Manual de Inmunologia básica 2012

Bioquímica Básica

•

UV

Alicia Zamudio

14/9/2023

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Bioquímica Básica

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UNIVERSIDAD VERACRUZANA FACULTAD DE BIOANALISIS
Manual de prácticas Inmunología Básica
Elaborado por Sandra Luz González

1. INTRODUCCIÓN

Actualmente la Inmunología constituye un área del conocimiento en constante
expansión y de gran utilidad en el campo clínico, por lo que se considera necesario
incluir en el plan de estudios de la carrera de Química clínica un curso de Inmunología
Básica que proporcione a los estudiantes conocimiento acerca de los fenómenos
inmunológicos y de los principios básicos que fundamentan los métodos y técnicas
comúnmente usados en el laboratorio.
El programa de la experiencia educativa aborda entre sus saberes teóricos los
siguientes: Aspectos básicos de la inmunidad, inmunidad innata y adquirida, respuesta
inmune humoral y respuesta inmune celular y hace hincapié en las reacciones antígeno-
anticuerpo. Este programa incluye un manual prácticas de laboratorio como
complemento de la enseñanza.
El propósito de este manual es apoyar a los estudiantes a comprender los mecanismos
de defensa que se desarrollan como respuesta a los antígenos, así como poner al
estudiante en contacto con el método científico, estimular su interés por los procesos
inmunológicos y familiarizarlo con la metodología y técnicas más comunes para la
identificación de las reacciones inmunológicas que más adelante les permita participar
en la resolución de problemas de salud.
El manual incluye trece prácticas con la estructura siguiente: sustento teórico, objetivos,
descripción breve, procedimientos, material y equipo, resultados y bibliografía; en ellas
se abordan la inducción y verificación de procesos inmunológicos como la inmunización
de animales de experimentación, la preparación de diversos antígenos, la obtención de
sueros inmunes con la consiguiente demostración de anticuerpos ; así también se
inducen procesos como la fagocitosis y la activación del complemento.
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Manual de prácticas Inmunología Básica
Elaborado por Sandra Luz González

Para el desarrollo adecuado de las prácticas de laboratorio los estudiantes
deberán observar las siguientes reglas:
 Usar bata blanca de manga larga y limpia durante la práctica.
 Utilizar guantes y cubreboca para la realización de las prácticas.
 Observar las normas establecidas para el manejo de los residuos
biológico- infecciosos y residuos químicos.
 Limpiar perfectamente su área de trabajo con una franela al término
de la práctica, colocando la basura en los depósitos adecuados.
 Observar una actitud de respeto hacia los demás.
 Traer el material biológico solicitado.
 Realizar actividades en coordinación con los demás integrantes del
equipo.
 Lavarse las manos al finalizar la práctica
 Leer previamente la técnica a seguir, exponiendo las dudas al
docente antes de iniciar la práctica.
 No comer, beber y fumar dentro del laboratorio.
 Presentarse a todas las sesiones con el manual de prácticas y anotar
sus observaciones.
 Los alumnos y el docente deberán terminar puntualmente la práctica.

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Manual de prácticas Inmunología Básica
Elaborado por Sandra Luz González

SUSTENTO TEÓRICO
La inmunidad se considera como la respuesta de un huésped a un agente
agresor real o potencial y las consecuencias de ella derivadas, se caracteriza porque no
desencadena manifestaciones colaterales que perjudiquen al huésped, como ocurre con la
alergia ( Margni, 1997). La inmunidad puede ser natural y adquirida. La primera es la
resistencia del huésped relacionada con factores genéticos y raciales, edad e influencias
hormonales, barreras mecánicas, secreciones, células fagocitarias y proteínas del
complemento, entre otros.
La inmunidad adquirida es la lucha específica entre el agente invasor y los anticuerpos y
células sensibilizadas por él originados. Puede ser de tres tipos: activa, pasiva y adoptiva,
dependiendo si el individuo elabora sus propios elementos defensivos o le son transferidos.
En el caso de la inmunidad activa se puede adquirir de manera espontánea tras la
penetración de un agente invasor que produce enfermedad o ser provocada artificialmente
mediante la inoculación de un antígeno modificado que ha perdido su carácter infecciosos o
tóxico como proteínas complejas, microorganismos vivos, muertos o atenuados, toxinas, etc.
En ambos casos se produce una respuesta inmunológica de larga duración que puede
ser mediada por anticuerpos (respuesta inmune humoral) o por células
especializadas (respuesta inmune celular) o ambas dependiendo de factores como
dosis, vía de administración, tipo de antígeno, etc.
Si un antígeno se administra por vía intravenosa, la mayor parte del anticuerpo es producida
por el bazo, parte del pulmón y médula ósea; si la vía de administración es subcutánea o
intradérmica, el antígeno se distribuye por la linfa a los ganglios linfáticos locales donde
inicia la producción de anticuerpos. Cuando se administra el antígeno unido a un adyuvante
hay una acumulación local de células inflamatorias y los anticuerpos se producen en el
tejido granulomatoso resultante y en los ganglios linfáticos que reciben la linfa drenada de
ese sitio ( Weir, 1998) .
OBJETIVOS.
Al finalizar la práctica, el alumno será capaz de:
a) utilizar diferentes vías para la inoculación y la obtención de muestras sanguíneas en
animales de experimentación.
b) preparar antígenos solubles y particulados
c) inducir una respuesta inmunológica en un conejo para obtener un antisuero con alto
contenido de anticuerpos .
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DESCRIPCIÓN DE LA PRÁCTICA
En esta practica el estudiante aplica un protocolo de inmunización a un conejo
(Orcytolagus cunicullus) con la intención de obtener un suero con alta concentración de
anticuerpos. Previamente sangra al animal para contar con un suero libre de anticuerpos
que pueda ser utilizado como suero control negativo en las pruebas subsecuentes .

PROCEDIMIENTOS PARA LA REALIZACIÓN DE LA PRACTICA
I SANGRADO DE CONTROL.
En todos los casos es necesario sangrar al animal antes de las inmunizaciones para contar
con un suero control negativo. Los animales de laboratorio: conejos, ratas, perros, etc.
suelen cooperar bien cuando son tratados adecuadamente, con firmeza pero con cuidado,
en un medio ambiente sin ruidos innecesarios. Es aconsejable tener conocimiento de los
pasos a seguir para tener a la mano el material necesario; torundas, jeringas, tubos, etc.
TÉCNICA.
Si se trata de conejos la sangría puede hacerse en la vena marginal de la oreja (para
pequeños volúmenes) o por punción cardiaca (para mayores cantidades).
a. Sangría de la vena de la oreja.
Puede pincharse la vena y dejar que la sangre fluya o puede utilizares aguja y jeringa.
1.- Frotar vigorosamente la oreja para estimular la circulación sanguínea .limpiar con
alcohol y hacer un corte pequeño longitudinal con una hoja de afeitar o una
lanceta.
2.-Recoger el volumen deseado de sangre en un tubo de ensayo.
3.-Mantener un algodón seco apretado sobre la punción hasta que cese la hemorragia.
b. Punción cardiaca.
El sangrado del corazón suele ser simple y puede llevarse a cabo repetidas veces en un
animal si se utiliza buena técnica. La anestesia no es necesaria .aunque en ocasiones
se emplea éter (debe tenerse cuidado porque los conejos mueren fácilmente con una
dosis excesiva del mismo). Se recomienda usar agujas largas del # 18.
1.- Cortar el pelo en lazona que cubre el esternón y desinfectar con alcohol o yodo.
2.- Localizar la zona de pulsación máxima, generalmente a mitad del camino del
esternón, ligeramente a la izquierda e introducir la aguja a través del espacio
intercostal, avanzando en línea recta hacia el hombro derecho empujando suavemente
hasta que el latido del corazón se sienta contra la punta de la aguja, entonces se da un
pinchazo corto hacia adelante para que entre al corazón. Pueden extraerse sin peligro
hasta 50 ml de sangre de un conejo mediano.
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Si se experimenta dificultad para llegar al corazón extraer casi completamente la
aguja e insertarla nuevamente en otra dirección. Los movimientos de la aguja dentro
de la cavidad pericárdica tienen peligro de desgarrar el corazón y causar la muerte
inmediata.
c. Separación del suero.
1.- Dejar coagular la sangre y remover el coágulo con un aplicador para facilitar la
retracción del mismo.
2.- Incubar la sangre coagulada a 37"C durante 30 minutos y separar el suero.
3.- Conservar el suero en tubos o frascos de vidrio rotulados con el número de equipo y
la fecha de extracción. Preservar el suero agregando 1 gota de Merthiolate al 1:10,000
o llevando a congelación.

