INMUNOLOGIA CLASE 11

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INMUNODIAGNOSTICO PARTE 1
Dra Noelia Meaurio 
INMUNOLOGIA 
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IMPORTANCIA DEL INMUNODIAGNOSTICO
Muchas técnicas de laboratorio habituales en los ámbitos clínico y de investigación se basan en el uso de anticuerpos. Además, muchas de las técnicas de la moderna biología molecular han proporcionado una información de enorme valor sobre el sistema inmunitario. 
Un buen profesional médico debe tener noción que existen diversas técnicas que visan auxiliar el mismo en la hora del análisis para así obtener un diagnóstico adecuado. 
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FUNDAMENTO
Algunos métodos de análisis utilizan a los anticuerpos y esto se debe a la exquisita especificidad de los anticuerpos por antígenos particulares convierte a los anticuerpos en reactivos muy valiosos para detectar, purificar y cuantificar antígenos. Como pueden producirse anticuerpos contra casi cualquier tipo de macromolécula y sustancias químicas pequeñas, pueden utilizarse técnicas basadas en anticuerpos para estudiar casi cualquier tipo de molécula en solución o celular. El método para producir anticuerpos monoclonales ha incrementado mucho nuestra capacidad de generar anticuerpos con casi cualquier especificidad deseada. 
Antes, muchos de los usos de los anticuerpos dependían de la capacidad del anticuerpo y del antígeno específico para formar grandes inmunocomplejos, bien en solución o en geles, que podían detectarse mediante diversos métodos ópticos. Estos métodos tuvieron mucha importancia en los primeros estudios, pero ahora han sido sustituidos casi por completo por métodos más sencillos basados en anticuerpos o antígenos inmovilizados. 
Encontrar el MICROORGANISMO
ANTICUERPOS contra el microorganismo
METODOS LABORATORIALES 
CATARRO- FLEMA
Recoleccion de ORINA-
Jato de urina –Colecta de orina 
Sonda Vesical–no tan esteril- 
Talla vesical- esteril
Escarro 
Secreción 
EJEMPLOS DE METODOS DIRECTOS
EJEMPLOS DE METODOS DIRECTOS
-QUALITATIVA: positivo o negativo
-CUANTITATIVA:
INMUNODIAGNOSTICO
La interacción antígeno-anticuerpo es una relación bimolecular parecida a la interacción enzima - sustrato, con una diferencia importante: no conduce a una alteración química irreversible en el anticuerpo ni en el antígeno. 
La relación entre un anticuerpo y un antígeno incluye varias interacciones no covalentes entre el determinante antigénico, o epítopo, del antígeno y el dominio de región variable (VH/VL) de la molécula del anticuerpo, en particular las regiones hipervariables, o regiones determinantes de complementariedad (RDC). 
INMUNODIAGNOSTICO – VENTAJAS Y DESVENTAJAS
VENTAJAS: La minuciosa especificidad de las interacciones antígeno-anticuerpo condujo al desarrollo de una diversidad de pruebas inmunológicas, que pueden utilizarse para detectar la presencia de anticuerpo o de antígeno. Los inmunoensayos han sido de vital importancia en el diagnóstico de enfermedades, la vigilancia del grado de respuesta inmunitaria humoral y la identificación de moléculas de interés biológico o médico.
 Estas valoraciones difieren en su rapidez y sensibilidad; algunas son estrictamente cualitativas, otras son cuantitativas. 
DESVENTAJAS: Aunque las reacciones Ag-Ac son muy específicas, en algunos casos el anticuerpo estimulado por un antígeno puede reaccionar en forma cruzada con un antígeno no relacionado. Esta reactividad cruzada ocurre si dos antígenos diferentes comparten un epítopo idéntico o muy similar. En el último caso la afinidad del anticuerpo por el epítopo de reacción cruzada suele ser menor que para el epítopo original.
1. TECNICAS DE AGLUTINACION 
En las pruebas de aglutinación (p. ej., aglutinación con látex, coagregación), partículas muy pequeñas (cuentas de látex, partículas de gelatina, bacterias) se acoplan con un reactivo antigénico o un anticuerpo. La partícula compleja formada se mezcla con la muestra (p. ej., líquido cefalorraquídeo o suero); si el anticuerpo o el antígeno buscados están presentes en la muestra, producirán el entrecruzamiento de las partículas, lo que se observa como una aglutinación.
