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1 UNIVERSIDAD NACIONAL AUTÓNOMA DE MÉXICO FACULTAD DE ESTUDIOS SUPERIORES IZTACALA Variación genética en poblaciones de Campylopterus hemileucurus (Apodiformes: Trochilidae) T E S I S QUE PARA OBTENER EL TÍTULO DE: BIÓLOGA P R E S E N T A : MONSERRAT GASPAR ARGOTE DIRECTOR DE TESIS: DRA. BERTHA PATRICIA ESCALANTE PLIEGO LOS REYES IZTACALA, ESTADO DE MÉXICO, 2019. UNAM – Dirección General de Bibliotecas Tesis Digitales Restricciones de uso DERECHOS RESERVADOS © PROHIBIDA SU REPRODUCCIÓN TOTAL O PARCIAL Todo el material contenido en esta tesis esta protegido por la Ley Federal del Derecho de Autor (LFDA) de los Estados Unidos Mexicanos (México). El uso de imágenes, fragmentos de videos, y demás material que sea objeto de protección de los derechos de autor, será exclusivamente para fines educativos e informativos y deberá citar la fuente donde la obtuvo mencionando el autor o autores. Cualquier uso distinto como el lucro, reproducción, edición o modificación, será perseguido y sancionado por el respectivo titular de los Derechos de Autor. 2 Contenido Resumen....................................................................................................................................... 4 Agradecimientos .......................................................................................................................... 6 Introducción .................................................................................................................................. 8 Biodiversidad en México ........................................................................................................ 8 Especiación ............................................................................................................................ 10 Selección natural: .................................................................................................................. 10 Filogeografía y uso de marcadores moleculares ............................................................. 13 Familia Trochilidae ................................................................................................................ 16 Antecedentes ............................................................................................................................. 18 Objetivo general......................................................................................................................... 21 Objetivos particulares ............................................................................................................... 21 Materiales y métodos ................................................................................................................ 22 Descripción de las localidades ............................................................................................ 24 Trabajo de laboratorio ............................................................................................................... 35 Protocolo de extracción de DNA para tejido animal (Sambrook et al., 1989): ............ 35 Amplificación: ......................................................................................................................... 37 NADH Deshidrogenasa subunidad 2 (ND2):................................................................. 39 Citocromo oxidasa I (COI): .............................................................................................. 39 Factor de Crecimiento Transformante Beta 2 (TGFB2) .............................................. 40 Cadena beta de Fibrinógeno (FIB5): .............................................................................. 40 Análisis genéticos .................................................................................................................. 41 Análisis filogenéticos: ........................................................................................................... 45 Resultados ................................................................................................................................. 50 Análisis genéticos: ................................................................................................................. 50 Matrices concatenadas: ....................................................................................................... 51 Análisis de Haplotipos: ......................................................................................................... 52 Análisis filogenéticos: ........................................................................................................... 56 Gen COI. ............................................................................................................................. 57 Genes mitocondriales (COI+ND2) .................................................................................. 60 Distancia genética entre grupos con el método K2P ........................................................... 63 3 Discusión: ................................................................................................................................... 64 Conclusiones:............................................................................................................................. 70 Literatura citada ......................................................................................................................... 71 4 Resumen Campylopterus hemileucurus es una ave de la familia Trochilidae, su distribución abarca América Central y México, esta especie toma importancia debido al papel ecológico que tienen los colibríes como polinizadores, por lo tanto, es necesario generar conocimiento sobre cómo se ha modificado la estructura genética de las poblaciones de estos organismos ya que es el componente más básico de la biodiversidad, ya que esto puede revelar áreas de interés para la conservación y un mayor entendimiento de su historia evolutiva. Los objetivos del proyecto fueron: evaluar la variación genética en las poblaciones de Campylopterus hemileucurus mediante genes mitocondriales y nucleares; examinar la variación espacial de la diversidad genética entre las poblaciones de Campylopterus hemileucurus hemileucurus y Campylopterus hemileucurus mellitus mediante análisis filogeográficos y realizar una comparación filogenética entre las poblaciones de Campylopterus hemileucurus hemileucurus y Campylopterus hemileucurus mellitus. Se utilizaron 41 muestras de tejido muscular de la Colección Nacional de Aves (CNAV) del Instituto de Biología y del Museo de Zoología de la Facultad de Ciencias, ambos de la UNAM. Se amplificaron los genes ND2, COI, FIB5 y TGFB2, mediante el método de PCR. Posteriormente se utilizaron 76 secuencias de genes mitocondriales y se realizaron análisis genéticos y filogenéticos en los que se obtuvieron índices de diversidad haplotípica, nucleotídica y Tajima D, una red de haplotipos, y distancias genéticas entre grupos y árboles filogenéticos. Se registraron valores altos de diversidad haplotípica 0.7417 y nucleotídica 0.01038, la diversidad haplotípica también fue alta (0.64 a 1). Con la prueba 5 Tajima D se obtuvieron valores positivos en las poblaciones de Veracruz y la Selva Zoque-La Sepultura, valores negativos en las poblaciones de Panamá y el Norte de Chiapas, y se registró una divergencia alta entre los grupos obtenidos en los árboles filogenéticos. Los resultados obtenidos muestran una alta variabilidad y flujo genético en las poblaciones mexicanas sin diferenciación geográfica o estructura genética definida, en la red de haplotipos se formaron dos haplogrupos uno que incluyó a poblaciones de Méxicosolamente y otro a poblaciones de México y de Panamá. 6 Agradecimientos A la Universidad Nacional Autónoma de México por haberme brindado la oportunidad de aprender y desarrollarme profesionalmente. A la Doctora Bertha Patricia Escalante Pliego por proporcionarme todo el material necesario para realizar este trabajo, por darme la oportunidad de aprender en el laboratorio y dirigirme, por la paciencia, entrega que tuvo para asesorarme siempre con una sonrisa y resolverme dudas. A los miembros del comité por los comentarios y aportaciones. A Jonathan Morales y especialmente a Noemí Matías por todo el apoyo otorgado en el desarrollo del trabajo en el laboratorio A mi Mamá y a mi hermano por ser parte de mi motivación. A Pilar y Arturo por haber puesto los cimientos de todo este camino. A mis compañeros y amigos de la Universidad, por todos los buenos momentos que compartimos: Lucy, Mariana, Paola, Gaby, Gaby Beth, Bruno, Toño, Marce y Toño, especialmente a Adolfo por ser siempre auténtico y leal y por supuesto a Alby por apoyarme con los trámites. A Daniel López por siempre tener un buen consejo y valiosa sinceridad en los momentos difíciles. A Majo, Alejandra y Antonia por hacerme creer que puedo lograr lo que sueño y todo el apoyo que me han brindado. 7 A Maru, Jorge y José por siempre ser incondicionales en mi vida a pesar de los años y la distancia. A Cristóbal por llegar justo en el momento indicado. 