II ESQUEMAS DE INOCULACIÓN.
Cuando se desea obtener un suero inmune experimentalmente deben tomarse en
consideración las características de los antígenos: inoculando antígenos particulados
se obtendrán sueros aglutinantes y la inoculación de antígenos solubles nos dará
sueros precipitantes.
2. 1 Antígenos particulados.
a) Antígenos bacterianos.
Se inmunizarán conejos con suspensiones de antígenos "O" y "H" de S. typhi, de S.
aureus y de C. álbicans ajustadas a una concentración equivalente a los tubos #3, #2 y
# 16 del nefelómetro de McFarland, respectivamente. Esto nos dará,
aproximadamente, las siguientes concentraciones: 900 millones de S. typhi ,600
millones de S aureus y 5000 millones de C. álbicans por ml de suspensión. Las
inmunizaciones se harán de acuerdo al siguiente protocolo:
Inyección Tiempo Dosis Vía
1 Día 0 0.5 ml Intravenosa (IV)
2 Día 4 1.0 ml Intravenosa (IV)
3 Día 8 2.0 ml Intravenosa (IV)
4 Día 12 3.0 ml Intravenosa (IV)
Sangrado Día 18

b) Antígenos eritrocitarios.
Se inmunizarán conejos con suspensiones al 50% de eritrocitos lavados por
centrifugación con solución salina de acuerdo al siguiente protocolo:
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Inyección Tiempo Dosis Vía
1 Día 0 1.0 ml Intravenosa (IV)
2 Día 4 1.0 ml Intravenosa (IV)
3 Día 8 1.0 ml Intravenosa (IV)
4 Día 12 1.0 ml Intravenosa (IV)
5 Día 16 1.0 ml Intravenosa (IV)
Sangrado Día 20

2.2. Antígenos solubles.
a) Suero humano normal.
Inocular al conejo con suero humano calentado a 630 C durante 20 minutos con objeto de
obtener un cierto grado de agregación de los componentes del mismo. El protocolo de
inmunización es el siguiente:

Inyección Tiempo Dosis Vía
1 Día 0 0-5 ml Intravenosa (IV)
2 Día 3 1.0 ml Intravenosa (IV)
3 Día 6 1.5 ml Intravenosa (IV)
4 Día 9 2.0 ml Intravenosa (IV)
Sangrado Día 14

b) Proteínas solubles.
Albúmina de huevo: preparar con buffer fosfato salina pH 7.2 una solución que
contenga 50 mg de albúmina por ml.
Plasma: preparar una dilución 1:2 del plasma en solución salina.
Estos antígenos son inoculados con aceite mineral de acuerdo al siguiente protocolo:
Inyección Tiempo Dosis Vía
1 Día 0 2.0 ml I.M. (1.5 ml en c/pierna)
2 Día 6 2.0 ml I.D (1 ml por 3 veces a lo largo de la columna)
3 Día 13 2.0 ml I.M. (1.5 ml en c/pierna)
Sangrado Día 19
Nota: agregar a cada dosis 1 ml. de aceite mineral.

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MATERIAL A UTILIZAR
Material por equipo de 4 alumnos Material biológico, equipo, reactivos y
soluciones por grupo:

6 tubos de ensaye de 13 x 100
2 tubos de ensaye de 12 x 75 con
tapón
1 palillo largo de madera
4 pipetas pasteur con bulbo
1 gradilla
1 vaso de precipitado de 50 ml
Torundas con alcohol

500 ml de solución salina al 0.85% estéril
Solución sedante para animales
Solución de cloro para inactivar residuos
Antígenos bacterianos
2 centrífugas
Baño maría o estufa a 37 C
Contenedores para desechos biológicos

III OBTENCIÓN DE SUEROS INMUNES EN ANIMALES DE EXPERIMENTACIÓN.

1. Sangrar al conejo por punción cardíaca (ver práctica de "Obtención de • suero
control") y obtener 20 ml de sangre. Dejar coagular.
2. Remover el coágulo con un aplicador e incubar 15 minutos a 370 C.Separar el
coágulo por centrifugación a 3000 rpm/10-15 minutos y transferir el suero a tubos
de ensaye. Puede conservarse adicionando merthiolate al -0.01%.
3. Después de la sangría inyectar al animal igual volumen de solución salina estéril
por vía intraperitoneal para sustituir el líquido perdido.
4. Efectuar diluciones dobles del antígeno a partir de la dilución 1:8 hasta la dilución
1:32.
5. Numerar 4 tubos de ensaye y colocar en los tres primeros una gota del suero del
conejo inmunizado y en el cuarto colocar una gota de solución salina o de suero
control de conejo.
6. Añadir a cada tubo una gota de las diferentes diluciones antigénicas, mezclar e
incubar a 370C durante 30 minutos.
7. Observar cada 5 minutos si en alguno de los tubos se forma un precipitado
blanco u opalescencia o un aglutinado de partículas.
8. Anotar los resultados.

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MATERIAL Y EQUIPO
Material por equipo de 4 alumnos Material biológico, equipo, reactivos y
soluciones por grupo:
1 jeringa de 20 ml
Agujas del No. 18
1 jeringa de insulina
2 ampolletas inyectables de 5 ml
10 tubos de 12 x 75
2 pipetas de 2 ml
1 micropipeta
Palillos largos

