Velarde Jefe del Departamento de Parasitología Lic. Manuel Casals Cardona Jefe del Departamento de Publicaciones MVZ Enrique Basurto Argueta Jefe del Departamento de Diseño Gráfico y Editorial Yazmín Alcalá Canto Juan Antonio Figueroa Castillo Coordinadores Yazmín Alcalá Canto Irene Cruz Mendoza Juan Antonio Figueroa Castillo Froylán Ibarra Velarde Cintli Martínez Ortíz de Montellano Agustín Pérez Fonseca Alberto Ramírez Guadarrama Evangelina Romero Callejas Yolanda Vera Montenegro Abel Zapata Arenas Autores 5 Nombres: Alcalá Canto, Yazmín, 1972- , editor. | Figueroa Castillo, Juan Antonio, editor. | Cruz Mendoza, Irene, autor. | Ibarra Velarde, Osvaldo Froylán, 1949- , autor. | Martínez Ortíz de Montellano, Cintli, autor. | Pérez Fonseca, Agustín, autor. | Ramírez Guadarrama, Alberto, autor. | Romero Callejas, Evangelina, autor. | Vera Montenegro, Yolanda, autor. | Zapata Arenas, Abel, autor. Título: Diagnóstico de Parásitos de interés en Medicina Veterinaria [Manual de prácticas de laboratorio de parasitología veterinaria] / Yazmín Alcalá Canto, Juan Antonio Figueroa Castillo, coordinadores; Irene Cruz Mendoza, Froylán Ibarra Velarde, Cintli Martínez Ortíz de Montellano, Agustín Pérez Fonseca, Alberto Ramírez Guadarrama, Evangelina Romero Callejas, Yolanda Vera Montenegro, Abel Zapata Arenas. Otros títulos: Parasitología veterinaria. Descripción: Primera edición. | Ciudad de México: Universidad Nacional Autónoma de México, Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia, 2018. Identificadores: LIBRUNAM 2018559 | ISBN Temas: Parasitología veterinaria -- Manuales de laboratorio. Clasificación: LCC SF810.A3 M345 Esta obra forma parte de los productos derivados del proyecto PAPIME PE202416 “Manual de Prácticas de Laboratorio de Parasitología Veterinaria ”, financiado por la Dirección General de Asuntos del Personal Académico de la UNAM. Responsable: Yazmín Alcala Canto, fmvz-unam. El Comité Editorial de la FMVZ reconoce el trabajo que realizó el Dr. Juan José Zárate Ramos como revisor técnico. Primera edición, 15 de enero de 2019 DR© 2019, Universidad Nacional Autónoma de México. Ciudad Universitaria, Coyoacán, C.P. 04510, Ciudad de México, México. ISBN: 978-607-30-1155-6 Registro legal de obra “Prohibida la reproducción total o parcial por cualquier medio sin la autorización escrita del titular de los derechos patrimoniales”. Hecho en México. / Made in Mexico. Esta obra se encuentra bajo una licencia Creative Commons Reconocimiento-NoComercial-SinObraDerivada 4.0 Internacional (CC BY-NC-ND- 4.0) Material fotográfico y los videos son originales. Diseño editorial y formación electrónica: LDCV F. Avril Braulio Ortiz Diseño de portada: LSCA Edgar Emmanuel Herrera López Fotografías de portada: Dr. Juan Antonio Figueroa Castillo Revisión de forma: Elizabeth Sarmiento de la Huerta Revisión de pruebas y gestión legal: MVZ Laura Edith Martínez Álvarez Webmaster: LCG Marco Antonio Domínguez Guadarrama 6 A Mateo Salazar Islas por los especímenes facilitados y por la realización de algunas técnicas fotografiadas. A los alumnos de TP Parasitología 2017: Cinthya Troncoso Castillo, Elizabeth Cruz Hernández y Jesús Vargas Castillo, por la realización de algunas de las técnicas fotografiadas. Agradecimientos 7 Contenido Prólogo . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 9 Capítulo I. Generalidades . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 12 PRÁCTICA 1. Organización del grupo, bioseguridad en el laboratorio y manejo del microscopio . . . . . . . . . . . . . . . . . 13 PRÁCTICA 2. Técnicas de colecta, conservación y envío de muestras para la identificación de parásitos en sangre. Frotis sanguíneo. Tinción de Wright. Técnica de Knott. . . . . . . 29 PRÁCTICA 3. Técnicas de colecta, conservación, envió de muestras para la identificación de parásitos en heces y técnicas coprológicas (directa, tamizado, microscópica directa, Graham, flotación simple y Faust). . . . . . . . . . . . . . . . . . 48 PRÁCTICA 4. Técnicas coprológicas de sedimentación, migración larvaria (Baermann), cultivo larvario, McMaster de campo y Kinyoun. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 77 Capítulo II. Protozoarios . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 101 PRÁCTICA 5. Morfología de los protozoarios flagelados intestinales, urogenitales hemáticos y tisulares en animales mamíferos domésticos. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 102 PRÁCTICA 6. Morfología de los protozoarios Apicomplexa intestinales, tisulares y hemáticos en animales domésticos. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 114 8 Capítulo III. Platelmintos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 132 PRÁCTICA 7. Morfología de los platelmintos adultos de los bovinos, ovinos, caprinos y equinos. . . . . . . . . . . . . . . . . . 133 PRÁCTICA 8. Morfología de los platelmintos en estadios larvarios y adultos de los animales domésticos. . . . . . . . . . . . 159 Capítulo IV. nematodos y acantocéfalos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 180 PRÁCTICA 9. Morfología de los nematodos de las familias Ascarididae, Heterakidae y Oxyuridae en animales domésticos. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 181 PRÁCTICA 10. Morfología de los nematodos del orden Strongylida en mamíferos domésticos. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 200 PRÁCTICA 11. Morfología de los nematodos espiruridos, enoplidos y acantocéfalos en mamíferos domésticos. . . . . . . 234 Capítulo V. artróPodos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 252 PRÁCTICA 12. Identificación de estructuras morfológicas de artrópodos Phtiraptera, Siphonaptera y Diptera. . . . . . . . . . 253 PRÁCTICA 13. Identificación de estructuras morfológicas de los ácaros y pentastómidos. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 287 Bibliografía y lecturas recomendadas . . . . . . . . . . . . 314 Anexos ANEXO 1. Esquema que ilustra la diferencia en tamaños de algunos ooquistes y huevos de parásitos. . . . . . . . . . . . . . . . 316 ANEXO 2. Raíces de los nombres de los parásitos incluidos en el Manual de Prácticas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 318 9 Prólogo Los parásitos son seres vivos que pueden encontrarse en las he- ces, las secreciones, los fluidos y los tejidos de los animales que se encuentran en situaciones que favorecen la presencia de estos organismos, tales como la higiene insuficiente, la falta de medi- das de bioseguridad en las unidades productivas, una deficiente nutrición, entre otros factores. Para el estudio de las parasitosis, es necesario contar con habilidades y destrezas en el diagnóstico oportuno y preciso de esas infecciones, a fin de tomar las accio- nes correctivas inmediatas, ya sea de tratamiento o de preven- ción y control.El propósito de este manual de prácticas de laboratorio es presentar a los alumnos que cursan la asignatura de Parasitolo- gía Veterinaria de la licenciatura en Medicina Veterinaria y Zootec- nia, las técnicas convencionales que un médico veterinario utiliza para detectar protozoarios, helmintos y artrópodos en muestras clínicas en la primera sección de la obra. Debido a que la mayoría de las fases diagnósticas de los parásitos son microscópicas, se enfatiza el desarrollo de habilidades en el manejo del microscopio y uso del equipo y materiales del laboratorio. La segunda parte del manual integra información y material gráfico de alta cali- dad y cuidadosamente seleccionado que apoyará la identificación de los parásitos que se revisan en el programa de la asignatura de Parasitología Veterinaria en el plan de estudios vigente. Las imágenes muestran las características morfológicas relevantes 10 para la correcta identificación de los organismos que se estudian en el laboratorio. Los coordinadores científicos y autores de esta obra son pro- fesores con una extensa y reconocida trayectoria académica en el diagnóstico, enseñanza, coordinación de prácticas de labora- torio, recolección, procesamiento y conservación de especíme- nes parasitarios. Asimismo, los autores son parasitólogos exper- tos que han recibido distinciones y premios relacionados con su labor docente, producción académica e innovaciones didácticas, científicas y tecnológicas. Indudablemente, los manuales de prácticas que se han utili- zado en las sesiones de laboratorio de parasitología veterinaria han constituido una invaluable ayuda para el proceso enseñan- za-aprendizaje de esta asignatura, y los autores del presente ma- nual reconocen y agradecen las aportaciones de estos textos que anteceden al presente manual. No obstante, los cambios en los planes de estudio en las es- cuelas de medicina veterinaria en varios lugares del mundo se están enfocando en incrementar el énfasis en el aprendizaje in- dependiente, desarrollar habilidades interpersonales y de re- solución de problemas. Para poder lograr estos objetivos, se ha tenido que prescindir de áreas tradicionales de estudio e instru- mentar nuevas tecnologías y actividades educativas. La enseñan- za y aprendizaje deben enfatizar que los estudiantes se vuelvan reflexivos y participen de manera colaborativa. Los sistemas de identificación apoyados en la tecnología han demostrado propor- cionar a los usuarios un recurso para relacionar las observaciones morfoanatómicas con nomenclatura taxonómica y subsecuente- mente integrar más conocimientos sobre los organismos. Este manual está disponible de manera electrónica y se dise- ñó para que la información pueda visualizarse en una pantalla de un equipo de escritorio o móvil. Ciertamente, estos dispositivos 11 fungirán como claves visuales electrónicas para la identificación de parásitos. El acceso al manual en un medio móvil permitirá a los usua- rios que se encuentren en un laboratorio o clínica, tener un acce- so rápido a los procedimientos diagnósticos, e identificación, así como a los materiales de consulta disponibles en línea que han sido desarrollados por los colaboradores de esta obra. El Manual de prácticas de laboratorio de parasitología veterina- ria detalla los procedimientos tradicionales, económicos y sen- cillos para detectar e identificar parásitos, y se espera que sea una herramienta de uso afable y completa para los alumnos y profesores de los planes de estudio de medicina veterinaria, así como para el personal técnico y profesional de los laboratorios de diagnóstico en sanidad animal. Yazmín Alcalá Canto 12 Capítulo I: Generalidades 13 Práctica 1 Organización del grupo, material y equipo de laboratorio, bioseguridad en el laboratorio y manejo del microscopio Yazmín Alcalá Canto y Abel Zapata Arenas Objetivos específicos Al término de la práctica, el alumno: 1. Se integrará a un equipo para realizar de manera colaborati- va la mayoría de las actividades en el laboratorio. 