PROTEINAS-DE-LA-MEMBRANA-DEL-GLOBULO-ROJO

Vista previa del material en texto

ESTUDIO DE PROTEINAS DE LA MEMBRANA DEL GLOBULO ROJO EN 
PACIENTES PEDIATRICOS CON ESFEROCITOSIS HEREDITARIA DE LA 
FUNDACION HOSPITAL DE LA MISERICORDIA 
 
 
 
 
 
 
 
 
Dr. EDGAR VLADIMIR CABRERA BERNAL 
 
 
 
 
 
 
 
UNIVERSIDAD NACIONAL DE COLOMBIA 
FACULTAD DE MEDICINA – DEPARTAMENTO DE PEDIATRIA 
UNIDAD DE ONCOHEMATOLOGIA PEDIATRICA 
BOGOTÁ 
2008 
 
 
ESTUDIO DE PROTEINAS DE LA MEMBRANA DEL GLOBULO ROJO EN 
PACIENTES PEDIATRICOS CON ESFEROCITOSIS HEREDITARIA DE LA 
FUNDACION HOSPITAL DE LA MISERICORDIA 
 
 
Autor: 
Dr. EDGAR VLADIMIR CABRERA BERNAL 
Código 597928 
 
 
Tesis de grado para optar por el titulo de: 
ESPECIALISTA EN ONCOHEMATOLOGÍA PEDIÁTRICA 
 
 
Director de Tesis: 
Dr. EDUARDO BELTRÁN DUSSAN 
Profesor Titular Departamento de Pediatría 
Coordinador Académico División de Oncohematología Pediátrica 
Coordinador de la Especialidad en Oncohematología Pediátrica 
 
Codirector de Tesis: 
Dr. JORGE EDUARDO CAMINOS PINZÓN 
Profesor de la Facultad de Medicina 
División de Bioquímica 
 
 
UNIVERSIDAD NACIONAL DE COLOMBIA 
FACULTAD DE MEDICINA – DEPARTAMENTO DE PEDIATRIA 
UNIDAD DE ONCOHEMATOLOGIA PEDIATRICA 
BOGOTÁ 
2008 
 
 
A mi compañera Adriana, impulsora incansable de todas mis 
batallas y a quien pertenece también este triunfo 
A mis hijas: Laura, Juliana y Camilita: a quienes debo el amor 
a la vida 
A mis padres Zoila y William, ejemplo de lucha, lealtad, 
rectitud y bondad 
 A mis maestros 
 A mis pacientes 
 A todos mis colaboradores 
 
 
AGRADECIMIENTOS 
 
A la Dra. Susana Bravo de la Facultad de Medicina de la Universidad de Santiago 
de Compostela, España 
Al Dr. Justo Castaño de la Universidad de Córdoba, España 
A la Universidad Nacional de Colombia 
A la Fundación Hospital de la Misericordia 
Al Departamento de Pediatría de la Universidad Nacional de Colombia 
Al Servicio de Oncohematología Pediátrica de la Fundación Hospital de la 
Misericordia 
 
 
CONTENIDO 
Pág. 
INTRODUCCION 10 
1. JUSTIFICACIÓN 13 
2. OBJETIVOS 15 
2.1 OBJETIVO GENERAL 15 
2.2 OBJETIVOS ESPECIFICOS 15 
3. MARCO TEORICO 16 
3.1 ESTRUCTURA DE LA MEMBRANA 16 
3.2 ETIOLOGIA Y FISIOPATOLOGIA 23 
3.3 MANIFESTACIONES CLINICAS Y PARACLINICAS 28 
3.4 DIAGNOSTICO 30 
3.5 TRATAMIENTO 37 
4. METODOLOGIA 38 
4.1 TIPO DE ESTUDIO 38 
4.2 CRITERIOS DE INCLUSION Y EXCLUSION 38 
4.3 RECURSOS INSTITUCIONALES 39 
4.4 RECURSO HUMANO 39 
4.5 CONSIDERACIONES ETICAS Y DISPOSICIONES VIGENTES 39 
4.6 TECNICAS Y PROCEDIMIENTOS 41 
5. RESULTADOS 47 
5.1 CARACTERÍSTICAS CLÍNICAS 47 
5.2 HALLAZGOS DE LABORATORIO 49 
5.3 CURVA DE FRAGILIDAD OSMÓTICA 50 
5.4 RESULTADOS DE ELECTROFORESIS 1D 50 
5.5 RESULTADOS DE 2D-PAGE Y ESPECTROMETRÍA DE MASAS MALDI-
TOF 51 
 
6. DISCUSION 53 
7. CONCLUSIONES 56 
BIBLIOGRAFIA 57 
ANEXOS 60 
 
 
 
LISTA DE TABLAS 
Pág. 
Tabla 1. Principales proteínas de la membrana del eritrocito 24 
Tabla 2. Clasificación de esferocitosis e indicación de esplenectomía 29 
Tabla 3. Características epidemiológicas de los pacientes 47 
Tabla 4. Antecedentes personales y familiares 49 
Tabla 5. Características de laboratorios 50 
 
 
 
LISTA DE FIGURAS 
Pág. 
Figura 1. Malla del citoesqueleto. Modificado de William’s Hematology 7ª 
edición. 18
Figura 2. Organización de la membrana del eritrocito. 21
Figura 3. Principales métodos proteómicos. 35
Figura 4. Diferencia de expresión de los pacientes con EH versus los 
controles 52
 
 
 
LISTA DE ANEXOS 
Pág. 
Anexo A. Consentimiento informado 61
Anexo B. Curvas de fragilidad osmótica 62
Anexo C. Gel de Coomasie donde se observan las proteínas 
similares(cuadros verdes) y diferentes(cuadros rojos) de los pacientes versus 
los controles 70
Anexo D. Electroforesis en 2D-PAGE, donde se observa las proteínas que se 
expresan en los pacientes con respecto a los controles. 71
Anexo E. Geles en 2D-PAGE: se observan las diferencias entre los controles 
y el paciente 3 (subrayado por un cuadro rojo) 72
Anexo F. Resultados de espectrometría de masas de algunas de las 
proteínas identificadas en los geles de los paciente 73
 
 
10 
 
INTRODUCCION 
 
La esferocitosis hereditaria (EH) es la causa de anemia hemolítica más frecuente 
en todo el mundo y es secundaria a alteraciones o deficiencias en las proteínas 
del citoesqueleto del eritrocito principalmente la espectrina, la ankirina, banda 3 y 
banda 4.2, entre otras. Esta patología ocurre en todos los grupos étnicos y 
raciales, con mayor prevalencia en la raza blanca. Tiene una incidencia que varía 
entre 1 por cada 2.000 a 5.000 nacidos vivos dependiendo del sitio geográfico; 
lamentablemente no hay estudios en Colombia donde se establezcan la incidencia 
y la prevalencia de esta enfermedad. 
 
Las manifestaciones clínicas son muy variadas por su comportamiento genético 
que es también heterogéneo. Es autosómica dominante aproximadamente en el 
75% de los casos y en el restante es: autosómica recesiva, autosómica dominante 
con penetrancia variable o por mutaciones de novo. 
 
El estudio y diagnóstico de la EH en nuestro medio es relativamente sencillo en 
aquellos pacientes con antecedentes familiares y con un cuadro clínico y examen 
físico clásico, el cual se complementa con los estudios de laboratorio que de 
manera indirecta nos ayudan al diagnóstico. Pero el problema son los pacientes 
con enfermedades leves o portadores (con rasgo) porque pueden cursar con 
síntomas mínimos o incluso asintomáticos y las pruebas diagnósticas de rutina 
pueden no revelar el diagnóstico por su baja sensibilidad en estos casos. Los 
estudios de laboratorio generales son: cuadro hemático con evaluación de la 
hemoglobina, hematocrito, volumen corpuscular medio, hemoglobina corpuscular 
media y concentración de hemoglobina corpuscular media, conteo de reticulocitos 
corregido, frotis de sangre periférica, Coombs directo y fraccionado y curva de 
fragilidad osmótica. Se complementa con: bilirrubina total y diferencial, ecografía 
11 
de abdomen superior para evaluar el tamaño del bazo y la presencia de cálculos 
en la vesícula biliar. 
 
Una de las pruebas confirmatorias es la electroforesis de proteínas de membrana 
del glóbulo rojo en gel de poliacrilamida solubilizada en sodio dodecil sulfato (SDS-
PAGE, de sus siglas en ingles) con la cual se puede identificar la ausencia única o 
combinada de las proteínas del citoesqueleto y del cual hay sólo un estudio en 
Colombia realizado por Torres et al (1) quienes describieron las características 
clínicas y de laboratorio de 29 pacientes adultos con EH y a quienes se les 
practicó electroforesis de proteínas de membrana del eritrocito en SDS-PAGE, 
encontrando mayor deficiencia de Banda 3 que de espectrina a diferencia de lo 
descrito en la mayoría de estudios y finalmente plantean completar los datos con 
estudios de biología molecular. 
 
Actualmente los avances científicos y tecnológicos en Biología Molecular permiten 
la evaluación simultánea de las características genéticas y proteicas de una 
muestra y han sido ampliamente empleados en diferentes campos de la medicina 
con un futuro prometedor. Dentro de estos avances están las llamadas técnicas 
“omic”: Genómica, Transcriptómica y Proteómica. Los genes (analizados por la 
genómica) se transcriben a ARN (estudiados por la transcriptómica). Hasta este 
nivel hay cierto grado de variabilidad generado por inicios, transcripción y 
procesamientos de intrones alternativos. La mayoría del ARN es traducido para 
generar proteínas (evaluadas por la proteómica). En este último proceso existe un 
alto nivel de heterogeneidad ya que la proteína recién sintetizada puede 
experimentar multitud de modificaciones postraduccionales, muchas de ellas con 
relevante significado funcional (2). Finalmente, el futuro en el diagnóstico, 
pronóstico y establecimiento de factores de riesgo de las enfermedades en 
general, se realizarán contécnicas moleculares como la proteómica que ayudará a 
establecer el significado funcional de las diferentes proteínas en los tejidos. Para 
el diagnostico de EH, no se realizan, hasta el momento, estudios electroforéticos 
12 
de rutina y menos estudios de proteómica pues por su complejidad y costo, sólo 
se puede acceder a esta tecnología en muy pocos centros de investigación a nivel 
mundial. Para los estudios de proteómica se emplea el sistema de electroforesis 
en 2 dimensiones (2D) que separa las proteínas por cargas y peso molecular y 
luego sobre el gel se hace la identificación y aislamiento de ”spots” diferentes, 
luego se realiza la extracción de la proteína mediante digestión enzimática con 
tripsina y se determina el patrón peptídico empleando espectrometría de masas. 
Este patrón se compara con la masa esperada de las proteínas incluídas en 
potentes bases de datos (como DMSR, SWISS-PROT y TrEMBL), generando un 
listado de posibles candidatos (2). 
 