Antígenos solubles y particulados
Merthiolate
Estufa a 370C
Torundas con alcohol

BIBLIOGRAFÍA
Abbas,A. ,Lichtman,A. Inmunología celular y molecular. Editorial Interamericana. Mc
Graw-Hill. España. 1998
CINVESTAV. UPEAL. Aspectos prácticos generales de inyectar. En línea
http://www.scribd.com/doc/3288385/Aspectos-practicos-generales-de-inyectar
consultado el 4 de junio de 2009.
Estrada P. y col.. Manual de Prácticas de Inmunología. Escuela Nacional de Ciencias
Biológicas. Departamento de Inmunología. Instituto Politécnico Nacional. México.
Janeway,Ch., Travers,P, Walport,M. Inmunobiología. El sistema inmunitario en
condiciones de salud y enfermedad. Editorial Mason. 2ª edición. Barcelona. 2003.
Margni, A. Inmunologìa e Inmunoquímica. 1996. Editorial Mèdica Panamericana. 5ª
edición. Buenos Aires. 1997
Regueiro ,J., López,C. Inmunología. Biología y patología del sitema inmune. Editorial
Médica Panamericana. 3ª edición.
Rojas, W., Anaya, J., Aristizábal, B. Inmunología (de Rojas). Editorial: Corporación para
Investigaciones Biológicas. CIB. Colombia. 2007
Stites, D. Inmunología Básica y Clínica . Editorial El Manual Moderno. 10ª edición.
México. 2003.
Weir,D. Inmunología. Editorial El Manual Moderno. México. 1998
http://www.scribd.com/doc/3288385/Aspectos-practicos-generales-de-inyectar
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SUSTENTO TEÓRICO
La fagocitosis es un mecanismo de protección no específico contra agentes
infecciosos y de eliminación de células dañadas o seniles. Es llevado a cabo por
los leucocitos polimorfonucleares y los macrófagos cuya función es ingerirpartículas de manera profesional. Los primeros son células sanguíneas circulantes
que se ponen en contacto con el material a fagocitar a través de la respuesta
inflamatoria. Los macrófagos provienen de monocitos circulantes o bien están
distribuidos estratégicamente en los tejidos. Ambos presentan diferencias en su
poder fagocítico.
Los polimorfonucleares neutrófilos son especialmente efectivos durante el inicio de
infecciones por bacterias extracelulares gram positivas y gram negativas. Los
macrófagos participan en etapas más tardías de la inflamación fagocitando
bacterias y restos celulares. Son importantes en la defensa ante bacterias
intracelulares y generalmente actúan en concomitancia con respuestas inmunes
adaptativas (Pepper, I., 2009).
El proceso fagocítico incluye varias etapas secuenciales como la quimiotaxis,
adhesión, ingestión, formación del fagolisososma, la muerte intracelular y la
expulsión del material de desecho (exocitosis) (Rojas,2003). La quimiotaxis es la
etapa de movilización y reclutamiento de leucocitos, por medio de interacciones
celulares, a la zona o tejido lesionado. El fagocito se adhiere levemente a la
superficie del endotelio (previamente activado por las citocinas), a través de
uniones moleculares de baja afinidad entre receptores en el leucocito y selectinas
sobre la superficie endotelial y atraídos por gradientes de concentración de las
quimiocinas, atraviesan el epitelio vascular hacia el foco de infección patógena.
Posteriormente otros receptores de los fagocitos actúan como mecanismos de
adherencia sobre los microorganismos o sobre opsoninas del sistema inmune del
huésped.
Menciona Weir (1998) que los fagocitos reconocen, fijan e ingieren el material
particulado por dos mecanismos distintos: uno inespecífico que depende de la
unión de las glicoproteínas de la superficie del fagocito a los carbohidratos de la
pared del microorganismo y otro mecanismo de evolución más reciente que
utiliza receptores en la membrana celular del fagocito para una porción del
anticuerpo y para un componente del complemento; por lo que un microorganismo
http://es.wikipedia.org/wiki/Endotelio
http://es.wikipedia.org/wiki/Citocinas
http://es.wikipedia.org/wiki/Selectina
http://es.wikipedia.org/wiki/Infecci%C3%B3n
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recubierto con anticuerpos y complemento se adhieren con mayor facilidad al
fagocito para ser ingerido.
Los anticuerpos que amplifican de manera notable la actividad fagocítica y
mejoran la digestión intracelular se conocen como opsoninas que significa “
preparar el alimento”.

OBJETIVO.
1. Incrementar la fagocitosis mediante la opsonización de estafilococos con suero
humano.

DESCRIPCIÓN DE LA PRÁCTICA
Una suspensión de Estafilococos aureus se opsoniza con suero humano para
estimular su ingestión por parte de células fagocitarias obtenidas de sangre periférica.
Esta etapa de la fagocitosis se observa mediante la preparación de frotis teñidos con
colorante de Wrigth o May-Greenwald Giemsa.

PROCEDIMIENTOS PARA LA REALIZACIÓN DE LA PRÁCTICA
1. Recoger 10 ml de sangre con citrato de sodio (2 ml por cada 8 ml de sangre),
homogeneizar la muestra.
2. Incubar la sangre en la jeringa en posición vertical o en un tubo de ensaye
siliconizado durante 45 minutos a 37° C. En caso de no contar con tiempo
suficiente centrifugar la muestra de sangre completa a 500 RPM /10 min.
3. Separar el plasma rico en leucocitos y recibirlo en un tubo de ensayo
siliconizado. Centrifugar a 1500 rpm/ 5 min y descartar el sobrenadante.
4. Lavar 2 veces el sedimento celular con solución salina de Hanks para remover
proteínas plasmáticas y anticoagulante, evitando la formación de burbujas y
resuspender con 0.5 ml de solución de Hanks. Si es necesario remover los
eritrocitos de la suspensión puede agregarse una o dos gotas de diluyente de
Turk (sin azul de metileno) al 3% y mezclar.
5. Durante el paso 2 puede iniciarse la opsonización de las bacterias: tomar 0.3 ml
de la suspensión de estafilococos más 1 ml de suero reciente e incubar a 37°
C/30 min.
6. En un tubo de ensaye siliconizado (tubo No 1) mezclar 0.2 ml de sedimento
celular resuspendido y 0.2 ml de antígeno estafilocócico opzonizado e incubar a
37°C /30 min.
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7. En otro tubo de ensaye (tubo No. 2) colocar 0.2 ml de sedimento celular
resuspendido agregar 0.2 ml de antígeno estafilocócico opsonizado y 0.3 ml de
NTB al 0.3% e incubar a 37°C/ 30 min.
8. Transferir gotas del tubo No 1 a los extremos de varios portaobjetos .preparar
frotis y teñir con colorante de Wright o May-Greenwald Giemsa. Realizar la
misma operación con el tubo No. 2.
9. Examinar con aceite de inmersión y contar las bacterias ingeridas por cada uno
de los primeros 2S PMN observados.
MATERIAL Y EQUIPO
Material por equipo de 4 alumnos Material biológico, equipo, reactivos y soluciones por
grupo:
4 tubos de ensaye siliconizados
4 pipetas pasteur
2 pipetas graduadas de 2 ml
4 portaobjetos
4 microscopios

10 ml de sangre obtenida con citrato de Na
20 ml de suspensión de S. aureus
(aproximadamente 500 millones/ ml)
5 ml de suero humano fresco
500 ml de solución salina de Hanks
1 Centrífuga
Estufa a 37°C
Colorante de Wright

BIBLIOGRAFÍA
Pepper,I. Atlas de Inmunología. Universidad de Chile. Consultado en
http://www2.med.uchile.cl/sitios_int/atlas/14.htm el 18 de agosto 2008
Rojas, W., Anaya, J., Aristizábal, B. Inmunología (de Rojas). Editorial: Corporación para
Investigaciones Biológicas. CIB. Colombia. 2007.
Rojas ,E., Arce, P. Fagocitosis: mecanismos y consecuencias. Primera Parte .Bioquimia.
Diciembre .Año/Vol 28. No 004. Asociación Mexicana de Bioquímica Clínica.
México. 2003

http://www2.med.uchile.cl/sitios_int/atlas/14.htm
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SUSTENTO TEÓRICO
Como se mencionó el proceso fagocitario comprende varias etapas:
QUIMIOTAXIS: movimiento orientado de los fagocitos bajo la influencia de
gradientes químicos externos.
ADHERENCIA: las células fagocíticas se adhieren a las partículas opsonizadas. La
opsonización consiste en la neutralización de cargas negativas e hidrofilia a través
de proteínas cargadas en forma positiva. Las opsoninas pueden ser específicas (
IgG) o inespecíficas (C3b, C4b, fibronectina, lisozima)
INGESTION: el citoesqueleto del fagocito se activa y emite pseudópodos, forma
una caveola que luego se cierra en apical constituyendo el fagosoma.
DIGESTION: las enzimas lisosómicas son vertidas en el fagosoma, formándose
entonces un fagolisosoma. La acción de las enzimas sobre la pared de los
microorganismos es variable en función de la composición o estructura de las
mismas.
La fagocitosis se incrementa mediante la opsonización, proceso simple que
optimiza el reconocimiento del antígeno y que involucra la participación de las
partículas ingeribles con factores séricos de diversa naturaleza denominados
opsoninas.

OBJETIVO
1. Demostrar la capacidad fagocítica y microbicida de los polimorfonucleares
utilizando Cándida álbicans como antígeno.