2. Conocerá el material y el equipo del laboratorio de parasitología. 3. Conocerá las medidas de seguridad para reducir los riesgos hacia uno mismo, a terceros o al ambiente por una práctica inadecuada. 4. Manejará el microscopio compuesto y el estereoscópico para realizar un enfoque perfecto. Introducción Organización del grupo De ser necesario el profesor dividirá al grupo en dos secciones. Los alumnos se organizarán en equipos y designarán a uno de los integrantes como representante del equipo, quien será res- ponsable de supervisar el buen uso del material y del equipo de laboratorio, así como de coordinar la limpieza del área de trabajo y los materiales prestados por el departamento. 14 Material y equipo de laboratorio El laboratorio de parasitología cuenta con una gran colección de parásitos (parasitoteca) en diferentes estadios de desarrollo (hue- vos, larvas, adultos, etc.), conservados en alcohol, formol o resina. Este material se proporciona a los alumnos durante las prácticas o en las sesiones de estudio extraclase. También cuenta con una amplia gama de materiales electrónicos, diseñados para facilitar el aprendizaje de la parasitología veterinaria o para consulta. Se encuentran disponibles en http://fmvzenlinea2-7.fmvz.unam.mx El laboratorio dispone del mobiliario, equipo y materiales para aplicar las diferentes técnicas de diagnóstico parasitológi- co, como los que a continuación se listan: Equipo ] Báscula ] Centrífuga ] Estufa de incubación ] Microscopios compuestos ] Microscopios estereoscópicos ] Platina con agitación ] Potenciómetro ] Refrigeradores y congeladores ] Triquinoscopio y placas para triquinoscopía Materiales ] Aparato de Baermann ] Asa de alambre ] Aserrín ] Cajas de Petri de varios diámetros y volúmenes ] Charolas porcelanizadas y de fondo obscuro http://fmvzenlinea2-7.fmvz.unam.mx 15 ] Coladeras de plástico y de metal de diferentes diámetros ] Cucharas ] Embudos de cristal y de plástico ] Espátulas ] Frascos de plástico y vidrio ] Fuentes de tinción ] Goteros ] Hisopos, torundas de algodón, gasas ] Lupas ] Matraces diversos ] Mecheros de Bunsen y de Fisher ] Morteros y cápsulas de porcelana ] Papel filtro ] Papel limpia lentes ] Pinza Möhr ] Pipetas Pasteur ] Pisetas ] Portaobjetos y cubreobjetos ] Tubos para centrífuga ] Vasos de Coplin ] Vasos de plástico ] Vasos de precipitados ] Vidrios de reloj Instrumentos ] Alcoholímetros ] Cámara de McMaster ] Densímetros ] Micrómetro ocular y objetivo ] Pipetas graduadas ] Probetas graduadas 16 ] Termómetros Soluciones, reactivos y colorantes ] Ácido clorhídrico ] Agua destilada ] Alcohol ácido ] Alcohol éter ] Alcohol glicerinado ] Alcoholes de diferentes grados ] Dicromato de potasio al 2 % ] Formol al 10 % ] Glicerina ] Hidróxido de potasio o de sodio al 10% ] Lactofenol ] Resina sintética ] Solución salina fisiológica ] Solución saturada de sal (SSS) ] Colorantes: azul de metileno, carmín acético, fucsina fenica- da, giemsa, haemalumbre de Mayer, lugol, Wright, etcétera. Bioseguridad en el laboratorio La bioseguridad está definida como el conjunto de medidas pre- ventivas (normas, procedimientos y actitudes), que minimizan los riesgos inherentes de los agentes biológicos, físicos y quími- cos con la finalidad de salvaguardar la salud y la vida de los estu- diantes, trabajadores y docentes, así como la de los animales y el medio ambiente. Este laboratorio se clasifica en el nivel 1 o básico de biose- guridad, (riesgo individual y poblacional escaso o nulo), debido a que se trabaja con organismos que tienen pocas probabilidades 17 de ocasionar enfermedades en el ser humano y los animales. Sin embargo, durante la práctica pueden ocurrir accidentes relacio- nados con: ] El carácter potencialmente peligroso de las muestras bioló- gicas (heces, sangre, vísceras…), así como de las solucionesy reactivos utilizados (alcohol, formol, cloro…). ] Falta o uso inadecuado de equipo de protección personal (bata, guantes, cubrebocas, mascarillas…). ] Errores humanos por negligencia o impericia al manipular el equipo, substancias químicas o muestras biológicas. ] Incumplimiento de la normas de seguridad Para reducir la exposición a los agentes infecciosos, físicos o quí- micos, así como disminuir la contaminación del ambiente y pre- venir accidentes, se establecieron las siguientes normas de se- guridad y de disposición de los residuos peligrosos, que deben ser atendidas por todos los usuarios del laboratorio (figura 1.1 ). Normas de seguridad y bioseguridad dentro del laboratorio de parasitología ] Vestir bata blanca de algodón, abotonada, de manga larga y limpia ] Utilizar guantes al manipular las muestras biológicas (he- ces, vísceras, sangre, etc.), o substancias químicas (formol, alcohol ácido, colorantes). ] Atender las disposiciones para el manejo y disposición de los residuos peligrosos biológicos infecciosos (RPBI´s). ] No consumir alimentos o bebidas (incluidos los dulces y chicles). 18 ] Evitar aplicarse maquillaje o tocarse la cara durante la práctica. ] No tocar los especímenes con el boligráfo o lápiz. ] Evitar los juegos o bromas mientras se manipulan las mues- tras biológicas. ] Evitar salir del laboratorio con la bata o guantes puestos. ] Manipular teléfonos celulares, tabletas electrónicas o com- putadoras con las manos limpias, sin guantes. ] Mantener el área de trabajo limpia y ordenada, evitar la pre- sencia de materiales que no tengan relación con el trabajo. Las mochilas deben colocarse en la parte baja de las mesas. ] Al término de la práctica, lavar, secar y guardar el material utilizado. Las mesas se limpian con un trapo. Posteriormen- te se descontaminan rociando alcohol al 70 % y retirándolo con toallas de papel. ] Reportar los derrames, accidentes reales o potenciales al responsable de la práctica, quien deberá proporcionar orien- tación y ayuda. ] En caso de salpicaduras en la cara con fluidos de las mues- tras biológicas se debe lavar con abundante agua y jabón, si la salpicadura cae en los ojos se utiliza el lavaojos por va- rios minutos. ] En caso de pinchazos y heridas se debe lavar la zona con abundante agua y jabón y desinfectar con alcohol o yodo. ] Una vez terminada la práctica, guardar la bata en una bolsa de plástico y lavarse las manos con agua y jabón. Disposición de los residuos peligrosos biológicos infecciosos (RPBI´s) Las prácticas generan residuos inocuos y algunos de ellos po- tencialmente peligrosos, para reducir su impacto en el am- 19 biente y minimizar el riesgo de daño al hombre, dentro del laboratorio los residuos químicos, biológicos y materiales con- taminados se separan de acuerdo a su naturaleza, y es obliga- ción del alumno su cumplimiento, y del personal del laboratorio su supervisión (figura 1.2 ). Los RPBI´s se desechan en bolsas especiales, rojas o ama- rillas con la leyenda residuos peligrosos biológico infecciosos y el símbolo universal de riesgo biológico (figura 1.3 ). Una vez terminada la práctica se eliminarán los residuos pro- ducidos de la siguiente manera: Tipo de residuo Estado físico Envasado Color a. Sangre Líquido Recipiente hermético Rojo b. Patológicos Sólido Bolsa de polietileno Amarillo Líquido Recipiente hermético c. Residuos no anatómicos Sólido Bolsa de polietileno Rojo Líquido Recipiente hermético d. Objetos punzocortantes Sólido Recipiente rígido Rojo No se deberá rebasar más del 80 % del total de las bolsas o recipientes a. Los tubos Vacutainer y capilares con sangre, se depositan en un recipiente hermético con una solución de cloro al 0.4 - 0.7 % durante 24 horas. b. Tejidos, órganos o partes que se extirpan o remueven duran- te las necropsias, o cirugías. Las muestras biológicas para análisis químico, microbiológico, citológico e histológico. Los cadáveres y partes de animales que fueron inoculados con agentes patógenos en centros de investigación y bioterios. 