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UNIVERSIDAD NACIONAL AUTÓNOMA DE MÉXICO FACULTAD DE QUÍMICA ÁCIDOS GRASOS DE CADENA IMPAR AISLADOS DE Capsicum annuum L. INHIBIDORES DE LA FOTOFOSFORILACIÓN TESIS QUE PARA OBTENER EL TÍTULO DE QUÍMICA DE ALIMENTOS PRESENTA Mayleth Domínguez Hernández MÉXICO, D.F. AÑO 2012 UNAM – Dirección General de Bibliotecas Tesis Digitales Restricciones de uso DERECHOS RESERVADOS © PROHIBIDA SU REPRODUCCIÓN TOTAL O PARCIAL Todo el material contenido en esta tesis esta protegido por la Ley Federal del Derecho de Autor (LFDA) de los Estados Unidos Mexicanos (México). El uso de imágenes, fragmentos de videos, y demás material que sea objeto de protección de los derechos de autor, será exclusivamente para fines educativos e informativos y deberá citar la fuente donde la obtuvo mencionando el autor o autores. Cualquier uso distinto como el lucro, reproducción, edición o modificación, será perseguido y sancionado por el respectivo titular de los Derechos de Autor. JURADO ASIGNADO: PRESIDENTE: Profesor: Dr. Blas Lotina Hennsen VOCAL: Profesora:Dra. María Isabel Aguilar Laurents SECRETARIO: Profesor: Dr. Jesús Fernando Montiel Aguirre 1er. SUPLENTE: Profesora: Dra. Vanessa Rebeca Maya Ampudia 2° SUPLENTE: Profesora: Dra. Isabel del Carmen Rivero Cruz SITIO DONDE SE DESARROLLÓ EL TEMA: LABORATORIO 115, DEPARTAMENTO DE BIOQUÍMICA, CONJUNTO E FACULTAD DE QUÍMICA, UNAM. ASESOR DEL TEMA: Dr. Blas Lotina Hennsen Nombre Firma SUPERVISOR TÉCNICO: Mtra. en C. Beatriz King Díaz Nombre Firma SUSTENTANTE: Mayleth Domínguez Hernández Nombre Firma Agradecimientos A la Universidad Nacional Autónoma de México, por permitirme formar parte de su comunidad, gracias por la formación tanto personal como profesional que ahí encontré. A mi asesor, Dr. Blas Lotina Hennsen por darme la oportunidad de realizar mi tesis con usted, por sus consejos y su enseñanzas. A Mtra. Beatriz King Díaz, por sus asesorías, sus consejos, su alegría, porque siempre me alentó a seguir adelante, ¡gracias Maestra!. Al proyecto PAPIIT IT102012 por el apoyo otorgado para la realización de este trabajo. Al proyecto PAIP 4290-03 por el apoyo otorgado para la realización de este trabajo. A las asesorías de la Dra. Ma. Isabel Aguilar Laurents en la interpretación de espectros y la revisión de este trabajo. Al Dr. José Fausto Rivero Cruz, por sus asesorías a lo largo de este trabajo. Al personal académico de la Unidad de Servicios de Apoyo a la Investigación (USAI), de la Facultad de Química, UNAM. A los miembros del jurado por tomarse el tiempo de revisar este trabajo. Dedicatorias A mis padres, por darme la oportunidad de terminar una carrera universitaria, por tooodo su apoyo brindado, porque sin ustedes simplemente no sería lo que soy. A mi mamá Lucila Hernández, por todos sus desvelos, porque siempre se ha preocupado por mi bienestar, mi futuro, porque a pesar de todos los obstáculos a los que nos hemos enfrentado, ella siempre me decía, tu no mires las carencias, no mires hacia atrás, siempre con la frente en alto y hacia adelante. Gracias por todos tus consejos mami!. A mi papá Magdaleno Domínguez, porque siempre me has apoyado, porque si en algún momento no tenías los recursos para darme, tu decías, no te preocupes, tu dedícate y yo veré como le hago, gracias papá!. Gracias a los dos por la confianza que han depositado en mí, por todos los sacrificios. Este logro es más de ustedes. A mis queridas hermanas, mejores que ustedes nadie. A Jan porque desde pequeña me has cuidado, me has ayudado y apoyado siempre, perdona por todos los dolores de cabeza que te hicimos pasar, éramos niñas y no entendíamos que sólo lo hacías porque nos quieres. A mi hemana Ale, porque fuiste mi mejor amiga de la infancia, porque siempre me has ayudado, por tus consejos que aunque no quieras te los seguiré pidiendo. Las quiero mucho. A mis amigas del CCH, porque con ustedes conocí la amistad, gracias por todos los gratos momentos que pasé con ustedes, por todo lo que me enseñaron, que había un mundo allá afuera. A Anita Vázquez porque me enseñaste a decir esas dos palabras que muchas veces las sentimos, pero nos cuesta mucho decir, “Te quiero”. A Vero Vázquez, por todos tus consejos, por tu alegría, tu madurez, y claro “Gracias Vero por ayudarme con el chile y en la selección de los chiles”. A Monse Soto por esa chispa que te caracteriza, a las tres gracias, porque estuvieron conmigo en momentos difíciles. Cómo olvidar a Monse Hernández, a Monse Almaraz y a Gaby, gracias a todas. A mis amigos de la universidad, me alegra tanto haber estado en la Facultad de Química. A Pau Ollin, difícilmente alguien puede no quererte teniendo ese carisma, tu alegría, tu entusiasmo, gracias Pau!, por ser mi amiga, por estar conmigo siempre, por ser la voz de mi conciencia, te quiero mucho!. A Vero Camarillo, mi hermanita pequeña, porque con tu alegría por más difícil que se viera el panorama, siempre me sacaste una sonrisa, me cuidabas. A Marianne Pidal, gracias Marianne!, aunque te conocí casi al final de la carrera, llegaste en el momento justo, me alegra mucho ahora poder decirte amiga, gracias por preocuparte por mí, te quieroooo muchooo!!. A Soni Martínez, en primer semestre que te conocí jamás creí que serías mi amiga, gracias Soni por tus consejos, por tu alegría y tu amistad. A Eri Rodríguez, gracias por confiar en mí, por toda esa alegría que nos transmites, te quello!. A Kari Camacho, perdón Kari si al principio fui grosera, pero no te sientas, le hice lo mismo a Pau y Marianne, jajaja, sabes que te quiero mucho, conversar contigo siempre es divertido, siempre me sigues la corriente, gracias por tu apoyo. A Viry Calzada, mi compañera también del CCH, ese no era nuestro momento Viry, pero que bueno que nos encontramos después, gracias por todo. Gracias Kari y Viry, por todo lo que han hecho por mí, por su compañía en momentos de diversión. A Alicia Villaseñor, Chilis!, gracias por toda esa alegría y esa chispa que te caracteriza. A Lupita Larios, por tu entusiasmo y apoyo, gracias por tu amistad Lupita. Gracias chicas, con ustedes aprendí muchas cosas, no sólo la amistad, el compañerismo, gracias por todos esos días en los que me acompañaron, por creer en mí cuando yo llegué a dudar, como les he dicho, su amistad es de las cosas más importantes con las que me quedo. Debí haber hecho algo muuuy bueno para que la vida me premie con tan excelentes amigas. Gracias por los días de baile, y los que faltan. Y aunque seguramente no leerá esto, no puedo dejar de mencionar a Fer, porque siempre me hiciste ver que la vida puede ser mejor, me escuchaste cuando lo necesite, gracias Fer!. A las amigas QFB´s, Pao Zavala y Ale Crisanto porque a pesar de que no nos vemos tan seguido, siempre están en mis recuerdos, y por supuesto Karlita Ortíz, por tus consejos a lo largo de estos años, porque con tu sola compañía mejoras cualquier situación. A mis compañeros del Lab 115, mis amigos, gracias, hicieron que mi estancia en el lab fuesemuy grata. A Félix, por todos sus consejos tanto académicos como personales, tu alegría y sinceridad, son algo que siempre te agradeceré; a Nery porque siempre me escuchaste cuando perdía de vista la luz, gracias Nery, siempre me alentaste a seguir, por tu ayuda y apoyo incondicional; a Bryan, gracias por tus consejos, por confiar en mí, y tu alegría es algo que jamás se olvida. A Aidé y Natalia, porque siempre me dieron palabras de aliento. Gracias a todos, jamás olvidaré las tardes en el laboratorio, ir a comer y lo que le seguía, jajaja, por todo, muchas gracias, los quiero. A todas y cada una de las personas que he conocido a lo largo de mi vida, que se tomaron un momento para alentarme a seguir adelante. Índice ÍNDICE PÁG. Lista de abreviaturas……………………………………………………...……... i Lista de Tablas………………………………………………………..………….. iv Lista de Figuras………………………………………………………………….. v Lista de Espectros.………………………………………………………..…….. vii 1. RESUMEN………………………………………………………………...…... 1 2. INTRODUCCIÓN………………………………………………………..……. 2 3. ANTECEDENTES…………………………………………………………..… 3 3.1 Capsicum annuum L…………………………………………………..…... 3 3.1.1 Historia…………………..…………………………………………..…. 3 3.1.2 Clasificación Taxonómica……………………..……………………… 4 3.1.3 Descripción de género Capsicum……………………………………. 4 3.1.4 Origen y Distribución de Capsicum………………………………….. 5 3.1.5 Producción Mundial………………………………………………….... 7 3.1.6 Producción Nacional………………………………….……………….. 7 3.1.7 Usos…………………………………………………………………….. 8 3.2 Maleza….