RESULTADO DE LA AGLUTINACION
Si los resultados son positivos, se realizan diluciones seriadas de la muestra y se prueban nuevamente. La aglutinación de las soluciones más diluidas indica que existen mayores concentraciones del anticuerpo o del antígeno en estudio..
Generalmente, las pruebas de aglutinación son rápidas, pero menos sensibles que muchos otros métodos. También permiten determinar los serotipos de algunas bacterias.
PANCREATITIS AGUDA –
PCR es elevada
Detección de proteína c reactiva
Aglutinación de Látex
PROTEINA C REACTIVA 
Proteina presente en Fase Aguda de una inflamación /infección 
SENSIBLE 
NO ESPECIFICO 
Tecnica: Aglutinacion 
autoinmuno
FACTOR REUMATOIDE
ES SENSIBLE 
NO ES ESPECIFICO
Tecnica de AGLUTANACION 
CORRELACION LA CLINICA CON EL LABORATORIO 
VDRL: LABORATORIO DE INVESTIGACION DE ENFERMEDADES VENEREAS 
Es un examen para detectar sífilis. Mide sustancias (proteínas), llamadas anticuerpos, que su cuerpo puede producir si usted entra en contacto con la bacteria que causa la sífilis.
PRUEBA SEROLOGICA PARA SIFILIS VDRL
Es un examen para detectar sífilis. Mide sustancias (proteínas), llamadas anticuerpos, que su cuerpo puede producir si usted entra en contacto con la bacteria que causa la sífilis.
Forma en que se realiza el examen
El examen se hace la mayoría de las veces con una muestra de sangre. También se puede realizar usando una muestra de líquido cefalorraquídeo. Este artículo aborda el examen de sangre.
Se necesita una muestra de sangre
Lo que se siente durante el examen
Cuando se inserta la aguja para extraer la sangre, algunas personas pueden sentir un dolor moderado, mientras que otras solo un pinchazo o picadura. Posteriormente, puede haber una de sensación pulsátil o un leve hematoma. Esto desaparece rápidamente.
Razones por las que se realiza el examen
Este examen se utiliza para diagnosticar la sífilis. La bacteria que causa la sífilis se llama Treponema pallidum.
Su proveedor de atención médica puede ordenar este examen si usted tiene signos y síntomas de una enfermedad de transmisión sexual (ETS).
Las pruebas de detección para sífilis son una parte rutinaria del cuidado prenatal durante el embarazo.
Resultados normales
Un examen negativo es normal. Significa que no se han observado anticuerpos contra la sífilis en la muestra de sangre.
Significado de los resultados anormales
El examen con resultado positivo indica que usted puede tener sífilis. Si el examen es positivo, el siguiente paso es confirmar los resultados con el examen FTA-ABS, que es un examen más específico para la sífilis.
VDRL = examen de sifilis 
Resultados normal= NEGATIVO 
RESULTADO ANORMAL = POSITIVO ----- Dx: sifilis 
Tecnica de AGLUTINACION 
Pedimos por sospecha clínica
Parejas sexuales 
PRENATALES DE LAS MUJERES EMBARAZADAS 
Test de Coombs
Se hace para detectar anticuerpos que atacan a los globulos rojos , causando destrucción prematura de los glóbulos rojos en la sangre 
Anticuerpos son proteínas que se secretan de los linfocitos B 
Ac atacan sustancias extrañas y los destruy 
SITUACIONES DONDE EL AC SE UNE A LOS GR
1 reacción a una transfusión sanguínea 
 sangre…….. Antigeno ABO - RH
Transfusion sanguínea tiene que ser compatible 
Si la sangre es incompatibl el sistema inmunitario destruiría a los GR que presentan antigenos. 