8 Introducción Biodiversidad en México: La biodiversidad ha sido fuente de recursos esenciales para la supervivencia del hombre. El valor de la biodiversidad va más allá de los intereses utilitarios, culturales y estéticos que las sociedades le han dado, ya que provee bienes y servicios esenciales para el funcionamiento del planeta y, por ende, para el bienestar de la sociedad (Sarukhán et al., 1996). La biodiversidad no se distribuye de manera homogénea; en general, las regiones tropicales albergan las más altas concentraciones de ella (Mittermeier et al., 1997). Esto se debe a la topografía, variedad de climas y a una compleja historia tanto geológica como cultural. Así, se ha formado un mosaico de condiciones ambientales y microambientes que promueven una gran variedad de hábitats y formas de vida (Sarukhán et al., 1996). México ocupa el onceavo lugar en la lista de países mega diversos del mundo debido a su alto grado de riqueza de especies de aves y en particular, de endemismos Por otro lado, en nuestro país habitan alrededor del 11% de todas las aves que se encuentran en el mundo (Navarro-Sigüenza et al., 2014). Concepto de especie: Debido a la gran diversidad que hay en nuestro país y en el mundo, ha sido importante para el ser humano clasificar e identificar a los organismos, sin embargo, la aplicación del concepto de especie ha sido un problema común y controvertido. La palabra especie fue utilizada por primera vez por el filósofo griego Platón, para referirse a cosas o ideas, así como a clasificaciones politómicas de objetos. Al pasar este vocablo al latín llevó dos 9 connotaciones: especie e idea. Consecuentemente la palabra especie es de origen latino, su significado es mirar, contemplar o tipo (Slobodchikoff, 1976). En 1757 Linneo, introdujo el concepto de especie como una manera de reconocer y dar nombre a las distintas entidades biológicas, posteriormente esta idea se reconoció como el concepto Linneano o morfológico de especie (Mayden, 1997). Actualmente se pueden contar más de veinte conceptos diferentes de especie, sin embargo, en este trabajo se hará referencia al concepto cohesivo de especie el cual fue propuesto por Templeton (1998, 1999), ya que se considera el más integrador y completo a nivel teórico de manera operacional en el reconocimiento y limitación de unidades evolutivas. Así, una especie es definida como un linaje (secuencia-ancestro-dependiente) donde las fuerzas genéticas y ecológicas crean un grupo cohesivo único de organismos con capacidad de entrecruzamiento. Por lo tanto, una especie es un grupo de organismos que tiene una determinada respuesta a las fuerzas ecológicas, tales como los factores ambientales y las fuerzas genéticas que interaccionan de tal modo que originan un grupo cohesivo único (Cerritos, 2007). 10 Especiación: La formación de nuevas especies puede ser considerado como un proceso temporal por el que algunas poblaciones se diferencian y alcanzan independencia evolutiva (Harrison y Rand, 1989) lo cual lleva a la aparición de un nuevo linaje evolutivo a partir de una especie ancestral (Morrone, 2001). El flujo génico puede mantener a las poblaciones cohesionadas, mientras que la interacción entre diferentes formas de selección, incluyendo la natural y sexual, la deriva génica, así como procesos históricos, pueden conducir a la diferenciación genética y causar divergencia entre las poblaciones que, aunado a la evolución del aislamiento reproductivo, eventualmente se separen en especies distintas (Slatkin, 1994). La divergencia genética puede ser el resultado del aislamiento por barreras o distancia geográfica, donde el intercambio de material genético entre poblaciones es limitado (Mayr y O´Hara, 1986; Moritz et al., 2000). La divergencia genética también puede ocurrir aun en presencia de niveles bajos de flujo génico, siendo factores como la selección natural la que promueve la diferenciación (Schneider et al., 1999). Selección natural: La selección natural se define como la reproducción diferencial de los individuos portadores de distintos genotipos en una población. El éxito reproductivo diferencial que resulta de las interacciones entre los organismos y su ambiente (biótico y abiótico) modela la variabilidad genética, ya sea produciendo cambios o manteniendo las frecuencias del conjunto de alelos que componen el 11 reservorio genético de una población. Existen diferentes tipos de selección natural los cuales se mencionan a continuación: Selección negativa: Elimina a los individuos con características extremas. Es probable que muchas formas mutantes sean suprimidas de este modo. En este caso los individuos con mayor aptitud son los que tienen fenotipo intermedio, es decir, que la selección desfavorece a los que tienen características extremas. Selección positiva: También conocida como direccional favorece un incremento constante en la proporción de individuos con una característica fenotípica determinada, es decir, elimina a los individuos con una característica específica y favorece a los que poseen el carácter del otro extremo de la distribución Es probable que el proceso conduzca al reemplazo gradual de un alelo o grupo de alelos por otros en el reservorio genético. Selección disruptiva: Provoca el incremento de los dos tipos extremos de una población a expensas de las formas intermedias y puede derivar en la formación de dos especies nuevas a largo plazo, ya que favorece a los dos caracteres fenotípicos de la distribución del carácter biológico. 12 Figura 1. Tipos de selección natural que pueden favorecer diferentes variantes fenotípicas en función dentro de los caracteres promedio de la población. Selección sexual: Es la principal causa de dimorfismo sexual, es decir, las diferencias entre machos y hembras de una misma especie, en particular de aquellas que no tienen relación con el acto de la reproducción en sí sino con la obtención de una pareja. Notablemente, diversos atributos de los machos resultan no adaptativos con respectos a otros aspectos de la aptitud ya que, por ejemplo, en muchos casos se trata de atributos que aumentan su exposición ante los depredadores, por lo tanto, ya que tales caracteres no hacen a los machos más aptos para sobrevivir en la lucha por la existencia se le ha dado a este tipo de selección una categoría diferente delde la selección natural (Curtis y Barnes, 2016). 13 Filogeografía y uso de marcadores moleculares: Los patrones de variación geográfica inter e intra especifica en rasgos genéticos y morfológicos, pueden ayudar a revelar patrones de diferenciación y divergencia entre especies y entre poblaciones de la misma especie, así como aportar evidencias para probar hipótesis de relaciones filogenéticas y adaptaciones ecológicas (Avise, 2000). Por otro lado, el estudio de la filogeografía mediante herramientas estadísticas ha permitido formular hipótesis acerca de los factores que han contribuido a la formación de la diversidad de aves en la época contemporánea. Se sabe que la estructura genética poblacional es el componente más básico de la biodiversidad, por lo tanto; es el resultado de procesos microevolutivos y demográficos que actúan entre y dentro de las poblaciones (Hernández-Baños et al., 2007). Debido a lo anterior, examinar las variaciones genéticas en las poblaciones puede ayudar a conocer las asociaciones, mecanismos históricos y ecológicos que intervienen en patrones fenotípicos, distribución y procesos de reestructuración, los cuales pueden conducir finalmente a la especiación. (Kirchman et al., 2000). El uso de marcadores moleculares como el DNA mitocondrial en estudios filogeográficos ha permitido realizar mejores descripciones de distribuciones geográficas, relaciones filogenéticas y distancias genéticas entre linajes evolutivos, llevando como consecuencia a un mejor entendimiento de la biogeografía regional y áreas de endemismo (Bermingham y Moritz, 1998). 14 En las últimas décadas han sido muy utilizados los marcadores moleculares. Un marcador es un segmento de ADN con una ubicación física identificable en un cromosoma y cuya herencia genética se puede rastrear (Nuez y Carrillo, 2000). La selección de la metodología para obtener los marcadores moleculares en un estudio depende de los objetivos y necesidades del trabajo, por ejemplo, para determinar la variación de una especie o género utilizando secuencias de ADN de genes mitocondriales y nucleares se puede obtener la información necesaria, por lo que no es recomendable emplear una técnica más costosa o complicada como los microsatélites los cuales se deben aislar y caracterizar previamente con marcadores específicos para la especie de interés; por otro lado, los marcadores mitocondriales ND2 y COI han sido ampliamente utilizados para evidenciar divergencia entre especies de aves con mucho éxito (Márquez, 2015). El DNAmt tiene recombinación prácticamente nula, presenta una tasa de mutación elevada y se hereda casi exclusivamente por vía materna (Vázquez- Domínguez, 2007). Por otra parte, los marcadores nucleares han proporcionado nuevos datos sobre la evolución aviar (Avise, 2004; Hackett et al., 2008). Debido a su menor tamaño, el estudio del DNAmt es más sencillo que el del DNA nuclear; se puede extraer en grandes cantidades, porque cada célula tiene varias mitocondrias (Rocco et al., 2001; Lovette, 2004). El DNAmt en animales evoluciona más rápido que el nuclear y no se recombina, pasando intacto entre generaciones salvo por las mutaciones; facilitando la identificación de las relaciones entre organismos muy parecidos (Lovette, 2004), y puede https://es.wikipedia.org/wiki/ADN https://es.wikipedia.org/wiki/Cromosoma https://es.wikipedia.org/wiki/Herencia_gen%C3%A9tica 15 proporcionar buena información para taxa o grupos que han divergido recientemente (Hebert et al., 2003). El genoma nuclear es heterogéneo, consta de regiones codificantes, intrones, regiones no traducidas (UTRs) y regiones intergénicas. Los marcadores nucleares varían en su patrón de evolución molecular (por ejemplo, las tasas de mutación y la composición de bases) y por lo tanto se pueden utilizar en una amplia variedad de diferentes niveles taxonómicos para responder diversos tipos de preguntas filogenéticas (Fain y Houde, 2004). Sin embargo, para determinar mejor la variabilidad intraespecífica se ha propuesto que los marcadores mitocondriales son más adecuados. Para estudiar la variación entre especies que han atravesado por grandes tiempos de divergencia se recomienda utilizar marcadores nucleares (Zhang y Hewitt, 2003), es decir, cuando las distancias genéticas entre especies o los individuos no son tan grandes, se sugiere utilizar secuencias nucleares debido a que estas pueden ser informativas; en aves se han utilizado los genes FIB5 Y TGFB2 para estudios filogenéticos (Marini y Hackett, 2002). Es importante destacar que un buen marcador molecular debe reunir una serie de características para maximizar su utilidad, se debe tener una buena distribución a lo largo del genoma y alto grado de polimorfismo. La técnica para analizar el marcador debe ser rápida, práctica y debe repetirse con fiabilidad en otros laboratorios (Cheng y Critteden, 1994), todo esto lo cumplen los genes ND2, COI, FIB5 Y TGFB2. 