………………………………………………………………...… 8 3.3 Herbicidas………………………………………………………………..… 9 Índice 3.4 Fotosíntesis………………………………………………….…….……….. 11 3.4.1 El cloroplasto…………………………………….………………......... 12 3.4.1.1 Fotosistema II……………….………………………….……......... 14 3.4.1.2 Fotosistema I……………….………………………….…………... 15 3.4.1.3 Producción de ATP por un gradiente de protones....….……… 16 3.4.1.4 Reacción de Hill…………………….……………………………... 17 3.4.2 Desacoplantes……………………………….………………………… 18 3.5 Alelopatía…………………………….……………………………………… 18 3.6 Metabolitos secundarios…………………………………………………. 19 3.7 Antecedentes previos de los efectos de C. annuum sobre otras plantas………………………………………………….………….…..……. 20 4. HIPÓTESIS…………………………………………………………………….. 22 5. OBJETIVOS………………………………………………..…………………. 23 5.1 Principal…………………………………………………………………….. 23 5.2 Particulares………………………………………………………….……… 23 6. DESARROLLO EXPERIMENTAL………………………………………...... 24 6.1 Obtención del material vegetal………………………………………….. 24 6.2 Obtención de los extractos……………………………………………….. 25 6.3 Germinación………………………………………………………………... 26 6.4 Aislamiento de cloroplastos de hoja de espinaca (Spinacea olereaceae L.)……………………………………………………………………... 26 6.5 Medición de la Síntesis de ATP……………………………………......... 27 6.6 Medición de la velocidad del transporte de electrones……………….. 28 Índice 6.7 Fraccionamiento del extracto hexánico por cromatografía de columna abierta……………………………………………….…..….…… 28 6.8 Obtención de la sales del extracto metanólico…………………………. 29 6.9 Prueba de cloruros……………………………………………................. 29 6.10 Perlas de Bórax…………………………………………………………... 30 6.11 Caracterización de las muestras……………………………….………. 30 6.12 Reacción de Metilación……………………………………………......... 30 6.13 Reacción de Acetilación…………………………………………………. 31 7. RESULTADOS Y ANÁLISIS DE RESULTADOS……………………........ 32 7.1 Efecto de los extractos sobre la germinación y la elongación de tallos y raíces de L. perenne y P. ixocarpa……………………………. 32 7.1.1 Efecto en la Germinación de Lollium perenne……………………… 32 7.1.2 Efecto en la Germinación de Physalis ixocarpa……………………. 33 7.2 Efectos de los extractos sobre la Síntesis de ATP in vitro……………. 35 7.3 Efectos de los extractos sobre transporte de electrones fosforilante…………………………………………………………………. 36 7.4 Fraccionamiento biodirigido del extracto hexánico de C. annuum…………………………………………………………………….. 38 7.5 Refraccionamiento de la Fracción 12…………………………………….. 39 7.6 Efecto de los ác. tridecanoico y heptadecanoico sobre la Síntesis de ATP in vitro..…………………………………………………………........ 43 7.7 Efecto de los ác. tridecanoico y heptadecanoico sobre el transporte de electrones fosforilante……………………………………………….. 44 Índice 7.8 Efecto de los ác. tridecanoico y heptadecanoico sobre la germinación de L. perenne y P. ixocapa………………………………. 46 7.8.1 Efecto de los ác. tridecanoico y heptadecanoico sobre la germinación de Lollium perenne………………………………………... 46 7.8.2 Efecto de los ác. tridecanoico y heptadecanoico sobre la germinación de Physalis ixocapa……………………………………….. 47 7.9 Caracterización de los cristales del extracto metanólico………….….. 52 8. CONCLUSIONES……………………………………………………………... 53 9. PERSPECTIVAS……………………………………………..…………......... 54 10. APÉNDICES…………………………………………………...…………….. 55 10.1 Apéndice 1. Medios……………………………………………………… 55 10.2 Apéndice 2 Espectros…………………………………………………… 56 11. BIBLIOGRAFÍA………………………………..…..………………………... 63 Lista de Abreviaturas i Lista de Abreviaturas A Absorbancia A0 Aceptor de electrones primario del Fotosistema I A1 FiloquinonaI AcOEt Acetato de etilo AgNO Nitrato de Plata ADP Adenosindifosfato ATP Adenosintrifosfato BF3 Trifloruro de Boro CCA Cromatografía en columna abierta CCF Cromatografía en capa fina CCL Complejo de Captación de Luz CF0 Porción lipofílica de la H+-ATPasa CF1 Porción hidrofílica de la H+-ATPasa CG-MS Espectrometría de Masas acoplado a Cromatografía de Gases CHCl3 Cloroformo Chl Clorofila CO2 Dióxido de Carbono Cyt b6f Complejo del citocromo b6f DMSO Dimetil Sulfóxido Fd Ferredoxina FSI Fotosistema I FSII Fotosistema II Lista de Abreviaturas ii HCl Ácido Clorhídrico Hex Hexano HRMN Resonancia magnética nuclear de hidrógeno I50 Concentración a la cual se inhibe el 50 % del parámetro estudiado KCl Cloruro de Potasio KOH Hidróxido de Potasio Λ Longitud de onda MeOH Metanol mL Mililitro M Micromolar mM Milimolar g Microgramo MV Metil Viológeno Na2SO4 Sulfato de Sodio Na2HCO4 Carbonato de Sodio NADP+ Nicotinadenindinucleótido fosfato oxidado NADPH Nicotinadenindinucleótido fosfato reducido NH4Cl Cloruro de Amonio Nm Nanómetro O2 Oxígeno molecular OEC Complejo liberador de oxígeno (Oxigen-envolving complex) P680 Centro de reacción del Fotosistema II P680* Centro de reacción excitado del Fotosistema II Lista de Abreviaturasiii P680+ Centro de reacción oxidado del Fotosistema II P700 Centro de reacción del Fotosistema I P700* Centro de reacción excitado del Fotosistema I P700+ Centro de reacción oxidado del Fotosistema I PC Plastocianina Pheo Feofitina Pi Fosfato inorgánico Ppm Partes por millón PQA Aceptor de electrones primario del Fotosistema II (Plastoquinona A) PQB Aceptor de electrones primario del Fotosistema II (Plastoquinona B) PQH2 Plastoquinol RMN Resonancia magnética nuclear Rpm Revoluciones por minuto UV Ultravioleta Lista de Tablas iv Lista de Tablas Pág. Tabla 1. Especies de Capsicum y Centro de Origen 3 Tabla 2. Algunos herbicidas sintéticos así como su sitio de acción 9 Tabla 3. Ejemplos de aleloquímicos usados como herbicidas 20 Tabla 4. Fracciones obtenidas de la CCA del extracto de n- hexano de C. annuum, así como sus valores de I50 obtenidos en el transporte de electrones fosforilante 38 Tabla 5. Componentes de la fracción Fr12-3 identificados por metilación y comparación con los datos presentes en la Biblioteca NIST MS Versión 2.0 (Espectro de masas LECO modelo PEGASUS) 40 Tabla 6. Cantidad de ácido heptadecanoico en diversos aceites y grasas 42 Tabla 7. Componentes probables de la fracción Fr6 identificados por comparación con los datos de la Biblioteca NIST MS Versión 2.0 (Espectro de masas LECO modelo PEGASUS) 50 Lista de Figuras v Lista de Figuras Pág. Figura 1. Capsicum annuum L. 4 Figura 2. Distribución puntual de C. annuum en México 6 Figura 3 (a). Diagrama esquemático del cloroplasto 13 Figura 3 (b). Micrografía electrónica del cloroplasto 13 Figura 4 (a). Estructura del complejo CF0F1 deducida a partir de estudios cristalográficos y bioquímicos. 17 Figura 4 (b). Modelo de unión y cambio en la síntesis de ATP para el complejo CF1 17 Figura 5. Estructura química de la capsaicina. 21 Figura 6. Plantas de Capsicum anuum después de 25 días. 24 Figura 7. Diagrama de obtención de los extractos. 25 Figura 8. Efecto sobre la germinación, elongación de tallo y raíz de Lolium perenne con los distintos extractos analizados a dos concentraciones diferentes, 25 y 50 ppm. 33 Figura 9. Efecto sobre la germinación y elongación de tallo y raíz de Physalis ixocarpa con los distintos extractos analizados a dos concentraciones diferentes, 25 y 50 ppm. 34 Figura 10. Efecto de los extractos de C. annuum sobre la velocidad de síntesis de ATP. 36 Figura 11. Efecto de los extractos orgánicos de las partes aéreas de C. annuum sobre el transporte de electrones fosforilante. 37 Figura 12. Influencia de los ácidos tridecanoico y heptadecanoico sobre la Síntesis de ATP. 43 Figura 13. Influencia de los ácidos tridecanoico y 44 Lista de Figuras vi heptadecanoico sobre el transporte de electrones fosforilante. Figura 14. Influencia de la mezcla de los ácidos grasos presentes en la fracción 12 sobre el transporte de electrones fosforilante. 