DESCRIPCIÓN DE LA PRÁCTICA
Los polimorfonucleares obtenidos de sangre periférica son adheridos a portaobjetos y
puestos en contacto con suspensiones de C. álbicans previamente opsonizadas para
facilitar la adherencia e ingestión.

PROCEDIMIENTOS PARA LA REALIZACIÓN DE LA PRÁCTICA
1. Adherir los cubreobjetos con aceite a los tapones de hule y colocarlos en cámara
húmeda.
2. Obtener 10 ml de sangre y pasarla a un matraz con perlasde vidrio (estéril),
tapando y sujetando.
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3. Al iniciar la coagulación agitar 20 veces fuertemente, extrayendo la sangre
desfibrinada con una pipeta Pasteur y colocándola en un tubo de ensaye.
4. Depositar dos gotas de sangre desfibrinada sobre dos cubreobjetos respec-
tivamente e incubar en cámara húmeda a 379C por 30 minutos.
5. Centrifugar el resto de la sangre a 1000 rpm/10 minutos
6. Separar el suero y agregar 2 ml de la suspensión de C. álbicans.
7. Tirar el excedente de los cubreobjetos incubados y sin dejar secar, enjuagar a
goteo suave y constante con solución de Hanks a 37° C.
8. Sin dejar secar las preparaciones, cubrirlas con 12 gotas de suero con C.
Álbicans e incubar a 37°C por 30 minutos en cámara húmeda.
9. Secar al aire y. teñir los cubreobjetos con colorante de Wright.
10. 10.- Montar las preparaciones invertidas sobre un portaobjetos con aceite de
inmersión y observar al microscopio.
11. Contar el número promedio de C. álbicans fagocitadas por los polimorfonu-
cleares.

MATERIAL Y EQUIPO
Material por equipo de 4 alumnos Material biológico, equipo, reactivos y
soluciones por grupo:
4 cubreobjetos
1 matraz esterilizado con perlas de
vidrio
2 pipetas pasteur
5 tubos de ensaye de 13 x 100 mm
2 cjas petri grandes
1 disco de papel filtro
2 microscopios
10 ml de sangre desfibrinada
5 ml de suero
Suspensión de Cándida álbicans (aprox.
5 millones por ml.)
5 puentes para tinción
2 centrífugas
Estufa a 37°C
Colorante de Wright o May-Greenwald
Giemsa
BIBLIOGRAFÍA
Janeway,Ch.,Travers, P,Walport,M. Inmunobiología. El sistema inmunitario en
condiciones de salud y enfermedad.Editorial Mason. 2ª edición. Barcelona. 2003.
Rojas, W., Anaya, J., Aristizábal, B. Inmunología (de Rojas). Editorial: Corporación para
Investigaciones Biológicas. CIB. Colombia. 2007.
Stites DP. Inmunología básica y clínica. 10a ed.México: Editorial El Manual Moderno; 2001.
Weir DM, Stewart J. Inmunología. 3a. ed. México: Editorial El Manual Moderno; 1999.
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Elaborado por Sandra Luz González

SUSTENTO TEÓRICO
El Complemento es un conjunto de más de 30 proteínas séricas y de la superficie
celular que interactúan con otras moléculas del sistema inmunitario y entre ellas mismas
para llevar a cabo funciones efectoras de la inmunidad humoral y la inflamación ( Abbas,
1998, p. 349). Parte de los factores del complemento potencian la inflamación y la
fagocitosis y actúan produciendo la lisis de células y microorganismos resultando
especialmente importante frente a gérmenes gram negativos.
Estos factores son producidos principalmente por el hepatocito, y en menor medida por
células epiteliales del intestino y del sistema genito-urinario, adipocitos y macrófagos
activados.
El complemento a diferencia de los anticuerpos es termolábil. Sus funciones biológicas
se dividen en dos categorías: 1) la lisis celular y 2) los efectos biológicos de los
fragmentos proteolíticos, tales como opsonización anafilatoxinas, eliminación de
inmunocomplejos y regulación de la respuesta inmunitaria humoral ( Abbas, 1998, p
370).
El complemento puede ser activado por dos vías: alternativa y clásica. La vía alternativa
se activa en ausencia de anticuerpo, por lo que se considera un mecanismo de la
inmunidad innata. Por su parte la Vía Clásica es uno de los principales mecanismos
efectores de la inmunidad humoral cuya activación comienza por la unión del complejo
C1 a anticuerpos unidos a antígenos (inmunocomplejos). El C1 es un complejo formado
por 5 proteínas y estabilizado por iones Ca2+.
Fundamento. Si en un pozo horadado en una placa de gel- eritrocito-anticuerpo se
coloca complemento activo, se desarrolla alrededor de él una zona de hemólisis, cuyo
tamaño es proporcional a la cantidad de complemento en el pozo.

OBJETIVO
1. Activar la vía clásica para demostrar la actividad hemolítica del complemento.

DESCRIPCIÓN DE LA PRÁCTICA
Los eritrocitos previamente sensibilizados con anticuerpos se fijan en el agar y se
hemolizan por la acción del complemento cuando la reacción antígeno- anticuerpo
activa a la Vía Clásica..

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PROCEDIMIENTOS PARA LA REALIZACIÓN DE LA PRÁCTICA
1. Preparar una solución de agar al 1% con Buffer P04 salina 0.15M pH 7.2. Hervir
hasta disolución total del agar, reponiendo el volumen de agua evaporada con
solución buffer. Añadir 1 ml de merthiolate al 1%.
2. Dejar enfriar entre 50-55QC.
3. En-una caja de petri chica colocar 0.5 ml de eritrocitos sensibilizados preparados
de la siguiente manera: en un tubo de hemólisis poner 0.2 ml de glóbulos O Rh+,
0.8 ml de solución salina y 0.2 ml de suero anti-Rh, Incubar durante media hora a
37°C; lavar 3 veces con solución salina y resuspender en 1 ml de solución buffer.
4. Aplicar rápidamente 4 ml de agar mezclándolo con la suspensión de eritrocitos
sensibilizados con movimientos suaves hasta obtener una capa -homogénea.
Mantener caliente la pipeta para evitar que se gelifique el agar.
5. Dejar gelificar el agar a temperatura ambiente
6. Hacer diluciones dobles del suero con solución buffer: 1:2,1:4 y 1:8.
7. Llenar cada pozo con un volumen, medido exactamente, de las diferentes
diluciones de suero siguiendo el esquema.
8. Incubar en cámara húmeda a temperatura ambiente durante 24-48 hrs.
9. Medir los halos de hemólisis formados.

Esquema utilizado

Pozo #1 - suero sin diluir
Pozo #2 - dilución 1:2
Pozo #3 - dilución 1:4
Pozo #4 - dilución 1:8

MATERIAL Y EQUIPO
Material por equipo de 4 alumnos Material biológico, equipo, reactivos y
soluciones por grupo:
caja petri chica
2 pipetas de 5 ml
1 ml de suero humano o de cobayo
1 ml de glóbulos rojos tipo O Rh
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Manual de prácticas Inmunología Básica
Elaborado por Sandra Luz González

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2 tubos de ensaye de 12 x 75
5 tubos de ensaye de 13 x 100
1 disco de papel filtro
positivo
Suero anti Rh comercial
Agar Agar
Solución salina al 0.85%
Baño María a 370 C
Buffer PO4 salina pH 7.4
2 centrífugas

BIBLIOGRAFÍA
Abbas,A. ,Lichtman,A. Inmunología celular y molecular. Editorial Interamericana. Mc
Graw-Hill. España. 1998
Janeway,Ch., Travers,P, Walport,M. Inmunobiología. El sistema inmunitario en
condiciones de salud y enfermedad. Editorial Mason. 2ª edición. Barcelona. 2003.
Rojas, W., Anaya, J., Aristizábal, B. Inmunología (de Rojas). Editorial: Corporación para
Investigaciones Biológicas. CIB. Colombia. 2007
Stites, D. Inmunología Básica y Clínica . Editorial El Manual Moderno. 10ª edición.
México. 2003.
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Manual de prácticas Inmunología Básica
Elaborado por Sandra Luz González