16 Familia Trochilidae: Destacan por su tamaño reducido, colorido y el importante papel que desempeñan en los ambientes donde se encuentran, ya participan en la polinización y reproducción de las plantas, aspecto que ha sido ampliamente documentado en los bosques neotropicales (Buzato et al., 2000; Lara et al., 2012). Esta familia es endémica del Continente Americano y cuenta con 357 especies (Gil y Donsker, 2019), de las cuales 57 habitan en México (AOS, 2019; Arizmendi y Berlanga, 2014; Torres y Navarro, 2000). Una de ellas es Campylopterus hemileucurus (Deppe, 1830), el género Campylopterus está formado por 10 especies de Colibríes (Schuchmann, 1999). Su distribución abarca América Central y México, sin embargo, dentro de la especie Campylopterus hemileucurus se incluyen dos subespecies reconocidas, la primera Campylopterus hemileucurus mellitus (Bangs, 1902) la cual se distribuye desde Costa Rica hasta Panamá y Campylopterus hemileucurus hemileucurus que se distribuye de manera discontinua desde el sur de México hasta el oeste de Panamá. En México se puede encontrar en selvas húmedas (0- 1500 msnm) y en Centro América vive en bosque húmedo de montaña y en vegetación ribereña (900- 2000 msnm) (Arizmendi y Berlanga, 2014). Es residente permanente en su hábitat durante todo el año (Dema, 2011). Tal vez hace migraciones altitudinales (Loetscher, 1941; Schuchmman, 1999). Campylopterus hemileucurus se caracteriza por tener un tamaño grande a comparación de otros colibríes, ya que mide aproximadamente de 13 a 15 cm, 17 presenta dimorfismo pronunciado, tiene el pico de color negro, principalmente decurvado en las hembras. La cabeza, espalda superior y partes inferiores del macho son de color violeta a azul. La hembra es completamente verde oscuro por encima, y por debajo es gris con un poco de violeta en la garganta. Su cola es ancha con coloración blanca en bordes distales de las rectrices externas (Del Hoyo et al., 2010) (Figura 2). Forman leks como sistema de apareamiento y se ha observado que tienen un canto simple y estereotipado a comparación de otras especies dentro del género (Skutch, 1972). Figura 2. Dimorfismo sexual y características morfológicas de Campylopterus h. hemilecurus, ilustración tomada de Arizmendi y Berlanga, 2014. 18 Actualmente, las principales amenazas para estos organismos son el comercio, la pérdida, degradación y fragmentación del hábitat. La familia Trochilidae la cual incluye a Campylopterus hemileucurus aparece en el apéndice II, de la Convención sobre el Comercio Internacional de Especies Amenazadas de Fauna y Flora Silvestres (CITES), en la cual se incluyen especies que no se encuentran necesariamente en peligro de extinción, pero cuyo comercio debe controlarse a fin de evitar una utilización incompatible con su supervivencia (CITES, 2019). Antecedentes En el caso de lasaves, los estudios que se han realizado en tierra altas de Mesoamérica han revelado que factores como una topografía compleja, distintos tipos de vegetación, restricción de hábitat e incluso factores históricos como fluctuación de clima y variaciones del nivel del mar, han mantenido a las poblaciones de ciertas especies lo suficientemente aisladas y con bajos niveles de flujo génico a lo largo del tiempo, debido a esto se ha observado que algunas poblaciones de ciertas especies representan linajes genéticos con una estructura definida (García-Moreno et al., 2004; Navarro Sigüenza et al., 2008; Barber y Klicka, 2010). Weir en (2006) encontró diferentes patrones de acumulación de especies y sugiere que las regiones de tierras bajas y altas se ven afectados de manera diferente por las fluctuaciones climáticas. Además, menciona que durante el 19 Pleistoceno se infiere un aumento en las tasas de diversificación de las tierras altas. Quintero y Perktas (2017) encontraron que en los géneros Schiste, Doryfera, y Colibri la mayoría de las subespecies tradicionalmente reconocidas son de hecho linajes evolutivos, en los que fenómenos como el levantamiento de los Andes, las transgresiones marinas del Plio-Pleistoceno, el cierre final del Istmo de Panamá y las oscilaciones climáticas del Pleistoceno podrían ser al menos, en parte, responsables de la diversificación de estos grupos tanto en las tierras bajas como tierras altas de esta región de América del Sur. Slager et al. (2014) encontraron que las especies de Vireónidos tropicales mostraron una mayor estructura genética intraespecífica que las especies de clima templado y menciona la posibilidad de que algunas especies reconocidas actualmente probablemente están compuestas de múltiples especies crípticas. Bonaccorso et al. (2008) en Chlorospingus ophthalmicus detectaron una alta diferenciación y estructura genética entre poblaciones de Mesoamérica y Sur América. Por otro lado, un trabajo realizado con Campylopterus curvipennis mostró la importancia del Istmo de Tehuantepec y los últimos eventos climáticos desde el Pleistoceno en la conducción de aislamiento y divergencia poblacional de estos organismos (González et al., 2011). https://www.sciencedirect.com/topics/agricultural-and-biological-sciences/genetic-structure 20 Malpica y Ornelas (2014) con ADN mitocondrial y nuclear de Selasphorus platycercus encontraron una expansión reciente de la población hacia el norte impulsada por la migración desde poblaciones sedentarias del sur. Miller et al. (2011) En Amazilia tzacatl encontraron tendencia a la formación de clados monofiléticos de ADN mitocondrial, lo atribuyen al aislamiento geográfico. Debido a la importancia ecológica que tienen los colibríes como polinizadores, es necesario generar conocimiento sobre cómo ha cambiado o se encuentra la estructura genética de las poblaciones de estos organismos, composición de especies y establecer sus límites como unidades evolutivas ya que con ello, podemos en un futuro delimitar áreas de interés para la conservación. La especie Campylopterus hemileucurus está dividida en dos subespecies y no se han realizado estudios genéticos para verificar su diferenciación y la posición taxonómica que ocupan, por lo tanto los objetivos en este trabajo fueron: 21 Objetivo general: Evaluar la variación genética en las poblaciones de Campylopterus hemileucurus mediante genes mitocondriales y nucleares. Objetivos particulares: Examinar la variación espacial de la diversidad genética entre las poblaciones de Campylopterus hemileucurus hemileucurus. Realizar una comparación filogenética entre las poblaciones de Campylopterus hemileucurus hemileucurus y Campylopterus hemileucurus mellitus. 22 Materiales y métodos Se utilizaron 40 muestras de tejido muscular preservadas en ultra congelación pertenecientes a 41 individuos los cuales fueron colectados previamente en distintos puntos en la República Mexicana en diferentes proyectos de investigación a cargo de la Colección Nacional de Aves, del Instituto de Biología de la UNAM en los años 1994 a 2007 (Figura 2). Las muestras preservadas en buffer donadas fueron obtenidas en los estados de Chiapas, Tabasco, Veracruz, Oaxaca y Guerrero (Tabla 1). Tabla 1. Muestras de Campylopterus hemileucurus hemileucurus donadas por la CNAV Población Punto Muestra Estado Municipio Latitud Longitud Año SVeracruz 1 TUX1401 Veracruz San Andrés Tuxtla 18.5833 -95.0666 1994 SVeracruz 1 TUX1023 Veracruz San Andrés Tuxtla 18.5833 -95.0666 1994 SVeracruz 1 TUX1050 Veracruz San Andrés Tuxtla 18.5833 -95.0666 1994 SVeracruz 1 TUX1018 Veracruz San Andrés Tuxtla 18.5833 -95.0666 1994 SVeracruz 1 KSW4118 Veracruz San Andrés Tuxtla 18.5833 -95.0666 2003 SVeracruz 1 KSW4121 Veracruz San Andrés Tuxtla 18.5833 -95.0666 2003 SVeracruz 2 PEP2463 Veracruz San Andrés Tuxtla 18.5262 -95.1462 1994 SVeracruz 3 BTS07310 Veracruz San Andrés Tuxtla 18.6399 95.09344 2007 SVeracruz 4 PEP2571 Veracruz Soteapan 18.3483 -94.8474 1994 SVeracruz 4 PEP2699 Veracruz Soteapan 18.3473 -94.8474 1994 SVeracruz 4 PEP2703 Veracruz Soteapan 18.3473 -94.8474 1994 SVeracruz 5 PEP2845 Veracruz Soteapan 18.2666 -94.85 1994 SVeracruz 6 PEP2808 Veracruz Tatahuicapan de Juárez 18.3483 -94.7383 1994 SVeracruz 6 PEP2809 Veracruz Tatahuicapan de Juárez 18.3483 -94.7383 1994 SVeracruz 7 FTS011101 Veracruz Catemaco 18.43 -94.9651 Sin datos 23 SVeracruz 7 FTS011102 Veracruz Catemaco 18.43 -94.9651 Sin datos SVeracruz 7 NGR1012 Veracruz Catemaco 18.43 -94.9651 2010 SVeracruz 7 NGR10140 Veracruz Catemaco 18.43 -94.9651 2010 SVeracruz 7 NGR1031 Veracruz Catemaco 18.43 -94.9651 2010 SVeracruz 7 PRZ1013 Veracruz