20 c. Recipientes o material desechables (excepto vidrio) que con- tengan sangre; materiales de curación, empapados, satura- dos o goteando de sangre o fluidos corporales, secreciones pulmonares y cualquier material usado para contener estos, de pacientes con enfermedad infecciosa. Así como los mate- riales absorbentes (cama) utilizados en las jaulas de anima- les que hayan sido expuestos a agentes patógenos y que lo eliminen a través de sus excretas. d. Navajas, lancetas, agujas de jeringas desechables, agujas hi- podérmicas, de sutura, hojas de bisturí, estiletes de catéter, y cualquier instrumento de venopunción o centesis, excepto todo material de vidrio roto utilizado en el laboratorio. Introducción al manejo del microscopio El microscopio es un instrumento óptico compuesto de lentes que permiten observar objetos diminutos, imperceptibles al ojo hu- mano. Es unaparato de precisión, por lo tanto, debe de manejarse con sumo cuidado, el microscopio nos permite ver con aumentos lo que a simple vista es difícil de observar. El microscopio tiene de manera general una parte óptica formada por un aparato de iluminación, un objetivo y un ocular. En el laboratorio, se cuenta con dos tipos de microscopio, el compuesto y el estereoscópico (figura 1.4 ). Es indispensable conocer con precisión las partes que lo conforman y sus funciones, para lograr el mejor enfoque de los especímenes o muestras a estudiar o analizar. Microscopio compuesto Este tipo de microscopio tiene tres sistemas: el óptico, el mecá- nico y el de iluminación. Partes de un microscopio compuesto: 21 a) Cabezal b) Oculares c) Objetivos d) Brazo e) Pinzas sujetadoras de la preparación f) Platina móvil g) Tornillo macrométrico h) Tornillo micrométrico i) Condensador j) Lámpara k) Base l) Botón de encendido y apagado 1) Sistema óptico Consta de dos tipos de lentes, el objetivo que produce la magnifi- cación inicial o primaria. Cada uno de los objetivos indica la can- tidad de veces que la lente magnifica la imagen. Los objetivos se rotan con una pieza denominada revólver. Los objetivos son los siguientes: ] 4X Lupa o lente panorámico ] 10X Seco débil ] 40X Seco fuerte ] 100X Lente de inmersión El condensador del sistema óptico concentra y orienta los rayos luminosos sobre la preparación microscópica. 2) Sistema mecánico Está formado por la base y el tubo del microscopio. En la par- te superior se encuentran los oculares y en la inferior el revól- ver con los objetivos. La platina es la placa móvil que se localiza 22 sobre el condensador. El tornillo macrométrico que sirve para enfoques rápidos y el tornillo micrométrico se utiliza para movi- mientos finos. 3) Sistema de iluminación Consta de una fuente luminosa, que en el caso de los microsco- pios del laboratorio de Parasitología, se trata de una lámpara. Método para enfocar en el microscopio compuesto 1. Colocar el objetivo de menor aumento (4X) sujetando el revól- ver de la porción superior sin tocar los tubos de los objetivos. 2. Desplazar la platina hasta el tope inferior. 4. Asegurarse que la intensidad de luz sea mínima antes de en- cender el microscopio. 5. Encender el microscopio. 6. Ajustar la intensidad de la luz de la lámpara. 7. Ajustar la apertura angular de los ojos moviendo los oculares con la cremallera que se localiza en el cabezal. 8. Colocar una preparación en la platina y sujetarla con los tornillos. 9. Enfocar la preparación con el tornillo macrométrico solo con el ojo derecho. 10. Cerrar el ojo derecho y enfocar la preparación hasta que se vea nítida usando el tornillo dióptico localizado en el tubo ocu- lar izquierdo. 11. Ajustar el enfoque con el tornillo micrométrico y cambiar el objetivo al aumento requerido. Material y equipo para la práctica ] Microscopio compuesto 23 ] Microscopio estereoscópico ] Especímenes para enfocar en el microscopio compuesto ] Especímenespara enfocar en el microscopio estereoscópico Actividades El profesor ] Organizará y coordinará una dinámica para formar secciones y equipos de trabajo. ] Asignará a cada equipo su área de trabajo. ] Mostrará los materiales y el equipo de laboratorio. ] Dará a conocer el reglamento del laboratorio y comentará aspectos de bioseguridad. ] Enseñará las partes y funciones del microscopio compuesto y el microscopio estereoscópico. ] Demostrará cómo enfocar una preparación en el microscopio compuesto y una en el estereoscópico. El alumno ] Se integrará a un equipo de trabajo conformado por sus com- pañeros de grupo. ] Conocerá las reglas básicas de bioseguridad del laboratorio de enseñanza práctica. ] Identificará las partes y conocerá las funciones de un micros- copio compuesto y un microscopio estereoscópico. ] Enfocará una preparación en el microscopio compuesto y una en el estereoscópico. 24 Habilidades y destrezas a adquirir Al término de la práctica, el alumno será capaz de enfocar una preparación microscópica y de comportarse de manera colabo- rativa y con seguridad en el laboratorio de parasitología. Autoevaluación La autoevaluación se encuentra disponible en http://fmvzenlinea2-7. fmvz.unam.mx El profesor explicará el procedimiento para ingre- sar a la autoevaluación y proporcionará la contraseña de acceso. http://fmvzenlinea2-7.fmvz.unam.mx/ http://fmvzenlinea2-7.fmvz.unam.mx/ http://fmvzenlinea2-7.fmvz.unam.mx/ 25 Imágenes de la Práctica 1 Figura 1.1. Para reducir los riesgos a la salud, en el laboratorio se han establecido normas de seguridad e higiene. A) Almacén de sustancias peligrosas. B) Regadera y lavaojos para utilizarse en caso de salpicaduras con sustancias peligrosas. C) Teléfonos de emergencia. http://fmvzenlinea2-7.fmvz.unam.mx/ 26 Figura 1.2. Los residuos químicos se identifican y almacenan temporalmente en este contenedor. 27 Figura 1.3. Los residuos de las prácticas se desechan de acuerdo con su naturaleza y peligro. 28 Figura 1.4. Algunas de las principales partes de un microscopio. 29 Práctica 2 Técnicas de colecta, conservación y envío de muestras para la identificación de parásitos en sangre: frotis sanguíneo, tinción de frotis sanguíneo, técnica de Knott Juan Antonio Figueroa Castillo Objetivos específicos Al término de la práctica el alumno: 1. Conocerá la técnica de obtención, conservación y envío de muestras sanguíneas para la identificación de parásitos. 2. Realizará frotis sanguíneos para la búsqueda de hemoparásitos. 3. Realizará la tinción de frotis sanguíneos mediante la técnica de Wright. Introducción Se entiende por frotis, frote o extendido sanguíneo, a la prepara- ción de sangre para examen microscópico extendida en capa fina en un portaobjetos con ayuda de otro portaobjetos. En esta prác- tica se utilizará para detectar parásitos sanguíneos. En la sangre se pueden encontrar protozoarios parásitos, como Babesia bovis y B. bigemina en ganado bovino, Babesia ca- nis en perros, Babesia equi en caballos, y Trypanosoma cruzi en perros y otros mamíferos. También se pueden detectar larvas de nematodos (llamadas microfilarias), p. ej. de Acantocheylonema reconditum y Dirofilaria immitis en perros. 30 Aunque los parásitos tienden a concentrarse en los vasos ca- pilares más pequeños (como los de la piel), y en algunos casos, son más abundantes durante los accesos febriles (por ejemplo babesiosis o tripanosomosis), o por las tardes (dirofilariosis), es posible encontrarlos en vasos sanguíneos de mayor calibre. Sin embargo, el sitio de punción dependerá principalmente de la es- pecie, facilidades de sujeción del animal, destreza del colector y cantidad de sangre que se extraerá. Para la detección de hemoparásitos no se requieren grandes cantidades de sangre, generalmente bastará con dos o tres mili- litros. Tratándose de animales pequeños (ratones, pájaros, palo- mas), o en caso de sospechar de Babesia, es recomendable rea- lizar algunos frotis de sangre capilar y enviarlos al laboratorio. La colecta de sangre se hace con material estéril: jeringas nuevas o de preferencia con el sistema de extracción de tubos al vacío. Debido a sus múltiples ventajas, el sistema al vacío es recomendado por estándares internacionales: la sangre pasa di- rectamente del paciente al tubo, así se evita su exposición al me- dio ambiente. Existen tubos con aditivos para diferentes pruebas analíticas (hematología, química, inmunología, etc.), también se dispone de una amplia variedad de agujas de diferentes calibres para diversos fines. Además, el mismo tubo sirve para transpor- tar la sangre al laboratorio. Material y equipo para la práctica (figura 2.1 ) ] Portaobjetos de bordes esmerilados, limpios y desengrasados ] Tubo con sangre con anticoagulante (EDTA K2) ] Colorante de Wright ] Amortiguador de fosfatos ] Varilla de vidrio o tubo de microhematocrito ] Fuente de tinción 31 ] Aceite de inmersión ] Microscopio compuesto Los siguientes son los sitios de punción más accesibles para la colecta de sangre, aunque existen muchos más (figura 2.2 ). ] Aves: vena radial o corte de uña (para realizar unos cuantos frotis sanguíneos). ] Bovinos: vena yugular, vena caudal (video ), vasos capilares de la oreja (hacer extendidos de sangre). ] Caprinos, equinos y ovinos: vena yugular (video ). ] Conejos: vena auricular. ] Gatos: vena yugular. ] Perros: vena radial, vena yugular. ] Porcinos: vena yugular, vena auricular. ] Ratas y ratones: corte de la punta de cola (seno retro- orbital —en ratones—) y se hacen extendidos de sangre. ] Todas las especies: Punción de la piel con lanceta. En este caso se colecta la sangre con un tubo capilar con anticoagu- lante y se hacen frotis sanguíneos. Las muestras deben enviarse al laboratorio debidamente empa- quetadas, identificadas y refrigeradas (4 a 8 ºC). Debe especifi- carse la especie e identificación del animal, historia clínica, diag- nóstico presuntivo o nombre de la técnica que solicita. En el laboratorio, la sangre con anticoagulante se conserva en refrigeración (2 a 8 ºC) hasta 48 horas. https://www.youtube.com/watch?v=DmQ3lXivTlA&index=7&list=PLa2DG4T4DHk84N1pjt4dfcQk9O5hzMRB6 https://www.youtube.com/watch?v=PGYy-f8jgMg&index=8&list=PLa2DG4T4DHk84N1pjt4dfcQk9O5hzMRB6 32 Técnica de frotis sanguíneo de capa delgada o capa fina Con este tipo de frotis, es posible observar tanto parásitos intra- celulares como extracelulares; sin embargo, para que los parási- tos intracelulares se puedan diferenciar es indispensable un buen extendido de la sangre y una buena tinción, libre de precipitados, como a continuación se describe. Por lo que se recomienda ha- cer dos buenos frotis por muestra. Antes de realizar los frotis la sangre debe homogeneizarse y alcanzar la temperatura del la- boratorio (figura 2.3 A ). 