45 Figura 15 Efecto sobre la germinación, elongación del tallo y la raíz de Lolium perenne debido a los ácidos tridecanoico y heptadecanoico analizados con cuatro concentraciones diferentes, 50, 100, 250 y 500 μM. 47 Figura 16 Efecto sobre la germinación, elongación del tallo y la raíz de Physalis ixocarpa debido a los ácidos tridecanoico y heptadecanoico analizados con cuatro concentraciones diferentes, 50, 100, 250 y 500 μM. 48 Lista de Espectros vii Lista de Espectros Pág. Espectro 1. Cromatograma de Gases de la Fracción Fr12-3 56 Espectro 2. Espectro de Infrarrojo de la Fracción Fr3 57 Espectro 3. Espectro de Infrarrojo de la fracción Fr10 58 Espectro 4. Espectro de RMN de hidrógeno de la Fracción Fr10 59 Espectro 5. Cromatograma de Gases de la Fracción Fr10 60 Espectro 6. Cromatograma de Gases de la Fracción Fr6 61 Espectro 7. Espectro de RMN de hidrógeno de la Fracción Fr9 62 Resumen 1 RESUMEN En la búsqueda de metabolitos secundarios que afecten la fotosíntesis y el crecimiento de otras plantas, de las plantas de Capsicum annuum con 25 días de crecimiento en invernadero, se obtuvieron tres extractos orgánicos de polaridad ascendente (hexánico, clorofórmico y metanólico) de los cuales, a través de ensayos de cernimiento como el transporte de electrones fosforilante y síntesis de ATP, resultó el extracto orgánico hexánico con efecto desacoplante en la fotosíntesis de cloroplastos aislados de hoja de espinaca. De este extracto, se identificaron por primera vez en C. annuum diferentes ácidos grasos de cadena impar y alcoholes primarios, así como ç-tocoferol, vitamina E y fitonadiona (vitamina K) y el alquino 9-eicosino por medio de un fraccionamiento biodirigido. Los ácidos grasos de cadena impar tridecanoico y heptadecanoico obtenidos de manera comercial de Sigma ®, fueron probados en el transporte de electrones fosforilante mostrando actividad desacoplante y al ser probados en la germinación de plántulas de P. ixocarpa y L. perene no mostraron actividad significativa. Introducción 2 INTRODUCCIÓN El constante aumento del uso de pesticidas incrementan la resistencia de las malezas a ellos y sus efectos tóxicos al medio ambiente (Lotina et al., 2006). Los biocidas desarrollados desde los aleloquímicos tienen importantes ventajas con respecto a los herbicidas, fungicidas o insecticidas comerciales. Los biocidas naturales tienen nuevos modos de acción, alta biodegradabilidad y bajo impacto al medio ambiente. (Rice, 1995). Se ha descubierto que los cereales tienen defensas químicas en contra de las infecciones a hongos, estas defensas también se han encontrado en maíz y arroz (Niemeyer, 1988). En 2003 Noguchi-Tanaka, observó el efecto de la capsaicina sobre la germinación y la elongación de la raíz y de los tallos de cinco semillas distintas; alfalfa (Medicago sativa L.), berro (Lepidium sativum L.), lechuga (Lactuca sativa L.), pasto (Digitaria sanguinalis L.), hierba timotea (Phleum pratense L.) y raigrás (Lolium multiflorum Lam.). Sus resultados mostraron que la capsaicina inhibió la germinación de pasto, hierba timotea y raigrás, así como la elongación de los tallos de todas las semillas (alfalfa, berro, lechuga, pasto, hierva timotea y raigrás), pero principalmente inhibió casi al 100% la elongación de la raíz de todas las semillas antes mencionadas, destacando su mayor efecto sobre las especies monocotiledóneas comparadas con las dicotiledóneas estudiadas. En este trabajo se estudiaron plantas de C. annuum de 25 días de crecimiento en invernadero para obtener metabolitos secundarios que mostraran efecto en la fotosíntesis y en la germinación y la elongaciónde las raíces y los tallos de P. ixocarpa y L. perenne con el objeto de obtener aleloquímicos diferentes a la capsaicina, que pudieran tener efectos biocidas. Antecedentes 3 3. ANTECEDENTES 3.1 Capsicum annuum L. 3.1.1Historia Capsicum annuum pertenece a la familia de las Solanaceas, su nombre común es “Chile” y su fruto es uno de los productos típicos dentro de la cocina mexicana, pues se estima que es el segundo vegetal consumido por la población Mexicana, sólo detrás del tomate (Álvarez et al., 2011). El chile es un producto que tiene su origen en América y fue distribuido a todo el mundo incluyendo África, cuando en 1492 Cristóbal Colón llegó a América creyendo haber llegado a la India. El género Capsicum comprende más de 200 variedades, de las cuales cinco son las especies más importantes mencionadas por los taxónomos: Capsicum bacatum, Capsicum chinense, C. pubescens, C. frutescens y Capsicum annuum. C. annuum L. es la especie con mayor importancia comercial, dentro de la cual se encuentran diferentes variedades como los chiles jalapeño y serrano (longum), piquín (acuminatum), morrón (grossum cylíndricum Batum), entre otros. En la Tabla 1 se muestran las cinco principales especies de C. annuum y su origen. Tabla 1: Especies de Capsicum y Centro de Origen (Codex Alimentarius, 2008) Especies domesticadas Origen Capsicum annuum var. Annuum Capsicum frutescens Capsicum baccatum var. Pendulum Capsicum chinense Capsicum pubescens México y Guatemala Cuenca del Amazonas Zonas bajas de Bolivia Cuenca del Amazonas Los Andes (Perú-Bolivia) Antecedentes 4 3.1.2 Clasificación Taxonómica Reino: Plantae División: Magnoliophyta Clase: Magnoliopsida Familia: Solanaceae Género: Capsicum L., 1753 Especie: C. annuum L., 1753 Figura 1: Capsicum annuum L. 3.1.3 Descripción del género Capsicum Las características de las especies de Capsicum cultivadas y las de origen silvestre son parecidas entre sí, dado que para ambas su fruto es una cápsula o baya lustrosa y más o menos hueca, que generalmente se encuentran verdes en los mercados, pero que adquieren una coloración amarilla o roja si se dejan madurar en la planta. En el caso particular de Capsicum annuum, el fruto es el órgano más estudiado en donde se encontró una oleorresina con contenido de alcaloides como capsaicina, además de otros alcaloides como el metil tetradecil- acetamida, dimetil-N-nitros-amina, N-nitroso-pilorridina, colina y acetil-colina. Otros compuestos encontrados son carotenos como capsantín, capsorubín, alfa, beta, y zeta-caroteno, fitoeno, critoxantín, fitoflueno, violaxantina y zeaxantina entre otros, el sesquiterperno capsidiol, los diterpenos capsianósido E, F, II y III y los triterpenos citostadienol, cicloartenol, ciclioeucalenol, lanosterol, lofenol y sus derivados metilado y etilado, lupeol y obstusifoliol, así como los compuestos Antecedentes 5 fenílicos ácido caféico, clorogénico y cumárico (Atlas de Medicina Tradicional Mexicana, 2009). La planta generalmente se cultiva una vez por año, y cuando crece en el campo el tallo tiene la suficiente fuerza para soportar las partes aéreas, pero en condiciones de invernadero, donde el crecimiento del fruto es más favorable y que muy probablemente crece con mayor tamaño, es necesario el uso de un soporte que ayude al tallo a mantenerse erguido y evitar que las ramas se quiebren. Después de la formación de la flor apical, el tallo se divide en dos o más ramas, parecidas al principal, y normalmente forma un arbusto. Las hojas son de color verde claro a oscuro, de forma oval o elíptica como una punta de lanza. De las hojas de Capsicum annuum, se han aislado el ácido clorogénico, capricósido, el alcaloide esteroidal solanina y tres glucósidos flavonoides de luteolina (Atlas de Medicina Tradicional Mexicana, 2009). Yang y col. en 2008 reportaron que en los tallos de Capsicum annuum el contenido total de flavonoides es 55.2 mg/ 100 g , de los cuales 53 mg son luteolina y 2.2 mg son apigenina (Yang y Lin 2008). Al igual que el tallo, el sistema radicular presenta una raíz principal y una gran cantidad de raíces laterales, la mayoría se encuentran entre los primeros 25 cm del suelo, aunque pueden llegar a una profundidad de 70 cm (FAO, 2002). De la raíz se han aislado las saponinas capsicósidas A-2, A-3, B-2, C-3, E y el funkiósido C. Las flores suelen tener cinco pétalos y pueden ser blancas o verdosas, crecen en la punta de las ramas aunque la mayor parte de las veces crecen en la parte axial de las hojas. 3.1.4 Origen y distribución de Capsicum El chile representa uno de los productos característicos dentro de la gastronomía mexicana, se sabe que desde tiempos prehispánicos ya era de gran importancia económica, pues su consumo iba de la mano del frijol y el maíz. Al pasar de los años su consumo ha ido aumentando, a tal grado que difícilmente se encontrará un platillo mexicano que en su preparación no contenga chile. Antecedentes 6 En Mesoamérica el género Capsicum fue unas de las primeras especies cultivadas, si no es que podemos decir que la primera; esto lo sugieren los hallazgos de restos de chiles que datan de entre 7000 y 5000 años a.C. encontrados en Coxcatlán, Puebla y en Ocampo en Tamaulipas y que presentan características silvestres, mientras que la domesticación llegó en la época prehispánica. Es por esto que se puede afirmar que el género Capsicum es de origen Americano pues en ninguna otra parte del mundo existen evidencias del chile antes de la llegada de los europeos a América, pudo tener origen entre Perú y Bolivia, pero fue domesticado por primera vez en México. El nombre de este vegetal se deriva del náhuatl chilli, modificado por los españoles a chile; en otros países es conocido como pimiento, paprika o ají. En la Figura 2 se muestra