SUSTENTO TEÓRICO
El sistema del complemento es parte de la inmunidad innata y constituye uno de
los principales mecanismos efectores de la inmunidad mediada por anticuerpos y
constituye un puente entre la inmunidad innata y la adaptativa. Es importante en la
protección contra la infección por bacterias piógenas y en la eliminación de complejos
inmunes y de productos de la inflamación.
En la Vía Clásica del Complemento intervienen proteínas designadas de C1 a C9. La
activación de esta vía requiere de la presencia de complejos antígeno-anticuerpo.
Mientras que los antígenos pueden ser solubles o particulados, los anticuerpos tienen
que ser de las clases IgM e IgG (excepto IgG4). La activación se inicia cuando dos o
más fragmentos Fc de losanticuerpos en los complejos inmunes reaccionan con el
componente C1 iniciándose una reacción en cascada que tiene como finalidad formar
dos enzima: la C3 convertasa y la C5 convertasa.
Los últimos factores del complemento, C5b, C6, C7, C8 y un polímero de C9, se unen
para formar el complejo de ataque a la membrana (MAC) que produce alteraciones en la
estructura de la membrana que facilitan la penetración parcial de C8 y la polimerización e
inserción de C9. El MAC causa la destrucción lítica de las células al favorecer la
desorganización de los lípidos de la membrana y al producir en ella poros o agujeros a
través de los cuales ocurre la salida y entrada de agua, iones y macromoléculas (Barrón,
2003).
Fundamento. La formación de complejos ag-ac en solución o sobre la superficie de una
célula inicia la activación de la vía clásica del complemento. Sin embrago, dada la
inestabilidad del complemento este proceso puede verse afectado por factores externos
como la agitación, la temperatura y la ausencia de Ca++ y Mg ++.

OBJETIVOS.
1. Demostrar la inestabilidad del complemento
2. Activar el complemento por la vía clásica para producir la lisis de los
glóbulos rojos.
DESCRIPCIÓN DE LA PRÁCTICA
La suspensión de glóbulos rojos se pone en contacto con plasma, suero humano normal,
y suero humano agitado violentamente y calentado a 63 0 C. Se incuba para activar la
vía clásica del Complemento y se revisan los sobrenadantes en busca de hemólisis.
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PROCEDIMIENTOS PARA LA REALIZACIÓN DE LA PRACTICA
1. Recoger sangre de los tipos A y B en tubos de ensaye con anticoagulante y
homogeneizar la mezcla por inversión. Utilizar 0.1 ml de EDTA al 10% por cada 5
ml de sangre.
2. Recoger sangre de cualquier tipo en dos tubos de ensaye: uno con
anticoagulante y otro sin anticoagulante para obtener plasma y suero
respectivamente.
3. Preparar una suspensión al 5% de eritrocitos A y B en solución salina al 0.85%
4. Tomar 0.5 ml de suero y calentar a 63°C por 3 minutos.
5. Preparar una dilución 1:10 del suero restante con un volumen final de 2 ml. Agitar
violentamente durante 10 a 15 minutos.
6. Marcar 4 series de 2 tubos de la siguiente manera: A1B1, A2B2, A3B3, A4B4.

Tubos A1 B1 A2 B2 A3 B3 A4 B4
Eritrocitos A 0.2 ml - 0.2 ml - 0.2 ml - 0.2 ml
Eritrocitos B - 0.2 ml - 0.2 ml - 0.2 ml - 0.2 ml
Suero calentado 0.2 ml 0.2 ml - - - - -
Suero agitado - - 0.2 ml 0.2 ml - - -
Suero - - - - 0.2 ml 0.2 ml -
Plasma - - - - - - 0.2 ml 0.2 ml

7. Mezclar e incubar a 370C durante 30 minutos.
8. Centrifugar todos los tubos a 2500 rpm /1 minuto
9. Observar si existe hemolisis en el sobrenadante.

Resultados.
Hemolisis: indica la presencia de hemolisinas y actividad del complemento en el
suero.
No hemolisis: indica ausencia de hemolisinas o no activación del complemento o
pérdida de la actividad del complemento.

MATERIAL Y EQUIPO
Material por equipo de 4 alumnos Material biológico, equipo, reactivos y
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Elaborado por Sandra Luz González

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soluciones por grupo:
1 vaso de precipitado de 50 ml
pipetas de 2 ml
1 micropipeta
1 gradilla
8 tubos de ensayo de 12 x 75
2 pipetas pasteur
10 tubos de ensaye de 13 x 100
1 agitador vórtex
1 termómetro

4 ml de suero humano
4 ml de plasma humano
2 ml de suspensión al 5% de
eritrocitos tipo A
2 ml de suspensión al 5% de
eritrocitos tipo B
2 centrífugas
Estufa a 370 C
Baño maría a 630 C

BIBLIOGRAFÍA
Abbas,A. ,Lichtman,A. Inmunología celular y molecular. Editorial Interamericana. Mc
Graw-Hill. España. 1998
Berrón- Pérez, R. ,Penagos,M. El sistema del complemento. Vías clásica y de la lectina
que se une a la manosa. Colegio Mexicano de Alergia, Asma e Inmunología
Pediátrica, AC. Vol. 12, Núm. 2 • Mayo-Agosto 2003. En línea
http://www.medigraphic.com/espanol/e-htms/e-alergia/e-al2003/e-al03-2/em-
al032b.htm consultado el 15 de julio de 2009
Janeway,Ch., Travers,P, Walport,M. Inmunobiología. El sistema inmunitario en
condiciones de salud y enfermedad. Editorial Mason. 2ª edición. Barcelona. 2003.
Rojas, W., Anaya, J., Aristizábal, B. Inmunología (de Rojas). Editorial: Corporación para
Investigaciones Biológicas. CIB. Colombia. 2007
Stites, D. Inmunología Básica y Clínica . Editorial El Manual Moderno. 10ª edición.
México. 2003.

http://www.medigraphic.com/espanol/e-htms/e-alergia/e-al2003/e-al03-2/em-al032b.htm
http://www.medigraphic.com/espanol/e-htms/e-alergia/e-al2003/e-al03-2/em-al032b.htm
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Manual de prácticas Inmunología Básica
Elaborado por Sandra Luz González

SUSTENTO TEÓRICO
La inmunoprecipitación es uno de los métodos más simples y directos para demostrar
la reacción antígeno- anticuerpo en el laboratorio. Cuando se utiliza un medio semisólido
como el agar, recibe el nombre de inmunodifusión y la formación de dicha reacción depende
de electrolitos amortiguadores, pH, temperatura y de las concentraciones relativas del
antígeno y anticuerpo. Las reacciones de inmunodifusión puden ser únicas y dobles. En la
primera el antígeno o el anticuerpo permanece fijo y el otro reactivo se mueve y se acopla
con él; en la inmunodifusión doble ambos reactivos están libres para moverse uno hacia el
otro y precipitan. El movimiento en cualquier forma de difusión pude ser lineal o radial.
La dobleinmunodifusión (DID), también llamada análisis de Ouchterlony esta basada en el
principio de que el antígeno y el anticuerpo introducidos en un medio semisólido se difunden
y al encontrarse en proporciones óptimas forman líneas de precipitación, cuyas
características dependerán de la concentración y pesos moleculares de los mismos.
Ouchterlony distinguía tres tipos principales de reacción que se observaban cuando
antígenos relacionados, que se hallan en excavaciones adyacentes, reaccionan con
anticuerpos contra los diversos determinantes antigénicos que difunden a partir de un
recipiente central formando bandas de precipitación. Este patrón de bandas se puede
clasificar de tres maneras: identidad parcial, total o no identidad.
La DID puede ser empleada también para el análisis semicuantitativo en los sistemas
serológicos humanos para determinar el título aproximado de precipitación del antisuero
(Carpenter, 1986, Stites, 2003).