1. Colocar un portaobjetos limpio (P1) y desengrasado en una superficie plana y firme. 2. Depositar una gota pequeña de sangre de 2 a 3 mm de diá- metro, a un centímetro de uno de los extremos del P 1 (figura 2.3 B-C ). 3. Con otro portaobjetos (P2) colocado en un ángulo de 30 a 45º del P1, tocar la gota de sangre y permitir que se extienda por capilaridad a los bordes del portaobjetos (figura 2.3 D ). 4. Extender la sangre moviendo el portaobjetos 2 de manera firme hacia el extremo opuesto de donde se depositó la gota de sangre. Los dos portaobjetos deben estar en contacto (figura 2.4 A ). 5. Secar el frotis agitándolo. 6. Identificar el frotis con lápiz de grafito o diamante y fijarlo con alcohol metílico si es necesario (figura 2.4 B-D ). En un buen frotis, el extendido de sangre forma una capa fina y homogénea, que cubre ¾ partes del portaobjetos. Se distinguen tres zonas: cabeza, cuerpo y cola. La presencia de estrías o zonas circulares sin sangre, el excesivo grosor, el extendido o muy cor- 33 to o muy largo, son características de un frotis incorrecto (figura 2.5 A-D ). Si elfrotis se va a enviar al laboratorio, se debe fijar en meta- nol absoluto por 2 a 5 minutos. Si el frotis se va a teñir pronto con Wright, no es necesario fijar. Un frotis fijado protegido del polvo y la humedad, se conserva durante mucho tiempo. La delgadez del frotis está determinada por la cantidad de sangre, el ángulo y la velocidad del portaobjetos esparcidor. Técnica de frotis sanguíneo de gota gruesa (figura 2.6 A ) Está indicado para parásitos extracelulares. 1. Colocar un portaobjetos limpio y desengrasado en una su- perficie plana y firme. 2. Depositar una gota grande de sangre sobre el portaobjetos (figura 2.6 B ). 3. Extender la sangre realizando movimientos circulares con un aplicador de madera, una varilla de vidrio o la esquina de otro portaobjetos. Cubrir una extensión de 2 cm de diámetro aproximadamente (figura 2.6 C ). 4. Secar el frotis al aire. 5. Cubrir el portaobjetos con el frotis con agua hasta la desapa- rición total del color rojo (figura 2.6 D ). 6. Secar 7. Teñir Tinción de frotis sanguíneo con la técnica de Wright (figura 2.7 A ). Los frotis sanguíneos se tiñen para observar las carácterísticas morfológicas de los parásitos. Existen varios colorantes y técni- 34 cas de tinción. En este laboratorio se realizará la técnica de Wri- ght en una fuente de tinción. 1. Colocar el frotis en la fuente de tinción. La cara del frotis debe quedar hacia arriba (figuras 2.7 B y C ). 2. Agregar gotas de colorante de Wright hasta cubrir el frotis. Debe quedar una capa delgada de colorante sobre el frotis. 3. Dejar que actúe el colorante. El tiempo depende de la madu- rez del colorante. El profesor le indicara si son cuatro o más minutos. 4. Agregar 4 a 10 gotas de agua destilada (figura 2.7 D ). 5. Agregar, lo más pronto posible, el amortiguador de fosfatos. 6. Lavar a chorro ligero de agua (figura 2.8 A ). 7. Secar y observar (figura 2.8 B ). Técnica de Knott (figura 2.9 A ) Es una técnica para la concentración y tinción de microfilarias sanguíneas. 1. Preparar el material (figura 2.9 B ). 2. Depositar 1 mL de sangre en un tubo cónico de 15 mL (figura 2.9 C ). 3. Agregar 10 mL de formol al 2 % (figura 2.9 D ). 4. Homogeneizar la sangre con los reactivos (figura 2.10 A ). 5. Centrifugar 3 min a 1500 rpm (figura 2.10 B ). 6. Decantar el sobrenadante (figura 2.10 C ). 7. Agregar una o dos gotas de azul de metileno al sedimento (figura 2.10 D ). 8. Homogeneizar (figura 2.10 E ). 35 9. Depositar una gota del sedimento entre porta y cubreobjetos (figura 2.11 A ). 10. Observar en el microscopio compuesto a 40X (figura 2.11 B ). Actividades El profesor ] Explicará la técnica de colecta, conservación y envío de sangre. ] Explicará y demostrará la realización de extendidos de san- gre en capa fina. ] Explicará la técnica de tinción de Wright. ] Indicará la ubicación de los materiales y organizará a los alumnos para realizar la práctica. ] Apoyará a los alumnos en la realización, tinción y observa- ción de los frotis sanguíneos. ] Verificará la calidad del frotis y la tinción que el alumno haga. ] Supervisará la correcta disposición de los residuos de la práctica. El alumno ] Revisará el material y equipo a utilizar durante la práctica. ] Realizará varios frotis sanguíneos de capa delgada y teñirá con Wright el que considere más adecuado. Lo observará con el objetivo de inmersión (100X) y lo mostrará al profesor. ] Observará preparaciones de Babesia de la colección del de- partamento de parasitología. ] Contestará la evaluación. 36 Habilidades y destrezas a adquirir Al término de la práctica el alumno será capaz de realizar frotis sanguíneos y teñirlos con Wright. Autoevaluación La autoevaluación se encuentra disponible en http://fmvzenlinea2-7. fmvz.unam.mx El profesor explicará el procedimiento para ingre- sar a la autoevaluación y proporcionará la contraseña de acceso. http://fmvzenlinea2-7.fmvz.unam.mx/ http://fmvzenlinea2-7.fmvz.unam.mx/ 3737 Imágenes de la Práctica 2 Figura 2.1. Material para la colecta de sangre con sistema de tubos al vacío. A. Aguja y soporte. B. Tubos para diferentes propósitos C. Sistema listo para la punción. 3838 Figura 2.2. Recolección de sangre A. Punción de la vena yugular de un borrego. B. Inserción de la aguja. C. Punción en la cola de un ratón. 3939 Figura 2.3. Frotis sanguíneo de capa fina. A. Material. B. Toma de muestra de sangre directamente del tubo. C. Tamaño de la gota de sangre para un frotis delgado. D. Inclinación del portaobjetos 2. 4040 Figura 2.4. A. Extendido de la gota de sangre. B. Identificación del frotis con lápiz. C. Identificación del frotis con marcador punta de diamante. D. Fijado del frotis con alcohol metílico. 4141 Figura 2.5. Frotis delgados. A. Adecuado B. Mucha sangre, extendido muy lento. C. Poca sangre, extendido muy rápido. D. Portaobjetos con grasa. 4242 Figura 2.6. A. Guía para realizar un frotis grueso. B. Tamaño de la gota de sangre. C. Extendido de la sangre de manera circular. D. El frotis se cubre con una película de agua destilada. 4343 Figura 2.7. A. Guía para la tinción de frotis sanguíneo con Wright. B. Modalidad de tinción utilizando papel filtro para evitar precipitados. C. Modalidad en cámara de tinción D. Detalle, tanto el colorante como el amortiguador deben formar una película sobre el frotis. 4444 Figura 2.8. A. Detalle del lavado con chorro de agua ligero. B. Resultado final a 100X. 4545 Figura 2.9. Técnica de Knott: A. Guía para realizar la técnica. B. Material. C. Agregando 1 mL de sangre. D. Agregando la formalina. 4646 Figura 2.10. Técnica de Knott: A. Homogeneizar la sangre y la formalina para fijar las microfilarias. B. Equilibrar los tubos en la centrífuga. C. Decantar y desechar el sobrenadante. D. Agregar un par de gotas de azul de metileno. E. Homogeneizar la mezcla. 4747 Figura 2.11. Técnica de Knott: A. Colocar una gota del sedimento entre porta y cubreobjetos. B. Observación de una microfilaria a 40X. 48 Práctica 3 Técnicas de colecta, conservación, envió de muestras para la identificación de parásitos en heces y técnicas coprológicas (directa, tamizado, microscópica directa, Graham, flotación simple y Faust) Evangelina Romero Callejas y Alberto Ramírez Guadarrama Objetivo específico 1. Al término de la práctica describirá las técnicas de colecta, conservación y envío de muestras fecales de diferentes es- pecies de animales domésticos. 2. Aplicará las técnicas coprológicas cualitativas para la identi- ficación de parásitos en una muestra de heces. Introducción En las heces es posible encontrar los estadios evolutivos (huevos, quistes, ooquistes o larvas) de los parásitos que se localizan en el tracto digestivo. También es posible encontrar estadios evo- lutivos de parásitos que se alojan en el tracto respiratorio (p. ej. Dictyocaulus) o en los conductos biliares (p. ej. Fasciola hepatica). También es frecuente observar a los parásitos adultos o segmen- tos de estos (proglotis). Por lo que el examen de la materia fecal brinda información valiosa sobre los parásitos de un individuo. Colecta La colecta de la muestra de heces dependerá de la especie, edad y facilidad de manejo del animal (video ). En rumiantes, cerdos y équidos manejables, es preferible co- lectar la muestra directamente del recto (figura 3.1 ). En corderos, https://www.youtube.com/watch?v=RBavx-GeOk4&list=PLa2DG4T4DHk84N1pjt4dfcQk9O5hzMRB6&index=6 49 cabritos, lechones y potrillos pequeños, o animales peligrosos, la muestra puede colectarse del suelo (figura 3.2 A ), siempre y cuando sea fresca y esté libre de tierra, cuerpos extraños o heces de otros animales (figura 3.2 B ). En aves de corral, la muestra se colecta de la cama o de las perchas. En aves de ornato, (si es posible), se coloca plástico en el piso de la jaula o hábitat, justo debajo de las perchas, donde suelen defecar las aves. En cone- jos criados en jaula, se colocanplásticos suspendidos debajo de la jaula para colectar las heces sin que toquen el suelo. En ra- tas, ratones, serpientes y otros animales que se crían en hábitats artificiales, las muestras se recogen directamente del suelo del hábitat. En animales silvestres, las muestras se recogen del sue- lo o del recto cuando son sedados para algún otro estudio. Existen otros procedimientos para obtener heces de un ani- mal, por ejemplo, enemas, cucharillas de muestreo rectal o in- troduciendo el termómetro para estimular la defecación, sin