la distribución puntual de C. annuum en México, de donde se puede observar que los estados con mayor presencia son Veracruz, Tabasco, Yucatán, Chiapas y el Sur de Tamaulipas. Figura 2: Distribución puntual de C. annuum en México tomada de: http://www.conabio.gob.mx/conocimiento/bioseguridad/SIOVM_Base/Informacion_Externa/Capsicum/cannuu m_mdpun.jpg Antecedentes 7 3.1.5 Producción Mundial A pesar de que el chile tiene su origen en América, y que en México es donde se encuentra la mayor variedad genética de Capsicum, curiosamente a nivel mundial, México no es el mayor productor de chile en el mundo, sino el segundo después de China con una producción de aproximadamente el 12% del total de toneladas que China produce (datos de 2008). En 2007 China produjo 14,033,000 toneladas de chile verde, mientras que México en ese año tuvo una producción de 1,690,000toneladas, finalmente le siguen en producción Turquía, Indonesia, Estados Unidos y España 3.1.6 Producción Nacional Para el caso específico de México, como se mencionó, aunque figura en la lista como el segundo productor a nivel mundial, su producción es poca para el consumo interno, la demanda de chile que se tiene en el país es muy grande, es por esto que México es obligado a importar chiles de otros países. Casi todos los tipos de chile cultivados en México, pertenecen a la especie Capsicum annuum, Var. annuum, las excepciones son el chile habanero (C. chinense) y el chile manzano (C. pubescens) (Aldama Rojas). En México el organismo encargado de la regulación de la producción del chile, es la Conaproch; según datos de este organismo, el principal estado productor de Capsicum annuum es Chihuahua, con más del 35% de la producción nacional. De los chiles de mayor producción son el chile jalapeño en primer lugar, seguido del serrano, morrón, poblano y chilaca. Antecedentes 8 3.1.7 Usos Sin lugar a dudas el principal uso que se le da al fruto del chile es para la elaboración directa de platillos, ya sea fresco o seco, es rico en vitamina C, sin embargo, existen otros usos poco menos comunes: En la industria de los aditivos, se utiliza para darle color a los alimentos, cuyo uso está menos restringido, por ser un producto natural. Se utiliza como colorante para la elaboración de salchichas, salamis, quesos, botanas, entre muchos otros. Por otra parte, la planta, en el Atlas de plantas de la Medicina Tradicional Mexicana, se describe su uso para tratar desde enfermedades culturales, hasta padecimientos más complejos. En Oaxaca y Veracruz, se utiliza para tratar “mal de ojo”, ojeaduras, vergüenza y tristeza, pero principalmente se utiliza para el “mal de aire”. Las hojas pueden hervirse con agua y después beberse para aliviar las enfermedades de los riñones. También se emplea en el tratamiento de la dispepsia, diarrea y dolor de oído, para atender padecimientos de la piel, como “chincual de criatura”, erisipela y heridas, además de utilizarse como antiséptico y analgésico En veterinaria se le emplea para atender el gabarro, aftas y estomatitis (Atlas de Medicina Tradicional Mexicana, 2009). 3.2 Maleza Maleza se les denomina a todas aquellas plantas que crecen en sitios donde no son deseadas. En los cultivos compiten por los nutrientes, agua y luz, además de ser hospederos de plagas y enfermedades, reduciendo la calidad del producto e interfiriendo en las labores de cosecha (González, 2007). De manera general, se acepta que las malezas ocasionan una pérdida directa de 10 % de la producción agrícola. Los métodos empleados para el control de malezas o para reducir su infestación a un determinado nivel, son los siguientes (Labrada y Caseley, 1996): Antecedentes 9 Métodos preventivos: Incluyen los procedimientos de cuarentena para minimizar la introducción, establecimiento y diseminación de malezas hacia nuevas áreas. Métodos físicos: Arranque manual, corte con machete u otra herramienta y labores de cultivo. Métodos culturales: Rotación de cultivos, preparación del terreno, uso de variedades competitivas, distancia de siembra o plantación, cultivos intercalados o policultivo y manejo del agua. Control biológico: Empleo de enemigos naturales específicos para el control de especies de malezas. Control químico: Uso de herbicidas. Se describe con mayor profundidad a continuación. 3.3 Herbicidas La palabra herbicida se deriva del latín herba, planta y caedere, que significa matar. Por ello, son productos destinados a la destrucción de malezas que afectan a una gran variedad de cultivos en el mundo, alterando la fisiología y/o crecimiento de la planta llevándola a la muerte. En general, podemos clasificar a los herbicidas de acuerdo a su uso, sus propiedades químicas y su modo de acción. Dependiendo de su sitio de acción, los herbicidas se pueden clasificar como se muestra en la tabla 2. Tabla 2: Algunos herbicidas sintéticos así como su sitio de acción. Compuesto Sitio de acción Triazinas de azufre FS II (Esser et al., 1975). Diquat y Paraquat (MV) FS I (Calderback et al .,1976). Bijiridilo Compite con los aceptores de electrones del FSII (Campbell et al.,2004). Atrazina Oxidación de agua (Campbell et al.,2004). Diuron Transferencia de electrones a plastoquinona (Campbell et al.,2004). Antecedentes 10 Ariloxifenoxipropionatos Acetil-CoA carboxilasa (Cobb et al., 2000). Glifosfato EPSP sintasa (Franz et al., 1997). Sulfonil ureas Acetolactato sintasa (Beyer et al., 1998). Amit Biosíntesis de clorofila (Campbell et al.,2004). Leptospermona Síntesis de plastoquinonas (Campbell et al.,2004). Gabaculin Síntesis de carotenoides (Campbell et al.,2004). Tiolactomicin Síntesis de lípidos (Campbell et al.,2004). Dependiendo de la etapa en la cual se aplica el herbicida en el cultivo, los herbicidas se clasifican como: herbicida pre-siembra, que se refiere a su aplicación cuando aún no se ha sembrado el cultivo, herbicidas pre-emergentes, son aquellos que actúan una vez que se ha sembrado el cultivo pero este aún no emerge como tampoco la maleza, un ejemplo de ellos, son las Anilinas, las cuales generan una capa fina sobre el suelo y que al momento de que se lleve a cabo la germinación de la planta, ésta entra en contacto con dicho herbicida interrumpiendo su crecimiento así como el desarrollo del sistema radicular; estos herbicidas pueden persistir de 3 a 6 meses. Los herbicidas post-emergentes, se aplican sobre los cultivos y las malezas que ya brotaron, ejemplo: el Ioxinil, que se absorbe por vía foliar y también interfiere en la fotosíntesis. Se aplica contra malezas dicotiledóneas. Por su tipo de absorción, se pueden clasificar en herbicidas de contacto que son aquellos que actúan sobre el sitio en donde entran en contacto con las plantas, afectando así sólo las partes aéreas de ésta, observándose necrosis o clorosis que son características que se observan fácilmente, un ejemplo de ellos es el Bromoxini. Los herbicidas sistémicos, son aquellos que se aplican directamente a la tierra penetrando desde la raíz y tallo de la planta y que no sólo tendrán efecto sobre el primer cultivo, sino también tendrán efecto sobre cultivos posteriores, puesto que tienen un efecto residual como ejemplo, los Carbamatos.- Antecedentes 11 Esta es una familia de compuestos, se encuentran herbicidas como: Asulam, Desmedifam, Molinato y Prosulfocarb. que son compuestos que se absorben por vía radicular, además el Asulam también se absorbe a través de las hojas. Estos compuestos se transportan a través de la savia hacia los meristemos, provocando la muerte de la planta en un intervalo de 1 a 3 meses, en las especies sensibles a ellos, de las cuales destaca el grupo de las gramíneas. Sin embargo hasta hace algunos años esto era contraproducente, pues en el intento por lograrlo, también los cultivos se veían afectados, es ahora que se están utilizando herbicidas que sean selectivos con las plantas. 