Análisis biologic

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IDENTIFICACIÓN Y MEDICIÓN 
DE LA RESPUESTA INMUNE
RESPUESTA INMUNE HUMORAL 
SEROLOGÍA
suero estudio
“Ciencia de la detección de anticuerpos”
Medición de las interacciones Ag - Ac, con fines 
diagnósticos, a partir del suero de un animal.
Sensibilidad
Capacidad de una prueba para detectar animales “enfermos” 
(VERDADEROS POSITIVOS) en una población “enferma”.
Ejs. BPA-ELISA-WESTERN BLOTTING-INMUNOFLUORESCENCIA
Especificidad
Capacidad de una prueba para detectar animales “sanos” 
(VERDADEROS NEGATIVOS) en una población “sana”.
Ejs. IDGA- WESTERN BLOTTING
Negativo 
verdadero
Falso negativo-
Falso positivoPositivo 
verdadero
+
SANOENFERMO
Animal
P
ru
e
b
a
1. PRIMARIAS
2. SECUNDARIAS
3. TERCIARIAS
Miden la cantidad de complejo Ag-Ac formado
Miden las consecuencias de la unión Ag-Ac in 
vitro
Miden las consecuencias o el efecto 
protector de anticuerpos en el animal (in 
vivo)
CLASIFICACIÓN DE PRUEBAS PARA MEDIR LA RESPUESTA INMUNE 
HUMORAL
0
200
400
600
800
1000
1200
1400
1600
1800
0 30 60 90 12
0
15
0
18
0
21
0
24
0
27
0
30
0
33
0
36
0
Post-infección
Natural
Post- Vacunación
B. abortus cepa 19
Evolución de los anticuerpos contra Brucella abortus
Ig M
Ig G
0
200
400
600
800
1000
1200
1400
1600
1800
0 15 30 45 60 75 90 10
5
12
0
13
5
15
0
16
5
18
0
Ig M
Ig G
Respuesta inmune humoral 
Brucella abortus
Isotipo Cantidad Presencia Características
IgM Abundante Temporaria Inespecífica ? 
IgG1 Abundante Continua Específica
IgG2 Escasa Discontinua Específica
IgA Abundante Discontinua Específica
APLICACIONES EN R. A. 
BRUCELOSIS BOVINA
Resolución 438/2006 del SENASA.
Prueba
TAMIZ BPA – ELISA I
COMPLEMENTARIAS SAT + 2-ME – FPA 
ELISA C
DEFINITORIA FC 
VIGILANCIA 
EPIDEMIOLÓGICA
PAL - ELISA I
Fundamento: visualización de la cantidad de Ag-Ac formado a 
través de marcadores ligados a enzimas, que en presencia del 
sustrato específico, producen una reacción colorimétrica.
ENZIMAS UTILIZADAS
• PEROXIDASA
• Fosfatasa alcalina
SUSTRATO
• ortofenildiamina
• paranitrofenilfosfato
ELISA
PRUEBAS INMUNOENZIMÁTICAS
Tipos de pruebas
INDIRECTA COMPETICIÓNSANDWICH
detección de 
ANTICUERPO
detección de 
ANTÍGENO
detección de 
ANTICUERPO
ELISA
ELISA INDIRECTO
ANTÍGENO 
adsorbido 
(reactivo)
Suero 
PROBLEMA
ANTIGLOBULINA 
marcada con 
ENZIMA (reactivo)
SUSTRATO de la 
enzima (reactivo)
CAMBIO DE COLOR
Lavado
Detección de ANTICUERPOS
Lavado Lavado
N
E
G
A
T
I
V
O
P
O
S
I
T
I
V
O
Antígeno 
Suero 
Problema
Ac
monoclonal
Conj. con 
enzima 
peroxidasa
Sustrato 
cromógeno
COLOR
Y Y Y Y