OBJETIVOS.
a) Realizar un análisis semicuantitativo de un antígeno soluble.
b) Identificar una reacción de identidad de una de no identidad.

DESCRIPCIÓN DE LA PRÁCTICA
En una placa con agar se hacen perforaciones equidistantes donde se colocan, de
acuerdo a los esquemas establecidos, el antisuero y diferentes antígenos para observar la
especificidad de la reacción antígeno- anticuerpo que formara líneas de precipitación entre
http://www.monografias.com/trabajos14/cambcult/cambcult.shtml
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el pozo que contienen los anticuerpos y su antígeno homólogo. Es una técnica
particularmente útil para el estudio de sistemas antígeno-anticuerpo debido a su alto poder
de resolución y la facilidad con que puede compararse un sistema con otro.

PROCEDIMIENTOS PARA LA REALIZACIÓN DE LA PRACTICA
1. En un vaso de 250 ml colocar 1 gramo de agar y agregar 100 ml de solución buffer
P04 salina 0.15 M pH 7.2. Hervir hasta disolución total del agar. El volumen de agua
evaporada se repone con solución buffer. Añadir 1 ml de merthiolate al 1%.
2. Vertir el agar en la caja de petri hasta formar una capa de 5 mm de espesor. Dejar
solidificar y hacer los orificios de 5 mm dediámetro (deben distar un cm entre sí).
3. Las perforaciones en el gel se hacen siguiendo los esquemas indicados y el agar
residual se remueve con un aplicador.
4. La distribución de los antígenos y de los antisueros en los orificios se hace de
acuerdo a los esquemas.
5. Incubar en cámara húmeda a temperatura ambiente durante 24-48 horas buscando
bandas de precipitación.
6. Dibujar el esquema de perforaciones utilizado, indicando la solución que fue
colocada en cada perforación, así como las bandas de precipitación que hayan
aparecido

Patrón No. 1

Pozo No. 1 antisuero contra A y B
Pozo No. 2 Antígeno A
Pozo No. 3 Antígeno A
Pozo No. 4 Antígeno B
Pozo No. 5 Antígeno A
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Patrón No. 2

MATERIAL Y EQUIPO
Material por equipo de 4 alumnos Material biológico, equipo, reactivos y
soluciones por grupo:
1 vaso de precipitado de 250 ml
1 caja de petri grande
1 pipeta de 5 ml
1 disco de papel filtro
10 tubos de 12 x 75 mm
1 gradilla
1 pipeta de plástico desechable
1 pipeta de 5 microlts
3 pipetas pasteur
1 mechero
1 lámina de asbesto
1 tripié
1 varilla de vidrio para mezclar
Suero control de conejo.
Antígenos solubles.
Antisuero precipitante homólogo.
500 ml de Buffer PO4 salina PH 7.2-
7.4
20 grs de Agar agarosa
500 ml de solución salina al 0.85%

BIBLIOGRAFÍA
Abbas,A. ,Lichtman,A. Inmunología celular y molecular. Editorial Interamericana. Mc Graw-
Hill. España. 1998
Janeway,Ch., Travers,P, Walport,M. Inmunobiología. El sistema inmunitario en condiciones
de salud y enfermedad. Editorial Mason. 2ª edición. Barcelona. 2003.
Rojas, W., Anaya, J., Aristizábal, B. Inmunología (de Rojas). Editorial: Corporación para
Investigaciones Biológicas. CIB. Colombia. 2007
Stites, D. Inmunología Básica y Clínica . Editorial El Manual Moderno. 10ª edición. México.
2003.
Pozo No. 1 Antisuero homólogo
Pozo No. 2 Antígeno sin diluir
Pozo No. 3 Antígeno diluido 1:2
Pozo No. 4 Antígeno diluido 1:4
Pozo No. 5 Antígeno diluido 1:8
Pozo No. 6 Antígeno diluido 1:16
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Regueiro ,J., López,C. Inmunología. Biología y patología del sitema inmune. Editorial Médica
Panamericana. 3ª edición.
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Elaborado por Sandra Luz González

SUSTENTO TEÓRICO
La inmunodifusión radial es una técnica introducida por Mancini que emplea la
difusión única para la determinación cuantitativa de los antígenos. Se basa en el
principio de que existe una relación cuantitativa entre la cantidad de antígeno colocado
en un pozo horadado sobre la placa de agar anticuerpo y el anillo resultante de
precipitación.
La aplicación clínica más importante de la inmunodifusión radial es la medición de las
concentraciones de inmunoglobulinas séricas.

OBJETIVO
1. Cuantificar antígenos solubles utilizando un método de inmunodifusión.

DESCRIPCIÓN DE LA PRÁCTICA
En un placa de agar- anticuerpo se realizan perforaciones donde se colocan cantidades
crecientes de antígeno llevándose a cabo una reacción ag-ac que se visualiza entre 48 y
72 horas como un halo de precipitación alrededor de cada pozo.

PROCEDIMIENTOS PARA LA REALIZACIÓN DE LA PRACTICA.
1. Preparar una solución de agar al 1% de igual manera a la descrita para la
inmunodifusión doble.
2. Añadir 1 ml de merthiolate al 1% y dejar enfriar entre 50-559C 3.- En una caja de
petri chica colocar' 0.5 ml de antisuero distribuyéndolo homogéneamente en el
fondo.
3. Aplicar rápidamente 4 ml de agar mezclándolo con el antisuero con movimientos
circulares suaves hasta obtener una capa homogénea. Mantener caliente la
pipeta para evitar que gelifique el agar.
4. Dejar gelificar el agar a temperatura ambiente.
5. Hacer 4 perforaciones equidistantes de un diámetro de 3 mm removiendo el agar
residual con un aplicador.
6. Hacer diluciones del antígeno al doble con solución buffer PO salina 0.15 M pH
7.2, -7.6 ; 1:2,1:4 y 1:8.
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7. Llenar cada pozo con un volumen, medido 'exactamente, de las soluciones de
antígeno de diferente concentración, colocando en el restante el antígeno sin
diluir.
8. Incubar en cámara húmeda a temperatura ambiente durante 24-48 horas.
9. Medir los diámetros de los halos de precipitación obtenidos.

ESQUEMA UTILIZADO.

Resultados: Hacer una gráfica en papel milimétrico poniendo en las ordenadas el
diámetro del halo de precipitación elevado al cuadrado y expresado en mm y en las
abscisas las concentraciones de los antígenos.
MATERIAL Y EQUIPO
Material por equipo de 4 alumnos Material biológico, equipo, reactivos y
soluciones por grupo:
1 vaso de precipitado de 250 ml
1 caja de petri chica
2 pipeta de 1 ml
1 pipeta de 5 ml
1 disco de papel filtro
6 tubos de 12 x 75 mm
1 gradilla
1 pipeta de plástico desechable
1 pipeta de 10 microlts
1 pipeta pasteur
1 mechero
1 lámina de asbesto
1 tripié
1 varilla de vidrio

500 ml de Buffer PO4 salina PH 7.2-7.4
20 grs de Agar agarosa
1 balanza granataria
1 centrífuga

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Regueiro ,J., López,C. Inmunología. Biología y patología del sitema inmune. Editorial
Médica Panamericana. 3ª edición.
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SUSTENTO TEÓRICO
Esta prueba fue creada por Ascoli en 1902 y constituye una de las modificaciones
más sensibles de la reacción de precipitación.
Es un método cualitativo basado en la reacción interfásica que se produce cuando en un
pequeño tubo se colocan sucesivamente, y evitando que se mezclen, las soluciones de
antígenos y anticuerpos que se corresponden, siendo conveniente que los reactivos se
encuentren en concentraciones equivalentes. El anticuerpo suele constituir la capa
inferior y el antígeno la capa superior.