Dentro del estudio de la EH es muy importante conocer la alteración de la proteína 
de del citoesqueleto de la membrana del glóbulo rojo, primero para confirmar el 
diagnóstico, establecer cuál es el déficit más frecuente, asociarlo con la severidad 
de la enfermedad, las alteraciones genéticas y finalmente para el manejo y el 
pronóstico. En nuestro medio no es posible realizar las pruebas de proteómica, 
pero conociendo la importancia de desarrollar esta técnica en nuestro país y 
especialmente en patologías hematológicas, este hecho nos llevó a plantear este 
estudio en pacientes con esferocitosis hereditaria (EH) en quienes se propone 
encontrar el déficit de proteínas de membrana pero además encontrar y describir 
la expresión de nuevas proteínas o proteínas alteradas por medio del estudio de 
masas. Es así como se realizó la toma de muestras de sangre de pacientes con 
EH que asisten a control de Hematología Pediátrica en la Fundación Hospital de la 
Misericordia, luego se llevó a cabo el aislamiento de las membranas del eritrocito 
en el Departamento de Bioquímica de la Facultad de Medicina de la Universidad 
Nacional de Colombia y posteriormente se realizó la electroforesis en 2D y la 
identificación de la(s) proteína(s) deficitaria(s) o alterada(s) con respecto a los 
controles, en el Departamento de Fisiología de la Facultad de Medicina de la 
Universidad de Santiago de Compostela en España con colaboración del grupo 
del Dr Justo Castaño en la Universidad de Córdoba. 
13 
 
1. JUSTIFICACIÓN 
 
La EH es la anemia hemolítica más frecuente en el mundo, causada por alteración 
en las proteínas de citoesqueleto del glóbulo rojo, de carácter hereditario 
autosómica dominante en un poco más del 70% de los casos, con una gran 
variabilidad en las manifestaciones clínicas desde asintomáticos en aquellos 
pacientes portadores hasta anemias severas, ictericia, esplenomegalia y 
requerimientos transfusionales. El diagnóstico es relativamente sencillo en los 
casos severos y moderados, pero la dificultad es en aquellos portadores 
asintomáticos o con mínimos síntomas, en los cuales las pruebas con las que 
contamos en nuestro medio no pueden confirmarlo por su baja sensibilidad. 
 
Los estudios básicos son: cuadro hemático completo para evaluar: hemoglobina, 
hematocrito, volumen corpuscular medio, concentración de hemoglobina 
corpuscular media, conteo de reticulocitos corregido, frotis de sangre periférica, 
además de Coombs directo y fraccionado y curva de fragilidad osmótica. Con esta 
última se confirma el diagnóstico, pero es una prueba con baja sensibilidad y 
frecuentes falsos positivos. 
 
Otro estudio de laboratorio de mayor complejidad y que no está estandarizado en 
nuestro medio para su realización de rutina en el diagnóstico de EH, es la 
electroforesis de proteínas del citoesqueleto del glóbulo rojo en SDS-PAGE. En 
Colombia sólo hay publicado un estudio realizado entre 1995 y 1997 por Torres et 
al, quienes hacen la descripción de las características clínicas de 29 pacientes 
adultos con EH y realizan posteriormente electroforesis en SDS-PAGE 
demostrando que la deficiencia más frecuente en este grupo es de Banda 3, a 
diferencia de lo reportado a nivel mundial. Finalmente concluyen que este estudio 
se debe confirmar con estudios de Biología Molecular (1), como serían los de 
14 
genómica (estudios de las alteraciones en los genes), transcriptómica (estudio de 
la trascripción del ARN) y proteómica (estudio de la codificación de las proteínas), 
técnicas de alta complejidad y con las cuales se cuentan en laboratorios de 
investigación de alto nivel. 
 
Con el advenimiento de nuevas técnicas de estudio en Biología Molecular en 
Medicina, como es la genómica, transcriptómica y ahora la proteómica, se planteó 
y realizó un estudio piloto de Proteómica en los pacientes con EH que asisten a la 
consulta de Hematología Pediátrica en la Fundación Hospital de la Misericordia 
para confirmar el diagnóstico, determinar la alteración más frecuente en las 
proteínas del citoesqueleto y su relación con la severidad clínica, el tratamiento 
quirúrgico y con la pruebas diagnósticas disponibles de rutina en el Hospital, 
además se quiere encontrar y describir la expresión de nuevas proteínas o 
proteínas alteradas en las membranas de eritrocitos de los pacientes con EH que 
puedan ayudar a explicar la adaptación de los glóbulos rojos a la mutación de las 
proteínas que generan la EH. 
15 
 
2. OBJETIVOS 
 
2.1 OBJETIVO GENERAL 
Realizar y estandarizar las pruebas de electroforesis en 2D-PAGE y 
espectrometría de masas MALDI-TOF de proteínas de membrana del eritrocito a 
pacientes que consultan en la Fundación Hospital de la Misericordia con 
diagnóstico de esferocitosis hereditaria (EH) y compararlas con las de individuos 
sanos para detectar la deficiencia de proteínas de membrana e identificar la 
modificación de otras. 
 
2.2 OBJETIVOS ESPECIFICOS 
• Identificar por estudios moleculares las alteraciones en las proteínas de la 
membrana del eritrocito en pacientes con diagnóstico de EH. 
• Establecer la posible relación entre los estudios moleculares de las proteínas 
de membrana del eritrocito con los resultados de laboratorio de los pacientes 
con diagnóstico de EH. 
• Establecer la posible relación entre los estudios moleculares de las proteínas 
de membrana con las características clínicas de los pacientes con diagnóstico 
de EH. 
• Encontrar y describir la expresión de nuevas proteínas o proteínas modificadas 
en la membrana de los eritrocitos de pacientes con EH. 
16 
 
3. MARCO TEORICO 
 
La esferocitosis hereditaria (EH) es la causa más frecuente de anemia hemolítica y 
es secundaria a deficiencias en las proteínas de la membrana y del citoesqueleto 
del eritrocito como son principalmente la espectrina, ankirina, banda 3, banda 4.2, 
entre otras. Esta patología ocurre en todos los grupos raciales, con mayor 
prevalencia en la raza blanca provenientes del norte de Europa. Tiene una 
incidencia que varía entre 1 por cada 2.000 a 5.000 nacidos vivos dependiendo del 
sitio geográfico, como en Europa donde alcanza a 1 en 2000 nacidos vivos, como 
se deduce de los estudios realizados en Alemania y Escandinavia, en donde a 
donadores de sangre se les realizó la prueba de fragilidad osmótica, 
encontrándose que el 1% estaban alteradas (3). Lamentablemente no hay 
estudios en Colombia donde se establezcan la incidencia y la prevalencia de esta 
enfermedad. 
 
Las manifestaciones clínicas son muy variadas y dependen de las alteraciones 
genéticas que también son heterogéneas. Es autosómica dominante 
aproximadamente en el 70% de los casos; no se ha detectado homocigotos 
posiblemente porque es incompatible con la vida (4,5). En el restante es: 
autosómica recesiva, autosómica dominante con penetrancia variable o son 
mutaciones de novo. 
 
3.1 ESTRUCTURA DE LA MEMBRANA 
La membrana del glóbulo rojoes aproximadamente el 1% de su peso. Está 
conformada por dos grandes estructuras: la primera, la bicapa lipídica que en un 
80% son fosfolípidos y colesterol y el 20% restante son glicolípidos y 
aminofosfolípidos; una característica de la bicapa es que los fosfolípidos son 
distribuídos asimétricamente: fosfatidilcolina y esfingomielina se localizan en la 
17 
monocapa externa mientras que la fosfatidiletanolamina, fosfatidilserina (PS) y 
fosfoinosítidos en la monocapa interna. Las proteínas escramblasas y flipasas, 
han sido implicadas en la función de mantener esta asimetría de la bicapa lipídica, 
la cual tiene importancia fisiológica porque la PS y los fosfoinositidos interactúan 
con las proteínas del citoesqueleto, espectrina y proteína 4.1R, para anclarlas a la 
bicapa lipídica y darle estabilidad. Por otro lado, la pérdida de la asimetría de la 
bicapa, resulta en traslocación de la PS a la monocapa externa, favoreciendo el 
reconocimiento y la fagocitosis por el macrófago. Este tipo de reconocimiento 
juega un papel importante en la destrucción prematura en el caso de células 
falciformes y de talasemias (6,7). La segunda, por proteínas integrales y 
periféricas. Las proteínas integrales se han descrito más de 50 y van de varios 
cientos a más de un millón de copias por eritrocito; aproximadamente 25 de estas 
proteínas son antígenos de subgrupos sanguíneos. Las proteínas periféricas 
conforman el citoesqueleto en la cara citoplasmática de la membrana e interactúan 
entre sí y con los filamentos y túbulos del citoesqueleto creando una malla que es 
importante para la estructura y estabilidad y le confieren las propiedades 
viscoelásticas al eritrocito. Entre estas proteínas periféricas se destacan: la 
espectrina, ankirina (bandas 2.1, 2.2, 2.3, y 2.6), banda 4.1, banda 4.2, banda 4.9, 
aducina, tropomiosina y banda 7 (8). 
 
3.1.1 Proteínas del citoesqueleto. El citoesqueleto del glóbulo rojo está 
constituido primordialmente por: espectrina con sus cadenas α y β, proteínas 4.1R, 
y actina. Están conectadas entre sí en dos sitios: primero, dos o más dímeros de α 
y β espectrina se articulan cabeza con cabeza (como se explica más adelante) en 
el sitio de unión (self association). Segundo, la parte final de los tetrámeros de 
espectrina convergen formando un complejo de unión (caja C en la figura 2) donde 
la proteína 4.1R interactúa con su dominio de 10 kD con la región N-terminal de la 
cadena beta de espectrina, manteniendo los tetrámeros juntos. Participan también 
en este complejo filamentos cortos de actina y una variedad de otras proteínas 
(demantina (proteína 4.9), β–aducina, tropomiosina, tropomodulina). 
18 
De una manera simplificada la malla básica del citoesqueleto es un hexágono, 
donde los lados y los radios están formados por los tetrámeros de espectrina y en 
la mitad de estos están los puntos de unión de las cadenas de espectrina y los 
puntos de convergencia son los complejos de unión (5). Figura 1. 
 