Catemaco 18.43 -94.9651 2010 SVeracruz 7 PRZ1090 Veracruz Catemaco 18.43 -94.9651 2010 SVeracruz 7 PRZ1010 Veracruz Catemaco 18.43 -94.9651 2010 SChis 8 BMM457 Chiapas Unión Juárez 15.0869 -92.1562 1990 NChis 9 BMM570 Chiapas Pueblo Nuevo 17.2127 -92.8652 1991 SChis 10 JK07295 Chiapas La Concordia 15.8938 -93.0193 2007 SChis 11 CHIS101 Chiapas Pijijiapan 15.6774 -93.1954 Sin datos OCSelvaZo 12 CHIMA284 Oaxaca Santa María Chimalapa 17.0966 -94.1203 1995 OCSelvaZo 12 CHIMA310 Oaxaca Santa María Chimalapa 17.0966 -94.1203 1995 OcSelvaZo 12 CHIMA538 Oaxaca Santa María Chimalapa 17.0966 -94.1203 1995 OCSelvaZo 13 CHIMA411 Oaxaca Santa María Chimalapa 17.0546 -94.1761 1995 OCSelvaZo 13 CHIMA486 Oaxaca Santa María Chimalapa 17.0513 -94.6577 1995 OCSelvaZo 14 CHIMA235 Oaxaca Santa María Chimalapa 16.9466 -94.7282 1995 OCSelvaZo 15 NIZA102 Oaxaca Asunción Ixtaltepec 16.4954 -94.9948 2002 OCSelvaZo 15 NIZA106 Oaxaca Asunción Ixtaltepec 16.4954 -94.9948 2002 OCSelvaZo 15 NIZA132 Oaxaca Asunción Ixtaltepec 16.4954 -94.9948 2002 NChis 16 CAM379 Tabasco Huimanguillo 17.3333 -93.6083 1996 NChis 16 CAM430 Tabasco Huimanguillo 17.3333 -93.6083 1996 NChis 17 PEP3093 Tabasco Tacotalpa 17.569 -92.8133 1996 OaxNte 18 GMM1024 Oaxaca San Felipe Jalapa de Díaz 18.0572 -96.6439 Sin datos Guerrero 19 Molgro481 Guerrero Cochoapa el Grande 17.1741 -98.5256 2013 Guerrero 19 Molgro482 Guerrero Cochoapa el Grande 17.1741 -98.5256 2013 24 Figura 3. Distribución de los puntos de colecta de muestras donadas por la CNAV de Campylopterus hemileucurus hemileucurus en México. Descripción de las localidades Veracruz, Reserva de la Biosfera Los Tuxtlas (Puntos 1, 2 y 3): Se encuentra ubicada en la planicie costera del Golfo de México en el Estado de Veracruz, delimitada por la costa de Golfo de México en Punta Puntillas, al norte limita con el lago de Catemaco y al sureste con la zona Federal MarítimoTerrestre de la costa del Golfo de México. Tiene una superficie total de 155,122 ha y cuenta con tres zonas núcleo; El volcán San Martín Pajapan, el volcán Santa Martha y el volcán San Martín Tuxtla (SEMARNAP, 1998). 25 El clima de la región se encuentra fuertemente influenciado por su orografía, lo que da como consecuencia un gradiente altitudinal, térmico y de humedad. Se han registrado temperaturas en la media anual mayor a 22ºC y la media del mes más frío superior a 28ºC, en tanto que en el semicálido la media anual es mayor a 18ºC. En la Reserva se encuentra una enorme biodiversidad, comparable con pocas áreas de México; en ella, se pueden identificar hasta 15 tipos de vegetación que contienen uno de los últimos reductos de selvas húmedas en el país (CONANP, 2019). Muestras obtenidas en esta zona: KSW4118, KSW4121, TUX1401, TUX1023, TUX1050, TUX1018, PEP2463, BTS07310. Soteapan (Puntos 4 y 5): Se encuentra ubicado en el sureste del Estado, en las estribaciones de la Sierra de los Tuxtlas. Limita al norte con el Golfo de México, al este con Mecayapan, al sur con Chinameca y Acayucan, al oeste con Hueyapan de Ocampo y Catemaco. Su distancia aproximada al sureste de la capital del Estado, por carretera es de 260 Km (Ramírez, 2012). Su clima es cálido-regular con una temperatura promedio de 23° C; su precipitación pluvial media anual es de 1,182.7 mm. Los ecosistemas que coexisten en el municipio son el de bosque alto tropical perennifolio con caoba, ramón, amate, jinicuil, palo de agua, rosa morada, barbasco, zapote de agua, donde se desarrolla una fauna compuesta por poblaciones de ardillas, conejos, tuzas, mono, coyote; colibrí, loro, zopilote; coralillo, iguana, culebra de agua; mojarra, robalo y chucumite (INAFED ,2019d). 26 Muestras obtenidas en esta zona: PEP2699, PEP2703, PEP2571, PEP2845. Tatahuicapan de Juárez (Punto 6): Entre los paralelos 18° 11’ y 18° 31’ de latitud norte; los meridianos 94° 41’ y 94° 54’ de longitud oeste; altitud entre 10 y 800 m. Colinda al norte con el municipio de Mecayapan y el Golfo de México; al este con el Golfo de México y el municipio de Pajapan; al sur con los municipios de Pajapan y Mecayapan; al oeste con los municipios de Mecayapan, Soteapan y Catemaco. Ocupa el 0.4 % de la superficie del estado. Temperatura oscila entre 18° C a 26° C el clima es Cálido húmedo con lluvias todo el año (65%), cálido húmedo con abundantes lluvias en verano (31%) y semicálido húmedo con lluvias todo el año (4%) (INEGI, 2019). Muestras obtenidas en esta área: PEP2808, PEP2809 Catemaco (Punto 7): El Puerto de Catemaco se ubica en la zona centro-sur del estado limitando al norte con el Golfo de México, al este con el municipio de Mecayapan, al sureste con Soteapan, hacia el sur con Hueyapan de Ocampo y al oeste con el municipio de San Andrés Tuxtla. Su extensión territorial es de 710.67 km². Catemaco se encuentra en el corazón de Los Tuxtlas, a unos 160 kilómetros al sur del puerto de Veracruz. La ciudad de unos 26,000 habitantes ocupa 2 ½ km a lo largo de la Laguna de Catemaco desde el borde del Río Grande a Playa Espagoya. El clima del municipio es húmedo-templado la mayor parte del año con algunos periodos calurosos durante el verano, con una temperatura promedio anual de 24,6° C. Se encuentran árboles frutales como el jobo, mango, nanche. Además de la vegetación de selva tupida y de sabana, se 27 encuentran: la de selva menos compacta que bordea a la costa, formaciones boscosas bajas en las playas, los manglares (SEMAR, 2019). Muestras obtenidas en esta zona: PRZ1010, PRZ1013, PRZ1090, NGR10140, NGR1012, FTS01101, FTS01102. Chiapas, Reserva de la Biosfera Volcán Tacaná (Punto 8.): La Reserva de la Biosfera Volcán Tacaná se localiza en la parte alta del volcán, incluye parte de los municipios Cacahotán, Unión Juárez y Tapachula y abarca una superficie de 6 mil 378-36- 95.86 hectáreas. La ubicación de esta Área Natural Protegida en los límites fronterizos entre México y Guatemala cumple una función relevante ya que es el origen de cuencas compartidas entre los países, dos de ellas son las de los ríos Suchiate y Coatán. La zona donde se ubica la Reserva es una de las áreas que presenta mayores volúmenes de precipitación en toda la región e incluso a nivel nacional, ya que se registran lluvias anuales en promedio de 4 mil 438.28 milímetros. La vegetación, con base en la imagen satelital 2005 Inventario Nacional Forestal (2000), que se distribuye en la Reserva, incluye bosque mesófilo de montaña, agricultura de temporal, pastizal inducido, selva alta y mediana perenne (CONANP, 2013). Muestras obtenidas en esta zona: BMM457. 28 Chiapas, Pueblo Nuevo (Punto 9): Este municipio pertenece a las regiones terrestres prioritarias de México; Bosques mesófilos de los altos de Chiapas. Esta región fue considerada prioritaria en virtud de que existe una alta diversidad de lepidópteros con poblaciones relictuales y especies de aves endémicas y en peligro de extinción. Especies endémicas de anfibios y reptiles que son las únicas extensiones en la región norte del estado de Chiapas. Se incluyen algunos fragmentos de bosque de pino-encino. Es importante destacar que la mayor parte de las regiones donde se reporta el bosque mesófilo se encuentra perturbado con vegetación secundaria y en la parte baja se desarrollan actividades agropecuarias. Un fenómeno propio de esta RTP es el hecho de que el bosque mesófilo ocupa pisos altitudinales superiores al bosque mixto de pino-encino. Los principales tipos de vegetación y uso del suelo representados en esta región, así como su porcentaje de superficie son: Bosque mesófilo de montaña Bosque con vegetación densa, muy húmedos, de clima templado. 61% sólo se presenta en laderas superiores a los 800 m. Agricultura, pecuario y forestal, actividades que hacen uso de los recursos forestales y ganaderos, 17%, puede ser permanente o de temporal. Bosque de pino y bosques predominantes de pino, a pesar de distribuirse en 16% zonas templadas, son característicos de zonas frías (Arriaga et al., 2000). Muestra obtenida en esta área: BMM570. 29 Chiapas, Reserva de la Biosfera El Triunfo (Puntos 10 y 11).: La Reserva de la Biosfera El Triunfo se localiza en la porción central de la Sierra Madre de Chiapas, entre los 15° 09’ 10” y 15° 57’ 02”, latitud norte y 92° 34’ 04” y 93° 12’ 42”, longitud oeste. Cuenta con una superficie total de 119,177-29-00 has, y abarca parte de los municipios de Pijijiapan, Mapastepec, Acacoyagua, Ángel Albino Corzo, La Concordia, Villa Corzo y Siltepec, comprendidos en las regiones económicas Frailesca, Sierra, Istmo, Costa y Soconusco, del estado de Chiapas (SEMARNAT y CONANP, 1999). La Reserva de la Biosfera El Triunfo protege a 10 tipos de vegetación, de los 19 con que cuenta Chiapas, de acuerdo con la clasificación de Breedlove (1981) éstas son: matorral perennifolio de neblina, bosque lluvioso de montaña, bosque perennifolio de neblina, bosque lluvioso de montaña baja, bosque estacional perennifolio, bosque de pino encino-liquidámbar, bosque de pino- encino, bosque de galería o ripario, selva baja caducifolia y comunidades secundarias arbóreas y arbustivas. Entre ellos destacan dos de los más amenazados en México: el bosque de niebla y el bosque lluvioso. El bosque de niebla de El Triunfo es reportado como uno de los de mayor diversidad de especies de árboles en Norte y Centro América según (Vázquez-García, 1993). Muestras obtenidas en esta zona: JK07295, CHIS101. 