em- bargo, la mayoría de las ocasiones la candidad de muestra que se obtiene es muy poca. La cantidad de materia fecal a enviar depende de la especie animal y la(s) prueba(s). En los bovinos y equinos, es recomenda- ble el envío de aproximadamente 100 gr de materia fecal, en pe- queños rumiantes 30 g, en perros y gatos 15 g serán suficientes. En conejos una muestra de 15 g por jaula. En ratones, aves de or- nato y serpientes por lo menos tres gramos. En pollo de engorda, los parásitos se detectan generalmente durante la necropsia de la mortalidad diaria. Para la identificación de coccidias es factible enviar muestras de la cama o el intestino completo (conservado en dicromato de potasio al dos por ciento). Las muestras se pueden obtener mediante el uso de guantes quirúrgicos o bolsas de polietileno de pared delgada. Tienen la ventaja de ser desechables y poder utilizarse como contenedor y transporte de la muestra. Para evitar lastimar al animal, se re- 50 comienda, lubricar la bolsa o guante con agua y voltear la bolsa (las comisuras deben quedar hacia adentro de la bolsa), antes de introducirlos en el recto del animal. Conservación de materia fecal Las muestras de heces que no se analizarán en las siguientes 3 o 4 horas de colectadas, deben conservarse en refrigeración (4 - 8 ºC) hasta su análisis. A las muestras que tardarán varios días o semanas en llegar al laboratorio y no es posible refrigerarlas, se les debe adicionar una solución de formol al 4 % para conservar las estructuras pa- rasitarias. Sin embargo, este tipo de muestras ya no serán ade- cuadas para detectar vermes pulmonares, trofozoitos o realizar cultivo larvario. Envío Por lo general, las muestras se envían en las bolsas o guantes con que se tomaron. Las bolsas se anudan suavemente y se iden- tifican con marcador indeleble (número o nombre del animal). Existen en el mercado frascos estériles (figura 3.3 A ) para uso en humanos, que resultan muy prácticos para el envío de muestras de perro o gato. Se pueden utilizar otros frascos, siem- pre y cuando estén limpios, sean de boca ancha y cierre hermé- tico. El tamaño del frasco debe ser adecuado a la cantidad de muestra, de tal forma que no quede mucho aire en el interior del frasco. Se sugiere empaquetar las muestras en bolsas y deposi- tarlas en una hielera con refrigerantes. 51 Nota: Si utiliza hielo, procure empaquetar las muestras en varias bolsas para que no les entre agua que diluya la muestra y borre la identificación (figura 3.3 B ). Cuando se remitan las muestras al laboratorio deben llevar una historia clínica que incluya: nombre del propietario o responsa- ble, dirección, especie animal, raza, edad, nombre o número del animal, análisis solicitados y medio de conservación utilizado (figura 3.4 ). Exámenes coprológicos Debido a la gran diversidad de parásitos que se pueden encontrar en las heces, el examen coprológico debe incluir varias técnicas que se complementen con el fin de confirmar o descartar la pre- sencia del mayor número de especies parásitas en una muestra. La técnica de elección depende de los parásitos de que se sospeche o la finalidad del examen (monitoreo, verificar la efi- cacia del tratamiento o para confirmar la etiología de un cuadro clínico), y el costo de cada prueba. La consistencia, color, olor, presencia de moco, sangre, coágulos, cuerpos extraños y aún la posibilidad de encontrar parásitos o partes de ellos, son elemen- tos que pueden orientar la estrategia de diagnóstico. Las técnicas coprológicas se pueden clasificar de la siguien- te forma: 52 La mayoría son cualitativas, es decir no indican la canti- dad de parásitos existentes, pero brindan información sobre su presencia. Técnica macroscópica directa El fundamento de esta técnica radica en que cuando los pará- sitos grastrointestinales mueren son expulsados del organismo en las heces. Algunos parásitos como los cestodos, desprenden segmentos (proglotis) de su cuerpo (estróbilo) y se excretan con las heces (figura 3.5 ). La dispersión de la materia fecal en una charola de fondo oscuro, para hacer resaltar los parásitos o frag- mentos de estos, por ejemplo, de trematodos, cestodos, nemato- dos y larvas de moscas de miasis gastrointestinales. Material y equipo ] Charola de fondo oscuro ] Cuchara ] Solución salina fisiológica (SSF) ] Pinceles (cero y doble cero) o agujas de disección y pinzas de disección ] Caja de Petri ] Microscopio estereoscópico 53 Método 1. Colocar una pequeña cantidad de heces en la charola de fon- do obscuro (figura 3.6 A ). 2. Dispersar con la cuchara para buscar parásitos o fragmen- tos de estos y colectarlos con pinzas o agujas de disección o con pinceles finos para recoger los parásitos más pequeños (figura 3.6 B ). 3. Colocar en una caja de Petri con solución salina fisiológi- ca para lavar los especímenes y observarlos al microscopio estereoscópico. 4. Si se desea conservar los especímenes revise el anexo 1. Nota: Se debe usar guantes de hule látex como medida de biosegu- ridad para evitar adquirir una infección. Técnica de tamizado El tamizado es un método físico para separar mezclas. Consiste en hacer pasar una mezcla de partículas de diferentes tamaños por un tamiz o colador. Las partículas de menor tamaño pasan por los poros del tamiz y las grandes quedan retenidas por el mismo. En parasitología, la técnica de tamizado es usada para de- tectar parásitos adultos, enteros o fraccionados en contenido gastrointestinal. Material y equipo ] Tamices de diferentes diámetros ] Cuchara ] Pinzas disección y aguja de disección ] Caja de Petri. ] Pinceles (cero y doble cero) ] Solución salina fisiológica http://es.wikipedia.org/wiki/Mezclas 54 ] Microscopio estereoscópico Método 1. Colocar pequeñas cantidades de contenido gastrointestinal en el tamiz (figura 3.7 A ). 2. Dispersar la muestra con ayuda de una cuchara y agua, has- ta lograr un filtrado lo más limpio posible (figura 3.7 B ). 3. Depositar el material que se quedó en el tamiz en una charola de fondo obscuro y revisarlo con ayuda de una lupa. En caso de encontrar parásitos, se deben identificar en el microsco- pio (figura 3.7 C ). Técnica microscópica directa simple, frotis directo o en fresco Es una prueba rápida que permite observar trofozoitos y larvas en movimiento (en heces frescas), aunque también se pueden detectar huevos y ooquistes, es poco representativa debido a que la muestra utlizada es muy poca. Es muy útil en aves, peque- ños mamíferos, reptiles o heces líquidas. Cuando se sospecha de giardiasis o amebiasis se recomienda examinar el moco fecal mediante esta técnica. Método 1. Colocar en cada extremo de un portaobjetos una gota de SSF y una gota de lugol. 2. Depositar una pequeña cantidad de heces (del tamaño de un grano de arroz), en la gota de SSF y homogeneizar con una varilla de vidrio, una aguja de disección o un palillo. Retirar las partículas más grandes 55 3. Depositar otra pequeña cantidad de heces en la gota de lugol y repetir el procedimiento anterior. 4. Colocar un cubreobjetos en cada gota. 5. Observar a 40X. Empezar por la gota que tiene SSF. Material y equipo: ] Portaobjetos ] Cubreobjetos ] Varilla de vidrio o aguja de disección ] Piseta con agua destilada o solución salina fisiológica ] Microscopio compuesto Técnica de Graham Tambien conocida con el nombre de técnica de cinta de celofán o cintatransparente adhesiva. Se utiliza para el diagnóstico de huevos de oxiuros en pequeños rumiantes, equinos, conejos, roe- dores y primates. Se basa en que las hembras de los oxiuros de- positan los huevos en los pliegues del ano, razón por la cual casi nunca se les encuentra en las heces. También es de utilidad para el diagnóstico de cestodos en perros y gatos, debido a que cuando los proglótidos grávidos de algunos de Dipylidium y Taenia ssp., se desprenden del estróbilo y fuerzan el esfínter anal, dejando ras- tros de huevos en la región perianal, mientras tienen movimientos de extensión y retracción. Se fundamenta en lograr la adhesión de huevos o segmentos de parásitos en la cinta y recuperarlos. Material y equipo ] Portaobjetos ] Microscopio compuesto ] Cinta adhesiva transparente ] Tijeras 56 ] Abatelenguas Método (figura 3.8 A ) 1. Pegar alrededor de un extremo del abatelenguas la cinta transparente con la parte adhesiva hacia el exterior (figura 3.8 B ). 2. Colocar la parte adhesiva en la región perianal haciendo presión. 3. Separar cuidadosamente la cinta del abatelenguas y pegarla sobre el portaobjetos. 4. Cortar los extremos de la cinta. 5. Observar en el microscopio compuesto con el objetivo seco débil o fuerte (figura 3.8 C – D ). Nota: Para mejorar la visibilidad de los huevos, se recomienda co- locar un par de gotas de agua en el borde de la cinta, para que por capilaridad penetre por debajo de la cinta. Método de flotación pasiva Es una técnica cualitativa, que se basa en el hecho de que la mayo- ría de los huevos de helmintos y ooquistes de protozoarios flotan en soluciones más densas que el agua (densidad relativa –d. r-) y las partículas de heces sedimentan. Algunas de las soluciones que se utilizan son: solución saturada de cloruro de sodio (1.2 d. r), sulfato de zinc al 33 % (1.18 d. r), de sacarosa (1.28 d. r), nitrato de sodio (1.25 d.r) y sulfato de magnesio (1.3 d. r). La elección de una u otra solución dependerá de su disponibilidad, inocuidad, facilidad de preparación y manejo, el costo y el parásito que se desea detectar. Por ejemplo, los huevos de Ancylostoma, Toxasca- ris, Toxocara, Parascaris, Ascaris y Trichuris flotan en soluciones con densidad relativa entre 1.18 y 1.2, pero los huevos de Taenia y 57 Physaloptera requieren soluciones con mayor densidad (como la de sacarosa o nitrato de sodio, 2.3 d. r). A mayor densidad de la solución concentradora, la deformación de las estructuras para- sitarias es mayor. En este curso se empleará la solución saturada de sal (1.2 d. r), que permite la concentración de coccidias, huevos tipo estrongilido, de Strongyloides, ascáridos, enóplidos y algunos ces- todos en todas las especies domésticas. Material y equipo ] Dos vasos de plástico ] Portaobjetos y cubreobjetos ] Asa de alambre de muestreo ] Mechero ] Cuchara ] Solución salina saturada de sal ] Coladera de plástico ] Microscopio compuesto Método (figura 3.9 A ) 1. Preparar el material para tenerlo cerca (figura 3.9 B ). 