La espectrina conforma una red localizada en el lado citoplasmático de la bicapa 
lipídica de la membrana. Cada proteína de espectrina tiene una cadena α y otra β 
constituídas por repeticiones de 106 aminoácidos que forman hélices y se enrollan 
de forma antiparalela. Los heterodímeros α y β forman tetrámeros al unirse cabeza 
con cabeza en el sitio conocido como el punto de unión donde la porción NH2- 
terminal de α espectrina se une con la COOH-terminal de β espectrina. Otros 
residuos terminales de los heterodímeros de espectrina se asocian con las 
proteínas 4.1R y actina (Figura 2). La unión vertical de la espectrina a la bicapa 
lipídica involucra dos proteínas transmembrana: la banda 3 y la glicoforina C las 
cuales se encuentran unidas formando dímeros y oligómeros móviles que pueden 
variar en su configuración dándole flexibilidad al glóbulo rojo. Las anormalidades 
de la espectrina, llevan a una inestabilidad de la bicapa lipídica con pérdida 
progresiva de ésta, alterando la relación volumen-superficie del eritrocito(3) 
 
Figura 1. Malla del citoesqueleto. Modificado de William’s Hematology 7ª edición. 
COMPLEJOS
DE
UNION
ESPECTRINA 
Fuente: Autor 
19 
3.1.2 Proteínas transmembrana. La Banda 3 (AE-1) es la principal proteína 
integral siendo aproximadamente el 30% de las proteínas de la membrana. Hace 
parte de la familia de proteínas de intercambio aniónico, AE 0-3 (de las siglas en 
inglés de Anion Exchanger) y está involucrada en un gran número de actividades 
fisiológicas que tiene que ver con el volumen y la osmolaridad celular, intercambio 
de iones de cloro y bicarbonato, envejecimiento del eritrocito, unión con IgG y 
remoción celular y finalmente con el mantenimiento de la integridad estructural de 
las células. Se encuentra en todas las membranas celulares e incluso de 
organelas como las mitocondrias, el aparato de Golgi y el núcleo. Se han descrito 
más de 50 mutaciones del gen de Banda 3 algunas de las cuales generan 
diferentes enfermedades como ovalocitosis (una deleción de 9 aminoácidos de los 
residuos 400 al 408), acidosis tubular renal distal que puede estar asociado con 
ovalocitosis. Alteraciones en Banda 3 también son asociadas a enfermedades 
neurológicas tales como disquinesia paroxística familiar, epilepsia generalizada 
idiopática y neuroacantosis. La mutación en el gen de Banda 3 también genera la 
EH, que se comporta como deficiencia ya sea porque la proteína mutada no se 
incorpora dentro de la membrana o por que no es funcional (9). 
 
En la cara externa la Banda 3 porta glicanos N- y/o O- algunos de los cuales son 
antígenos del grupo sanguíneo (sistema ABO)(6). Su dominio citoplasmático N-
terminal media el anclaje del citoesqueleto através de la Ankirina-1 y se une a 
varias enzimas importantes para el control de la glicolisis. El dominio 
transmembrana C-terminal tiene 12 segmentos y contiene el canal de intercambio 
aniónico para el bicarbonato y cloro, permitiendo el transporte de dióxido de 
carbono de los tejidos a los pulmones. Existe como dímero y tetrámero que 
interactúa con la Ankirina, la cual a su vez se une a la beta espectrina y a la 
Proteína 4.1R (banda 4.1R) en su dominio N- terminal. La banda 3 se une también 
a la Proteína 4.2 para dar más estabilidad al citoesqueleto (Ver grafica 2)(5). 
 
La Banda 3 es el centro del “complejo Banda 3” (caja A en Figura 2) el cual está 
compuesto por: ankirina-1; proteína 4.2 y Glicoforina A. Con este está asociado el 
20 
”complejo Rh” que incluye 5 proteínas: polipéptido Rh, glicoproteína asociada a 
Rh, el CD 47, glicoforina B y glicoproteína Landsteiner-Wiener, una glicoproteína 
integral de membrana de 241 residuos y miembro de la superfamilia de Ig (caja B 
en figura 2)(5). 
 
Las proteínas que unen glicosilfosfatidilinositol (GPI-proteins: glycosylphosphati 
dylinosito l-linked proteins) están en la cara externa de la bicapa lipídica y unida a 
su estructura por glicanos cortos y complejos y residuos de fosfatidilinositol. Están 
involucradas en la hemoglobinuria paroxística nocturna (Figura 2). 
 
Las glicoforinas son las glicoproteínas integrales más abundantes del eritrocito. 
Están compuestas de un único dominio extracelular hidrofílico N-terminal, un 
dominio transmembrana y una cola intracelular C-terminal. Estudios de genómica 
han revelado que las glicoforinas se pueden dividir en dos diferentes grupos, el 
primero, las glicoforinas A y B son homólogas entre sí y son codificadas por dos 
genes que están estrechamente relacionados, el segundo, son las glicoforinas C y 
D que derivan de un único locus, pero se diferencias por el uso de un inicio de 
traslación creado por splicing alternativo (3). Las glicoforinas por tener ácido 
siálico en la porción N terminal extracelular, son las responsables de más del 60% 
de la carga negativa de la superficie del eritrocito, lo cual modula las interacciones 
entre eritrocito y eritrocito y entreeritrocito-endotelio. La Glicoforina C interactúa 
con la proteína p55 y con la proteína 4.1R, que a su vez se une a la cadena β de 
la espectrina, desempeñando un papel fundamental en la estabilización del 
citoesqueleto. Las glicoforinas sirven como receptores a algunos agentes 
infecciosos como el Plasmodium falciparum, además son portadoras de algunos 
antígenos del grupo sanguíneo como MN, Ss, Miltenberger V entre otros (3). 
 
3.1.3 Proteínas de unión. Estas moléculas median la unión entre las proteínas 
del citoesqueleto y las de transmembrana. Primero, la Ankirina-1 une la Espectrina 
(en el dominio 15 de la cadena β porción C-terminal) a la Banda 3 en su dominio 
citoplasmático. La Proteína 4.2 juega un papel aún no bien definido en esta 
21 
interacción. Segundo, la función principal de la proteína 4.1R es unir la red de 
espectrina con las proteínas de transmembrana Glicoforina C/D (5). 
 
Figura 2. Organización de la membrana del eritrocito. 
Tropomiosina
a
Ankirina-1Actina
Interacciones horizontales
α-Espectrina
β-Espectrina
In
te
ra
cc
io
ne
s 
 v
er
ti
ca
le
s
 
Caja A: Complejo Banda 3, Caja B: Complejo Rh, Caja C: Complejo de unión, Caja D: espectrina. 
GPA: glicoforina A, GPC/D: glicoforina C/D, GPI: (glycosylphosphatidylinositol-linked protein) 
proteína que une glicosilfosfatidilinositol, LW: glicoproteína Landsteiner-Wiener, RhAG: (Rh-
associated glycoprotein) glicoproteína asociada a Rh, Rh: polipéptidos de Rh. 
Fuente: Delaunay J. The molecular basis of hereditary red cell membrane disorders. Blood 
Reviews 2007; 21: 1-20. 
 
La proteína 4.1R interactúa con la espectrina mediante uno de sus dominios en el 
complejo de unión y con otro dominio se une a la glicoforina C/D inmediatamente 
al lado del complejo de unión (5). 
 
22 
La proteína p55 es un miembro de la familia MAG-UK (Homólogas de la guanilato 
kinasa asociada a membrana, de las siglas en inglés de membrana-associated 
guanylate kinase homologues) y contiene un dominio PDZ, que interactúa con 
4.1R y Glicoforina C/D. Estos dominios PDZ, están en proteínas localizadas en 
sitios submembranosos especializados y parecen tener una función de receptores, 
canales iónicos y de señalización intracelular (5). 
 
La ankirina es una proteína polar que se puede separar en tres dominios 
funcionales: un dominio N-terminal unido a la membrana, que tiene sitios de unión 
para banda 3, otro dominio intermedio que tiene sitios de unión para espectrina y 
otro dominio C-terminal con funciones regulatorias de unión entre ankirina y las 
otras proteínas. El dominio regulatorio C-terminal, tiene múltiples isoformas 
generadas por splicing alternativo; una de estas isoformas (ankirina 2.2) tiene 
mayor afinidad y se une más fuertemente a la espectrina y a Banda 3 (3). Las 
anomalías de ankirina son las más frecuentes en la EH por su importancia en la 
unión entre la bicapa lipídica por medio de la banda 3 y con el citoesqueleto 
através de la espectrina. 
 
Los estudios moleculares han permitido conocer la localización cromosómica de 
estas proteínas así como la secuencia de cada uno de los genes (Tabla1). 
 
Las interacciones de las proteínas integrales y del citoesqueleto son 
fundamentales para la estabilidad e integridad de la membrana y son de dos tipos: 
• Verticales: que fijan el citoesqueleto a la doble capa lipídica y están dadas por 
la unión entre espectrina y banda 3 por medio de ankirina y regulada por 
proteína 4.2 como también por la unión de proteína 4.1R y banda 3. 
• Horizontales: son responsables de la estabilidad global del citoesqueleto y se 
establecen por la unión entre moléculas de espectrina para formar dímeros y 
oligómeros de mayor peso molecular y por la unión entre espectrina, actina y 
la proteína 4.1R, regulada por la proteína 4.9 (8). (ver figura 2). 
23 
Las proteínas de la membrana del glóbulo rojo tienen una gran variedad de 
isoformas por cambios postraduccionales o postranslacionales generados por 
mecanismos de splicing alternativo. Esto hace que a pesar de provenir de un 
mismo gen y gracias al splicing alternativo, las isoformas puedan estar en 
diferentes células o incluso en las mismas células en diferentes organelas o en el 
mismo lugar subcelular con diferentes estados de diferenciación (3). 
 