3.4 Fotosíntesis El oxígeno (O2) es el principal elemento para que exista la vida en este planeta. Pero, ¿y de dónde se obtiene este preciado elemento? La respuesta es: Através de la fotosíntesis. Ese proceso lo llevan a cabo las plantas superiores, algunas algas y cianobacterias y dan como resultado la producción de O2 y carbohidratos, siendo éstos últimos la fuente de energía de las plantas y los animales. La fotosíntesis en plantas superiores se lleva a cabo en sus hojas, y es un proceso que exige la presencia de un fotón proporcionado por el sol para poder dar inicio. La reacción general de la fotosíntesis es: CO2 + H2O luz O2 + [CH2O] donde [CH2O] representa un carbohidrato en general. Sin embargo, la fotosíntesis engloba dos procesos importantes descritos en dos reacciones parciales (Horton, 1995). H2O + ADP + Pi + NADP+ luz O2 + ATP + NADPH + H+ CO2 + ATP + NADPH + H+ [CH2O] + ADP + Pi + NADP+ CO2 + H2O luz O2 + [CH2O] Antecedentes 12 El primer proceso comprende una serie de pasos denominados reacciones luminosas, que mediante la oxidación fotoquímica del H2O, debida a la energía de la luz solar, dará paso a dos cosas, la primera es la reducción del agente oxidante NADP+ a NADPH, produciéndose así equivalentes reductores y O2. Y por otro lado, la energía de la luz se captura y se transforma mediante la fosforilación del ADP a ATP. A este proceso se le denomina foto fosforilación. El segundo proceso, son las denominadas reacciones oscuras, que se denominan así porque no requieren la presencia de luz para poder llevarse a cabo, pero eso no implica que se lleven a cabo en la oscuridad, o que se lleven a cabo en la noche como se pensaba; de hecho ambas reacciones se llevan a cabo en todo momento pero se aceleran con la presencia de luz (Mathews, 2002). En las reacciones oscuras, el ATP y NADPH productos de las reacciones luminosas, se utilizan para la biosíntesis reductora de los hidratos de carbono a partir de CO2 y H2O. El dióxido de carbono de la atmósfera se combina con un azúcar de cinco carbonos para producir, a través de un intermediario, dos azucares de tres carbonos y posteriormente la molécula de glucosa de seis carbonos. 3.4.1 El Cloroplasto Tanto en las cianobacterias como en los procariontes, la fotosíntesis se lleva a cabo en los gránulos enlazados con la membrana plasmática, mientras que los eucariontes realizan la fortosíntesis en el cloroplasto (Figura 3). Antecedentes 13 Figura 3. Cloroplasto. (a) Diagrama esquemático. (b) Micrografía electrónica (Modificada de Nelson y Cox, 2009). La estructura del cloroplasto consta de una membrana externa ligeramente permeable y una membrana interna con una permeabilidad selectiva. La membrana interna encierra un material denominado estroma, sitio en el cual se llevan a cabo las reacciones de la fase oscura de la fotosíntesis. En el estroma se encuentran inmersas múltiples estructuras membranosas, en forma de sacos planos llamados tilacoides, formados por una membrana, llamada membrana tilacoidal donde se llevan a cabo las reacciones de la fase luminosa de la fotosíntesis con la formación de ATP y NADPH; al espacio interno de esta membrana se le denomina luz del tilacoide o lumen tilacoidal. Los tilacoides se encuentran apilados uno sobre otro, formando estructuras llamadas grana. Las granas individuales se encuentran interconectadas a través de extensiones de los tilacoides llamadas lamelas. Para capturar la energía luminosa, los organismos fotosintéticos han desarrollado un conjunto de pigmentos que absorben de manera eficaz la luz visible e infrarroja próxima. Las partes de los pigmentos que absorben la luz, se denominan cromóforos y absorben a longitudes de onda específicos. Los pigmentos más abundantes en las plantas superiores son la clorofila a y la clorofila b. Dado que absorben la luz del azul oscuro y del rojo, la luz que no se absorbe y que por tanto se refleja por los cloroplastos es verde. La pérdida de clorofila de las hojas en otoño, hace que se observen los colores de los pigmentos accesorio, como el β-caroteno y la ficocianina (Mathews, 2002). (a) (b) Antecedentes 14 La clorofila y algunos pigmentos accesorios, están contenidos en las membranas tilacoidales del cloroplasto, además en estas membranas también se encuentran una gran cantidad de proteínas, y algunos de los pigmentos fotosintéticos están unidos a estas proteínas, sin embargo las clorofilas a y b, sólo presentan una interacción. Los ensamblajes de los pigmentos de captación de luz dentro de la membrana, así como sus proteínas asociadas, están organizadas en dos Fotosistemas, el Fotosistema I (FS I) y el Fotosistema II (FS II), que son las unidades funcionales de las reacciones dependientes de la luz de la fotosíntesis. La tarea de estos Fotosistemas es absorber fotones y transformarlos en energía química. Los primeros pasos de la fotosíntesis empiezan con la captación de la energía luminosa por los complejos de clorofila, enviándola a un par de moléculas especializadas de clorofila que actúan como centros de reacción atrapando los cuantos de energía excitados por la absorción de la luz. Los centros de reacción de los FSI y FSII se llaman P700 y P680 (P por pigmento y 700 y 680 son las longitudes de onda () a las que absorben al máximo la luz). 3.4.1.1 Fotosistema II Al absorberse un fotón por el sistema de captación de la luz del FSII, este es conducido en forma de excitón a una clorofila del centro de reacción, P680. La excitación de P680 hace pasar a la molécula del estado basal a un estado excitado P680*, así P680* pasa a ser un excelente agente reductor transfiriendo rápidamente un electrón a un aceptor electrónico primario de menor energía, la feofitina a Pheo-. A este proceso se le conoce como separación de cargas. P680 + 1 excitón P680* Excitación P680* + Pheo P680+ + •Pheo- Separación de cargas Antecedentes 15 El electrón de la Pheo- se transfiere a continuación a una serie de moléculas de aceptores de electrones, plastoquinonas (PQA y PQB), asociadas con las proteínas del FSII. Finalmente, dos electrones y dos protones, estos últimos provenientes del estroma, son captados por la plastoquinona PQB, formando la plastoquinona reducida, PQH2 (plastoquinol) que se libera a la porción lipídica de la membrana tilacoidal. 2(•Pheo-) + 2H+ + PQB 2Pheo + PQBH2. La reacción global iniciada en el Fotosistema II, es por lo tanto: 4P680 + 4fotones + 4H+ + 2PQB 4P680+ + 2PQBH2 El plastoquinol interacciona con el complejo citocromo b6f, que cataliza la transferencia de los electrones a una cuproproteína, la plastocianina (PC). Así, el complejo b6f realiza dos funciones, transferir electrones activados del Fotosistema II al Fotosistema I a través de la plastocianina, al mismo tiempo que se bombean protones del estroma a la luz del tilacoide, dejando a P680 con un déficit de electrones, P680+, que recupera del agua, que se fragmenta en presencia de un aceptor electrónico, liberando oxígeno. Este aceptor electrónico es una proteínaque contiene un grupo de cuatro átomos de manganeso puenteados con oxígeno, llamado también complejo liberador de oxígeno (OEC por sus siglas en inglés), lo que da como resultado que fluyan cuatro electrones de vuelta a P680 y se liberen los cuatro protones acompañantes a la luz del tilacoide. Sin embargo, los protones de las moléculas de agua aún no han alcanzado su destino final, que es la formación de NADPH. Este proceso es tarea del Fotosistema I. 3.4.1.2 Fotosistema I Una vez reducida la plastocianina, P700 se energiza a P700*, por la excitación de un fotón absorbido por la clorofila antena y llevándolo a P700, así P700* libera Antecedentes 16 un electrón, una segunda separación de cargas. Este electrón pasa a través de una cadena de transporte electrónico; primero es captado por un aceptor clorofílico (denominado A0), luego se transfiere a una molécula de filoquinona (A1) y por último se transporta por una serie de tres proteínas hierro-azufre (FX, FB y FA) a una pequeña proteína de hierro-azufre que se denomina ferredoxina (Fd), la cual se encuentra en el estroma del cloroplasto. El bajo potencial de reducción de la ferredoxina le permite reducir con facilidad el NADP+ a NADPH. Esta reducción es catalizada por la ferredoxina-NADP+ oxidorreductasa. La formación del NADPH, completa la secuencia no cíclica del transporte de electrones. 