2. Homogeneizar la muestra fecal dentro de la bolsa contene- dora (figura 3.9 C ). 3. Poner en un vaso de 3 a 5 gramos de heces (figura 3.9 D ). 4. Agregar solución saturada de sal (figura 3.10 A ). 5. Mezclarla con una cuchara hasta formar una pasta homogé- nea (figura 3.10 B ). 6. Diluir con más solución, aproximadamente 100 mL (figura 3.10 C ). 7. Filtrar a través de un tamiz o coladera de plástico de malla fina a un segundo vaso (figura 3.10 D ). 8. Dejar reposar 15 minutos (figura 3.11 A ). 58 9. Flamear un asa microbiológica en un mechero (figura 3.11 B ). 10. Tomar tres gotas separadas de la superficie de la solución con un asa de muestreo (figura 3.11 C ). 11. Depositar las gotas en un portaobjetos (figura 3.11 D ). 12. Observar con el objetivo 10X. Si se requiere examinar con el objetivo 40X es necesario poner un cubreobjetos sobre la gota. 13. Cuando la muestra es escasa, por ejemplo, en ratones y aves de ornato, se puede utilizar la siguiente variante de la téc- nica: después de filtrar al segundo vaso se homogeneiza la suspensión y se vierte en un tubo de ensayo de 15 mL hasta el borde del tubo formando un menisco, se coloca un cubreob- jetos sobre el menisco y se deja reposar de 10 a 15 minutos, después se retira el cubreobjetos y se coloca sobre un por- taobjetos para su observación en el microscopio. Técnica de Faust modificada con solución de sulfato de zinc al 33 por ciento Existen muchas modificaciones a la técnica descrita por Carroll Faust y col. (1938). La variante que aquí se presenta hace una ex- celente concentración de quistes de protozoarios (Giardia), pero es menos eficiente para concentrar los huevos de cestodos y ne- matodos, que flotan a mayor densidad relativa. Sin embargo, si se incrementa la densidad relativa a 1.25, es posible hacer que floten los huevos de Fasciola hepatica y otros trematodos, pero los quistes de protozoarios y los huevos de nematodos se deforman y destruyen rápidamente. Material y equipo ] Muestra de heces positiva a protozoarios y helmintos ] Vaso de plástico 59 ] Cuchara ] Agua destilada ] Gasa y embudo ] Tubos cónicos de 15 ml ] Centrífuga ] Solución de sulfato de zinc al 33 % (1.18 d. r) ] Portaobjetos y cubreobjetos ] Microscopio compuesto ] Mechero y asa de alambre Método (figura 3.12 A ) 1. Preparar el material (figura 3.12 B ) 2. Mezclar en un vaso tres gramos de heces con 10 partes de agua destilada para formar una suspensión (figura 3.12 C ). 3. Hacerla pasar a través de un tamiz de malla fina a un segun- do vaso (figura 3.13 A ). 4. Agitar para hacer una mezcla homogénea (figura 3.13 B ). 5. Verter el contenido del segundo vaso en tubos de centrífuga de 15 mL (figura 3.13 C ), y centrifugar a 1 500 rpm durante tres minutos 6. Repetir el ciclo de lavado de la muestra con agua (figura 3.14 A ) hasta que la apariencia del sobrenadante es clara (figura 3.14 B ). 7. Decantar el sobrenadante y agregar la solución de sulfato de zinc hasta 1.5 cm del borde del tubo y resuspender el sedi- mento mezclando con una varilla de vidrio (figura 3.15 A ). 8. Centrifugar a 1 500 rpm durante tres minutos. 9. Sin sacar el tubo de la centrifuga, se toma una muestra de la superficie del menisco con una asa, y se deposita sobre un portaobjetos, al que poco antes se le colocó una gota de lu- gol. Se coloca un cubreobjetos y entonces se le analiza en el microscopio con los objetivos 10X y 40X. 60 10. Una variante es, después de la resuspensión del sedimento con sulfato de zinc al 33 %, se coloca el tubo en una gradi- lla, se le agrega con mucho cuidado, la solución de sulfato de zinc hasta llenar el tubo y formar un menisco (figura 3.15 A y B ). Entonces, pondrá un cubreobjetos en la boca del tubo, y esperará tres minutos. 11. Retirar el cubreobjetos y colocar la muestra sobre un por- taobjetos para examinarlo con el microscopio compuesto con el objetivo 10X y 40X. (figura 3.15 C ). Actividades El profesor ] Dará una breve explicación de las técnicas de colecta, con- servación y envío de muestras para la identificación de pará- sitos en heces. ] Indicará al alumno el momento en que ejecutarán las técni- cas de microscopia directa y flotación, para la observación e identificación de quistes, ooquistes de protozoarios y huevos de helmintos. ] Apoyará a los alumnos que tengan dificultad para la obser- vación de las estructuras parasitarias que se diagnostican por medio de las técnicas de microscopía directa y flotación simple. El alumno ] Revisará al inicio de la práctica el material y equipo a utilizar durante la práctica. ] Practicará las técnicas directas microscópicas y de flotación simple para la observación e identificación de huevos de hel- mintos, quistes, ooquistes y trofozoitos de protozoarios con 61 el objetivo seco débil (10X) y seco fuerte (40X) del microsco- pio compuesto. Habilidades y destrezas a adquirir Al término de la prácticael alumno será capaz de recolectar, con- servar y enviar muestras fecales a un laboratorio de diagnóstico, así como de realizar las técnicas de microscopía directa y flota- ción para la identificación de estructuras parasitarias utilizando la microscopía compuesta de manera colaborativa. Autoevaluación La autoevaluación se encuentra disponible en http://fmvzenlinea2-7. fmvz.unam.mx El profesor explicará el procedimiento para ingre- sar a la autoevaluación y proporcionará la contraseña de acceso. http://fmvzenlinea2-7.fmvz.unam.mx/ http://fmvzenlinea2-7.fmvz.unam.mx/ 6262 Imágenes de la Práctica 3 Figura 3.1. Recolección de heces del recto. 6363 Figura 3.2. Recolección de heces del suelo. B Recolección de heces de una superficie limpia. 6464 Figura 3.3. A. Frasco estéril para muestras biológicas. B. La identificación de las muestras debe ser clara. 6565 Figura 3.4. Transporte o envío de las muestras. 6666 Figura 3.5. Observación directa de parásitos completos o segmentos en heces. A. Heces de conejo con Passalurus. B. Heces de perro con Dipylidum. C. Heces de gato con Toxocara. D. Contenido intestinal de caballo con diferentes helmintos. 6767 Figura 3.6. El examen de las heces en charola de fondo obscuro realza la presencia de los parásitos. A. Taenia eliminada en heces de perro. B. Anoplocephala recuperadas de heces de caballo. 6868 Figura 3.7. Técnica de tamizado. A. Proceso de tamizado. B. Haemonchus en contenido abomasal de un ovino. C. Passalurus en contenido intestinal de conejo. 6969 Figura 3.8. Técnica de Graham. A. Guía rápida del procedimiento. B. Huevos de Taenia a 4X. C. Cinta transparente adherida al portaobjetos. D. Huevos de Taenia a 40X. 7070 Figura 3.9. Técnica de flotación pasiva. A. Guía rápida. B. Material. C. Homogeneizar la muestra dentro de la bolsa contenedora. D. 3 a 5 g de heces. 7171 Figura 3.10. Resuspensión y homogeneización de la muestra fecal en solución salina saturada y filtrado de la misma. 7272 Figura 3.11. La mezcla debe reposar de 15 a 20 min. B. Flameado del asa. C. Detalle de la colecta de la superficie de la mezcla. D. Colocación de las muestras en el portaobjetos. 7373 Figura 3.12. Técnica de Faust. 7474 Figura 3.13. Técnica de Faust. A. Filtrado a otro vaso. B. Agitar. C. Colectar 10 mL de la muestra y depositarlos en un tubo cónico. 7575 Figura 3.14. A. Ciclo de lavado de la muestra con agua. B. El ciclo se repite hasta que la apariencia del sobrenadante es clara, generalmente 2 o 3 veces son suficientes. 7676 Figura 3.15. Detalle de la colecta de una muestra de la suspensión. A. Se agrega ZnSO4 hasta que se forma un pequeño menisco en la superficie del tubo. B. Se coloca un portaobjetos con cuidado para no derramar el líquido y se deja reposar 10 min para que floten los quistes. C. Se retira el cubreobjetos y se coloca en el portaobjetos para observar a 10X y 40X. 77 Práctica 4 Técnicas coprológicas de sedimentación, migración larvaria (Baermann), cultivo larvario, McMaster de campo y Kinyoun Evangelina Romero Callejas y Alberto Ramírez Guadarrama Objetivo específico Aplicará las técnicas coprológicas cualitativas y cuantitativas para la identificación de estructuras parasitarias en heces de diversas especies animales domésticas. Metodología Técnica de sedimentación pasiva Se usa para el diagnóstico de huevos de Fasciola hepatica, pa- ramfistomidos, Macracanthorhynchus hirudinaceus y quistes de Balantidium coli, entre otros. Se fundamenta en que los huevos y quistes de los parásitos antes mencionados son densos y sedi- mentan en agua. Material y equipo ] Heces positivas a Fasciola hepatica ] Cuchara ] Dos vasos de precipitados de 250 mL ] Agua ] Coladera o tamiz de malla fina ] Caja de Petri cuadriculada ] Azul de metileno o violeta de genciana ] Microscopio estereoscópico 78 Método (figura 4.1 A ) 1. Preparar el material (figura 4.1 B ). 2. Depositar en un vaso de precipitados una cucharada de he- ces (3 a 5 g) (figura 4.1 C ). 3. Agregar un poco de agua y mezclar hasta dispersar la ma- teria fecal y obtener una pasta homogénea (figura 4.2 A ). 4. Agregar más agua (hasta 250 mL) y mezclar (figura 4.2 B ). 