3.2 ETIOLOGIA Y FISIOPATOLOGIA 
El defecto primario es en las proteínas de membrana y del citoesqueleto del 
eritrocito incluyendo espectrina α y β, ankirina y proteína 4.2. Puede ser 
cuantitativo o cualitativo, causando inestabilidad del citoesqueleto y fragilidad de la 
membrana llevándola a formar microvesículas en los puntos en los cuales no hay 
proteínas ancladas y pérdida de superficie con disminución en la relación entre 
superficie y volumen del eritrocito tornándose esférico, más sensible a los cambios 
de volumen y menos flexible, lo que hace que sea más fácilmente atrapado en los 
sinusoides del bazo y destruído por el sistema retículo-endotelial (3,8,10). Esto 
hace que el bazo sea un órgano importante en la fisiopatología de la hemólisis que 
sufren los pacientes con EH, la cual como vemos es secundaria a los defectos de 
membrana (5). También se ha descrito que los esferocitos son vulnerables a las 
alteraciones metabólicas llevándolos más rápidamente a la autohemólisis cuando 
se incuban en ausencia de glucosa. Esto se explica porque los esferocitos en 
ausencia de glucosa se depletan más rápidamente de ATP, lo que causa una 
falla en la bomba de cationes, penetrando agua y sodio intracelular. Si 
continúan los niveles bajos de ATP, también falla la bomba de calcio causando 
una salida de potasio, cambiando la osmolaridad intracelular y saliendo agua 
deshidratándose el eritrocito. Los esferocitos son muy susceptibles a estos 
cambios de osmolaridad lo que también causa vesiculación de la membrana 
predominando sobre la disminución del volumen y se produce la auto hemólisis 
(8). 
24 
Tabla 1. Principales proteínas de la membrana del eritrocito 
Banda 
el GEL 
SDS-
PAGE 
Proteína Localización Cromosómica 
Símbolo 
del gen 
Tamaño 
del gen 
(Kb) 
Número 
de 
exones 
Número 
de amino 
ácidos 
PM 
(kD) 
aprox / 
deducido 
PI 
1 α-Espectrina 1q22-25 SPTA1 80 52 2 429 240/241 4,96 
2 β-Espectrina 14q23-24.2 SPTB > 100 32 2 137 220/246 4,96 
2.1 Ankirina 8p11.2 ANK1 ~160 42 1 880 210/206 5,65 
2.9 α-Aducina β-Aducina 
4p16.3 
2p13-14 
ADDA 
ADDB 
85 
~100 
16 
17 
737 
726 
103/81 
97/80 
3 Banda 3 17q12-21 EPB3 17 20 911 90-/102 5,96 
4.1 Proteína 4.1 1p33-34.2 EL1 > 250 23 588 88/66 
4.2 Palidina 15q15-21 ELB42 20 13 691 72/27 5,24 
4.9 Demantina p55 
8p21.1 
Xq28 
- 
MPP1 
- 
- 
- 
- 
- 
466 
48/43 
55/53 
5 β-Actina tropomodulina 
7pter-q22 
9q22 
ACTB 
TMOD 
>4 
- 
6 
- 
375 
359 
43/42 
43/41 
6 G3PD 12p13 G3PD 5 9 - 35/36 
7 Estomatina Tropomiosina 
9q34.1 
1q31 
EPB72 
TPM3 
40 
- 
7 
- 
287 
239 
31/31 
27/28 
pI: punto isoeléctrico 
Fuente: Autor 
25 
Por otro lado en la dinámica del atrapamiento esplénico, aún no está claro cuál es 
el mecanismo de la hemólisis. Se sabe que los esferocitos son selectivamente 
atrapados por el bazo, produciendo una pérdida de la membrana y la eventual 
hemólisis. El tiempo de tránsito en el bazo se correlaciona inversamente con la 
supervivencia del glóbulo rojo, pero también hay evidencia que el bazo genera 
cambios metabólicos y de pH en el esferocito lo que acelera su autohemólisis 
(8,11). 
 
3.2.1 Defectos de las proteínas de membrana. El estudio de la membrana del 
eritrocito ha revelado varios defectos cualitativos y cuantitativos en la EH. En 
frecuencia, las alteraciones son: 
• Deficiencia de ankirina combinada con deficiencia de espectrina 
• Deficiencia de banda 3 
• Deficiencia aislada de espectrina 
• Deficiencia aislada de banda 4.2 (3,12) 
 
• Ankirina. La deficiencia de ankirina junto con espectrina es la más frecuente 
en EH y se han incluídovarios mecanismos desde disminución en la síntesis de 
ankirina, disminución en el ensamble o un ensamble anormal lo cual lleva a que la 
espectrina no se una a la membrana. Tiene un patrón hereditario autosómico 
dominante (AD) pero no es infrecuente que también sean debidas a mutaciones 
de novo dentro de una familia (5). La mayoría son mutaciones nonsense o de 
cambio en el marco de lectura lo que genera una ankirina defectuosa y/o 
deficiente (3). Con una excepción, todas las mutaciones descritas en el gen ANK-1 
son individuales y no se repiten en otras familias. El cuadro clínico puede ser 
moderado, pero generalmente no requieren de trasfusión al menos durante el 
primer año de vida (8). En pacientes con herencia autosómica recesiva (AR) han 
sido descritas variantes genéticas en el promotor del gen de ANK-1, pero no se ha 
revelado la importancia funcional de esta mutación. 
26 
No se han reportado casos homocigotos en humanos, sin poder aclarar si esta 
condición es incompatible con la vida (8). Se han descrito pacientes con EH por 
deficiencia de ankirina, con dismorfismo, retardo psicomotor e hipogonadismo. 
Estos pacientes sufren de un síndrome de “gen contiguo” que incluye el locus del 
gen ANK-1, 8p11.2. 
 
• Banda 3. Las mutaciones en el gen de banda 3 (SLC4A1) tienen un patrón de 
herencia AD. En los heterocigotos todas las mutaciones son en los dominios 
transmembrana y citoplasmático con un cuadro clínico de hemólisis moderado (8). 
Un subgrupo de pacientes tienen disminución del 20 al 30% de banda 3 
concomitante con proteína 4.2, con un cuadro leve a moderado y esferocitos 
“pincered” en el frotis de sangre periférica (3,13). Hay una gran variabilidad en la 
expresión de la mutación lo cual hace que el cuadro clínico no sea siempre 
severo. 
 
Se han descrito 3 grupos de homocigotos para mutaciones de banda 3 en 
humanos dentro de familias consanguíneas: Banda 3 Coimbra, Neapolis y 
Algerian. Excepto por un grupo, las demás tiene algunas proteínas banda 3 en las 
membranas celulares. En su mayoría se asocian a acidosis tubular renal distal. Lo 
que es importante resaltar es que a pesar de la ausencia de la proteína banda 3, 
pueden ser compatibles con la vida con determinados tratamientos a diferencia de 
la ausencia de ankirina o espectrina las cuales como se ha visto no son viables 
(8,13). 
 
• Espectrina. Los esferocitos de muchos pacientes son en su mayoría 
deficientes de espectrina. El grado de deficiencia de espectrina se correlaciona 
bien con la esferocidad del eritrocito, la habilidad para soportar las fuerzas de 
cizallamiento, el grado de hemolisis y la respuesta a la esplenectomía (3,8,12,13) 
27 
Las mutaciones de α-espectrina son AR mientras que las de β-espectrina son AD, 
esto es debido a que la cadena α de la espectrina se sintetiza en exceso 
comparada con la de la β espectrina, haciendo que una reducción en la síntesis de 
esta última tenga una mayor efecto en la configuración del citoesqueleto en los 
pacientes heterocigotos (autosómica dominante), (12,14). Al final el grado de 
deficiencia de espectrina y de la cadena α o β, se asocia con la severidad de la 
hemólisis (13,14). 
 
• Proteína 4.2. La variedad de EH por mutación en el gen EPB42 es rara y 
tiene una herencia AR. El cuadro clínico usualmente es de sintomatología 
moderada (8). Se han descrito 9 mutaciones hasta ahora y la mayoría en el Japón. 
La deficiencia de proteína 4.2 también se ha asociado a mutaciones en el dominio 
citoplasmático de banda 3 por compromiso de los sitios de interacción entre estas 
proteínas. 
 
3.2.2 Herencia. Los genes implicados son los de α y β espectrina, banda 3, 
ankirina y proteína 4.2. Entre el 50 y 75% de los casos, la EH es AD. En los 
restantes pacientes puede ser AR o mutaciones de novo. Los casos de herencia 
AR resultan en defectos de α-espectrina o proteína 4.2. Unos pocos casos de EH 
resultado de mutaciones homocigotos o heterocigotos compuestos en banda 3 o 
espectrina dan como resultado anemias hemolíticas severas en el periodo 
neonatal o muertes fetales por hidrops (3). Un estudio realizado en Italia con 80 
niños con diagnóstico de EH de diferente severidad pero con padres normales, 
demostró que las mutaciones de novo dominante son 6 veces más frecuentes que 
las mutaciones recesivas, lo cual debe ser tenido en cuenta para consejería 
genética de una pareja normal con un hijo con EH (15). 
 
28 
3.3 MANIFESTACIONES CLINICAS Y PARACLINICAS 
Las manifestaciones clínicas son muy heterogéneas. El cuadro clínico típico 
combina manifestaciones de hemólisis (ictericia, esplenomegalia y anemia con 
reticulocitos elevados) con extendido de sangre periférica con esferocitosis y 
antecedentes familiares positivos (3). La severidad del cuadro es variable, desde 
asintomático en los casos de portadores hasta severo con todo el cuadro clínico 
evidente. Se puede clasificar como: portador (rasgo), leve, moderada (también 
denominada típica) y severa, dependiendo del valor de Hb, bilirrubinas, 
reticulocitos y de la concentración de espectrina en el glóbulo rojo (esta última se 
correlaciona con la severidad de la hemolisis) (Tabla 2). 
 
Portadores asintomáticos: corresponden a menos del 2% de los pacientes. 
Presentan mínimos síntomas o generalmente asintomáticos. Pueden ser un 
miembro de una familia con herencia AR con laboratorios ligeramente alterados, 
elevación leve de reticulocitos, aproximadamente 2%, escasos esferocitos y 
fragilidad osmótica incubada alterada. También pueden ser mutaciones nuevas 
dentro de una familia, lo que aparentaría una herencia AR, por lo que siempre es 
importante el estudio de la familia (3,8,16). 
 
Los casos de esferocitosis leve son aproximadamente entre el 20 y 30%. 
Presentan una hemólisis ligera compensada con valores de Hb normales. La 
sintomatología es mínima, cursan con esplenomegalia e ictericia muy leves lo que 
hace difícil el diagnóstico y generalmente se encuentran en estudios de rutina de 
EH familiar. También se pueden manifestar durante una infección viral por ejemplo 
Parvovirosis, con anemia, esplenomegalia e ictericia (3; 8). 
 
La esferocitosis típica se presenta en la mayoría de los pacientes con EH AD y 
pueden ser entre el 50 y el 60% de los casos. Se presenta con una hemólisis 
descompensada y anemia moderada. Se puede manifestar con ictericia en niños, 
pero también en adultos y asociado a esplenomegalia leve entre 2 a 6 cm de su 
29 
tamaño, generalmente después de una infección viral por la estimulación que 
produce del sistema reticuloendotelial. Los requerimientos trasfusionales son 
ocasionales y generalmente son después del primer año de vida (3,8). 
 