2 Sensibilizacion al RH antigeno D 
RH antigeno ( Ag factor de RHESUS) 
Madre RH negativo, Padre RH positivo ….. Hijo RH positivo 
2, 3, 4 embarazo la madre esta sensibilizada … Presenta Anticuerpos Rh
Los globulos rojos del Feto serán atacados por el sistema inmunitario de la madre 
Eritroblastosis fetal 
Anemia Hemolítica autoinmunataria 
Poco frecuentes
Cuerpo forma anticuerpos contra los propios GR
LISIS : QUEBRA / muerte 
HEMO: sangre 
¿Por qué se produce el efecto prozona?
Diversos mecanismos pueden causar el efecto prozona: 
Primero,a concentraciones altas de anticuerpo, el número de sitios de unión de anticuerpo puede exceder en grado considerable el de epítopos. Como resultado, casi todos los anticuerpos se unen a antígeno sólo de manera univalente en lugar de multivalente. Los anticuerpos que se unen de manera univalente no pueden enlazar en forma cruzada un antígeno con otro. Los efectos prozona se diagnostican con facilidad al valorar una diversidad de concentraciones de anticuerpo (o antígeno). Conforme se diluye a una concentración óptima de anticuerpo, se observan valores más altos de aglutinación o cualquier parámetro que se mida en la valoración que se utilice.
¿Por qué se produce el efecto prozona?
El efecto prozona también puede ocurrir por otra razón cuando se emplean anticuerpos policlonales. Es posible que el antisuero contenga concentraciones altas de anticuerpo que se unen a antígeno pero no inducen aglutinación; estos anticuerpos, llamados anticuerpos incompletos, a menudo son de la clase IgG. A concentraciones altas de IgG, las anticuerpos incompletos pueden ocupar la mayor parte de los sitios antigénicos y bloquear así el acceso de la IgM, que es una buena aglutinina. Este efecto no se presenta con anticuerpos monoclonales aglutinantes. 
¿Por qué se produce el efecto prozona?
La falta de actividad aglutinante de un anticuerpo puede deberse a flexibilidad restringida en la región en bisagra, que dificulta que el anticuerpo asuma el ángulo necesario para el enlace cruzado óptimo de epítopos y dos o más antígenos particulados. Es factible, la solución a ambos problemas consiste en probar anticuerpos diferentes que pueden reaccionar con otros epítopos del antígeno que no presentan estas limitaciones.
FIJACION DEL COMPLEMENTO
La fijación del complemento mide la cantidad de anticuerpos consumidores de complemento (o que lo fijan) de una muestra de suero o líquido cefalorraquídeo. Se usa para el diagnóstico de algunas infecciones virales o micóticas, especialmente para la coccidioidomicosis.
La muestra se incuba con cantidades conocidas de complemento y del antígeno que es el blanco del anticuerpo en estudio. El grado de fijación del complemento indica la cantidad relativa de anticuerpos en la muestra.
La prueba permite medir los títulos de anticuerpos IgM e IgG, o puede modificarse para detectar determinados antígenos. Es precisa, pero tiene aplicaciones limitadas, es laboriosa y requiere muchos controles.
OTROS TIPOS DE PRUEBAS DE MAYOR SENSIBILIDAD
Como la sensibilidad de la mayoría de los inmunoensayos es elevada, suele utilizárselos con fines de rastreo o cribado. Pueden determinarse los títulos mediante la dilución seriada de las muestras, como en los ensayos de aglutinación.
Las sensibilidades de estas pruebas, aunque suelen ser bastante elevadas, pueden variar de acuerdo con la edad del paciente, el serotipo del microorganismo o el estadio clínico de la enfermedad.
INMUNOENZIMATICO
ELISA DIRECTO
El ELISA directo es adecuado para determinar la cantidad de antígenos de alto peso molecular y se considera el tipo de ELISA más simple. Se requieren menos pasos y es considerablemente más rápido que otros tipos de ELISA. Otra ventaja es que se elimina la posibilidad de reactividad cruzada del anticuerpo secundario, que puede ocurrir en un ELISA indirecto. Sin embargo, el marcaje directo de los anticuerpos primarios requiere mucho tiempo, es costoso y puede afectar negativamente a la inmunorreactividad del anticuerpo con el antígeno al que está dirigido.