3.4.1.3 Producción de ATP por un gradiente de protones Tres etapas diferentes en la cadena fotosintética del transporte de electrones, cambian la distribución de los protones entre el estroma y el lumen del tilacoide. Primero, los protones del agua son liberados dentro del lumen del tilacoide por el complejo OEC. Segundo, los protones del estroma son liberados dentro del lumen durante la oxidación de PQH2 por el complejo del citocromo b6f (Cyt b6f). Tercero, la captación de un protón durante la reducción del NADP+ disminuye la concentración de protones en el estroma, generando un gradiente protónico a través de la membrana tilacoidal, de tal manera que el lumen pasa a ser más ácido que el estroma. La ATP sintasa fijada a la membrana tilacoidal y en presencia de un gradiente de protones transmembranal, cataliza la formación de ATP a partir de ADP y P i. Debido a que este proceso en las plantas es dependiente de la luz, la formación de ATP se denomina fotofosforilación. La ATP sintasa de los cloroplastos es un complejo multiproteico similar a su contraparte en las mitocondrias, en que ambas constan de dos componentes importantes, en el tilacoide son CF0 y CF1. CF0 es una proteína integral de membrana, enclavada en la membrana tilacoidal y forma un canal para los protones. CF1 es una proteína periférica del estroma, unida a CF0, y cataliza la formación de ATP a partir de ADP y Pi (Figura 4a) Antecedentes 17 El ADP y el Pi se condensan fácilmente para formar ATP en la superficie de la enzima, si bien la enzima requiere una fuerza protón motriz, la liberación del ATP ligado a la catálisis rotacional ocupa secuencialmente cada una de las tres subunidades de la ATP sintasa, la síntesis de ATP, la liberación de ATP y la unión de ADP y Pi (Figura 4b). Figura 4: Estructura del complejo CF0F1 deducida a partir de estudios cristalográficos y bioquímicos (a). Modelo de unión y cambio en la síntesis de ATP para el complejo CF1 (b) ( 2009 Nelson y Cox 2009). El ATP y el NADPH que se producen en las reacciones luminosas son usados en las reacciones oscuras, que ocurren en el estroma de los cloroplastos, su función es fijar el CO2 atmosférico y transformarlo en carbohidratos. La fijación del CO2, se realiza mediante su unión a una molécula aceptora (ribulosa-5-fosfato) a través de una serie de reacciones cíclicas conocidas como ciclo de Calvin. 3.4.1.4 Reacción de Hill En 1937, Robert Hill descubrió que al iluminar cloroplastos en ausencia de CO2 y en presencia de un aceptor de electrones artificial como puede ser (b) (a) CF1 CF0 Antecedentes 18 ferricianuro, se produce O2 con la reducción concomitante del aceptor a ferrocianuro. Con esta reacción se demuestra que el oxígeno producido en la fotosíntesis no proviene del CO2 aún cuando sí hay un proceso redox involucrado. La reacción de Hill, es la foto reducción de un aceptor de electrones a expensas de agua y es una herramienta experimental útil para encontrar nuevos o potenciales agentes herbicidas (Trebs, 1972). H2O + aceptoroxid ½ O2 + aceptorred 3.4.2 Desacoplantes La mayoría de los desacoplantes son ácidos débiles, lipofílicos, los cuales en su forma iónica atraviesan la membrana tilacoidal tomando protones tanto del medio interno como externo. Una vez protonados, éstos pasan nuevamente a través de la membrana del tilacoide donde liberan el protón mediante disociación. Muchos desacoplantes, incluyendo el CCCP (carbonil cianuro m-clorofenilhidrazona), son ácidos débiles solubles en lípidos que disipan el gradiente de protones. Otros compuestos que disipan el gradiente de protones son los ionóforos como la gramicidina que forma un canal transmembranal acuoso, a través del cual pasan los protones y otros pequeños iones sin ser un acarreador (Mc Carty, 1980). 3.5 Alelopatía Alelopatía comúnmente se define como aquellos efectos perjudiciales o benéficos, estimulatorios o inhibitorios, mediada por un compuesto químico liberada al medio ambiente por una planta o microorganismo dado (Rice, 1984). A estos compuestos también se les conoce como metabolitos secundarios. h Cloroplastos Antecedentes 19 3.6 Metabolitos secundarios Los metabolitos secundarios son aquellos compuestos que los organismos producen a través de diversas rutas biosintéticas, no son vitales para la supervivencia del organismo que los posee, sin embargo juegan un papel importante en su defensa, competencia y adecuación. Así el metabolito secundario surge de la necesidad intrínseca de los organismos para responder a las exigencias del medio ambiente ( Hartmann 2007). De acuerdo con Whittaker (1970) y Whitttaker y Finney (1971), muchos aleloquímicos son metabolitos secundarios, no todos están presentes en los organismos vivos ya que aparecen en forma esporádica. La producción de aleloquímicos es promovida por estrés biótico y abiótico. Los aleloquímicos son conocidos como metabolitos secundarios debido a que se obtienen a través de la derivación de las principales rutas metabólicas de carbohidratos, grasas y aminoácidos. Es un hecho conocido que las sustancias alelopáticas son inducidas por estreses ambientales tales como el ataque de patógenos, heridas o alta luz/UV. Los compuestos alelopáticos pueden ser liberados de las plantas al ambiente por medio de la exudación de las raíces, lixiviación, volatilización y descomposición de los residuos de las plantas en el suelo. Estos compuestos son fenólicos, terpenos, ácidos grasos de cadena larga y ácidos simples (Kil-Ung y Dong-Hyun, 2004). Han sido de especial atención aquellos aleloquímicos que suprimen o eliminan especies de plantas competitivas, debido a su potencial como herbicidas naturales y selectivos. En la tabla 3, se muestran ejemplos de aleloquímicos usados como herbicidas,así como su origen, estructura y sitio de acción. Antecedentes 20 Tabla 3: Ejemplos de aleloquímicos usados como herbicidas Herbicida Referencia Origen Estructura Sitio de acción Sorgoleone (Benzoquinona) Vyvyan, 2002, Czarnota, M.A., et al., 2001 Shorgum sp. O O OH O CH3 O CH2( ) 7 Síntesis de clorofila Transporte de electrones en FS II Brevionas A (Terpenoide) Vyvyan, 2002 Penicillium brevicompact um CH3 O CH3CH3 O O CH3 CH3 O CH3 CH3 Crecimiento de plántulas Triticum sp. Tambulina (Flavonoide) Vyvyan, 2002, Macías et al., 1997 Helianthus annus O CH3 OOH O CH3 O CH3 O CH3 Crecimiento de raíz de plántulas Lycopersicon esculentum y Hordeum vul. 3.7 Antecedentes previos de los efectos alelopáticos de Capsicum annuum sobre otras plantas. La capsaicina (Figura 5) es el principal metabolito responsable de la pungencia del chile, es el capsaicinoide que se encuentra en mayor proporción en el fruto de C. annuum, y es un aleloquímico. Kato-Noguchi-Tanaka en 2003, observó la inhibición de la capsaicina sobre la germinación y elongación de raíz y tallos de cinco semillas distintas (alfalfa (Medicago sativa L.), berro (Lepidium sativum L.), lechuga (Lactuca sativa L.), pasto (Digitaria sanguinalis L.), hierba timotea (Phleum pratense L.) y raigrás (Lolium multiflorum Lam.)), el efecto mayor es la inhibición de la elongación de la raíz de todas las semillas; destacando su Antecedentes 21 mayor efecto sobre las especies monocotiledóneas comparadas con las dicotiledóneas estudiadas. Figura 5: Estructura química de la capsaicina No obstante, los capsaicinoides no son exclusivos del fruto de la planta de C. annuum, pues también se encuentran aunque en menor proporción en sus tallos y hojas, siendo que en estas últimas partes aéreas la dihidrocapsaicina es más abundante que la capsaicina, contrario a la proporción encontrada en fruto. Sin embargo también se observó que las plantas a las cuales se les removieron las flores para impedir que el fruto brotara, los capsaicinoides no se encontraban presentes, concluyendo entonces, que los capsaicinoides se producen a partir de la formación del fruto (Estrada et al., 2002). Tsuchiya y colaboradores en 1994, estudiaron los efectos de los extractos de las diferentes partes de la planta (tallo, hojas y raíz) del pimiento rojo sobre la germinación de este mismo, se analizaron los extractos metanólicos de raíz, tallo y hojas, así como los extractos acuosos, las fases cloroformo-agua y fenólicos de la raíz, encontrando que la germinación de las semillas no se afectaba, sin embargo las longitudes de las radículas e hipocotilos disminuyeron, por lo que sugirieron que los compuestos fenólicos como el ácido vinílico y el ácido p-hidroxibenzoico entre otros, presentes en los extractos de raíz fueran los responsables de dicha actividad. En el trabajo de Zamin y col., 2005), al analizar los efectos de lixiviados de Capsicum annuum sobre la germinación, crecimiento de las plántulas y la acumulación de la clorofila en Vigna radiata, observaron que estos lixiviados inhiben la germinación y el crecimiento de las plántulas, siendo más afectada la elongación de la raíz, además de observarse una disminución de la clorofila, debida a la inhibición de la biosíntesis de ésta. Cabe resaltar que los lixiviados se obtuvieron desde la etapa de crecimiento hasta la fructificación. Hipótesis 22 3. HIPÓTESIS Si los extractos orgánicos de las partes aéreas de C. annuum cosechadas antes de la formación de la flor apical, inhiben la fotofosforilación y/o germinación de los tallos y las raíces de L. perenne y P. ixocarpa entonces será posible la obtención de metabolitos secundarios distintos a la capsaicina con posible actividad herbicida. Objetivos 23 4. OBJETIVOS 4.1 OBJETIVO GENERAL Aislar metabolitos secundarios con posible actividad herbicida a partir de extractos obtenidos de Capsicum annuum a través de un fraccionamiento biodirigido. 