Tabla 2. Clasificación de esferocitosis e indicación de esplenectomía 
CLASIFICACIÓN RASGO LEVE MODERADA SEVERA 
Hb (g/dl) >15 11-15 8-12 6-8 
Conteo de 
reticulocitos 
Normal 
(<3%) 
3-6% > 6 % > 10 % 
Bilirrubina T. 
(mg/dl) 
< 1 1-2 2-3 > 3 
Espectrina por 
eritrocito (% del 
normal) 
100 80-100 50-80 40-60 
Esplenectomía No 
requerida 
Usualmente 
no necesaria 
Necesaria antes 
de la pubertad 
Necesaria, en 
lo posible > 6 
años 
Modificado de: Bolton-Maggs PHB. The diagnosis and management of hereditary spherocytosis. 
Baillère’s Clinical Haematology. 2000; 13: 327-42. 
Fuente: Autor 
 
La esferocitosis severa, se presenta en el 5 al 10% de los casos, con ictericia y 
anemia severa que requiere múltiples trasfusiones. Se manifiesta generalmente 
desde recién nacido con ictericia intensa que requiere incluso 
exsanguinotransfusión. Se presenta en la EH tanto AD como AR, generalmente 
por mutaciones en el gen de la α-espectrina. 
 
Dentro de las complicaciones más frecuentes esta el retardo en el crecimiento, 
retardo en la maduración sexual y anemias aplásicas transitorias. El tratamiento 
de elección es la esplenectomía. (3,8): 
30 
3.4 DIAGNOSTICO 
La esferocitosis hereditaria generalmentees fácilmente sospechada por el cuadro 
clínico, los laboratorios de rutina y cuando existen antecedentes familiares, pero 
hay varias situaciones que pueden hacer difícil el diagnóstico como la anemia 
hemolítica neonatal o durante una crisis hemolítica aguda, o cuando no hay 
antecedentes familiares y es una mutación de novo o cuando uno de los padres es 
un portador asintomático o en otras patologías que también aumentan la relación 
superficie-volumen de los glóbulos rojos como en la ictericia obstructiva, la 
deficiencia de hierro, las talasemias, la deficiencia de vitamina B12 o folato y las 
hemoglobinopatías SC que pueden mimetizar una EH. 
 
El diagnóstico por laboratorios se basa fundamentalmente en el hemograma en 
donde se puede encontrar la Hb baja, el volumen corpuscular medio (VCM) normal 
o levemente disminuída, la concentración de hemoglobina corpuscular media 
(CHCM) alta (entre 35 y 38%) y el aumento en el conteo de los reticulocitos. 
 
En el extendido de sangre periférica típico se debe encontrar un número variable 
de esferocitos (eritrocitos de menor tamaño y sin el halo claro central), estando 
presentes en un 3 al 5% en las formas leves y en un 25 al 30% en las formas 
moderadas. Con menor frecuencia se encuentran esferocitos pequeños y densos, 
eritrocitos con formas bizarras y anisocitosis y poiquilocitosis. Se han descrito 
características morfológicas específicas de ciertos déficits como los esferocitos 
pincered (por déficit de banda 3) y esfero-acantocitos (por déficit de β-espectrina). 
 
También se analizan los niveles de bilirrubinas total y diferencial y se realiza 
ecografía de abdomen superior para evaluar tamaño del bazo y presencia de 
colelitiasis. 
 
Dentro de los estudios de laboratorio para completar el diagnóstico se encuentran: 
31 
• Test de fragilidad osmótica: se basa en la fragilidad aumentada que 
tienen los esferocitos a la solución salina hipotónica en comparación con las 
células normales (22). Este test tiene como desventajas en primer lugar la baja 
sensibilidad, en donde los casos leves hasta el 20% pueden ser omitidos después 
de la prueba con incubación. No es fiable en pacientes con escaso número de 
esferocitos incluyendo los transfundidos y finalmente no diferencia la esferocitosis 
causada por trastornos inmunológicos, deficiencia de hierro o ictericia obstructiva. 
 
La fragilidad osmótica se encuentra incrementada en el 66% de los pacientes con 
EH no esplenectomizados. 
 
Se considera que la prueba de resistencia osmótica está disminuída cuando existe 
evidencia de hemólisis en concentraciones de solución salina ≥0,55g/dl. Según la 
clasificación de Dacie, la curva de resistencia osmótica se divide en tipo I si había 
desplazamiento de la curva hacia la derecha con hemólisis que inicia en 
concentraciones de solución salina de 0,55g/dl. Curva de resistencia osmótica 
disminuída tipo II cuando hay desplazamiento de la curva hacia la derecha con 
inicio de hemólisis en concentraciones de solución salina de 0,6 g/dl y curva de 
resistencia osmótica disminuída tipo III si hay desplazamiento de la curva hacia la 
derecha con inicio de hemólisis en concentraciones de solución salina de 0,85 g/dl 
(1,17) 
• Test de lisis con glicerol: útil en neonatos porque la cantidad de muestra 
requerida es mínima. Se realiza colocando una mezcla de solución salina de 
glicerol hipotónica a la muestra de sangre con anticoagulante y tomando el tiempo 
en que la densidad óptica medida por espectrofotometría cae al 50% de la inicial 
(50%de lisis); los eritrocitos normales toman más de 30 minutos y los esferocitos 
tiene un rango de 25 a 150 segundos. Tiene igual sensibilidad que el test de 
fragilidad osmótica (16,18). No disponible en Colombia como prueba de rutina. 
32 
• Gradiente osmótico ektacitométrico: es un examen muy sensible, pero 
de alto costo, que requiere de experiencia por parte del operador. Mide con un 
láser los cambios de forma del glóbulo rojo al ser expuesto a fuerzas de 
cizallamiento. Ventaja: distingue curvas entre EH, Eliptocitosis hereditaria y 
drepanocitosis (16,18). No se dispone de esta prueba en Colombia. 
• Citometría de flujo: se emplea una sonda fluorescente que reacciona con 
la banda 3. Pacientes con esferocitosis hereditaria que tengan defecto en la 
espectrina, banda 3 o proteína 4.2 tienen disminución en la señal de fluorescencia, 
comparado con los controles, con neonatos o con pacientes con otras anemias. 
Tiene la ventaja de requerir un volumen muy pequeño de sangre y que los 
resultados se obtienen en pocas horas. Sensibilidad de 92.7% y especificidad de 
99.1% (16,18). No se dispone de esta prueba estandarizada en Colombia 
(3,16,18). 
• Análisis bioquímico de las proteínas de membrana de los glóbulos 
rojos: se realiza mediante separación por electroforesis en gel de poliacrilamida 
(PAGE-SDS polyacrylamide gel electrophoresis in the presencia sodium 
dodecylsulate).que detecta defectos en las proteínas de membrana. Es una 
prueba especializada, tiene alto costo, es útil en los pacientes con diagnóstico 
poco claro y es una prueba confirmatoria de EH. No se hace de rutina en 
Colombia (3,16,18). 
• Análisis genético molecular: está disponible en unos pocos laboratorios 
especializados. Busca identificar alteraciones en la expresión de las proteínas de 
membrana por mutaciones en los genes que las codifican. Varias técnicas han 
sido utilizadas como secuenciación de nucleótidos y amplificación del gen mutado 
con reacción en cadena de la polimerasa (PCR) (16,18). 
• Técnicas de mapeo en 2D y espectrometría de masas: es una 
herramienta invaluable en la exploración de patologías relacionadas con defectos 
genéticos y alteraciones en las proteínas (19). Se realiza mediante el análisis de 
33 
mezcla de proteínas y la posterior identificación por espectrometría de masas. Es 
un método muy preciso, sensible y específico, con alta resolución y 
automatización, la desventaja es su alto costo y que se realiza a nivel de 
investigación en pocos centros especializados. No está disponible en Colombia y 
no hay estudios de proteínas de membranas en EH. 
 
3.4.1 Proteómica. Actualmente los avances científicos y tecnológicos en Biología 
Molecular permiten la evaluación simultánea de las características genéticas y 
proteicas de una muestra y han sido ampliamente empleados en diferentes 
campos de la medicina con un futuro prometedor. Dentro de estos avances están 
las llamadas técnicas “omic”: Genómica, Transcriptómica y Proteómica. Los genes 
(analizados por la genómica) se transcriben a ARN (estudiados por la 
transcriptómica). En este nivel existe cierto grado de variabilidad generado por 
inicios, transcripción y procesamientos de intrones alternativos (splicing 
alternativo). La mayoría del ARN es traducido para generar proteínas (evaluadas 
por la proteómica). En este último proceso existe un alto nivel de heterogeneidad 
ya que la proteína recién sintetizada puede experimentar multitud de 
modificaciones postraduccionales, muchas de ellas con relevante significado 
funcional y patológico (2,20). Alteraciones cuantitativas o cualitativas (estructura, 
localización y función) de una proteína, que son aspectos que son valorados 
mediante técnicas de proteómica, pueden ser biomarcadores de anomalías 
patológicas previas al desarrollo de manifestaciones clínicas, útiles marcadores 
diagnósticos o pronósticos. Es por estas características de la proteómica que está 
superando a la genómica como herramienta de análisis más amplio de los 
elementos relacionados con procesos fisiopatológicos y en la búsqueda de nuevos 
blancos terapéuticos. La proteómica que en un inicio tenía el objetivo de identificar 
las proteínas que se modifican como causa de diferentes factores (genéticos o 
no), ahora permite conocer aspectos más profundos de la estructura, función, 
interacciones, las modificaciones postraduccionalese incluso la localización 
celular de las proteínas identificadas (2,20). 
 
34 
La técnica que se ha desarrollado para analizar mezclas de proteínas y que ha 
permitido que la proteómica evolucione se llama espectrometría de masas. Se 
trata de un método muy avanzado con alta precisión, sensibilidad (a nivel de 
fentomoles), especificidad, resolución y automatización. 
 
Existen diferentes equipos para preparar y cargar las proteínas en estos sistemas 
de espectrometría de masas, el más usado es el matrix assited laser 
desorption/Ionization (MALDI). La muestra ionizada posteriormente se pasa a 
analizadores de masas, el más empleado es el time of flight (TOF). 
 
Primero se deben separar las proteínas de la muestra y hay dos aproximaciones: 
• Empleando el sistema de electroforesis en 2 dimensiones (2D) que separa las 
proteínas por cargas y peso molecular y luego, sobre el gel, se hace la 
identificación y aislamiento de ”spots” diferentes, identificación de la proteína 
mediante digestión enzimática con tripsina y determinación del patrón de masas 
peptídico empleando espectrometría de masas. Este patrón se compara con la 
masa esperada de las proteínas incluídas en potentes bases de datos (como 
DMSR, SWISS-PROT y TrEMBL), generando un listado de posibles candidatos. 
También se puede separar por cromatografía líquida, un sistema 
multidimensional que separa proteínas usando cromatografía de intercambio 
iónico y de fases reversas, acoplado directamente a sistemas de espectrometría 
de masas o por trampa iónica, en este caso la ionización es distinta a la 
empleada en la espectroscopia de masas por MALDI-TOF, puesto que aquí la 
ionización es en fase líquida al aplicar un alto voltaje a la salida de la 
cromatografía líquida. El tipo de ionización se conoce como ESI. El empleo de 
uno u otro método depende de la proteína y de por cuál de los dos métodos se 
obtenga una mejor ionización de sus péptidos. En general este método detecta 
proteínas que no entran o no se separan fácilmente en geles 2-DE. 
• Mediante el estudio sistemático y a gran escala de muestras sin separación 
electroforética de las proteínas para la identificación de perfiles proteicos. 
35 
Emplea como sistema el SELDI-TOF (surface enhaced laser/desorption 
ionization) de alta resolución tras capturar las proteínas de una muestra con 
diferentes chips analíticos (diferentes tipos de matrices que unen las proteínas 
de una muestra empleando distintas características físico químicas) Figura 3. 
 