ELISA INDIRECTO
El ELISA indirecto es un proceso de unión de dos pasos que implica el uso de un anticuerpo primario y un anticuerpo secundario marcado. En este método, el anticuerpo primario se incuba con los pocillos de una placa recubiertos con antígeno. A continuación, se agrega un anticuerpo secundario marcado que reconoce el anticuerpo primario. Luego se agrega un sustrato para producir una amplificación de la señal. Este método se utiliza comúnmente para diagnosticar infecciones por bacterias, virus o parásitos y cuantificar los anticuerpos contra este antígeno extraño. 
La detección por ELISA indirecta es versátil, ya que se pueden usar diferentes marcadores de visualización con el mismo anticuerpo primario. Dado que se puede unir más de un anticuerpo marcado por objetivo de anticuerpo, se considera que el ELISA indirecto es altamente sensible y más flexible que el ELISA directo. Sin embargo, puede producirse reactividad cruzada y una señal no específica con el anticuerpo secundario.
ELISA TIPO SANDWICH
Los ensayos conocidos como ELISA sándwich utilizan dos anticuerpos específicos contra el antígeno para capturarlo a manera de emparedado (sándwich) en la placa de detección. En una primera la primera etapa, el antígeno de interés se añade a un anticuerpo primario unido a una placa. Durante una segunda incubación, se añade un anticuerpo secundario al complejo antígeno anticuerpo primario formado en el primer paso. 
El anticuerpo secundario puede estar directamente conjugado a una enzima que sólo requiera la adición del sustrato o estar unido a un marcador que requiera la adición de un segundo compuesto que es el que reaccionará directamente con el sustrato. Cuando se agrega un sustrato cromogénico al ensayo para desarrollar color, las muestras con una alta concentración de antígeno generan más señal que aquellas con una baja concentración de antígeno, lo que produce una señal directamente proporcional a la cantidad de antígeno en la muestra. Para estimar la concentración de antígeno presente en la muestra se extrapolan las mediciones con una curva de calibración.
Este tipo de ensayo se usa generalmente para proteínas de peso molecular bajo a alto, como la endotelina 1 (por ejemplo, HSP70, o la proteína de supervivencia de las neuronas motoras. Los ELISA sándwich son altamente específicos ya que se basan en un par de anticuerpos para la captura y detección en lugar de fijar de manera directa el antígeno a una placa de plástico, como se hace en el ELISA directo. Esto permite concentrar el antígeno de interés sobre la superficie de la placa aun cuando esté presente en concentraciones muy bajas en la mezcla inicial.
INMUNOFLUORESCENCIA
Se incuba el tejido o la célula con un anticuerpo marcado con un fluorocromo o una enzima, y la posición que ocupe el marcado, determinada o con el microscopio adecuado, sirve para deducir la ubicación del antígeno. En la primera versión de este método, llamada inmunofluorescencia, el anticuerpo se marcaba con un colorante fluorescente y se le dejaba unirse a una monocapa de células o a un corte del tejido congelado. Las células o los tejidos teñidos se examinaban con un microscopio de fluorescencia para localizar el anticuerpo. 
Cuando el marcado se une directamente al anticuerpo primario específico, el método recibe el nombre de directo; cuando lo hace a un anticuerpo secundario o hasta terciario, el método pasa a ser indirecto. En los métodos indirectos pueden utilizarse algunas veces otras moléculas diferentes a los anticuerpos. Por ejemplo, tanto la proteína estafilocócica A, que se une a la IgG, como la avidina, que lo hace a los anticuerpos primarios marcados con biotina, se prestan a combinarse con fluorocromos o enzimas.
INMUNOPRECIPITACION
Los anticuerpos pueden utilizarse para purificar proteínas a partir de una solución o para identificarlas y caracterizarlas. Dos de los métodos empleados a menudo para identificar y purificar proteínas son la inmunoprecipitación y la cromatografía por afinidad. La inmunotransferencia es una técnica muy difundida para determinar la presencia de una proteína en una muestra biológica y su tamaño. La inmunoprecipitación es una técnica en la que se usa un anticuerpo específico frente a un antígeno proteínico en una mezcla de proteínas para identificar este antígeno específico.