30 Santa María Chimalapa (Puntos 12, 13 y 14): Una región reconocida por su biodiversidad alta y por su buen estado de conservación es la conocida como Los Chimalapas, ubicada en el este del Estado de Oaxaca, en el sureste de México, incluye los municipios de Santa María Chimalapa y San Miguel Chimalapa y es partede la Selva Zoque, junto con la Selva del Ocote y La Sepultura en Chiapas. Esta región abarca casi 600 mil hectáreas de las cuales el 64% están cubiertas por selva alta y mediana (Salas et al., 2001; Martínez, 2012). Están presentes 41 especies de mamíferos terrestres de talla media y grande, que representan el 54% de riqueza a nivel nacional de este grupo, y de éstas, 20 pertenecen al orden Carnívora 66% de la riqueza nacional (Olguín et al., 2008; Galindo y Lira 2012). Muestras obtenidas en esta zona: CHIMA 284, CHIMA310, CHIMA486, CHIMA411, CHIMA 538, CHIMA235. Asunción Ixtaltepec (Punto 15.): Se ubica entre los paralelos 16°26’ y 16°51’ de latitud norte; los meridianos 94°48’ y 95°11’ de longitud oeste; altitud entre 0 y 800 m. Colinda al norte con los municipios de El Barrio de la Soledad y Santa María Chimalapa; al este con los municipios de Santa María Chimalapa, San Miguel Chimalapa y Heroica Ciudad de Juchitán de Zaragoza; al sur con los municipios de Heroica Ciudad de Juchitán de Zaragoza, El Espinal, San Blas Atempa y San Pedro Comitancillo; al oeste con los municipio de San Pedro Comitancillo, Magdalena Tlacotepec, Ciudad Ixtepec y El Barrio de la Soledad. Se registran temperaturas alrededor de 24 – 28°C, el clima es cálido 31 subhúmedo con lluvias en verano, menos húmedo (52.93%), cálido subhúmedo con lluvias en verano, de humedad media (46.54%) y cálido subhúmedo con lluvias en verano, más húmedo (0.53%) (INEGI, 2019a). Muestras obtenidas en esta zona: NIZA106, NIZA102, NIZA132. Huimanguillo (Punto 16).: Se localiza en la región de la Chontalpa, colinda al norte con el municipio de Cárdenas, al sur con los estados de Chiapas y Veracruz, al este con el estado de Chiapas y al oeste con el estado de Veracruz; posee referencias especiales o mojoneras naturales que señalan sus límites. Se aprecian dos tipos de clima: el cálido húmedo con abundantes lluvias en verano con cambios térmicos en los meses de diciembre-enero; su temperatura media anual es de 26.2°C, siendo la máxima media mensual en mayo con 30.6°C; a la vez, la máxima y mínima absoluta alcanzan los 45°C y 14°C, respectivamente; el clima cálido húmedo con lluvias todo el año (Af) se da en la parte sur y suroeste, colindando con los estados de Veracruz y Chiapas, éstas lluvias decrecen ligeramente en invierno, período en la cual se registra el 14.4% del total anual. La temperatura media oscila entre los 25.4 °C y 26.9°C (INAFED, 2019a). Muestras obtenidas en esta zona: CAM379, CAM430. 32 Tacotalpa (Punto 17): El municipio de Tacotalpa se localiza en la región de la sierra, Colinda al norte con los municipios de Jalapa y Macuspana; al sur y al este con el estado de Chiapas; al oeste con el municipio de Teapa. El clima es cálido húmedo con abundantes lluvias todo el año, presenta cambios térmicos en los meses de octubre, noviembre y diciembre. Temperatura media anual de 25.6°C, siendo la máxima media mensual de 29.2°C en el mes de mayo, la mínima media mensual de 22°C en los meses de diciembre y enero. La vegetación predominante en los últimos años ha sido la selva alta perennifolia que ha dado paso paulatinamente a la apertura de nuevas vegetaciones producto de la actividad agrícola predominante en la zona como es la actividad maicera, las plantaciones cafetaleras y la ganadería. La diversidad de la vegetación se refleja en la flora que va desde las praderas cultivadas hasta las zonas selváticas en donde es posible todavía hoy observar especies de flora y fauna en vías de extinción como el canacoite, árbol que por su rareza se encuentra en la lista de especies amenazadas (INAFED, 2019c). Muestras obtenidas en esta zona: PEP3093. 33 San Felipe Jalapa de Díaz (Punto 18.): El municipio de San Felipe Jalapa de Díaz, se localiza en las coordenadas 18º 04’ latitud norte y 96º 32’ longitud oeste, a una altura de 140 metros sobre el nivel del mar, limita con el municipio de San Pedro Ixcatlán al norte, al sur con San Andrés Teotilalpan, San Pedro Sochiapan y San Felipe Usila y al oriente con San José Independencia, San Lucas Ojitlán y al poniente con San Bartolomé Ayautla. El clima es caluroso, mantiene una temperatura de 24. 7º C con régimen de lluvias en los meses de junio, julio, agosto, septiembre y octubre. La flora que caracteriza al municipio es la de selva media, en donde predominan las siguientes especies, el amate, higo, aguacatillo, caoba, roble, cedro, palma, ceiba y hormiguillo. La fauna del municipio es de tipo silvestre, presenta las siguientes especies: venado temazate, jaguar, venado cola blanca, zorro gris, puerco espín, armadillo, mapache, aguilillas y gavilán (INAFED, 2019b). Muestra obtenida en esta área: GMM1024. Guerrero, Cochoapa el grande (Punto 19): El municipio de Cochoapa el Grande se localiza a 2000 metros sobre el nivel del mar. Ubicado entre los paralelos 17°11’ de latitud norte y 98°27’ de longitud oeste respecto al meridiano de Greenwich. Colinda al norte con el municipio de Metlatonoc; al sur con el municipio de Metlatonoc y el de Tlacoachistlahuaca. Presenta tres tipos de clima, cálido-subhúmedo, semicálido y subhúmedo- templado los meses de Abril y Mayo son los más calurosos, y los más frescos, 34 Enero y Febrero, con una temperatura media anual de 22 °C. Las lluvias se presentan de Junio a Octubre con una precipitación de 2,400 milímetros. Predomina una cubierta vegetal típica de las zonas templadas áridas. Existe selva baja caducifolia en donde se puede encontrar mezquite, matorral espinoso, nopaleras y pastizal; abundan bosques de pino, encino y mesófilo de montaña (INAFED, 2019). Muestras obtenidas en esta área: Molgro481, Molgro482. 35 Trabajo de laboratorio A todas las muestras de tejido muscular se les realizó una extracción de DNA genómico usando la técnica fenol-cloroformo compuesta por cuatro etapas principales: Homogenización del tejido y lisis celular, separación de proteínas, precipitación del DNA y redisolución. Después, se comprobó la integridad del DNA por electroforesis en gel de agarosa al 1% y las extracciones obtenidas se almacenaron a -4ºC (Sambrook et al., 1989). Protocolo de extracción de DNA para tejido animal (Sambrook et al., 1989): Se rotularon tres series de tubos Eppendorf de 1.5 ml. A la primera serie de tubos se les añadió un fragmento de tejido muscular (aproximadamente 3mm), 700μl de Buffer de extracción (que contenía: 10Mm Tris- HCl pH8.0; 100mM EDTA; 100Mm NaCl y 1% SDS) y 7μl de Proteinasa K (20 mg/ml). Se dejaron incubando las muestras a 56°C con agitación, durante dos días. En los tubos con las muestras, se agregó 250μl de fenol y 250 μl de cloroformo (diclorometano +isoamílico 24:1). Se agitaron bien y se centrifugaron durante 10 minutos a 13200rpm. El sobrenadante se trasladó a la segunda serie de tubos rotulados y se les agregaron 500μl de cloroformo, se agitó bien y se centrifugaron nuevamente 10 min a 13,200 rpm. 36 Después se trasladó el sobrenadante a la tercera serie de tubos y se añadieron 700μl de alcohol frio (100%). Se dejó precipitar durante la noche a 4°C. Luego se centrifugó durante 10 minutos a 13,200 rpm a 4°C en una centrifuga refrigerada. Se extrajo el sobrenadante utilizando una pipeta de 200μl, teniendo cuidado de no llevarse el botón de DNA. Se añadió a cada tubo 700μl de etanol al 70% frio. Se centrifugó nuevamente durante 10minutos a 13200rpm. Se extrajo nuevamente el alcohol utilizando una pipeta de 200μl, teniendo cuidado de no llevarse el botón de DNA. Se dejó secar el precipitado con los tubos abiertos cubiertos con un papel secante, de un día para otro. Finalmente, se re-suspendió el botón de DNA en 200μl de agua bidestilada estéril. Para verificar la presencia de DNA se realizó una electroforesis en gel de agarosa al 1%. El gel de agarosa se preparó utilizando 0.4gde Agarosa y 40ml de Buffer TBE 0.5x, se cargaron los pozos del gel con 1μl de DNA, 1μl red gel y 1μl Buffer LB y un pozo con escalera de 50pb utilizada como referencia, después se aplicaron 85 voltios durante 45 minutos, finalizado el tiempo se observó en un transiluminador (Figura 4). 37 Figura 4. Gel de agarosa de las extracciones realizadas con fenol- cloroformo de algunas muestras de Campylopterus hemileucurus Amplificación: Se amplificaron 4 genes, dos mitocondriales y dos nucleares mediante la reacción en cadena de la polimerasa, conocida como PCR. Los reactivos y las cantidades utilizadas para la amplificación de las secuencias se muestran en la Tabla 2, los oligonucleótidos utilizados se muestran en la Tabla 3. Tabla 2. Reactivos empleados para la amplificación de los fragmentos COI, ND2, FIB Y TGFB2 de Campylopterus hemileucurus mediante la técnica de PCR Reactivo Cantidad Trehalosa 10% 6.25μl H2O 22μl Buffer 10x 13.75μl MgCl2 50Mm 6.875μl Primer A 1.375μl Primer B 1.375μl DNTPS 0.6875μl Taq Polimerasa 0.66μl Total 10.4975μl 38 Tabla 3. Oligonucleótidos y condiciones utilizadas para la amplificación de fragmentos mitocondriales y nucleares de Campylopterus hemileucurus Gen Primer Secuencia amplificada Temperatura Tamaño Fuente ND2 L5215 5’- TATCGGGCCCATACCCCGAAAAT- 3’ 54ºC 900pb Hackett , S. J. 1996 H6313 5’- CTCTTATTTAAGGCTTTGAAGGC-3’ Sorens on et al.,199 9 H5677 5’- DGADGARAADGCYARRAYYTTDCG -3’ 500pb Brumfie ld et al.,200 7 COI COIbirdF 1 5’- TTCTCCAACCACAAAGACATTGGC AC-3’ 48ºC 600pb Hebert et al. 2004 COIbirdR 1 5’- ACGTGGGAGATAATTCCAAATCCT GG-3’ TGFB 2 TGFB2F 5’-AGGCAGCAATTATCCTGCAC-3’ 64ºC 500pb Burt,19 91 TGFB2R 5’-GAAGCGTGCTCTAGATGCTG-3’ FIB5 FIB5 5’- CGCCATACAGAGTATACTGTGACA T-3’ 55ºC 500pb Marini, M. Â., Hackett , S.J.200 2 FIB6 5’-GCCATCCTGGCGATTCTGAA-3’ 39 