Figura 3. Principales métodos proteómicos. 
a
 
Las proteínas de una muestra se pueden separar 1) en geles 2D, 2) en cromatografía líquida y 3) 
por utilización de chips. LC: cromatografía líquida, MS: espectrometría de masas. 
 
Fuente: Corral J, González-Conejero R, Hernández-Espinosa D, Martínez C, Vicente V. 
Genómica y proteómica en hemostasia. Haematologica 2005;90: 65-70. 
 
36 
La principal limitación de las técnicas proteómicas es la incapacidad de amplificar 
las proteínas, a diferencia de los ácidos nucleicos. También la gran 
heterogeneidad proteica de un tejido o plasma puede hacer que dos muestras de 
un mismo paciente sean ligeramente diferentes, lo que exige al menos repetir 3 
veces la prueba para obtener resultados fiables (20). 
 
También se ha avanzado significativamente en el proteoma de las células, 
especialmente del eritrocito (21). Los trabajos realizados en estas células 
muestran un proteoma complejo, mayor del que se podía esperar (teniendo en 
cuenta que el 98% del citoplasma del eritrocito es Hb y que no tiene núcleo ni 
organelas) mostrando nuevamente las diferencias entre genómica y proteómica. 
 
Además de la Hb, el eritrocito tiene otras proteínas importantes para su 
metabolismo y su conformación estructural, e incluso otras funciones como las 
oxidativas e inflamatorias. Hasta el momento los estudios realizados en eritrocitos 
han detectado más de 1500 proteínas (22,23) que abarcan múltiples funciones 
(citoesqueleto, señalización, receptores de membrana, metabolismo 
intermediario), aunque el número real de proteínas es mucho mayor. En un 
estudio de proteómica del eritrocito (21) se identificaron 340 proteínas de 
membrana discriminadas así: 105 proteínas integrales, 54 unidas a la membrana, 
5 como GPI, 40 del citoesqueleto, 21 como organelos, 41 del citoplasma (8 de las 
cuales tiene actividad en la glucolisis), 20 extracelulares y para 54 proteínas su 
localización subcelular no fue posible. Estos estudios de proteómica además 
permiten describir las proteínas y sus modificaciones implicadas en procesos 
específicos de la función del eritrocito. 
 
 
 
37 
3.5 TRATAMIENTO 
El tratamiento es médico en los casos de esferocitosis leve con aportes de ácido 
fólico y seguimientos clínicos y de laboratorio cada año. Ecografías de abdomen 
superior pueden realizar desde los 5 años y controles posteriores cada 3 a 5 años 
en casos en que permanezcan estables y sin síntomas (16). Los controles se 
hacen más frecuentes en las épocas del año en que se presentan más infecciones 
virales. 
 
La esplenectomía es el tratamiento de elección para los pacientes con EH severa 
por ser más efectivo en el control de la anemia aunque la sobrevida de los 
esferocitos permanece acortada. Está indicada en pacientes con anemia 
hemolítica severa o en los casos de esferocitosis moderada con complicaciones 
como cálculos en la vesícula biliar y esplenomegalia importante. En los casos 
leves y moderados sin complicaciones, la decisión de esplenectomía está muy 
discutida porque no tiene un claro beneficio y aumenta el riesgo de infecciones 
graves. La decisión de esplenectomía en estos pacientes se debe evaluar 
individualmente. La esplenectomía se intentar posponer hasta los 5 a 6 años para 
reducir el riesgo de complicaciones como infecciones por gérmenes encapsulados 
y por lo cual previo al procedimiento quirúrgico se indica la vacunación contra 
neumococo con 23 serotipos y profilaxis antibiótica con fenoximetilpenicilina 
durante 5 años después de la esplenectomía (8,16,18). 
 
Diferentes estudios han demostrado que el grado de respuesta a la esplenectomía 
está relacionado directamente con el grado de deficiencia de espectrina, 
especialmente en la forma severa (la forma AR), por lo que los pacientes mejoran 
adecuadamente posterior a la esplenectomía (8,16). 
 
La complicación más grave es la sepsis que puede ocurrir en 3 al 5% de los 
pacientes esplenectomizados de los cuales puede ser fatal hasta el 60%. Por esta 
razón se han empleado métodos quirúrgicos más conservadores como la 
esplenectomía parcial o embolización esplénica parcial con éxito aceptable (8). 
38 
 
4. METODOLOGIA 
 
4.1 TIPO DE ESTUDIO 
Es un estudio descriptivo de los resultados obtenidos de una prueba de 
electroforesis en 2D-PAGE y espectrometría de masas MALDI-TOF realizada a 
proteínas de membrana de eritrocitos y el análisis de características clínicas y de 
laboratorios de una serie de pacientes con diagnóstico de EH que asisten a la 
consulta de Hematología Pediátrica de la Fundación Hospital de la Misericordia. 
 
4.2 CRITERIOS DE INCLUSION Y EXCLUSION 
Se hizo una selección preliminar de los pacientes que asisten a la consulta de 
Hematología Pediátrica de la Fundación Hospital de la Misericordia con 
diagnóstico de esferocitosis hereditaria. Se revisaron las historias clínicas y los 
laboratorios los cuales deben incluír: hemograma (de IV nivel con índices), conteo 
de reticulocitos, extendido de sangre periférica, prueba de fragilidad osmótica, 
bilirrubinas totales y diferenciales, prueba de Coombs directo y ecografía de 
abdomen superior. Posteriormente, se realizó una base de datos. 
 
Se tuvieron en cuenta los siguientes criterios de inclusión: 
• Pacientes con anemia hemolítica no inmunológica (con prueba de Coombs 
directo negativo), con sospecha de esferocitosis hereditaria. 
• Pacientescon manifestaciones clínicas y criterios paraclínicos compatibles 
con esferocitosis hereditaria como se menciona en el numeral 4.3 y 4.4 del 
marco teórico. 
• Consentimiento informado firmado por los padres o representante legal 
aceptando participar en el estudio. Ver anexo A. 
39 
Criterios de exclusión: 
• Haber sido trasfundido en los últimos 4 meses previos a la toma de la muestra 
para estudio de proteínas de membrana. 
• La no aceptación a participar en el estudio. 
 
4.3 RECURSOS INSTITUCIONALES 
Se contó con la colaboración de la Fundación Hospital de la Misericordia, de 
donde se obtuvieron los pacientes y sus registros clínicos; la Universidad Nacional 
de Colombia, Facultad de Medicina, Departamento de Bioquímica donde se 
tomaron y procesaron las muestras para realizar la extracción de membranas; la 
Universidad de Santiago de Compostela, Facultad de Medicina, Departamento de 
Fisiología donde se realizó la electroforesis 2D-PAGE y análisis de los resultados 
y la Universidad de Córdoba donde se realizó la espectrometría de masas. 
 
4.4 RECURSO HUMANO 
Se contó con la colaboración del personal docente y de laboratorio de la 
Universidad Nacional de Colombia, Facultad de Medicina, Departamentos de 
Pediatría y Bioquímica y del personal de enfermería y administrativo de la 
Fundación Hospital de la Misericordia en Colombia y con el personal del 
laboratorio de Fisiología de la Facultad de Medicina de la Universidad de Santiago 
de Compostela y de la Universidad de Córdoba. 
 
4.5 CONSIDERACIONES ETICAS Y DISPOSICIONES VIGENTES 
El desarrollo de la presente propuesta se realizará de acuerdo a la legislación 
vigente y otras normas reguladoras en materia de ética, experimentación humana, 
animal o de bioseguridad. El proyecto de investigación será sometido a la 
evaluación del Comité de Ética de la Fundación Hospital de la Misericordia, de 
40 
acuerdo a las disposiciones previstas en la Resolución No. 008430 de 1993 del 
Ministerio de Salud y en la Ley 84 de 1989. 
 
En cuanto a las implicaciones éticas o de bioseguridad del presente proyecto de 
investigación, se puede afirmar que: 
• Este proyecto está clasificado como Investigación con riesgo mínimo, según 
las características establecidas en el artículo 11 de la Resolución 008430 de 
1993, del Ministerio de Salud. 
• El proyecto se desarrollará en los servicios de consulta externa del Hospital de 
la Misericordia, en el Laboratorio de Bioquímica de la Facultad de Medicina de 
la Universidad Nacional de Colombia Sede Bogotá y el Departamento de 
Fisiología de la Facultad de Medicina de la Universidad de Santiago de 
Compostela, en España, las cuales cuentan con comité de ética. En el 
proyecto se detallan las muestras biológicas obtenidas de los diferentes 
ensayos y el uso que éstas recibirán. 
• La Facultad de Medicina, así como el Hospital de la Misericordia, disponen de 
instalaciones apropiadas y con personal idóneo en el procedimiento de toma 
de muestras sanguíneas a pacientes pediátricos. 
• La Unidad de Recursos Físicos de la Universidad Nacional a través del 
programa UN Ambiente se hará cargo de la disposición definitiva de los 
desechos orgánicos y químicos producidos por el presente proyecto. 
• Para la participación en la investigación se solicitará el consentimiento 
informado por escrito a los padres o acudientes del menor, explicándole los 
objetivos de la investigación y los riesgos de la toma de muestra de sangre. 
• La historia clínica de los niños del grupo de estudio están custodiadas en el 
archivo por el Hospital Universitario Fundación Hospital de La Misericordia, 
garantizando la confidencialidad de la misma. 
41 
• El presente estudio no ofrecerá dilemas éticos al grupo investigativo, ya que 
los pacientes se encuentran bajo tratamiento en un hospital de cuarto nivel de 
complejidad y el análisis de las muestras no ofrecen ningún riesgo para la 
salud de los niños. 
• Se garantiza que será suspendido el estudio para las familias que así lo 
manifiesten. 
• En cualquier momento previo a la toma de las muestras, se diligenciará el 
consentimiento informado por escrito mediante el cual, a cualquiera de los 
padres o al representante legal del menor se solicita la autorización para la 
participación del menor en el estudio, en el que aceptará pleno conocimiento 
del procedimiento y de los riesgos que éste conlleva así como la libre elección 
de participar. Se adjunta el texto completo del consentimiento informado. 
Anexo 1. 
• Las muestras no serán utilizadas para fines distintos del proyecto o que no 
estén mencionados en el consentimiento informado. 
 