4.2 OBJETIVOS PARTICULARES Obtención de los extractos, fracciones y/o compuestos de las partes aéreas de Capsicum annuum y evaluar en los mismos los siguientes efectos: Actividad pre-emergente. Medición de la germinación, elongación de los tallos y las raíces de dos semillas mono y dicotiledóneas (P. ixocarpa y L. perenne). Velocidad de transporte d electrones fotosintético. Determinar la estructura química de los compuestos activos, mediante el uso de técnicas espectroscópicas y espectrométricas. Desarrollo Experimental 24 6. DESARROLLO EXPERIMENTAL 6.1 Obtención del material vegetal. Se compraron semillas de Capsicum annum de la marca Itsco (bajo licencia de: Lone Star Seed Co., Inc. 119 W. La Chapelle st. San Antonio, Tx. 78204-1944 USA). El sustrato empleado fue una mezcla de tierra negra, agrolita y peat moss (fertilizante de origen orgánico) en una proporción 2:1:1, el cual se esterilizó en un autoclave a 120°C con una presión de 1.5 atm durante 20 min. Las semillas de Capsicum annuum se lavaron con una solución de hipoclorito de sodio al 10% durante 15 minutos y posteriormente fueron enjuagadas con agua desionizada y estéril tres veces. En 20 charolas de plástico de 40 x 25 cm se vertió la tierra y se esparcieron las semillas al azar, las cuales fueron cubiertas con más tierra. Las charolas permanecieron en un invernadero con una temperatura promedio de 25 °C, y con un sistema de irrigación cada tercer día durante 25 días, después de los cuales las plantas fueron cosechadas a nivel del suelo. El tamaño promedio de las plantas era de 10 cm (Figura 6). Figura 6: Plantas de Capsicum annuum después de 25 días. Desarrollo Experimental 25 6.2 Obtención de los extractos Las plantas se dejaron secar a temperatura ambiente durante 15 días, tras los cuales se pulverizaron con una licuadora (Modelo L-21, Osterizer). Se tomaron 2 g de pulverizado y se transfirieron a un matraz Erlenmeyer con 50 mL de hexano, se dejó macerar durante 48 horas y después se filtró el extracto y se concentró a presión reducida en un rotavapor Laborota 4002, el pulverizado restante se dejó secar. Una vez seco, se le agregaron 50 mL de cloroformo y se maceró por 48 h, se concentró y se repitió como con el extracto hexánico, nuevamente se dejó secar el pulverizado y por último se agregaron 50 mL de metanol repitiéndose el mismo procedimiento como con los dos extractos anteriores, obteniendo así tres extractos con diferente polaridad (Figura 7). De cada uno de los extractos obtenidos se pesaron 10 mg, se disolvieron en 1 mL de dimetil sulfóxido (DMSO) y se almacenaron en refrigeración para las pruebas posteriores. 2 g de material vegetal Extracto hexánico 50 ml hexano (48h) Material vegetal 50 ml metanol (48h) Material vegetal Extracto metanólico50 ml cloroformo (48h) Extracto clorofórmico Material vegetal Figura 7: Diagrama de obtención de los extractos. Desarrollo Experimental 26 6.3 Germinación Para medir el efecto de cada uno de los extractos sobre la germinación de semillas de tomate (P. ixocarpa) y pasto (L. perenne), 30 semillas de cada especie se seleccionaron manualmente descartando las dañadas, después, se lavaron con una solución de hipoclorito de sodio al 10% y se enjuagaron tres veces con agua desionizada y estéril. Se sembraron 30 semillas de cada especie en cajas petri de 9cm de diámetro con papel filtro (previamente esterilizadas) y 10 ml de solución con diferentes concentraciones de los extractos (25, 50 y 75 ppm), usando una solución de DMSO como control. Las cajas se sellaron y se dejaron germinar durante 5 días (3 días para la germinación y dos más para el crecimiento del tallo y la radícula) a 27°C en una cámara de crecimiento marca WTC Binder en la oscuridad. Posteriormente se midió la elongación de tallo y raíz así como el índice de germinación (relación entre el número de semillas que muestran emergencia de la radícula y las semillas totales). 6.4 Aislamiento de cloroplastos de hojas de espinaca (Spinacea olereaceae L.) Nota: La siguiente metodología se realizó en condiciones de obscuridad y a 4 ºC. Para hacer el aislamiento de cloroplastos de hojas de espinaca (Spinacea olereaceae L.), se seleccionaron las hojas que no estaban maltratadas, rotas o amarillas. Se les retiró la nervadura y el ápice, se cortaron en fragmentos pequeños y se colocaron en una licuadora con medio de aislamiento de cloroplastos (Apéndice 1), se trituraron a una velocidad baja no dañar los cloroplastos. Posteriormente el homogenizado se filtró a través de 8 capas de gasa simple y se recibió el filtrado en tubos de centrífuga. Se centrifugaron durante 5 min a 4000 rpm, empleando una centrífuga de mesa con refrigeración, Modelo Sorval Super T21, DUPONT, se decantó el sobrenadante y el pellet de todos los tubos se resuspendió en 2 mL de medio de aislamiento, la suspensión se mantuvo en la oscuridad y a 4 °C. Desarrollo Experimental 27 Una vez aislados los cloroplastos, se llevó a cabo la cuantificación de clorofila. Para ello, en 2 matraces aforados de 5 mL, se colocaron 20 L de la suspensión de cloroplastos y se aforó con acetona al 80%. Los matraces se dejaron en hielo durante 5 min, transcurrido este tiempo, el sobrenadante se centrifugó en una centrifuga clínica (Modelo EBA 8S Hettich) a 4000 rpm por 5 minutos. El contenido de clorofila se cuantifico mediante el método de Arnon (Arnon, 1949) a dos longitudes de onda, 663 y 645 nm utilizando un espectrofotómetro Beckman modelo DU650. El blanco utilizado fue acetona al 80%. La concentración de la clorofila se calculó con la siguiente fórmula: Dónde: [Clorofila] = concentración de clorofila en µg por cada mL de suspensión de cloroplastos 8.05 y 20.29 = Constantes establecidas de manera experimental a partir de los coeficientes de extinción para cada longitud de onda. A = Absorbancia. 6.5 Medición de la Síntesis de ATP En una cubeta de reacción se colocan 3 mL de medio Bomba (Apendice 1), 1 mM de ADP, 3 mM de fosfato inorgánico (Pi), se ajusta el pH entre 8.0 y 8.05 empleando KOH y/o HCl, y se agregan los cloroplastos (20g de clorofila/mL de medio). La cubeta de reacción se ilumina durante 3 min empleando una lámpara de halógeno y un filtro de solución de sulfato de cobre al 2 %, control; los extractos se ensayan a diferentes concentraciones (25, 50, 100, 150 y 200 ppm), y se emplea como control negativo 6 mM de NH4Cl. La síntesis de ATP fue determinada por los cambios de pH medidos por un electrodo marca Orion Mod. Ross 8103 conectado a un potenciómetro Coming, Mod. 12. con escala expandida (Dilley 1972, Jiménez et al., 1998), y registrados por un aparato marca Kipp and Zone. Desarrollo Experimental 28 Los cambios de pH registrados son la medida indirecta de la síntesis de ATP de acuerdo a la siguiente ecuación: [Mg·ADP]ˉ + PO42+ +H+ [Mg·ATP·H]2- Éste es un método simple que provee una medida real de la síntesis o de la hidrólisis de ATP. La técnica es por lo tanto adecuada para determinar la velocidad de hidrólisis de ATP y para efectuar estudios cinéticos de este proceso (Hipkins y Baker, 1986). 6.6 Medición de la velocidad del transporte de electrones Para medir la velocidad del transporte de electrones fotosintético no cíclico (transporte basal), se colocó en una cubeta de reacción 3 mL de medio de transporte de electrones con Metil Viológeno (Apendice 1), 60g de clorofila y los extractos a diferentes concentraciones (25, 50, 100, 150 y 200 ppm), empleando DMSO como control; la cubeta de reacción se ilumina durante 3 min con una lámpara de halógeno, y un filtro de solución de sulfato de cobre al 2 %. En esta metodología se monitorean los cambios en el consumo de oxígeno a través de un electrodo tipo Clark conectado a un oxímetro marca YSI Mod. 5300A Para la determinación del transporte de electrones fosforilante, se utilizó el mismo medio que para el transporte basal más 3 mM de ADP y 3mM de Pi. Para la medición del transporte de electrones desacoplado se midió de la misma forma que el transporte basal, con la diferencia de que se agregaron a la cubeta de reacción 6 mM de NH4Cl como desacoplante (Calera et al, 1995; Saha et al 1971). 