La amplificación se llevó a cabo en un termociclador Eppendorf Mastercicle Pro 384 con los siguientes programas: NADH Deshidrogenasa subunidad 2 (ND2): Para el gen que codifica la NADH Deshidrogenasa subunidad 2 (ND2) se utilizaron los oligonucleótidos L5215 (5’-TATCGGGCCCATACCCCGAAAAT -3’) (Hackett, 1996) y H6313 (5’-CTCTTATTTAAGGCTTTGAAGGC-3’) (Sorenson et al., 1999), mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) con el siguiente protocolo: Desnaturalización inicial a 94ºC durante 2 minutos, 40 ciclos con desnaturalización a 94ºC durante 30 segundos, alineación a 54ºC durante 45 segundos, extensión a 72ºC durante 2 minutos, por último, extensión final a 72ºC durante 10 minutos, 4ºC y pausa. Para algunas muestras se utilizaron los oligonucleótidos L5215 (5’- TATCGGGCCCATACCCCGAAAAT -3’) (Sorenson et al., 1999) y H5677 (5’- DGA DGARAA DGC YAR RAY YTT DCG3-3’) (Brumfield y Edwards, 2007) y se utilizó el mismo programa. Citocromo oxidasa I (COI): Con el fin de amplificar la región que codifica el gen mitocondrial Citocromo oxidasa I(COI) se utilizaron los oligonucleótidos COIBIRDF1 (5’TTCTCCAACCACAAAGACATTGGCAC-3’) Y COIBIRDR1(5’ ACGTGGGAGATAATTCCAAATCCTGG-3’) (Hebert et al. 2004), se realizó una desnaturalización inicial a 94ºC por un minuto, continuó con 5 ciclos de desnaturalización a 94ºC durante 30 segundos, para la alineación se utilizó una temperatura de 48ºC durante 40 segundos, para la etapa de la extensión inicial se llevó a cabo a 72ºC durante 1 minuto y después en 35 ciclos se 40 desnaturalizó a 94ºC durante 30 segundos, alineación a 51ºC durante 40 segundos, extensión a 72ºC por 1 minuto y finalmente, la extensión final a 72ºC durante 10 minutos, posteriormente 4ºC y pausa. Factor de Crecimiento Transformante Beta 2 (TGFB2): Para la Amplificación del gen del Factor de Crecimiento Transformante Beta 2 (TGFB2) se emplearon los oligonucleótidos TGFB2F (5’- AGGCAGCAATTATCCTGCAC-3’) y TGFB2R (5’- GAAGCGTGCTCTAGATGCTG-3’) (Burt y Paton, 1991). El programa utilizado consistió en: Desnaturalización inicial a 94ºC durante 2:00, desnaturalización a 95ºC durante 0:30, alineación a 64ºC durante 0:30, extensión a 72ºC durante 0:45, extensión final a 72ºC durante 10:00, finalmente, 4ºC y pausa. Cadena beta de Fibrinógeno (FIB5): Para la amplificación del gen FIB5 que codifica para la cadena beta de fibrinógeno (FIB5) se utilizaron los oligonucleótidos FIB5 (5’- CGCCATACAGAGTATACTGTGACAT-3’) y FIB6 (5’- GCCATCCTGGCGATTCTGAA-3’) (Marini y Hackett, 2002). Se llevó a cabo una desnaturalización inicial a 94ºC durante 2 minutos, después se continuó con 30 ciclos de desnaturalización a 95ºC durante 30 segundos, la alineación a 55ºC durante 30 segundos, la extensión a 72ºC durante 45 segundos, y extensión final a 72ºC durante 10 minutos, finalmente, 4ºC y pausa. Todos los productos obtenidos de la PCR fueron sometidos a electroforesis en gel de agarosa con concentración de 1% y visualizados en transiluminador. Se 41 colocó un control negativo durante todas las pruebas para descartar contaminación. Secuenciación: Se realizó en el Instituto de Biología por parte de Laboratorio de Secuenciación Genómica de la Biodiversidad y la Salud. Análisis genéticos: Las secuencias obtenidas fueron visualizadas y editadas mediante el programa Seq trace, se eliminaron las zonas cercanas a los oligonucleótidos y se revisó que las lecturas de los nucleótidos por parte del programa fueran correctas, después se convirtieron a formato FASTA. Con el programa MEGA 6 (Tamura et al., 2016) se realizó una matriz para cada gen, se verificó la ausencia de pseudogenes detectando la presencia de codones de paro, esto a través de la traducción a aminoácidos. Posteriormente se realizó un alineamiento múltiple para cada matriz utilizando MAFFT online (Katoh et al, .2017). Con esto se obtuvieron 4 matrices (la primera de COI, la segunda de ND2, la tercera de FIB5 y la última de TGFB2). Con el programa MESQUITE (Maddison y Maddison, 2011) se hicieron otras 4 matrices, en las que las secuencias se concatenaron de la siguiente manera: en la primer matriz se incluyeron todos los genes (COI+ND2+FIB5+TGFB2), se utilizaron 29 secuencias de Campylopterus hemileucurus hemileucurus de la CNAV, se realizó una búsqueda de secuencias en Genbank y se añadieron 13 secuencias de Campylopterus h. mellitus con códigos de acceso: BSPBA66907, BSPBA67007, BSPTR04713, BSPTR04813, BSPTR06413, BSPTR13213, BSPTR13313, JQ174259.1, JQ1742601, JQ1742611, USNMA03510, 42 USNMA54910, USNMA55010, 2 secuencias fueron utilizadas de Orthorhyncus cristatus como grupo externo con código de acceso: JQ175632.1, JQ175633.1, finalmente quedaron 44 secuencias dentro de la matriz. En la segunda matriz se concatenaron las secuencias de los genes mitocondriales (COI+ND2), se utilizaron 37 secuencias de la CNAV, a través de una búsqueda de secuencias en Genbank se añadieron 13 secuencias pertenecientes a Campylopterus hemileucurus mellitus con los siguientes códigos de acceso: BSPBA66907, BSPBA67007, BSPTR04713, BSPTR04813, BSPTR06413, BSPTR13213, BSPTR13313, JQ174259.1, JQ1742601, JQ1742611, USNMA03510, USNMA54910, USNMA5501. Como grupo externo, se agregaron 2 secuencias de Orthorhyncus cristatus con códigos de acceso JQ175632.1, JQ175633.1, finalmente quedaron 51 secuencias en la matriz. La tercera matriz se realizó con 40 secuencias del gen COI pertenecientes a Campylopterus hemileucurus de la CNAV, mediante una búsqueda en Genbank se agregaron 13 secuencias de Campylopterus hemileucurus mellitus con códigos de acceso: BSPBA66907, BSPBA67007, BSPTR04713, BSPTR04813, BSPTR06413, BSPTR13213, BSPTR13313, JQ1742591, JQ1742601, JQ174261.1, USNMA54910, USNMA03510, USNMA55010 y 2 secuencias como grupo externo de Orthorhyncus cristatus con código de acceso JQ175632.1 y JQ175633.1 quedando finalmente 55 secuencias en total. En la cuartamatriz se concatenaron 32 secuencias de FIB5 y TGFB2, no se encontraron secuencias de Orthorhyncus cristatus para utilizar como grupo 43 externo por lo tanto se agregó una secuencia de Calypte anna con código de acceso: XM008496577.1 obtenida de Genbank (Tabla 4). Tabla 4. Códigos de acceso de las secuencias agregadas a las matrices de gen Secuencias de Genbank utilizadas en las matrices Especie Número de acceso Lugar de Colecta C. hemileucurus mellitus JQ1742591 Panamá, Chiriquí C. hemileucurus mellitus JQ1742601 Panamá, Chiriquí C. hemileucurus mellitus JQ1742611 Panamá, Chiriquí C. hemileucurus mellitus BSPTR064-13 Panamá, Boquete C. hemileucurus mellitus USNMA035-10 Panamá, Chiriquí C. hemileucurus mellitus USNMA550-10 Panamá,Chiriquí C. hemileucurus mellitus BSPAA670-07 Panamá, Chiriquí, Boquete C. hemileucurus mellitus BSPBA669-07 Panamá, Gualaca C. hemileucurus mellitus BSPTR047-13 Panamá, Chiriquí,Boquete C. hemileucurus mellitus BSPTR048-13 Panamá, Chiriquí,Boquete C. hemileucurus mellitus BSTR133-13 Panamá,Chiriquí,Hato Chami C. hemileucurus mellitus BSTR132-13 Panamá, Chiriquí,Hato Chami C. hemileucurus mellitus USNMA549-10 Panamá,Chiriquí Klais guimeti ROMC092-07 Costa Rica, Punta Arenas Orthorhyncus cristatus JQ175632.1 Parroquia, San Vicente de las Granadinas Orthorhyncus cristatus JQ175633.1 Parroquia, San Vicente de las Granadinas Calypte anna XM008496577.1 Estados Unidos 44 En todas las matrices se verificó la ausencia de codones de paro a lo largo de las secuencias mediante la traducción a aminoácidos en el programa MEGA6 (Tamura et al., 2016), también se realizó una cuantificación de caracteres totales, caracteres conservados, caracteres variables, caracteres informativos no informativos en cada matriz y la composición nucleotídica de las secuencias. Se decidió utilizar la matriz del gen COI con 55 secuencias de Campylopterus hemileucurus hemileucurus y Campylopterus hemileucurus mellitus debido a que tenía un mayor número de secuencias en comparación con las otras matrices y por lo tanto era más representativa, se eliminaron las secuencias del grupo externo y quedaron 53 secuencias en total. Posteriormente, con la matriz del gen COI, en MEGA6 se obtuvo la diversidad nucleotídica y con el programa DNAsp (Librado y Rosas, 2009) se calculó el número de haplotipos y la diversidad haplotípica. La diversidad haplotípica mide la singularidad de un haplotipo en una población dada con relación al tamaño muestral, es decir, es la probabilidad de que dos haplotipos tomados al azar de una población sean diferentes. Por otro lado, la diversidad nucleotídica es la probabilidad de que dos nucleótidos con homología de posición tomados al azar sean distintos. Cuantos más altos sean estos valores más alta es la variabilidad genética de la población. Un punto importante es que se ha mencionado que la diversidad nucleotídica es una medida más adecuada de variabilidad genética obtenida a partir de secuencias ya que no es tan dependiente del tamaño de muestra ni del tamaño 45 de la secuencia analizada como la diversidad haplotípica (Nei et al., 1979). Posteriormente, las secuencias se agruparon en poblaciones y se obtuvieron los parámetros: haplotipos, sitios polimórficos, diversidad haplotípica, diversidad nucleotídica y Tajima D (Tabla 10). Se generó un archivo con extensión .rdf, a continuación, con el programa PopArt se generó una red de haplotipos mediante Media-Joining. Análisis filogenéticos: Se utilizó el programa JModelTest v 2.1.4 (Posada, 2008) para establecer el modelo de sustitución nucleotídica correcto para deducir la evolución de las secuencias en las matrices realizadas previamente. Las relaciones entre los individuos fueron resueltas mediante análisis filogenéticos utilizando los métodos, Máxima Verosimilitud (MV), Inferencia Bayesiana (IB) y Neighboor Joining. El análisis de Máxima Verosimilitud se realizó mediante MEGA6 (Tamura et al., 2016) con el modelo TrN+I+G y dado que el modelo no garantiza encontrar la mejor topología se realizaron 1000 bootstraps para evaluar el apoyo de los nodos, los árboles iniciales a partir de una búsqueda heurística se obtuvieron automáticamente aplicando los algoritmos Neighbor Joining y BioNJ a una matriz de distancias por pares estimadas utilizando el enfoque Maximum Composite Likelihood (MCL) y después se seleccionó la topología con mayor Verosimilitud, se utilizó una distribución Gamma discreta para modelar las diferencias evolutivas entre los sitios, finalmente se visualizó en Figtree v.1.4.3.