fundamentos ELISA

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Técnicas: 
Elisa y Western Blot 
 
Aspectos prácticos… 
Prof. Diana Ortiz 
Cátedra Inmunología 
EJMV-UCV 
dprincz@gmail.com 
Técnica de Elisa 
Fundamento: 
Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay: Ensayo por Inmunoadsorción 
Ligado a Enzimas. 
Inmunoensayo: detección Antígeno – Anticuerpo unido a una 
enzima y cuantificado por espectofotometría 
Ventajas: 
 Es una prueba de alta 
sensibilidad y especificidad. 
 Es cuantitativa. 
 Es relativamente 
económica. 
 Se pueden procesar hasta 
96 muestras por placa. 
 Reactivos de gran 
estabilidad. 
Limitaciones: 
 Positividad Vs. Infección 
activa: depende del tipo de 
anticuerpo evaluado. A 
menos que se evalúe 
presencia de antígenos en la 
muestra problema. 
 Dificultad de detección de 
Acs en pacientes con alguna 
inmunodeficiencia, en período 
de ventana o infectados por 
cepas desconocidas. 
 
1. Unión del antígeno o anticuerpo primario a los pocillos de la 
placa (soporte sólido (polímero): poliestireno, polivinilo) 
2. Lavado 
3. Bloqueo 
4. Muestra (antígeno o anticuerpo) 
5. Lavado 
6. Anticuerpo secundario conjugado con una enzima 
(sensibilidad) 
7. Lavado 
8. Sustrato de la enzima 
9. Cuantificación (lector de ELISA) 
 
Técnica de Elisa: fases 
Técnica de Elisa: tipos 
Elisa Indirecto 
Ejemplos: 
Diagnóstico de infección por VIH-1 
Diagnóstico serológico de H. pylori , hongos 
 
 
 
Técnica de Elisa: tipos 
Elisa sándwich 
Ejemplos: 
Determinación de antígenos de superficie del Virus de Hepatitis B. 
Diagnóstico de antígenos de H. pylori en heces. 
 
 
 
Técnica de Elisa: tipos 
Elisa competitivo 
Ejemplos: 
Determinación de Gonadotropina Coriónica Humana (h-CG) 
 
Prof. E. Escobar 
Prof. E. Escobar 
Prof. E. Escobar 
 
Prof. E. Escobar 
 
Prof. E. Escobar 
Prof. E. Escobar 
Técnica de Elisa 
Aspectos a considerar: 
 
Adecuado uso de controles positivos y negativos 
(control de calidad). 
 
Adecuado diseño de la técnica (Ag-Ac, Enzima 
sustrato). 
 
 Concentración/ dilución de antígenos y anticuerpos. 
 
Reactivos en buen estado. 
 
Cuidado de la cadena de frío. 
 
Técnica de Elisa 
Estuches comerciales: 
 
Detección de 
anticuerpos 
IgM, IgG, IgE, 
IgA. 
Kit Pyloriset EIA-G 
(Orion Diagnostic): 
Títulos ≥ 20 positivos 
1.- IgA secretora anti H. pylori en saliva: (ELISA) 
Sensibilización: 2,5µg/pozo Ag Hp toda la noche a 4°C o 2h a 37°C 
Lavado: 3 veces con 200 µl de PBS-Tween 
Bloqueo: PBS-BSA 1% x 2h a 37°C 
 Muestras de saliva 1/10 x 1h a 37°C 
Lavado: 3 veces con 200 µl de PBS-Tween 
 
Anticuerpo secundario conjugado: con peroxidasa 1/1000 x 1h a 37°C 
 Revelado: OPD (o-phenylenediamine) + Peróxido de hidrógeno 
Se detiene la reacción con H2SO4 
Valores: UDO > 0,300 positivos 
(Ortiz y col., 2000) 
2.- IgA secretora total en saliva: (ELISA) 
 Monoclonal IgA (Sigma) (Ortiz y col., 2000) 
 
Técnica de Elisa 
Elisa estandarizada en laboratorio 
Técnica de Elisa 
Enzimas más utilizadas: 
 Peroxidasa 
Fosfatasa alcalina 
β-galactosidasa 
 Tetra-metil-benzidina 
 
 
Interpretación de resultados: 
Técnica de Elisa 
¿Qué es un valor cut off? 
 
Títulos de anticuerpos 
 
Valores reportados en 
unidades de Densidad óptica 
Algunas Aplicaciones de la ELISA 
Determinación de hormonas: progesterona, estrógenos, cortisol, insulina, HGC, etc. 
Proteínas 
Agentes infecciosos (virales, bacterianos, parásitos, hongos) 
Marcadores de drogas 
Control de calidad de vacunas 
Screening de recién nacido 
Investigación clínica 
Anticuerpos: Acs antinucleares 
Antígenos tumorales: alfa-feto-proteína, Ag postático, carcinoembrionario, etc. 
Autoanticuerpos 
Técnica de Elisa 
Elispot 
Mide el número de células productoras de anticuerpos. El antígeno se une al 
fondo de un pocillo, se añaden las células productoras de anticuerpos en un 
medio semisólido y los anticuerpos que se han secretado y unido se detectan 
mediante un anticuerpo anti-Ig ligado a una enzima como en un ELISA. 
Una variante de la ELISA 
Inmunohistoquímica 
Western Blot 
 Western blot, inmunoblot o electrotransferencia, técnica analítica 
altamente específica utilizada para identificar proteínas específicas 
en una mezcla compleja de proteínas, presente en extractos 
celulares o de tejidos. 
 
Etapas: 
1. Preparación de la muestra 
 
2. Separación de la muestra por tamaño (Electroforesis en gel de 
poliacrilamida) 
 
3. Transferencia a un soporte sólido (membrana de nitrocelulosa ) 
 
4. Visualización mediante marcaje de proteínas con el uso de 
anticuerpos primarios o secundarios apropiados. 
 
Western Blot 
Preparación del gel de 
poliacrilamida SDS-PAGE 
y corrida electroforética. 
Western Blot 
Tinción del gel con azul de Coomassie 
Western Blot 
Transferencia 
Se transfieren las bandas de 
proteínas o desde el gel hacia 
una membrana de 
nitrocelulosa (flechas azules). 
Western Blot 
Western Blot 
Western Blot 
Revelado 
Western Blot 
CORTES X, GARCIA Z, TORRES L, TAYLOR L. Patrones Indeterminados de Western Blot en sueros reactivos por 
anticuerpos contra los virus linfotrópicos de células T tipo I/II (HTLV I/II) en donantes de sangre en Costa Rica. Rev. 
costarric. cienc. méd [online]. 2007, vol.28, n.1-2 [cited 2017-02-15], pp. 11-20 . 
Western blot 
Western Blot 
Aplicaciones: 
 
 Investigación: Es una de las técnicas más usadas en el estudio de la 
biología molecular 
Permite identificar antígenos inmuno-dominates para vacunas. 
Estudiar perfil de citocinas. 
Presencia o ausencia de una proteína y sus niveles en una muestra. 
Factores de crecimiento 
Niveles de fosforilación, modificaciones post traduccionales, etc 
 
Diagnóstico: 
Prueba confirmatoria de VIH 
 
Prueba de la encefalopatía espongiforme bovina, comúnmente 
llamada“enfermedaddelasvacaslocas” 
 
Enfermedad de Lyme. 
ELISA Vs. Western Blot…