OBJETIVO.
1. Aplicar una reacción de precipitación en medio líquido para identificar antígenos
proteicos en solución.

DESCRIPCIÓN DE LA PRÁCTICA.
El antígeno en cantidades decrecientes se pone en contacto con el antisuero homólogo
formando dos fases para interaccionar y formar un precipitado anular blanco en la
interfase, previa incubación a 370 C. Este método se emplea para identificar proteínas,
por ejemplo, en la determinación medico legal de manchas de sangre.

PROCEDIMIENTOS PARA LA REALIZACIÓN DE LA PRÁCTICA
1. Antes de la prueba, el antisuero y la solución antigénica deben centrifugarse a
2500 rpm/5 minutos para remover cualquier partícula.
2. Colocar en una serie de tubos de hemólisis 0.2 ml del suero precipitante. (5
tubos)
3. En una serie separada de tubos de ensaye preparar diluciones 1:10,1:50,
1:100.1:150 y 1:200 del antígeno.
4. Con una pipeta añadir, por las paredes, 0.2 mlde cada dilución a los tubos que
contienen el suero evitando que se mezclen.
5. Llevar a baño de agua a 379C y observar a los 15,30 y 60 minutos si en alguno
de ellos aparece un precipitado anular blanco. En caso de no presentarse esta
reacción, dejar los tubos en refrigeración toda la noche y observar de nuevo.
6. Preparar al mismo tiempo un tubo control negativo con el suero del conejo
obtenido antes de la inmunización o con solución salina.
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RESULTADOS.
 Positivo: formación de un precipitado blanco anular en la interface que gradualmente se
va ensanchando y aumenta de intensidad.
 Negativo: no hay formación de precipitado.

MATERIAL Y EQUIPO
Material por equipo de 4 alumnos Material biológico, equipo, reactivos y
soluciones por grupo:
4 pipetas pasteur con bulbo
10 tubos de ensaye de 12 x 75
mm
1 gradilla de metal
2 pipetas graduadas de 1 ml
2 pipeta graduada de 2 ml
6 tubos de hemólisis
1 gradilla de plastico
1 pipeta graduada de 5 ml
1 escobillón

Solución salina al 0.85%
Antisueros precipitantes obtenidos
por los alumnos
Suero control obtenido por los
alumnos
Jabón para lavar el material
2 centrífugas
Estufa a 370 C
Papel parafilm

BIBLIOGRAFÍA ACTUALIZADA
Abbas,A. ,Lichtman,A. Inmunología celular y molecular. Editorial Interamericana. Mc
Graw-Hill. España. 1998
Janeway,Ch., Travers,P, Walport,M. Inmunobiología. El sistema inmunitario en
condiciones de salud y enfermedad. Editorial Mason. 2ª edición. Barcelona. 2003.
Rojas, W., Anaya, J., Aristizábal, B. Inmunología (de Rojas). Editorial: Corporación para
Investigaciones Biológicas. CIB. Colombia. 2007
Stites, D. Inmunología Básica y Clínica . Editorial El Manual Moderno. 10ª edición.
México. 2003.

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SUSTENTO TEÓRICO
Si se coloca un antígeno sobre una capa de agar-anticuerpo específico se
formarán bandas en el agar como consecuencia de la precipitación que tiene lugar en la
superficie en que avanza el antígeno; a medida que la concentración de éste aumenta,
se produce la solución del precipitado por detrás del frente que avanza, dando la
apariencia de una migración de la banda.

OBJETIVO.
1. Aplicar un método de inmunodifusión para identificar un antígeno presente en
una mezcla.

DESCRIPCIÓN DE LA PRÁCTICA
Los anticuerpos presentes en el suero hiperinmune se fijan al agar; los antígenos en
solución se colocan sobre la superficie del mismo formando bandas de precipitación .

PROCEDIMIENTOS PARA LA REALIZACIÓN DE LA PRACTICA
1. Marcar dos tubos de hemólisis como 1 y 2.
2. En el tubo #1 mezclar 0.3 ml de agar al 1% fundido y enfriado a 500C y-0.2 ml de
suero precipitante. Las pipetas y los tubos utilizados deben mantenerse tibios y
efectuara la operación rápidamente. Dejar enfriar para que solidifique.
3. En el tubo #2 mezclar el agar de la misma manera con 0.2 ml de suero control de
conejo o con solución salina. Este es el tubo control.
4. Preparar una mezcla con los antígenos solubles y dejar escurrir 0.5 ml sobre la
superficie del agar en ambos tubos.
5. Tapar los tubos para evitar evaporaciones y dejarlos a temperatura ambiente de
24-48 horas para la lectura de los resultados.

RESULTADOS.

Positivo: formación de bandas de precipitado en el agar
Negativo: sin formación de bandas de precipitación.

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MATERIAL Y EQUIPO
Material por equipo de 4 alumnos Material biológico, equipo, reactivos y
soluciones por grupo:
1 vaso de precipitado de 250 ml
2 pipeta de 1 ml
6 tubos de 12 x 75 mm
1 gradilla
1 pipeta de 20 microlts
1 pipeta pasteur
1 mechero
1 lámina de asbesto
1 tripié
1 varilla de vidrio

Antisuero precipitante de conejo
Suero control de conejo
Antígenos solubles ( albúmina, suero,
plasma)

BIBLIOGRAFÍA ACTUALIZADA
Janeway,Ch., Travers,P, Walport,M. Inmunobiología. El sistema inmunitario en
condiciones de salud y enfermedad. Editorial Mason. 2ª edición. Barcelona. 2003.
Rojas, W., Anaya, J., Aristizábal, B. Inmunología (de Rojas). Editorial: Corporación para
Investigaciones Biológicas. CIB. Colombia. 2007
Stites, D. Inmunología Básica y Clínica . Editorial El Manual Moderno. 10ª edición.
México. 2003.
Kabat E. et al. Inmunoquímica experimental. Ed. La Prensa Médica Mexicana. 2ª edición.
México. 1986

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Manual de prácticas Inmunología Básica
Elaborado por Sandra Luz González

SUSTENTO TEÓRICO
La aglutinación es la agregación de un antígeno particulado -un microorganismo o
una célula- por la interacción con su anticuerpo específico. En esta reacción, a
diferencia de la reacción de precipitación, el fenómeno visible se produce con mayor
sensibilidad debido a que involucra un antígeno particulado, es decir, con sitios
antigénicos estrechamente dependientes de una estructura relativamente voluminosa.
Las bacterias y los eritrocitos son las partículas más utilizadas en la aglutinación porque
constituyen sistemas antigénicos complejos( Rojas,2007).
Los grupos sanguíneos se caracterizan por la presencia sobre los eritrocitos de
antígenos conocidos como isoantígenos. Cuando estos encuentran anticuerpos
homólogos, las células de las cuales forman parte pueden ser aglutinadas.
En la aglutinación interviene factores inespecíficos como el pH, la temperatura y las
fuerzas iónicas de todo el sistema en que ocurre la reacción ( que tiene lugar en
soluciones isotónicas neutras de cloruro de sodio) La unión del anticuerpo y el antígeno
da lugar a la formación de una malla que precipita haciendo visible la reacción; hay una
relación cuantitativa entre la cantidad de anticuerpo y el número y tamaño de
determinantes antigénicos en la superficie del antígeno (Ortiz,1987).
En esta práctica los anticuerpos del sistema ABO reaccionarán con su antígeno
específico provocando la aglutinación de los eritrocitos que lo poseen.

OBJETIVOS.
Aplicar una reacción de aglutinación directa para determinar la presencia de anticuerpos
del sistema ABO.

DESCRIPCIÓN DE LA PRÁCTICA
Se mezclan eritrocitos de grupo A o B con sus anticuerpos homólogos para producir
una aglutinación que puede ser visible con diferentes grados de intensidad.