(Rambaut, 2009). 46 El análisis de Inferencia Bayesiana fue realizado con el programa MrBayes v 3.2 (Ronquist et al., 2012) se utilizó el modelo de sustitución TrN+I+G y 10, 000,000 generaciones con 2 cadenas de Markov Monte Carlo calientes y se descartaron el 25% de los árboles generados, el árbol obtenido se visualizó en Figtree v1.4.3. (Rambaut, 2009). Se realizó un análisis de Neighbor Joining con la matriz del gen COI y la matriz de genes mitocondriales (COI+ND2) en MEGA6 (Tamura et al., 2016) se seleccionó el modelo K2P, se incluyeron transiciones y transversiones utilizando gamma de 4.99, utilizando 1000 bootstraps, posteriormente se visualizó en Figtree v 1.3.4. (Rambaut, 2009). Para poder visualizar mejor los árboles filogenéticos obtenidos se elaboraron claves más cortas a partir de las etiquetas de las secuencias de la CNAV (Tabla 5) y las secuencias obtenidas de Genbank (Tabla 6). 47 Tabla 5. Claves que se observan en los análisis filogenéticos de las secuencias utilizadas Muestra Colectado en Especie Clave BMM422 Chiapas C. hemileucurus hemileucurus BM2ChhChia BMM457 Chiapas C. hemileucurus hemileucurus BM7ChhChia BMM570 Chiapas C. hemileucurus hemileucurus BM0ChhChia BTS07310 Veracruz C. hemileucurus hemileucurus S070ChhVer CAM 379 Tabasco C. hemileucurus hemileucurus CA9ChhTab CAM 430 Tabasco C. hemileucurus hemileucurus CA0ChhTab CHIMA235 Oaxaca C. hemileucurus hemileucurus CH5ChhOax CHIMA284 Oaxaca C. hemileucurus hemileucurus CH4ChhOax CHIMA310 Oaxaca C. hemileucurus hemileucurus CH0ChhOax CHIMA411 Oaxaca C. hemileucurus hemileucurus CH1ChhOax CHIMA486 Oaxaca C. hemileucurus hemileucurus CH6ChhOax CHIMA538 Oaxaca C. hemileucurus hemileucurus CH8ChhOax CHIS101 Chiapas C. hemileucurus hemileucurus IS1ChhChia FTS011101 Veracruz C. hemileucurus hemileucurus FT101ChhVer FTS011102 Veracruz C. hemileucurus hemileucurus FT102ChhVer GMM10 24 Oaxaca C. hemileucurus hemileucurus G1024ChhOax JK 07 295 Chiapas C. hemileucurus hemileucurus JK295ChhChia KSW 4118 Veracruz C. hemileucurus hemileucurus KS4118ChhVer KSW 4121 Veracruz C. hemileucurus hemileucurus KS4121ChhVer Molgro481 Guerrero C. hemileucurus hemileucurus MOL481ChhGro Molgro482 Guerrero C. hemileucurus hemileucurus MOL482ChhGro NGR1012 Veracruz C. hemileucurus hemileucurus NG1012ChhVer NGR10140 Veracruz C. hemileucurus hemileucurus NG140ChhVer NG1031 Veracruz C. hemileucurus hemileucurus NG1ChhVer NIZA102 Oaxaca C. hemileucurus hemileucurus NI102ChhOax NIZA106 Oaxaca C. hemileucurus hemileucurus NI106ChhOax NIZA132 Oaxaca C. hemileucurus hemileucurus NI132ChhOax PEP2463 Veracruz C. hemileucurus hemileucurus PE2463ChhVer PEP2571 Veracruz C. hemileucurus hemileucurus PE2571ChhVer PEP2699 Veracruz C. hemileucurus hemileucurus PE2699ChhVer PEP2703 Veracruz C. hemileucurus hemileucurus PE2703ChhVer PEP2808 Veracruz C. hemileucurus hemileucurus PE2808ChhVer PEP2845 Veracruz C. hemileucurus hemileucurus PE2845ChhVer PEP3093 Tabasco C. hemileucurus hemileucurus PE3093ChhTab 48 PRZ1013 Veracruz C. hemileucurus hemileucurus PZ1013ChhVer PRZ1090 Veracruz C. hemileucurus hemileucurus PZ1090ChhVer PRZ1010 Veracruz C. hemileucurus hemileucurusPZ1010ChhVer TUX1401 Veracruz C. hemileucurus hemileucurus TU1ChhVer TUX1023 Veracruz C. hemileucurus hemileucurus TU3ChhVer TUX1050 Veracruz C. hemileucurus hemileucurus TU0ChhVer TUX1018 Veracruz C. hemileucurus hemileucurus TU8ChhVer 49 Tabla 6. Claves utilizadas en los análisis filogenéticos de las secuencias utilizadas obtenidas de Genbank Número de acceso Colectado en Especie Clave JQ1742591 Panamá, Chiriquí C. hemileucurus mellitus JQ9Chmellitus JQ1742601 Panamá, Chiriquí C. hemileucurus mellitus JQ260Chmellitus JQ1742611 Panamá, Chiriquí C. hemileucurus mellitus JQ1Chmellitus BSPTR064-13 Panamá, Boquete C. hemileucurus mellitus BS1Chmellitus USNMA035-10 Panamá, Chiriquí C. hemileucurus mellitus US5Chmellitus USNMA550-10 Panamá, Chiriquí C. hemileucurus mellitus US0Chmellitus BSPAA670-07 Panamá, Chiriquí, Boquete C. hemileucurus mellitus BS70Chmellitus BSPBA669-07 Panamá, Gualaca C. hemileucurus mellitus BS69Chmellitus BSPTR047-13 Panamá, Chiriquí, Boquete C. hemileucurus mellitus BS47Chmellitus BSPTR048-13 Panamá, Chiriquí, Boquete C. hemileucurus mellitus BS48Chmellitus BSTR133-13 Panamá, Chiriquí, Hato Chami C. hemileucurus mellitus BS33Chmellitus BSTR132-13 Panamá, Chiriquí, Hato Chami C. hemileucurus mellitus BS32Chmellitus USNMA549-10 Panamá, Chiriquí C. hemileucurus mellitus US49Chmellitus JQ175632.1 Parroquia, San Vicente de las Granadinas Orthorhyncus cristatus JQ2Ocristatus JQ175633.1 Parroquia, San Vicente de las Granadinas Orthorhyncus cristatus JQ32Ocristatus XM008496577.1 Estados Unidos Calypte anna XM7Calypteanna 50 Después, en MEGA6 (Tamura et al., 2016) con la matriz del gen COI, se tomó como referencia la topología general de las filogenias obtenidas y se realizó un análisis de distancia media entre los grupos filogenéticos utilizando el método K2P en el cual se incluyeron transiciones y transversiones utilizando una distribución gamma con sitios invariantes (g+i) y gamma de 4.99. El modelo calcula el número de diferencias acumuladas entre las secuencias de los grupos desde su último ancestro común esto se realizó para poder estimar la divergencia evolutiva entre las poblaciones mexicanas de (Campylopterus h. hemileucurus) y de Panamá (Campylopterus h. mellitus) Resultados Análisis genéticos: En conjunto, se obtuvieron 39 secuencias correspondientes al gen mitocondrial Citocromo oxidasa I (COI), 37 al gen mitocondrial NADH deshidrogenasa subunidad 2 (ND2), 31 secuencias al gen nuclear del intrón 5 de beta fibrinógeno (FIB5) y 31 secuencias del gen nuclear del intrón de factor de crecimiento transformante beta 2 (TGFB2), para un total de 141 secuencias de Campylopterus h. hemileucurus. Los parámetros obtenidos se observan en la tabla 7 y 8. 51 Tabla 7. Composición nucleotídica de las secuencias de C.h.hemileucurus y C.h mellitus. Timina y Adenina Guanina y Citosina ND2 55.80% 44.20% COI 51.20% 48.80% FIB5 63.30% 46.70% TGFB2 57.30% 42.70% La composición nucleotídica de Guanina y Citosina obtuvo valores de entre 42.70% y 49.80%, los valores que se obtuvieron de Timina y Adenina fueron mayores de entre 51.20% y 63.30%. Tabla 8. Parámetros calculados en las secuencias de C.h.hemileucurus y C.h mellitus. Gen Caracteres totales Conservados Variables Variables Informativos Variables no informativos ND2 899 777 122 84 38 COI 652 560 92 81 11 FIB5 523 523 0 0 0 TGFB2 488 488 0 0 0 Se obtuvo una mayor cantidad de caracteres variables informativos y no informativos en las secuencias de genes mitocondriales, en las secuencias de genes nucleares los valores obtenidos fueron de cero. Matrices concatenadas: En la Matriz de genes mitocondriales (COI+ND2) el número de caracteres totales fue de 1346, 1215 fueron caracteres conservados, 131 variables, 115 informativos y 16 no informativos y se obtuvo la composición nucleotídica la cual fue de T= 24.4%, C=33.5%, A= 29.9% y G=12.1%. 52 En la Matriz genes nucleares (FIB5+TGFB2) el total de caracteres fue de 1016 y de ellos 751 fueron conservados, 260 variables, 2 caracteres fueron sitios informativos y 2 resultaron no informativos. La composición nucleotídica promedio fue de: T=29.2%, C= 18.4%, A=31.2%, G=21.2%. Matriz de todos los genes (COI+ND2+FIB5+TGFB2) el número total de caracteres fue de 2381 caracteres de los cuales 1264 fueron conservados, 1091 resultaron ser variables, 275 informativos y 818 no informativos. Análisis de Haplotipos: En DNAsp (Librado y Rosas, 2009) con la matriz del gen COI se encontraron 8 haplotipos (h) y una diversidad haplotípica (hd) de 0.7417, 13 sitios polimórficos, diversidad nucleotídica de 0.01083, y un índice de neutralidad de 1.45338 el cual resultó no significativo (Tabla 9). Posteriormente en DNAsp (Librado y Rosas, 2009) se agruparon las secuencias de acuerdo a la población a la que pertenecían. La mayor diversidad haplotípica se registró en Guerrero ya que obtuvo un valor de 1, seguido de OcSelvaZo (Oaxaca) con un valor de 0.67857, después Chiapas (SChis) con valor de 0.66667, Veracruz obtuvo un valor de 0.62502, y Tabasco (NChis) obtuvo 0.5000, el menor valor se observó en la población de Panamá con 0.15385, en el caso del norte de Oaxaca no se obtuvo ningún valor ya que solo se tenía una secuencia y no se tenían más muestras para compararla (Tabla 10). 