AUSENCIA DE COLOR
ELISA COMPETICIÓN
Lavado Lavado Lavado Lavado
Lavado Lavado Lavado Lavado
E
L
IS
A
VENTAJAS
 Alta sensibilidad y especificidad
 Rápido
 Reactivos estables
 Resultado visual
DESVENTAJAS
 Costo microplacas
 Costo equipo automatización
 Brucelosis
 IBR
 BVD
 Peste porcina
 Aujesky
 Newcastle
Bia
Leucemia felina
Salmonella
Aftosa
Estreptococos
TBC
 Babesia
 Trichinella
 Toxoplasma
 Toxocara
 Hormonas
 Micotoxinas
 Cuantificación de 
inmunoglobulinas
APLICACIONES EN VETERINARIA
PRUEBAS SECUNDARIAS
 SOLUBLE
 PARTICULADO
 SUPERFICIE + COMPLEMENTO
PRECIPITACIÓN
AGLUTINACIÓN
FIJACIÓN DE 
COMPLEMENTO
La prueba a realizar depende de las 
características del Ag
Comparación precipitación - aglutinación
Antígeno 
SOLUBLE
Antígeno 
PARTICULADO
Formación de “retículo” “Amontonamiento”
PRECIPITACIÓN AGLUTINACIÓN
Anticuerpo
AGLUTINACIÓN
Fundamento: un antígeno particulado (ejemplo: 
bacterias, eritrocitos), al ser puesto en contacto con su 
anticuerpo específico en proporciones óptimas, se une 
por medio de enlaces cruzados. Este complejo de unión 
agruma, produciendo una reacción de aglutinación.
Se produce cuando existe un marcado exceso de Ac con 
respecto a los determinantes antigénicos de la partícula, de 
tal manera que es poco probable que los dos sitios de unión 
de la Ig puedan unirse a dos determinantes antigénicos de 
dos partículas distintas, inhibiéndose de este modo la 
aglutinación. Generalmente ocurre en las diluciones bajas de 
sueros muy positivos.
FENÓMENO DE ZONA O PROZONA
Antígeno 
particulado 
(reactivo)
+
YY
YY Y
Suero problema
Proporción
Medio
Y
Y
AGLUTINACIÓN
AGLUTINACIÓN
En PLACA En TUBO
BrucellaSalmonella Micoplasma
BPA
Brucella
SAT+2-ME PAL
Aglutinación en placa: BPA
1. Suero problema 2. Antígeno específico 
(reactivo)
Aglutinoscopio + placa de 
vidrio
Prueba del Antígeno Brucélico Acidificado
3. Mezclar
8 MINUTOS
LECTURA E 
INTERPRETACIÓN
Con GRUMOS Sin GRUMOS
AGLUTINACIÓN POSITIVA Negativa
Aglutinación en tubo: SAT + 2-ME
SAT (Seroaglutinación en Tubo)
Ig M Ig G
2- ME (2- Mercaptoetanol)
Se realizan en 
simultáneo
En TUBO: SAT + 2- ME
SUERO 
BPA (+)
1. Suero problema
Título
SAT
2-ME
37ºC-48 hs
2. Solución fisiológica fenicada (SFF)
2. Solución 2-ME
3. Antígeno
60 MINUTOS
1/25 1/50 1/100 1/200
LECTURA e INTERPRETACIÓN
37ºC-48 hs
POSITIVA INCOMPLETA NEGATIVA
FIJACIÓN DE COMPLEMENTO
Fundamento: la activación (“fijación”) del complemento 
por el anticuerpo unido al antígeno hace que se generen 
complejos de ataque de membrana. Si el anticuerpo se 
une a eritrocitos, éstos se destruyen y sobreviene 
hemólisis.