5. Filtrar la suspensión a través de un tamiz o coladera de malla fina a un segundo vaso de precipitados y agregar agua hasta 250 mL (figura 4.2 C ). 6. Dejar reposar cinco minutos (figura 4.2 D ). 7. Decantar el sobrenadante, en el vaso se dejarán aproximada- mente 50 mL. El movimiento debe ser suave para no revolver el sedimento (figura 4.3 ). 8. Resuspender el sedimento en unos 250 mL de agua , dejar reposar cinco minutos y decantar una vez más; este paso se repite varias veces hasta que quede limpio el sedimento (por lo regular 3 o 4 veces) (figura 4.3 ). 9. Depositar el sedimento en una caja de Petri cuadriculada (fi- gura 4.4 A ) y agregar una o dos gotas de azul de metileno, o de violeta de genciana como medio de contraste. 10. Examinar en el microscopio estereoscópico para detectar los huevos de trematodos (figura 4.4 B-D ). Técnica de migración larvaria (Baermann) Esta técnica se utiliza para el diagnóstico de nematodos pulmo- nares como: Dictyocaulus sp., Muellerius sp. y Protostrongylus sp., causantes de bronquitis verminosa en los rumiantes. En équidos para la detección de larvas de Dictyocaulus arnfieldi y en perros para Oslerus sp.. Se fundamenta en que los nematodos pulmo- nares tienen huevos larvados, cuya pared es tan frágil que casi 79 siempre se rompe cuando pasa por el tracto respiratorio o diges- tivo, entonces libera las larvas (L1) en las heces. Las larvas sedi- mentan en agua. También se utiliza para la concentración de larvas 3 (L3), del cultivo larvario. Material y equipo ] Heces ] Soporte universal ] Embudo de plástico ] Manguera de hule látex ] Pinzas Mörh ] Coladera de plástico ] Gasas ] Cuchara ] Agua tibia ] Vidrio de reloj de 10 cm de diámetro ] Pipeta Pasteur ] Lugol ] Portaobjetos y cubreobjetos ] Microscopio estereoscópico y compuesto Método ] Armar el aparato de Baermann —integrado por un soporte universal, un embudo unido a una manguera de hule látex, una pinza Möhr y una coladera de malla fina— (figura 4.5 A ). ] Depositar de tres a cinco gramos de heces en una gasa o servilleta de papel y envolver las heces para formar un bulto. Colocar el bulto en la coladera sobre el embudo. ] Llenar el embudo con agua hasta cubrir el bulto fecal. Verter el agua por las paredes del embudo. 80 ] Dejar reposar la muestra durante 12 a 24 horas, tiempo sufi- ciente para que las larvas migren y se concentren en el fondo de la manguera. ] Abrir la pinza Mörh para obtener unos 3 mL del líquido y de- positarlo en un vidrio de reloj (figura 4.5 B ). ] Examinar en un microscopio estereoscópico, si es positivo se agregan dos gotas de lugol y se extraen las larvas con una pipeta Pasteur y se depositan en un portaobjetos (figura 4.5 C y 4.6 A-B ). ] Observar con el objetivo 10X y 40X del microscopio compues- to para su identificación . Técnica de cultivo larvario (coprocultivo) Debido a que los huevos de los nematodos estrongilidos, que afectan a los rumiantes y equinos son similares, no se pueden identificar los diferentes géneros. La técnica de cultivo larvario, se basa en proporcionar las condiciones de temperatura, hume- dad y oxigenación adecuadas para que este tipo de huevos se de- sarrollen hasta el estadio de larva infectante (L3), larvas que se pueden diferenciar con relativa facilidad (figura 4.7 A-D ). Material y equipo ] Vaso de plástico ] Agua ] Aserrín estéril o limpio ] Lugol ] Cuchara ] Pipeta Pasteur ] Aparato de Baermann ] Microscopio estereoscópico 81 ] Vidrio de reloj de 10 cm de diámetro ] Microscopio compuesto Método ] Colocar 10 g de heces positivas a huevos tipo estrongilido en un recipiente o vaso. ] Mezclar las heces con un sustrato (aserrín o hule espuma). ] Agregarun poco de agua y mezclar. No debe quedar encharcado. ] Incubar a 27 ºC en la estufa de cultivo durante 12 días. Nota. El tiempo de incubación depende del género del nema- todo y la temperatura. Bajo estas condiciones se obtienen la mayoría de los géneros de estrongilidos que afectan a los ru- miantes. Para disminuir la presencia de hongos en el cultivo, se recomienda mezclar diariamente las heces. ] Al término del periodo de cultivo, se recomienda concentrar las larvas mediante la técnica de Baermann. Para la identificación de las larvas, se deben emplear claves es- pecíficas (para bovinos, pequeños rumiantes o équidos). Es con- veniente iniciar la observación con menor aumento (10X). De este modo se aprecia mejor el aspecto general de las larvas, y lo más importante, la proporción entre el largo total y el largo de la cola de la vaina larval, que permite la clasificación primaria. Una vez ubicada dentro de uno de los tres grupos (cola corta, mediana o larga), se examina con mayor aumento para observar: forma de la extremidad anterior, existencia de cavidad bucal y forma de la misma, número de células intestinales, terminación de la cola larval, largo y forma de la cola de la vaina larval. El proceso de fijación de las larvas permite observar los de- talles morfológicos, y se puede hacer con calor o agregando unas gotas de lugol. 82 Para fijarlas por calor, pasaremos sobre la llama y con cuida- do, el portaobjetos que contiene la muestra. Las larvas mueren con su cuerpo estirado, lo que facilita las mediciones, en cambio su estructura puede alterarse por la elevada temperatura. Me- diante el agregado de solución de lugol, las larvas quedan curva- das, sin embargo, la coloración de contraste que toman, facilita la observación de detalles morfológicos. Técnicas cuantitativas Técnica de McMaster de campo La demostración de la presencia de huevos en las heces propor- ciona una evidencia irrefutable de que el animal se encuentra parasitado, sin embargo, no indica el grado de parasitismo. El desarrollo de métodos cuantitativos para determinar la cantidad de huevos constituyó un importante avance en la estimación indi- recta de las cargas parasitarias. Si bien el recuento de huevos no determina con certeza la abundancia de parásitos establecidos en el aparato digestivo, constituye una herramienta de alta valo- ración técnica y práctica para el control de la enfermedad en los sistemas de producción. Es usada para demostrar y contabilizar huevos de helmintos y ooquistes en muestras fecales. Mediante la técnica de McMaster se estima el grado de infes- tación en un rebaño y la eficacia de los tratamientos. Cada género parasitario tiene sus características de patogenicidad y las hem- bras depositan huevos en cantidad diferente. Por lo tanto, debe- mos conocer la proporción relativa de cada género, que se logra a través del coprocultivo y la identificación de larvas infectivas. Existen modificaciones a la técnica y al equipo utilizado, mas el fundamento sigue siendo el mismo: cuantificar los huevos u ooquistes en un volumen conocido (0.3 mL) de una suspensión de heces (2 g) en solución saturada de sal (28 mL). 83 Género parasitario Postura de huevos/día/hembra Haemonchus spp. 5 000- 10 000 Oesophagostomum spp. y Chabertia spp. 3 000-5 000 Cooperia spp. 500-1000 Ostertagia spp. y TrichostrongyIus spp. 100-200 Nematodirus spp. 50-100 Material y equipo ] Heces ] Equipo de McMaster (tubo de dilución, gotero, cámara) (figura 4.8 A-D ) ] Gasa o coladera ] Solución saturada de sal (SSS) ] Vaso de plástico ] Cuchara ] Microscopio compuesto Método (figura 4.9 ) ] Depositar SSS hasta la primera marca del tubo (14 mL) (figura 4.9 A ). ] Agregar heces poco a poco hasta que el nivel de la solución alcance la segunda marca del tubo (2 mL) (figura 4.9 B ). Ta- par el tubo y agitar hasta homogeneizar la mezcla. ] Agregar SSS hasta la tercera marca (14 mL), tapar y mezclar una vez más el contenido hasta obtener una suspensión ho- mogénea (figura 4.9 A ). ] Agitar el tubo y poner una gasa en la boca del tubo, con el go- tero, tomar la suspensión (figura 4.9 C ), y rápidamente lle- nar ambas cámaras. Se recomienda llenar el tubo con cuida- do para que no queden burbujas. O se filtra el contenido del tubo en un vaso, se mezcla y se recolecta con el gotero o con una pipeta una muestra de la suspensión: llene ambos lados de la cámara de McMaster (figura 4.10 A-D ). 84 ] Enfocar la cuadrícula de la cámara en el microscopio com- puesto a 10X. Esperar tres minutos para empezar a contar los huevos y los ooquistes de cada uno de los cuadros de la cámara. Solo se cuentan los huevos u ooquistes que se en- cuentren dentro de la cuadrícula. ] El total de huevos (suma de ambas cuadrículas) se multiplica por 100 y se divide entre dos para obtener el número de hue- vos u ooquistes por gramo de heces. Tinción de Ziehl-Neelsen modificada o Kinyoun Este procedimiento se utiliza para la detección de coccidios in- testinales que presentan la característica de ácido alcohol resis- tente debido a los componentes de su pared, por ejemplo, Cryp- tosporidium sp. y Cyclospora sp. principalmente. Cuando las muestras de materia fecal tienen gran cantidad de moco, la tinción puede ser ineficaz, o bien, requerirá un ma- yor tiempo de tinción. Otro inconveniente es que la solución de fucsina se precipite provocando que se observen al microscopio artefactos que causen confusión en el diagnóstico, se rechazarán todas las preparaciones que contengan precipitados abundantes. Material y equipo ] Heces ] Fuente tinción ] Portaobjetos ] Mechero de Bunsen ] Alcohol metílico absoluto ] Fucsina fenicada ] Pinzas de disección sin diente ] Agua corriente 85 ] Solución de ácido sulfúrico al 10 % o alcohol ácido al 3 % de ácido clorhídrico ] Azul de metileno o verde brillante ] Aceite de inmersión ] Microscopio compuesto Método ] Realizar un frotis o extensión de materia fecal sospechosa a la presencia de ooquistes. ] Fijar el extendido primero con calor y después con alcohol metílico absoluto. ] Cubrir el frotis con la solución de fucsina por dos minutos y enjuagar con agua corriente. ] Agregar gota a gota la solución de ácido sulfúrico al 10 %, el frotis tomara una coloración amarillenta —se puede utilizar una solución de alcohol-ácido clorhídrico para decolorar—. ] Enjuagar con agua corriente, el extendido tomará una colo- ración rosada. ] Cubrir el frotis con solución verde brillante o azul de metile- no durante 30 segundos, enjuagar con agua corriente. ] Dejar secar por escurrimiento en posición vertical. ] Observar al microscopio con el objetivo 40X y 100X. Interpretación de los exámenes coproparasitoscópicos La presencia de elementos parasitarios son prueba de la exis- tencia de una infección, sin embargo, no siempre representan la severidad del problema. Corresponde al médico realizar una va- loración escrupulosa de los resultados y relacionarlos con la ma- nifestación clínica que presenten los animales, pues de lo con- trario se toman decisiones incorrectas si se trata de prescribir un tratamiento, o establecer medidas de control y prevención. 