53 Los valores de diversidad nucleotídica del Sur de Chiapas probablemente variaron debido a que este parámetro se basa en el tamaño de la secuencia y no considera el número de muestras, sin embargo a pesar de esto los valores de diversidad haplotípica y nucleotídica coincidieron en que el mayor valor se obtuvo en la Población de Guerrero y el menor en Panamá (Tabla 10). Tabla 9. Parámetros obtenidos con el programa DNAsp (Librado y Rosas, 2009) con la matriz de secuencias del gen COI de Campylopterus h. hemileucurus. Tabla 10. Parámetros obtenidos para cada población de secuencias del gen COI de Campylopterus h. hemileucurus y Campylopterus h. mellitus en DNAsp (Librado y Rosas, 2009). Población Secuencias Haplotipos Sitios Polimórficos Diversidad haplotípica (hd) Diversidad nucleotídica (Pi) Tajima D OaxNte 1 - - - - - Veracruz 22 4 9 0.64502 0.01090 3.06791 NChia 4 2 7 0.50000 0.00888 -0.85987 SChia 3 2 2 0.66667 0.00338 - Guerrero 2 2 7 1.0000 0.01777 - OcSelva Zo 8 3 7 0.67875 0.00973 2.17845 Panamá 13 2 2 0.15358 0.00078 -1.46801 Matriz Secuencias Haplotipos Sitios Polimórficos Diversidad haplotípica (hd) Diversidad nucleotídica (Pi) Tajima D COI 54 8 13 0.7417 0.01083 1.45338 54 Después, con el programa PopART se generó una red en la que se visualizan los haplotipos de las secuencias del gen COI, nuevamente se utilizaron las secuencias de este gen debido a que fue con las que se obtuvieron un mayor número de secuencias para incluir dentro de la matriz, el tamaño de los círculos representa la frecuencia. La mayor frecuencia se observó en el haplotipo 1 ya que estuvo representado por 18 muestras y 5 localidades, el haplotipo 2 obtuvo 17 muestras distribuidas en 5 localidades, seguido del haplotipo 7 el cual se detectó en 12 muestras dentro de la misma localidad. En el Haplotipo 3 se registraron solo 2 muestras de la misma localidad y finalmente, los haplotipos 4, 5, 6 y 8 fueron los que obtuvieron una menor frecuencia ya que solo se encontraron en una muestra. En la red se observan ocho haplotipos pertenecientes a 7 localidades, los haplotipos registrados en un mayor número de localidades fueron el 1 y 2. En el haplotipo 1 se registraron las localidades Guerrero, OaxNte, Veracruz, OcSelvaZo y NChia. En el haplotipo 2 se registraron las localidades Guerrero, SChia, Veracruz, OcSelvaZo y NChia. Los haplotipos 3 y 6 estuvieronrepresentados solo por el haplotipo de SVeracruz. Los haplotipos 4 por SChia y 5 OcSelvaZo. La localidad más representada en un mayor número de haplotipos fue SVeracruz la cual aparece en 4 haplotipos Figura 5. 55 Figura 5.Red de Haplotipos obtenidos con secuencias de Campylopterus h. hemileucurus y Campylopterus h. mellitus del gen COI. Del lado izquierdo en el mapa, se ubican las localidades muestreadas, el color representa a cada localidad. Del lado derecho, cada círculo representa un haplotipo mientras que su tamaño representa la frecuencia. Los colores representan a cada sitio en el que fue identificado ese haplotipo, el tamaño del círculo representa la frecuencia y las barras que cruzan las líneas entre cada uno los cambios mutacionales entre ellos. En color naranja se observan los haplotipos que pertenecen a Guerrero, en verde claro los del Norte de Oaxaca (OaxNte), en morado los de Veracruz (SVeracruz), en azul rey los de la región de la Selva Zoque la cual se encuentra en Oaxaca (OcSelvaZo), en rosa el Norte de Chiapas (NChia), en verde el Sur de Chiapas (SChia) y en amarillo los de Panamá. 56 Análisis filogenéticos: Con el programa JModelTest v 0.1.1 (Posada, 2008) se encontró el mejor modelo de sustitución considerando el criterio de Akaike (AIK) para cada matriz. Para la matriz del gen COI el mejor modelo fue GTR+I y para la matriz de genes mitocondriales (COI y ND2) el mejor resultó HKY+I+G. Con la matriz del gen COI la cual incluía a la mayoría de las secuencias que se han utilizado en este estudio, se realizaron las filogenias y la red de haplotipos con el fin de tener una mayor representatividad de poblaciones. Posteriormente, se realizaron los demás análisis con las matrices mitocondriales, debido a que la matriz de genes nucleares no tuvo sitios informativos, los genes mitocondriales ofrecieron una mejor resolución. 57 Gen COI. En Mega 6 (Tamura et al., 2016) se obtuvo un árbol filogenético por el método de Máxima Verosimilitud con la mayor probabilidad de registro, la cual fue de -992.75. Se registraron valores de soporte de 91.1% a 100% (ver Figura 6). Figura 6. Árbol filogenético de las secuencias COI de Campylopterus h. hemileucurus y Campylopterus h. mellitus con el método de Máxima Verosimilitud, sobre las ramas se observan los valores de Bootstrap 58 Mediante el método de Inferencia Bayesiana con MrBayes (Ronquist et al., 2012) se obtuvo un árbol final después de haber evaluado 15,002 posibles topologías, en el árbol se observan valores de 53.5% a 100% de Bootstrap (Figura 7). Figura 7. Árbol filogenético de las secuencias COI de Campylopterus h. hemileucurus y Campylopterus h. mellitus con el método de Inferencia Bayesiana, sobre las ramas se observan los valores de Bootstrap. 59 Mediante el programa MEGA 6 (Tamura et al., 2016) Con el método de Neighbor-Joining se obtuvo un árbol óptimo con longitud de ramificación de 0.25568590 los valores de Bootstrap estuvieron entre de 50.1% y 100% (Figura 8). Figura 8. Árbol filogenético obtenido con el método Neighbor-Joining a partir de secuencias de Campylopterus h. hemileucurus y Campylopterus h. mellitus del gen COI. 60 Genes mitocondriales (COI+ND2) Con el programa Mega6 (Tamura et al., 2016) se obtuvo un árbol consenso por el método de Máxima Verosimilitud, la mayor probabilidad de registro fue de - 2774.54. Se registraron valores de Boostrap de 56.2% a 100% (Figura 9) Figura 9. Árbol filogenético de las secuencias COI y ND2 de Campylopterus h. hemileucurus y Campylopterus h. mellitus con el método de Máxima Verosimilitud, sobre las ramas se observan los valores de Bootstrap. 61 Se realizó un análisis de Inferencia Bayesiana por medio de MrBayes (Ronquist et al., 2012) en el cual se obtuvo un árbol consenso después de haber evaluado un total de 15002 topologías, en el árbol obtenido se observan valores de 52% a 100% de Bootstrap (Figura 10). Figura 10. Árbol filogenético de las secuencias COI y ND2 de Campylopterus h. hemileucurus y Campylopterus h.mellitus con el método de Inferencia Bayesiana, sobre las ramas se observan los valores de Bootstrap. 62 Con el programa MEGA 6 (Tamura et al., 2016) a través del método de Neighbor-Joining se obtuvo un árbol óptimo con longitud de ramificación de 0.79397558 los valores de Bootstrap fueron de entre de 55% y 100% (Figura 11). Figura 11. Árbol filogenético obtenido con el método Neighbor-Joining con las secuencias mitocondriales ND2 y COI de Campylopterus h. hemileucurus y Campylopterus h. mellitus, sobre las ramas se observan los valores de Bootstrap. 63 Distancia genética entre grupos con el método K2P La distancia genética es una medida del grado de divergencia entre secuencias. En este caso se agruparon de la misma forma en la que se formaron los nodos internos en las filogenias realizadas con el gen COI previamente. En el Nodo C se incluyeron secuencias de C.h mellitus, en el nodo A y B están incluidas las secuencias de C. h hemileucurus. El grupo BC contiene las secuencias de los nodos internos que incluyeron a C.h hemileucurus y a C.h. mellitus (Figura 6). Tabla 11. Distancias genéticas obtenidas con el método Neighborg Joining K2P entre grupos de Campylopterus hemileucurus. Las letras A, B y C, corresponden a los clados obtenidos. Grupo Distancia genética A BC 9.50% B C 2.2% La divergencia entre los grupos A y BC es alta a diferencia de la divergencia registrada en la comparación entre B y C. 64 Discusión: La composición nucleotídica de GC obtenida en las secuencias de la matriz de genes mitocondriales fue de 45.6%, Li y Graur en (1991) mencionaron que un contenido de GC entre 40 y 45% es adecuado en organismos vertebrados para este organelo, lo cual coincidió con lo obtenido en las secuencias de este trabajo y por lo tanto se descartó la presencia de pseudogenes. Respecto a los parámetros obtenidos en todo el conjunto de secuencias de la especie hemileucurus analizadas con el gen COI, se obtuvo un índice de Tajima D positivo (1.45338) el cual indica niveles bajos de polimorfismo debido posiblemente a una disminución del tamaño de la población o un cuello de botella reciente, se registró una diversidad haplotípica de 0.7417 y nucleotídica de 0.0108 ambos valores altos, valores similares de diversidad haplotípica se han registrado en Amazilia beryllina (0.699) y en Amazilia cyanura (0.897) sin embargo la diversidad nucleotídica de Amazilia beryllina fue menor (0.0025) y en Amazilia cyanura igual (0.01) (Jiménez y Ornelas 2016), que la registrada en hemileucurus. Los valores altos de diversidad pueden indicar un efecto de barrera geográfica para las poblaciones (Beysard y Heckel, 2014) o la supervivencia de pequeñas y aisladas poblaciones que se esparcieron cuando las condiciones fueron favorables (Tougard et al., 2008). 65 La diversidad haplotípica y nucleotídica registrada para cada población muestreada de C. h. hemileucurus fue alta, ya que se observaron valores de 0.64 a 1 y de, lo cual indica un alto flujo génico entre los organismos, además, esto puede indicar que estas poblaciones albergan una diversidad genética alta y homogénea con poca estructura. Por otro lado, en Campylopterus hemileucurus mellitus los valores registrados fueron bajos ya que se registró 0.15358 en diversidad haplotípica y 0.00078 en diversidad nucleotídica lo cual probablemente corresponde a un menor flujo génico y un cuello de botella entre los organismos de las poblaciones del norte y las poblaciones del sur, por lo tanto, el escenario más factible es que esta población tuvo un origen más reciente que las poblaciones mexicanas y quizá la pérdida de variación se debe a que algunos organismos de las poblaciones originales formaron
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