FIJACIÓN DE COMPLEMENTO
2 sistemas
Sistema de PRUEBA Sistema INDICADOR
• Suero problema
• Antígeno específico 
• Complemento 
• Eritrocitos 
• Hemolisina (Ac. anti eritrocitos) 
FIJACIÓN DE COMPLEMENTO
C
Eritrocitos
Ac antieritrocitos
Y
YY Y
Antígeno 
Suero problema Complemento 
Suero problema
-
SIN 
HEMÓLISIS
POSITIVO
Con 
HEMÓLISIS
Negativo
Y
C
APLICACIONES EN VETERINARIA
BRUCELOSIS
 IBR
 DVB
 AFTOSA
 MOQUILLO CANINO
 TOXOPLASMOSIS
POLARIZACIÓN FLUORESCENTE 
(FPA)
 Fundamento:
Se produce in vitro una reacción antígeno-anticuerpo, 
enfrentando el suero de un animal enfermo de 
brucelosis con una fracción de del antígeno de 
bruecella (cadena O), este complejo forma una masa 
grande que en suspensión gira mas lentamente . 
Además ese antígeno se conjuga con isotiocianato de 
fluoresceína (IFTC) y se hacen incidir distintos haces 
de luz. El complejo emitirá luz con distintos grados 
de despolarización en función de su velocidad de 
rotación.
Aglutinación en tubo: PAL
PRUEBA DEL ANILLO EN LECHE
Fundamento: si en una muestra de leche se encuentra
un anticuerpo específico, y se le agrega un antígeno 
particulado coloreado, ambos se unirán, formando un 
complejo Ag-Ac que se adhiere a los glóbulos de grasa y 
asciende con la nata
1. Leche problema
2. Antígeno (reactivo)
37ºC-1 hora
LECTURA e INTERPRETACIÓN
+ ++ +++ ++++
PAL
REACCION EN CADENA DE LA 
POLIMERASA
PRUEBAS MOLECULARES
HIBRIDOMA
REACCIÓN EN CADENA DE LA POLIMERASA
(PCR)
Multiplicación de una secuencia de ADN 
específica y conservada de la especie a 
identificar, que puede ser visualizada y 
cuantificada
NUCLÉOTIDO
Fosfato
Base nitrogenada
Azúcar
CADENA DE AZÚCAR 
Y FOSFATO
AZÚCAR
FOSFATO
BASE
ADN
 ADN
 OLIGONUCLEÓTIDOS (PRIMERS)
A T
G C
 NUCLEÓTIDOS 
 POLIMERASA
Primers
Primers
Polimerasa
Polimerasa
100
90
80
70
60
50
40
30
20
Detección
35 ciclos
ADN
Primers
Polimerasa
dNTP
Desnaturalización 94º C
1 min
Extensión 72º C
1 min
Hibridación 56º C
1 min
Producto de PCR para identificar Brucella spp en 
muestras de leche
Producto de PCR para caracterizar cepas de 
Brucella abortus en muestras de leche
ID 
11
17
33
58
61
113
168
172
189
242
255
1487
151
157
179
228
260
1380
124
PCR
B. abortus silv.
B. abortus silv.
B. abortus silv.
B. abortus silv.
B. abortus silv.
B. abortus silv.
B. abortus silv.
B. abortus silv.
B. abortus silv.
B. abortus silv.
B. abortus silv.
B. abortus silv.
B. abortus silv – RB51
B. abortus silv –RB51
B. abortus silv – RB51
B. abortus silv – RB51
B. abortus silv – RB51
B. abortus silv – RB51
B. abortus RB51
Cultivo
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
+
-
-
-
-
-
FC 
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
-
ELISA-C 
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
-
ELISA-I 
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
-
37 % con B. abortus silvestre se infectó con RB51 
0,8 % de las sanas se infectó con B. abortus RB51 
(p<0,0001)
n=223
Tipos de 
PCR
 CON PRIMERS ANIDADOS
 ASIMÉTRICA
 INVERSA
 MULTIPLEX
 NESTED
VENTAJAS
 FIDELIDAD
 SENSIBILIDAD
 ESPECIFICIDAD
 AUTOMATIZACIÓN
APLICACIONES
 Diagnóstico (virales- bacterianas- parasitarias- micóticas)
 Enfermedades hereditarias
 Enfermedades autoinmunes
 OncologÍa
 Medicina forense
 Arqueología
HIBRIDOMA
Selección 
in vitro
en el medio 
HAT