INMUNOCROMATOGRAFIA
La inmunocromatografía se basa en la migración de una muestra através de una membrana de nitrocelulosa. La muestra es añadida en la zona del conjugado, el cual está formado por un anticuerpo específico contra uno de los epítopos del antígeno a detectar y un reactivo de detección. Si la muestra contiene el antígeno, este se unirá al conjugado formando un complejo inmune y migrará a través de la membrana de nitrocelulosa. Si no, migrarán el conjugado y la muestra sin unirse.
La zona de captura está formada por un segundo anticuerpo específico contra otro epítopo del antígeno. Al llegar la muestra a esta zona, los complejos formados por la unión del antígeno y conjugado quedarán retenidos y la línea se coloreará en este caso como rosa o azul (muestras positivas). En el caso contrario las muestras son negativas.
La zona control está formada por un tercer anticuerpo que reconoce al reactivo de detección. Cuando el resto de muestra alcanza esta zona, el anticuerpo se unirá al conjugado libre que no ha quedado retenido en la zona de captura. Esta línea es un control de que el ensayo ha funcionado bien, porque se colorea siempre, con muestras positivas y negativas.
Importancia del diagnóstico individual
El diagnostico individual permite abordar la enfermedad de nuestro paciente con una especificidad mayor y así alcanzar el resultado esperado evitando a lo máximo las posibles sorpresas. 
Debemos tomar en cuenta algunos factores aquí que nos puedan auxiliar. Como por ejemplo. 
La edad del paciente 
Condición física 
Presencia de comorbidades 
Factores heredables 
Condición social 
Localidad donde vive 
Donde trabaja 
Rutina 
Sensaciones por el cuerpo 
La semiología 
Dieta del paciente
Condiciones psicológicas
El diagnostico epidemiológico del grupo. 
El diagnostico epidemiológico de un grupo nos permite obtener resultados palpables para combatir una enfermedad que se asola sobre un grupo de personas, además de alcanzar medidas de prevención gracias a estos resultados. 
Aquí debemos tomar en consideración. 
Periodo del año o estación 
Condiciones del barrio/ciudad
Condiciones de la población 
Enfermedades que se repiten 
Endemias 
Dieta del grupo 
Situación social 
Apoyo social del gobierno 
Presencia o ausencia del estado 
Bases para la interpretación de ensayos. 
	Recuento de hematíes (He)	Se expresa como He x 1012/L. La vida media es de 120 días. Se encuentra aumentado en número (poliglobulia) en las talasemias, en las cardiopatías, habitantes de grandes alturas, en estados de deshidratación y menos en las anemias ferropénicas. En cambio, en las anemias megaloblásticas se encontrará disminuido.
	Hemoglobina (Hb)
	Es una ferroproteína situada en el interior de los hematíes, encargada del transporte de oxígeno hacia los tejidos. Es el mejor parámetro para valorar la anemia, aunque la cifra de eritrocitos sea normal o incluso elevada. Se expresa en g/L de sangre. En los casos de anemia estará disminuida y en la poliglobulia estará elevada.
	Hematocrito (Hto)
	Es el volumen de elementos formes (hematíes) en relación a la cantidad de plasma. Se expresa en L/L. Se encontrará aumentado en las poliglobulias, ya sean falsas por hemoconcentración, verdaderas en aquellos casos donde el Hto es superior a 0,60 L/L o fisiológicas como en los recién nacidos.
	Índices eritrocitarios de Wintrobe
	Partiendo de la Hb, He y Hto se calculan una serie de índices útiles en la práctica clínica
INDICES HEMATIMETRICOS
	Volumen corpuscular medio (VCM)
	Se calcula a partir del Hto y del número de hematíes (VCM = Hto x 1.000/ He). Se expresa en fl (fentolitro = 10-15 L). Un VCM elevado indica macrocitosis (hematíes grandes), siendo el caso de anemias megaloblásticas, anemias hemolíticas y en hepatopatías. En el recién nacido, la macrocitosis es fisiológica. En las microcitosis (hematíes pequeños), los valores están disminuidos, como en anemias ferropénicas y en talasemias.