4.6 TECNICAS Y PROCEDIMIENTOS 
Desde marzo a julio de 2008 se inició la revisión de historias clínicas de pacientes 
con diagnóstico de EH que asisten a la consulta de Hematología Pediátrica de la 
Fundación Hospital de la Misericordia; se obtuvo una base de datos de posibles 
candidatos para el estudio teniendo en cuenta las características clínicas y de 
laboratorio como hemograma completo, extendido de sangre periférica, prueba de 
fragilidad osmótica, bilirrubinas totales y diferenciales y ecografía de abdomen 
superior. Con la revisión de historia clínica se procedió a hablar con los padres o 
representantes legales y después de cumplir los criterios de inclusión y exclusión, 
se firmó el consentimiento informado. 
 
42 
Después de obtener firmado el consentimiento por parte de los padres y/o 
acudientes, se tomó una muestra de sangre venosa entre 5 y 10 cc, en tubo con 
anticoagulante (EDTA) a los pacientes seleccionados con diagnostico de 
esferocitosis hereditaria y a los controles, en el Departamento de Bioquímica de la 
Facultad de Medicina de la Universidad Nacional de Colombia. 
 
A continuación se explica la técnica en los siguientes pasos: 
• Separación de las membranas de los eritrocitos. Una fracción de la 
muestra de sangre se centrifuga a 1500g y se lava el pellet de glóbulos rojos en 
buffer salino de fosfato (PBS-pH 7.4) tres veces. Aproximadamente cien millones 
de hematíes se tratan con buffer de lisis (buffer, 50 mM Tris-HCl, pH 7.5, 2mM 
dithiothreitol, 1 mM phenylmethylsulfonyl fluoride, 1 mM EDTA, 0.25 M sucrose) 
durante 10 minutos a 4ºC. Las membranas se centrifugan a 14.000 g durante 10 
minutos a 4ºC y luego se lavan tres veces con tampón de lisis. Las muestras se 
lisan por frío, se dejan 20 min a temperatura ambiente en buffer de lisis y se 
centrifugan a 14.000 g durante 20 minutos. Posteriormente se resuspenden en un 
buffer específico para 2D con elevado contenido de Urea (7M de Urea, 2M de 
Tiourea, 5% de CHAPS y 2mM de TCEP (Tris(2-carboxyethyl)phosphine 
hydrochloride)) y se almacena a -70ºC (24) hasta que se corra la electroforesis en 
2D. 
• Electroforesis en 2D. La cuantificación de la concentración de proteína se 
realizó utilizando kits comerciales en los que no influye la urea de la muestra, kit 
RC DC protein Assay (BIO-RAD); además se confirmó el resultado corriendo un 
gel 1D y realizando una tinción con Coomasie, con lo cual se consigue ver si las 
proteínas se encuentran en buen estado (no degradadas). Es muy importante que 
las muestras destinadas a un análisis por espectrometría de masas sean 
preparadas en un ambiente lo más limpio posible, libre de queratinas y suciedad 
(los cristales en los que se corran los geles, cualquier recipiente utilizado y el 
material fungible) y que cualquiera de estas sean manipuladas con guantes libres 
43 
de talco y nunca con las manos desnudas. A continuación se procede a su 
fraccionamiento mediante geles 2D-PAGE (SDS-PAGE) de diferentes rango de pH 
permitiendonos separar las distintas proteínas presentes en las muestras con base 
en la diferente masa y punto isoeléctrico. Estudios previos realizados en otros 
tipos de tejidos muestran que el mayor número de proteínas se encuentra en el 
rango de pH de 4 a 7. Las muestras se solubilizan,durante más de 4 horas en un 
buffer de rehidratación (7M de Urea, 2M de Tiourea, 5% de CHAPS) usando como 
reductor 50mM de DTT y 4% de anfolitos del mismo rango de pH en el que se 
corren los geles para facilitar la migración de las proteínas. La primera dimensión, 
en la que las proteínas se separan en función del pI (punto isoeléctrico), se lleva a 
cabo en un equipo IPGphor III (Ge Healthcare); se corre en tiras de 11 cm y se 
somete a un enfoque de 12000V totales siguiendo el protocolo: 
-. 30V 5h 
-. 60V 5h 
-. 120V 1h 
-. 250V 1h 
-. 500V 1h 
-. 1000V 30 min 
-. gradiente 1000V a 8000V 30 min 
-. enfoque a 12000 
 
Antes de realizar la segunda dimensión, las tiras se equilibran en buffer de 
equilibrado con 1% de DTT durante 30 minutos (para reducir las proteínas) y 30 
minutos en buffer de equilibrado con 4% de iodoacetamida (para alquilar las 
proteínas). A continuación se cargan las tiras en geles de acrilamida-bisacrilamida 
al 12% (segunda dimensión) para separar las proteínas en función del peso 
molecular mediante un sistema de electroforesis vertical Hoefer (Bio-Rad). El 
patrón de expresión proteico se visualiza utilizando métodos de tinción con plata 
44 
mediante el uso del kit comercial PlusOne Silver Staining Kit, Protein (Ge 
Healtcare). 
 
Una vez obtenidos los geles de las distintas muestras controles vs pacientes y un 
mínimo de triplicado por muestra se realiza un análisis exhaustivo de todas las 
proteínas observadas en los geles. Para ello, los geles se escanean y se analizan 
las imágenes del patrón de expresión de proteínas mediante el uso de programas 
informáticos como, “PDQuest” disponibles en la unidad de Proteómica de la 
Universidad de Córdoba, España (en colaboración permanente con el grupo del Dr 
Justo Castaño) que facilita la comparación entre las proteínas observadas en los 
distintos geles. Además estos geles pueden compararse con bases de datos de 
geles de 2D existentes en el dominio público de la red de Internet lo que nos daría 
una idea de la proteína que puede ser de interés. El análisis mediante los 
programas informáticos nos da datos de interés como el porcentaje en el que las 
proteínas están sobreexpresadas o disminuídas. 
 
• Identificación de la(s) proteína(s) expresada(s) de forma diferencial 
mediante MALDI-TOF. Una vez analizados los geles, en caso de encontrar 
algunas proteínas diferenciales se cortan los “spots” y se procede a la digestión 
tríptica “in-gel” de las proteínas de interés mediante la utilización del robot digestor 
automático Proteineer DP (Bruker-Daltonics). Esta muestra se resuspende en 10 
microlitros de 0.2% de TFA y se purifica mediante la utilización de puntas de 
pipetas Zip-Tipc18 que disponen en su extremo de una pequeña columna 
cromatográfica en fase reversa. A continuación se seca en un speed-back, se 
mezcla con la matriz adecuada (ácido alfa-ciano-4-hidroxicinámico) y se procede a 
plaquearla en un anchorChip para la obtención de la huella peptídica (fingerprint) 
usando un espectrómetro de masas MALDI-TOF Bruker Reflex IV, dotado con un 
software específico adecuado para el análisis exhaustivo de los datos recogidos. 
El tratamiento y análisis realizados con distintos programas informáticos de los 
picos observados nos permite enviar las masas de los péptidos trípticos medidos, 
45 
a una base de datos (NCBInr, MSDB, SwissProt, MASCOT) mediante un software 
específico en que se concretan varios parámetros críticos a la hora de la 
identificación de cada proteína. 
 
4.6.1 Evaluación de las características clínicas y de laboratorio de los 
pacientes. Para la clasificación de severidad de los pacientes con EH, se tuvo en 
cuenta los exámenes paraclínicos disponibles en la historia clínica y los criterios 
descritos en la tabla 2 del marco teórico. 
 
Se consideró que la prueba de resistencia osmótica estaba disminuída cuando 
existía evidencia de hemólisis en concentraciones de solución salina ≥0,55g/dl. 
 
Según la clasificación de Dacie, la curva de resistencia osmótica se dividió en tipo 
I: si había desplazamiento de la curva hacia la derecha, con hemólisis que inició 
en concentraciones de solución salina de 0,55g/dl; curva de resistencia osmótica 
disminuída tipo II, cuando hubo desplazamiento de la curva hacia la derecha con 
inicio de hemólisis en concentraciones de solución salina de 0,6 g/dl, y curva de 
resistencia osmótica disminuída tipo III si había desplazamiento de la curva hacia 
la derecha con inicio de hemólisis en concentraciones de solución salina de 0,85 
g/dl (1,17). 
 
Con el fin de establecer los rangos normales de las proteínas de membrana de los 
eritrocitos y de tener un grupo control, se estudiaron paralelamente un grupo de 8 
individuos normales sanos a quienes se les realizó electroforesis de proteínas de 
membrana en 1D y 2D. Este grupo tiene un hemograma normal, bilirrubinas 
normales, prueba de Coombs negativa y fragilidad osmótica normal. 
 
Para este estudio se estableció que la cantidad de espectrina más ankirina, banda 
4.1 más banda 4.2, fueron expresadas en relación con la banda 3. Estas se 
cuantificaron por densitometría de los geles teñidos en Coomasie a 540nM 
46 
(BioRAD) y el área bajo los picos se determinó por el programa de computadora 
Molecular Analist (BioRAD). Los resultados fueron basados en 3 electroforesis del 
mismo paciente. 
 
Se catalogó como déficit de espectrina más ankirina cuando la relación entre la 
banda electroforética correspondiente a espectrina más ankirina y la banda 
electroforética correspondiente a banda 3 fue menor que la misma relación medida 
en los individuos normales. El diagnóstico de déficit de proteína 4.1 mas proteína 
4.2 fue hecho cuando la relación entre la banda electroforética correspondiente a 
banda 4.1 mas banda 4.2 y la banda 3 fue menor que la misma relación medida en 
el grupo de individuos normales. El diagnóstico de déficit de de banda 3 fue 
realizado cuando la relación entre la banda electroforética correspondiente a 
espectrina más ankirina y la banda 3 fue mayor que la misma relación en los 
individuos normales. 
47 
 
5. RESULTADOS 
 
Se realizó el estudio en 8 pacientes y 8 controles. Los pacientes son niños que 
asisten a la consulta de Hematología Pediátrica de la Fundación Hospital de la 
Misericordia con diagnóstico de esferocitosis hereditaria (EH) a quienes se les hizo 
seguimiento desde marzo hasta agosto de 2008 y cumplieron los criterios de 
inclusión. 
 
El promedio de edad fue de 7,1 años, con rango de 1,8 a 13,75 años. El 62,5% 
correspondió al sexo femenino y 37,5% al masculino. 
 
Las características epidemiológicas de los 8 pacientes se muestran en la Tabla 3. 
 