PROCEDIMIENTOS PARA LA REALIZACIÓN DE LA PRACTICA
1. Marcar dos tubos con las letras A y B respectivamente.
2. Colocar en cada tubo una gota de los eritrocitos correspondientes.
3. Agregar dos gotas del suero problema a cada tubo.
4. Mezclar bien y centrifugar a 3500 rpm durante 15 segundos.
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5. Sacudir levemente el fondo del tubo para apreciar la reacción de aglutinación.
Resultados
Positivo: formación de grumos o ligera hemolisis.
Negativo: no aglutinación ni hemolisis.
MATERIAL Y EQUIPO
Material por equipo de 4 alumnos Material biológico, equipo, reactivos y
soluciones por grupo:
8 tubos de ensaye de 12 x 75
mm
1 gradilla
4 pipetas pasteur
1 escobillón
1 ml Suspensión de Eritrocitos A
1 ml Suspensión de Eritrocitos B
1 ml Suero humano

BIBLIOGRAFÍA
Ortiz,L. Inmunología .Editorial Interamericana. México. 1987
Rojas, W., Anaya, J., Aristizábal, B. Inmunología (de Rojas). Editorial: Corporación para
Investigaciones Biológicas. CIB. Colombia. 2007
Stites, D. Inmunología Básica y Clínica . Editorial El Manual Moderno. 10ª edición.
México. 2003.
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SUSTENTO TEÓRICO
La aglutinación de bacterias se lleva a cabo cuando los antígenos localizados en su
superficie celular entran en contacto con los anticuerpos específicos presentes en el
suero.

OBJETIVO
1. Identificar diferentes microorganismos utilizando antisueros aglutinantes de
conejo.

DESCRIPCIÓN DE LA PRÁCTICA.
La suspensión bacteriana que contiene los antígenos particulados se mezcla con el
antisuero de conejo para visualizar la formación de grumos indicativo de la reacción de
aglutinación.

PROCEDIMIENTOS PARA LA REALIZACIÓN DE LA PRACTICA
1. En cada óvalo de una placa de vidrio colocar 0.03 ml de cada uno de los
antisueros evitando que se mezclen. Hacer un testigo de la prueba con suero
control de conejo o con solución salina.
2. Añadir a todos ellos una gota (± 0.03 ml) de la suspensión bacteriana y mezclar
para homogeneizar.
3. Agitar la placa por rotación manual durante 3 minutos y observar.

RESULTADOS.
Aglutinación: indicará correspondencia entre antígeno y anticuerpo
No aglutinación: ausencia de anticuerpos específicos en el suero.
Nota: realizar el mismo procedimiento con todas las suspensiones bacterianas
identificando en cada caso el microorganismo de que se trate.

MATERIAL Y EQUIPO
Material por equipo de 4 alumnos Material biológico, equipo, reactivos y
soluciones por grupo:
UNIVERSIDAD VERACRUZANA FACULTAD DE BIOANALISIS
Manual de prácticas Inmunología Básica
Elaborado por Sandra Luz González

12 tubos de ensaye de 12 x 75
3 pipetas graduadas de 1 ml
3 pipetas pasteur con bulbo
1 gradilla
1 vaso de precipitado de 50 ml

Suspensiones bacterianas utilizadas para
inmunizar a los conejos
Antisueros aglutinantes obtenidos por los
alumnos
Sol. Buffer PO4 salina . pH 7.2, 0.15 M
Solución de hipoclorito de sodio
2 lupas
2 centrífugas
1 balanza granataria
1 vaso de precipitado de 250 ml
Estufa a 370 C
Papel parafilm o tapones de hule
Bolsas y contenedores para RBPI

UNIVERSIDAD VERACRUZANA FACULTAD DE BIOANALISIS
Manual de prácticas Inmunología Básica
Elaborado por Sandra Luz González

SUSTENTO TEÓRICO
La inhibición de la aglutinación es una variante de la reacción de aglutinación que
puede ser utilizada para demostrar la presencia de de un anticuerpo o antígeno en una
preparación. Si se combina un antígeno con su anticuerpo la aglutinación de los
hematíes secundariamente introducidos en la mezcla es inhibida y esta inhibición es
inmunológicamente específica.
Po lo tanto si a un suero para diagnóstico anti-A se le agrega una sustancia secretora de
tipo A, se neutralizarán sus aglutininas inactivando el reactivo que ya no podrá aglutinar
glóbulos A. El mismo razonamiento se sigue para el suero anti-B.

OBJETIVO.
1. Aplicar una reacción de inhibición de la aglutinación para determinar si un
individuo es o no secretor de las sustancias de grupo sanguíneo.

DESCRIPCIÓN DE LA PRÁCTICA.
Cantidades decrecientes de saliva se ponen en contacto con los antisueros de tipo
A o B y después, previa incubación, se agregan los eritrocitos en suspensión y si estos
no aglutinan la saliva contiene antígenos de grupo A o B.

PROCEDIMIENTOS PARA LA REALIZACIÓN DE LA PRACTICA

1. Colectar en un vaso de precipitado 4-5 ml de muestra. Colocar en un tubo de
ensaye y calentar 10 minutos en baño de agua a 370C. Centrifugar a -3000 rpm/5
minutos y decantar el sobrenadante.
2. Preparar 6 diluciones triples de saliva con solución salina isotónica.
3. En una gradilla colocar 6 tubos de ensaye: en el primero poner: una gota de
saliva calentada sin diluir y en los cuatro siguientes una gota de cada una de las
diluciones anteriores en el sexto tubo, depositar una gota de solución salina
(testigo negativo).
4. Añadir una gota de suero anti-A a cada uno de los tubos, mezclar y dejar reposar
a temperatura ambiente durante 5 minutos.
UNIVERSIDAD VERACRUZANA FACULTAD DE BIOANALISIS
Manual de prácticas Inmunología Básica
Elaborado por Sandra Luz González

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5. Añadir una gota de la suspensión de eritrocitos del grupo A a cada uno de los
tubos, mezclar y dejar reposar durante 5 minutos.
6. Centrifugar los tubos a 3400 rpm/30 segundos, remover suavemente los
eritrocitos sedimentados y observar si existe aglutinación.
7. Nota: seguir el mismo procedimiento para saliva de tipo B utilizando suero anti-B
y eritrocitos B.

RESULTADOS:

Secretor: no hay aglutinación ni hemolisis.
No secretor: aglutinación y/o hemolisis.

MATERIAL Y EQUIPO
Material por equipo de 4 alumnos Material biológico, equipo, reactivos y
soluciones por grupo:

1 vaso de precipitado de 50 ml
1 gradilla
10 tubos de 12 x 75
1 pizeta con solución salina

5 ml de saliva
Antisueros comerciales Anti A y anti B
1 centrífuga
Baño de agua a 370C

BIBLIOGRAFÍA
Instituto Politécnico Nacional. Unidad Profesional Interdisciplinaria de Biotecnología.
Recuperado de
http://www.comunidades.ipn.mx/upibi/Languages/Espanol/UploadFiles/Documents/405M
anual%20Inmunolog%C3%ADa%20Aplicada.pdf el 5 de abril de 2009
Manual de prácticas de Inmunología. Departamento de Inmunología. Escuela Nacional
de Ciencias Biológica. ENCB-IPN. México.
Linares J. Inmunología Básica Aplicada en el Banco de Sangre. Litotec. Caracas 1986.

http://www.comunidades.ipn.mx/upibi/Languages/Espanol/UploadFiles/Documents/405Manual%20Inmunolog%C3%ADa%20Aplicada.pdf
http://www.comunidades.ipn.mx/upibi/Languages/Espanol/UploadFiles/Documents/405Manual%20Inmunolog%C3%ADa%20Aplicada.pdf