86 Por su parte, el analista debe considerar todos aquellos fac- tores que determinen las variaciones de la presencia de los pa- rásitos, tales como: la estandarización de las técnicas, las inter- pretaciones personales, la mala conservación de las muestras fecales que provoca que los parasitarios evolucionen, se defor- men o se deterioren, así como otros factores relacionados con la biología de los parásitos como son: el número de individuos ma- chos y hembras sexualmente maduros, la diferencia en la proli- ficidad de las diversas especies de parásitos y el ritmo de la eli- minación de los elementos parasitarios, principalmente. Otros factores que influyen sobre la intensidad de la eliminación de los elementos parasitarios son: las diferentes condiciones del esta- dofisiológico e inmunológico del huésped, así como también los factores externos como la época del año y el tipo de explotación; la densidad animal, el programa de control parasitario estable- cido, el tipo de suelo, la temperatura, la humedad relativa y la precipitación pluvial de la zona, todos estos factores tienen una relación directa o indirecta con la carga parasitaria detectada en un animal o en un hato. Entre los principales errores que se cometen al analizar las muestras se manifiestan: ] Mala elección de la técnica. ] Utilizar soluciones que no tienen la densidad apropiada. ] No respetar los tiempos de espera. ] Realizar una lectura rápida y superficial. ] No enfocar el campo donde se ubicarán los parásitos. ] Confundir estructuras vegetales, minerales o nematodos de vida libre con parásitos (figura 4.11 ). Un resultado coproparasitoscópico negativo es posible que se deba a la ausencia real de la infección parasitaria; a que la can- 87 tidad de elementos parasitarios es muy baja y las técnicas rea- lizadas son poco sensibles; que el parásito se encuentre en el periodo prepatente, pospatente o en hipobiosis (no hay produc- ción de huevos o larvas); a la producción intermitente de huevos, larvas o quistes, o al mal manejo de las muestras fecales. Por lo anterior, se recomienda el examen coproparasitoscópico seriado que consiste en analizar muestras de heces del mismo animal de tres días consecutivos. Actividades El profesor ] Dará una breve explicación de las técnicas coprológicas de sedimentación, migración larvaria, coprocultivo, McMaster y Kinyoun para la identificación de huevos y larvas de helmin- tos, ooquistes y quistes de protozoarios en heces. ] Indicará la realización de las técnicas de sedimentación, Mc- Master y Kinyoun por alumno para la observación e identi- ficación de quistes, ooquistes de protozoarios y huevos de helmintos. ] Apoyará a los alumnos que tengan dificultad para la observa- ción de las estructuras parasitarias que se diagnostican por medio de las técnicas de sedimentación, McMaster y Kinyoun. ] Proporcionará preparaciones permanentes teñidas de la co- lección del departamento, para la identificación de los oo- quistes de Cryptosporidium spp. El alumno ] Revisará al inicio de la práctica el material y equipo a utilizar durante la práctica. 88 ] Colectará materia fecal de diferentes especies de animales domésticos sospechosos de presentar una parasitosis gas- trointestinal, en bolsas de polietileno o frascos, los transpor- tará al laboratorio en refrigeración a 4 °C. ] Practicará las técnicas de sedimentación, McMaster y Kin- youn para la observación e identificación de huevos de hel- mintos, quistes, ooquistes y trofozoítos de protozoarios con el microscopio compuesto con el objetivo seco débil (10X), seco fuerte (40X) y de inmersión (100X). ] Observará las preparaciones temporales de la colección del de- partamento de parasitología para la identificación de los huevos de helmintos y ooquistes de protozoarios intestinales median- te los siguientes criterios y características morfológicas que se listan: Huevos de helmintos \ Forma y dimensiones. \ Presencia o ausencia de características morfológicas es- pecíficas (cigoto, blastómeros, larvas, opérculos). Ooquistes de protozoarios \ Forma y dimensiones. \ Presencia o ausencia de características morfológicas es- pecíficas (núcleo, cigoto o esporonte, esporocistos, tapón de micrópilo). ] Dibujará los diferentes estadios parasitarios observados en las técnicas coprológicas realizadas e indicará las estructu- ras relevantes para su identificación. Habilidades y destrezas a adquirir Al término de la práctica, el alumno será capaz de realizar técni- cas coprológicas para la identificación y cuantificación de estruc- 89 turas parasitarias utilizando la microscopía compuesta o este- reoscópica de manera colaborativa. Autoevaluación La autoevaluación se encuentra disponible en http://fmvzenlinea2-7. fmvz.unam.mx El profesor explicará el procedimiento para ingre- sar a la autoevaluación y proporcionará la contraseña de acceso. http://fmvzenlinea2-7.fmvz.unam.mx/ http://fmvzenlinea2-7.fmvz.unam.mx/ 90 Imágenes de la Práctica 4 Figura 4.1. Sedimentación pasiva. A. Guía rápida. B. Material. C. Cinco gramos de heces. 91 Figura 4.2. Sedimentación. A Disolver las heces con un poco de agua. B. Aforar a 250 mL y agitar. C. Filtrar a través de una coladera de malla fina. D. Dejar reposar cinco minutos. 92 Figura 4.3. Sedimentación. A Ciclo de lavado. B. De izquierda a derecha, se observa el efecto del ciclo decantar-aforar-reposar-decantar. 93 Figura 4.4. Sedimentación. A. El sedimento se deposita en una caja de Petri cuadriculada. B. Se agregan dos gotas de azul de metileno y la caja se observa en el microscopio. C. Huevos de Fasciola sp. vistos en el microscopio estereoscópico. D. Huevo de Fasciola sp., paramfistómido y quiste de Balantidium sp., los tres sedimentan en agua (100X). 94 Figura 4.5. Técnica de Baermann. A. Armado del aparato de Baermann. B. Colecta de las larvas del fondo del tubo. C. Se agregan 2 o 3 gotas de lugol para fijar las larvas y evidenciarlas. 95 Figura 4.6. Técnica de Baermann. A. Se colectan las larvas con una pipeta Pasteur. B. Las larvas se ponen entre porta- y cubreobjetos para identificarlas en el microscopio compuesto. 96 Figura 4.7. Larvas de estrongilido gastrointestinal. A. Detalle de las células a 40X. B. Detalle de la faringe de una L2. C. Nematodo de vida libre. D. Larva a 10X. 97 Figura 4.8. Equipo para McMaster de campo. A. Cámara. B. Cámara vista lateral. C. Diferentes tubos de dilución. D. Tubo de dilución utilizado en equinos. 98 Figura 4.9. Técnica de McMaster. A. Guía rápida. B. Se agrega solución de cloruro de sodio saturada (SSS) hasta la primera marca. B. Se agregan heces poco a poco hasta que el nivel de la SSS llegue a la segunda marca. C. Detalle de la colocación de la gasa para colectar la muestra de la dilución de heces. 99 Figura 4.10. Técnica de McMaster. A. Antes de colectar la muestra, se debe agitar la dilución de heces. B. Ambos lados de la cámara deben estar llenos y sin burbujas. C. La cámara llena, debe reposar para que los huevos floten. D. Representación de uno de los lados de la cámara de McMaster. 100 Figura 4.11. Artefactos que pueden confundirse con parásitos. 101 Capítulo II: Protozoarios 102 Práctica 5 Morfología de los protozoarios flagelados intestinales, urogenitales, hemáticos y tisulares en animales mamíferos domésticos Alberto Ramírez Guadarrama y Evangelina Romero Callejas Objetivo específico Al término de la práctica el alumno diferenciará morfológicamen- te los protozoarios flagelados intestinales, urogenitales y hemá- ticos más comunes, mediante técnicas permanentes y efímeras con el fin de identificarlos por microscopía. Material y equipo para la práctica ] Portaobjetos de bordes esmerilados, limpios y desengrasados ] Tubo con sangre con anticoagulante (EDTA K2) ] Colorante de Wright ] Amortiguador de fosfatos ] Varilla de vidrio o tubo de microhematocrito ] Fuente de tinción ] Aceite de inmersión ] Microscopio compuesto ] Prepaciones fijas de la colección del departamento: Tricho- monas, Trypanosoma y Giardia Introducción Los protozoarios del subphylum Mastigophora son organismos unicelulares que se mueven mediante estructuras especializa- 103 das denominadas flagelos —extensiones citoplásmicas largas semejantes a hilos—, su número varía en cada género y especie. Estos protozoarios se originan en estructuras citoplasmáticas denominadas o blefaroplasto o kinetoplasto. Algunos son parási- tos intestinales y otros tisulares o hemáticos. Se reproducen ge- neralmente en forma asexual. Los principales géneros patógenos son Giardia spp., Trichomonas spp., Trypanosoma spp., Leishmania spp. y otros. Giardia intestinalis (duodenalis o lamblia) Se localiza
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