Tabla 3. Características epidemiológicas de los pacientes 
PACIENTE SEXO EDAD 
(años) 
PESO 
(Kg) 
TALLA 
(cm) 
1 F 1,81 10,3 77 
2 M 13,75 48,5 159 
3 F 8,51 28,7 128,5 
4 M 5,52 22,3 113 
5 F 13,1 57 161 
6 F 2,66 11,7 84 
7 F 5,41 18 106 
8 M 6,25 28,7 123 
Fuente: Autor 
 
5.1 CARACTERÍSTICAS CLÍNICAS 
Los antecedentes personales de los pacientes estudiados se muestran en la 
Tabla 4. 
 
48 
Cinco pacientes tenían antecedente de ictericia neonatal manejada 
hospitalariamente con fototerapia, 3 de los cuales también requirieron trasfusión 
de glóbulos rojos en la misma hospitalización por anemia pero no para 
exsanguinotrasfusión indicando que la ictericia fue moderada con adecuada 
respuesta a fototerapia. De estos 5 pacientes, 4 tenían antecedentes familiares de 
EH: dos son hermanos y la madre tiene diagnóstico de EH y los otros dos tienen 
antecedentes de padre con EH. 
 
Hay cinco pacientes con antecedentes familiares de EH, cuatro descritos en el 
párrafo anterior y el quinto con antecedente de padre con EH y esplenectomía. 
 
En total 4 pacientes han requerido trasfusión de glóbulos rojos por anemias 
consideradas como importantes; 3 en edad de recién nacido y uno, posteriora un 
procedimiento quirúrgico osteoarticular programado. Ninguno ha sido trasfundido 
en los últimos 6 meses. 
 
Hay una paciente a quien durante el estudio y seguimiento de EH con ecografía 
abdominal, se le encontró colelitiasis, la cual está en control clínico y radiológico 
estrecho. 
 
Al examen físico el paciente número 8 se encontraba ictérico y con 
esplenomegalia de 4 cm por debajo del reborde costal derecho (PDRCD); el 
paciente número 6 presentaba bazo palpable a 2 cm PDRCD, sin ictericia. La 
paciente número 5 fue esplenectomizada en marzo de 2008 por la severidad del 
cuadro clínico y los otros 5 pacientes se encontraron asintomáticos y sin ictericia ni 
bazo palpable. 
 
Según la gravedad del cuadro clínico, teniendo en cuenta los criterios descritos en 
el marco teórico, los pacientes se pueden clasificar como: rasgo en un caso 
(paciente Nº 2) (12,5%), leve en 4 casos (pacientes Nº1,3, 6 y 8)(50%), moderada 
49 
en 2 casos (pacientes Nº 4 y 11) (25%) y severa en un caso (paciente Nº 
5)(12,5%), esta última es la paciente que se esplenectomizó en marzo de 2008. 
 
Tabla 4. Antecedentes personales y familiares 
ANTECEDENTES PACIENTES(%) n=8 
Ictericia 7 (87,5%) 
Ictericia Neonatal 5 (62,5%) 
Familiares 5 (62,5%) 
Anemia 4 (50,0%) 
Trasfusiones 4 (50,0%) 
Colelitiasis 1 (12,5%) 
Esplenectomía 1 (12,5%) 
Fuente: Autor 
 
5.2 HALLAZGOS DE LABORATORIO 
La tabla número 5 describe las características del hemograma y niveles de 
bilirrubinas más significativos reportados en la historia clínica de los 8 pacientes 
estudiados. 
 
En el cuadro hemático, el promedio de la concentración de hemoglobina 
corpuscular media estuvo en valores normales (33.7 g/dl), pero los pacientes 4, 6 
y 8 tuvieron valores elevados ≥ de 35 g/dl. 
 
El ancho de distribución está elevado en todos los pacientes por encima del rango 
normal de 15%. 
 
El valor promedio de bilirrubina total estuvo elevado, en 4.9 mg/dl (rangos de 0,9 a 
14,7mg/dl). Sólo el paciente Nº1 tenía valores dentro de límites normales y está 
clasificado como rasgo por los otros parámetros de laboratorio. 
50 
Tabla 5. Características de laboratorios 
No. Hb 
(g/dl) 
Hcto 
(%) 
VCM
(fL) 
CHCM
(g/%) 
HCM
 
AD 
(%) 
Retis 
correg
FSP BT BI 
1 12 35,4 80,9 34,9 28,3 16,0 5,74 + 4,49 4,07 
2 15 44,4 88,1 34,3 30,2 15,3 2,0 NORMAL 0,9 0,6 
3 12 37,6 87,4 32,7 28,6 17,0 16,0 ++ 5,49 4,46 
4 10 27,0 78,7 37,4 29,4 19,4 7,0 + 14,7 13,83
5 5,6 16,0 75,4 30,8 23,1 21,4 11,6 +++ 4,89 4,41 
6 13 35,2 71,9 35,7 25,7 20,2 20,0 + 2,3 2,05 
7 8,6 28,8 87,3 29,9 26,1 24,6 9,65 ++ 2,91 2,41 
8 11 34,0 82,6 35 28,9 24,8 15,7 NORMAL 4,27 3,66 
FSP= frotis de sangre periférica. 
+ esferocitos escasos 
++ esferocitos moderados 
+++ esferocitos abundantes 
Fuente: Autor 
 
5.3 CURVA DE FRAGILIDAD OSMÓTICA 
Se realizó la prueba de fragilidad osmótica incubada, la cual se repitió mínimo en 
dos oportunidades en laboratorios de referencia y se encontraron las siguientes 
curvas que se pueden ver en el Anexo B: en los pacientes Nº 1, 3, 4, 6 y 7 el perfil 
de hemólisis es tipo III. En dos pacientes (Nº 2 y 5) fueron normales y en uno (Nº 
8), la curva es de patrón de resistencia globular osmótica. En la paciente 5 se 
repitió la prueba de fragilidad osmótica y evidenció un patrón sugestivo de EH (no 
mostrado en el Anexo B). En este caso primó el cuadro clínico y los antecedentes 
familiares. 
 
5.4 RESULTADOS DE ELECTROFORESIS 1D 
Se realizó a los pacientes y a los controles electroforesis 1D que fueron teñidas 
con Coomasie (ver ejemplo en anexo 3). A pesar de realizarse varios ensayos a 
diferentes concentraciones de poliacrilamida, no se logró separar la banda de 
51 
ankirina de la de espectrina debido a que el peso molecular de estas dos proteínas 
es muy similar entre sí y solamente se pueden diferenciar mediante 
aproximaciones de inmunohistoquímica como Western Blot, por lo cual se decidió 
tomar en conjunto el área de la espectrina y la ankirina. De igual manera no se 
observa una alteración en el tamaño de estas dos proteínas lo cual podría estar 
asociado a mutaciones puntuales y no a perdidas como deleciones. 
 
Respecto a las proteínas de membrana alterada se encontró: 3 pacientes (Nº2, 3 y 
4)(37,5%) con déficit combinado de ankirina y espectrina y en los 5 pacientes 
restantes, déficit de banda 3 (Nº 1, 5, 6 , 7 y 8)(62,5%). 
 
En todos los geles de electroforesis 1D de los pacientes, se encontró por 
densitometría la presencia de una banda proteica a nivel del marcador de peso 
molecular de 26 kD, la cual no se evidenció en los geles de los controles. 
 
5.5 RESULTADOS DE 2D-PAGE Y ESPECTROMETRÍA DE MASAS MALDI-TOF 
Posteriormente se realizaron electroforesis 2D-PAGE a los pacientes y controles, 
en las cuales también se evidenció diferencias significativas en algunas proteínas 
de membrana localizada en un peso molecular aproximado de 26 kD cuando se 
analizan con densitometría y presentes únicamente en los pacientes y ausentes 
en los controles (Ver anexo 3, 4 y 5 y gráfica 1). 
 
Luego, las proteínas que se identificaron en estos geles, se aislaron sus “spots” y 
se procedió a la digestión con tripsina para su posterior análisis por 
Espectrometría de Masas la cual se realizó en la Universidad de Córdoba en el 
Servicio Central de Apoyo a la Investigación, con el objetivo de identificar algunas 
proteínas que se manifestaron únicamente en los pacientes y poder explicar su 
expresión este grupo de pacientes con EH. 
 
52 
Los resultados del estudio de masas de los “spots” permitieron identificar 
diferentes proteínas, muestras S1, S2 y S3 que se consignan en el anexo 6, donde 
se destaca principalmente la presencia de α-espectrina localizada en un peso 
molecular diferente al calculado para su estructura y punto isoeléctrico. 
 
Figura 4. Diferencia de expresión de los pacientes con EH versus los controles 
 
Proteína de 26Kda que se ve tanto en los geles teñidos con coomasie como en los 2D 
0
0.5
1
1.5
2
2.5
3 ***
N
iv
el
es
 d
e 
pr
ot
eí
na
control
paciente
 
Fuente: Autor 
53 
 
6. DISCUSION 
 
Se evidenció que los 8 pacientes con EH incluídos en este estudio, presentan al 
igual que se describe en la literatura, una variabilidad clínica y paraclínica de tal 
forma que dos terceras partes de los pacientes presentaron ictericia neonatal pero 
no de magnitud significativa como para exsanguinotrasfusión. Aproximadamente el 
65% tienen, antecedentes familiares de EH lo cual coincide con los reportes 
mundiales que están entre el 70 a 85%. La mitad de los pacientes consultaron por 
anemia y un poco más del 85%, por ictericia. Sólo un paciente requirió 
esplenectomía por la severidad de los síntomas y en otro se encontró colelitiasis 
como hallazgo incidental dentro de los estudios de extensión. 
 
En el hemograma los hallazgos más notorios fueron anemia, reticulocitosis y 
elevación del ancho de distribución pero a diferencia de lo descrito en estudios 
previos (1, 3, 4, 8, 10, 11, 13, 16, 18), no hay un aumento de la concentración de 
hemoglobina corpuscular media en este grupo. 
 
La curva de fragilidad osmótica más frecuente en los pacientes estudiados fue la 
tipo III y no se correlaciona con la severidad de la enfermedad. 
 
La prueba de fragilidad osmótica que en nuestro medio hace parte fundamental 
del diagnóstico de EH, fue normal en 3 pacientes. En todos los pacientes, el 
corrido electroforético en 1D detectó deficiencias en las proteínas de membrana, lo 
cual indica que esta última es más sensible y específica para el diagnóstico. 
 
Encontramos que todos los pacientes seleccionados tenían deficiencia de 
proteínas de membrana y la más frecuente en esta serie es la de Banda 3, 
seguida por la deficiencia combinada de espectrina y ankirina. No encontramos 
deficiencias de proteínas 4.1 y 4.2. Llama la atención este hallazgo, pues la 
54