	Hemoglobina corpuscular media (HCM)	Se calcula a partir de la hemoglobina y del número de hematíes (HCM = Hb/He). Se expresa en pg (picogramo = 10-12 g). Se correlaciona con el VCM, ya que informa del contenido medio de hemoglobina de cada hematíe, por este motivo, estará alterado en los mismos casos.
	Concentración de hemoglobina corpuscular media (CHCM)
	Indica la concentración de hemoglobina por el total de masa de He (CHCM = Hb/Hto). Se expresa en g/L, siendo los parámetros de normalidad 330 ± 20 g/L. Valores aumentados (hipercromía) se observan exclusivamente en la esferocitosis. Valores disminuidos indican hipocromía, como en el caso de las anemias ferropénicas.
OTROS INDICES HEMATIMETRICOS
	Índice de dispersión de la Hb o distribución de Hb en los hematíes (HDW)
	Se expresa en g/L con valores de normalidad entre 27 ± 5 g/L. Alterado cuando hay una doble población de hematíes, como es el caso de los pacientes transfundidos. También, lo observaremos en las anemias ferropénicas en tratamiento.
	Morfología de los hematíes
	Los eritrocitos normales son discos bicóncavos fácilmente deformables. La morfología de estos, ya sea por tamaño o forma, nos permite diagnosticar anemias, así como patologías que conllevan alteración de la membrana del hematíe.
	Reticulocitos
	Son hematíes jóvenes, no totalmente maduros. Su recuento es importante en el estudio de anemias y en la monitorización de su tratamiento; ya que, nos informa de la capacidad eritropoyética de la médula ósea. El valor normal 55 ± 20 x 109/L (1 ± 0,5%).
Un descenso se observa en anemias ferropénicas no tratadas, aplasias y leucemias. Aumentan en la anemia hemolítica, anemia hemorrágica intensa, después de una esplenectomía, en anemias ferropénicas en tratamiento y de forma fisiológica en el período neonatal.
	Velocidad de sedimentación globular (VSG)
	Se ha de valorar la 1ª hora. Los valores normales son 5-10 mm. Es un parámetro muy inespecífico, por lo que la podemos encontrar alterada en diversos procesos: infecciones, colagenosis, leucosis, tumores con participación hematológica, anemias y período post-prandial. En las poliglobulias y en el período neonatal (fisiológico), se encontrará disminuida.
SERIE BLANCA
	Serie blanca
	Los leucocitos son células presentes en sangre cuya función es la defensa del organismo frente a las agresiones del medio externo. Su estudio nos ayudará principalmente al diagnóstico de los procesos hematológicos e infecciosos.
	Recuento de leucocitos (Le)
	Se expresa en Le x 109/L, siendo los valores normales de 4 a 10 x 109/L. Se denomina leucopenia cuando se encuentran cifras inferiores a 4 x 109/L y leucocitosis a cifras superiores a 10-12 x 109/L. La vida media de los leucocitos es de seis a siete horas; por tanto, una fórmula leucocitaria puede variar completamente en este período.
La leucopenia puede ser indicativa de leucosis o infecciones. Tanto virus como bacterias pueden asociarse a leucopenia, pero en el último caso es sugestivo de infección grave. La leucocitosis puede ser fisiológica en el recién nacido y también se observa en: infecciones bacterianas, tos ferina, mononucleosis infecciosa, leucosis, tratamientos con corticoides o tras esplenectomía.
Una reacción leucemoide es aquella en la que encontramos cifras de leucocitos mayores de 50 x 109/L como puede ser el caso de infecciones bacterianas, mononucleosis infecciosa, en la fase de recuperación de una agranulocitosis o, más recientemente, por tratamientos con factores estimulantes de colonias granulopoyéticas (G-CSF, GM-GSF).
	Formula leucocitaria
	Nos permite cuantificar los diferentes tipos de leucocitos (neutrófilos, linfocitos, basófilos, eosinófilos y monocitos). Normalmente, se expresa en porcentaje, aunque los valores absolutos (x 109/L) son más precisos.