6.7 Fraccionamiento del extracto hexánico por cromatografía de columna abierta Las partes aéreas de las plantas de chile cosechadas (72g) fueron deshidratadas y pulverizadas y sometidas a maceración exhaustiva con hexano a Desarrollo Experimental 29 temperatura ambiente, el disolvente fue eliminado a presión reducida empleando un rotaevaporador Laborota 4002. Para eliminar la mayor cantidad de pigmentos posibles en el extracto de n- hexano seco (1.6 g), se disolvió de nuevo en hexano, se le agregó carbón activado; esta suspensión se filtró a presión reducida empleando papel Whatman número 1 y una cama de celita, el filtrado se llevo nuevamente a sequedad. Se montó una columna de cromatografía empleando gel de sílice para columna 60 Merck tamaño de malla de 0.0063-0.200 nm y un sistema de elución con un gradiente de polaridad ascendente hex:AcOEt y finalmente acetona. Se tomaron eluatos de 100 mL, y el contenido fue monitoreado por medio de cromatografía en capa fina (CCF), utilizando placas de aluminio recubiertas con gel de sílice de 0.25 mL de espesor (sílice gel 60 F254, Merck), visualizadas con luz UV (onda corta 254 nm y onda larga 366 nm) y se revelaron utilizando sulfato cérico amoniacal como agente cromógeno (Apéndice 1); para el desarrollo de color, las placas se colocaron en una parrilla eléctrica (100 °C 5 minutos). Los eluatos con composición similar se mezclaron. 6.8 Obtención de las sales del extracto metanólico El extracto de metanol seco (7g), se disolvió empleando la menor cantidad de metanol caliente (60°C), la suspensión resultante se filtró por gravedad empleando papel filtro. Los cristales obtenidos se lavaron con metanol caliente (60°C) y se dejaron secar. 6.9 Prueba de cloruros Para esta prueba, se preparo una disolución 0.1 M de nitrato de plata; se colocó una pequeñamuestra de la sal en un tubo de ensaye, y se le agregaron Desarrollo Experimental 30 gotas de la disolución de AgNO3, la formación de un precipitado blanquecino es indicativo de la presencia de cloruros (Sierra et al., 2007). 6.10 Perlas de Borax Se pesó 1 g de los cristales y se pulverizaron en un mortero. Para la formación de las perlas, se calentó un asa bacteriológica al rojo vivo empleando un mechero de Bunsen, posteriormente se sumergió en el polvo de bórax y se colocó nuevamente a la flama para la formación de la perla. Una vez formada la perla, ésta se sumergió en el pulverizado de la muestra y de inmediato se colocó nuevamente a la flama y se observó su color (Gómez, 2006). 6.11 Caracterización de las muestras Las fracciones y cristales obtenidos se caracterizaron por métodos espectroscópicos y espectrométricos (RMN, CG-EM, IR) llevados a cabo en la Unidad de Servicios y Apoyo a la Investigación (USAI) Facultad de Química UNAM, además del análisis elemental y punto de fusión. 6.12 Reacción de Metilación 20 mg de la mezcla de ácidos grasos y 2 mL de KOH al 5% en metanol se colocaron en un tubo con tapón de rosca, agitándose durante un minuto en un vortex, luego se colocó en baño María a 80°C durante 1 h. La muestra se dejó enfriar y se agregaron al tubo 10 mL de HCl al 5% en Metanol y 100L de BF3 (trifloruro de boro), se colocó nuevamente en baño María a 80 °C durante 1h. Al producto de la reacción se le agregaron 4 mL de agua destilada, 2 mL de una mezcla tolueno-hexano (80:20) y se agitó durante 1 min. La fase orgánica se extrajo con 4 mL de agua y 2 mL de la mezcla tolueno-hexano. El extracto orgánico se secó con Na2SO4 anhidro y por evaporación, obteniendo así la mezcla de ácidos grasos metilados (Calderón, 2007). Desarrollo Experimental 31 6.13 Reacción de Acetilación Para esta reacción, se pesaron 100 mg de la muestra, se colocaron en un matraz de tres bocas y se agregaron 1 mL de ácido acético y 0.3 mL de piridina. Esta mezcla se dejó reaccionar durante 24 h con agitación magnética y a temperatura ambiente, monitoreándose la reacción mediante cromatografía de capa fina. En un embudo de separación se colocaron 5 g de agua-hielo así como la mezcla de reacción, y se acidificó con una solución de HCl al 10%. La mezcla acuosa se extrajo con 15 mL de AcOEt por triplicado. La fase orgánica se extrajo con tres porciones de 5 mL de solución saturada de NaHCO3, posteriormente se lavó tres veces con 5 mL de agua. El extracto orgánico posteriormente se secó Na2SO4 anhidro y por evaporación para obtener el producto acetilado (Shriner et al., 1997). Resultados y Análisis de Resultados 32 7. RESULTADOS Y DISCUSIÓN DE RESULTADOS 7.1 Efecto de los extractos sobre la germinación y la elongación de tallos y raíces de L. perenne y P. ixocarpa. Los extractos orgánicos de las partes aéreas de C. annuum, se evaluaron sobre la germinación y la elongación de los tallos y las raíces de las plántulas mono y dicotiledóneas (P. ixocarpa y L. perenne), para determinar su posible efecto pre-emergente. 7.1.1. Efecto en la germinación de Lollium perenne En la Figura 8 se observa el efecto de los extractos a 25 y 50 ppm en la germinación y elongación de las plántulas de L. perenne. El extracto de n- hexano no presentó actividad inhibitoria significativa (valores de p mayores a 0.05) en la elongación de la raíz y el tallo a ninguna de las dos concentraciones. En cuanto a la germinación, este extracto la inhibió 45 % a la concentración de 25 ppm. El extracto de cloroformo solamente presentó una ligera inhibición en el crecimiento del tallo (13 %) a 50 ppm, con un valor de significancia de p = 0.032. El extracto metanólico a 25 ppm, disminuyó la elongación de la raíz en un 30%, presentando un valor de significancia igual a 0.0064, y aunque a 25 ppm, la elongación del tallo así como de la germinación disminuyeron 15 y 10 % respectivamente, estos valores no fueron significativos (p > 0.05). Sin embargo a 50 ppm de este extracto, la germinación de las semillas de L. perenne se inhibió 30%. Resultados y Análisis de Resultados 33 0 25 50 0 20 40 60 80 100 [% ] Extracto Hexanico de C. annuum [ppm] 0 25 50 0 20 40 60 80 100 120 [% ] Extracto CHCl3 de C. annuum [ppm] 0 25 50 0 20 40 60 80 100 [ % ] Extracto MeOH de C. annuum [ppm] Figura 8: Efecto sobre la germinación, la elongación del tallo y la raíz de Lolium perenne con los distintos extractos analizados a dos concentraciones diferentes, 25 y 50 ppm. El control representa el 100%. 7.1.2 Efecto en la germinación de Physalis ixocarpa En la germinación de Physalis ixocarpa, las actividades medidas bajo el efecto de los extractos aumentaron incluso hasta el doble más que el control. El extracto de n-hexano a 25 ppm incrementó el tamaño de la raíz y el tallo en 20 y 130 % respectivamente, no así la germinación, la cual disminuyó 10 %. A 50 ppm del extracto, el efecto se observó en la elongación de raíz, tallo así como en la germinación, disminuyendo 35, 33 y 7 % respectivamente; presentando valores de significancia para todas las actividades medidas, a las Resultados y Análisis de Resultados 34 diferentes concentraciones, valores de p menores de 0.05, lo que indica que estos efectos son significativos. Con respecto al extracto de cloroformo, los parámetros medidos aumentaron considerablemente, siendo este aumento de 240 y 90 % para la elongación de raíz a 25 y 50 ppm respectivamente. El tallo aumentó 180 y 10 % a estas concentraciones, mientras que a 25 ppm la germinación aumentó 8 % y a 50 ppm disminuyó 27%. Cabe mencionar que los valores de significancia de los parámetros medidos fueron menores a 0.05, a excepción para el aumento del tallo a 50 ppm, el cual presentó un valor mayor. 0 25 50 0 50 100 150 200 250 [% ] Extracto Hexánico de C. annuum [ppm] 0 25 50 0 50 100 150 200 250 300 350 [ % ] Extracto CHCl3 de C. annuum [ppm] 0 25 50 0 50 100 150 200 250 300 [% ] Extracto MeOH de C. annuum [ppm] Figura 9: Efecto sobre la germinación y elongación de tallo y raíz de Physalis ixocarpa con los distintos extractos analizados a dos concentraciones diferentes, 25 y 50 ppm. El control representa el 100%. Resultados y Análisis de Resultados 35 Por último, el extracto de metanol a 25 ppm aumentó la elongación de la raíz y el tallo en 200 y 100 % respectivamente, pero disminuyó sólo en un 2% su germinación. A 50 ppm, la elongación de raíz disminuyó 20 %, así como la elongación del tallo en un 22 %, mientras que la germinación sólo disminuyó 8%. Estos parámetros presentaron valores de significancia (p) menores a 0.05. Los resultados muestran que solo el extracto de n-hexano presentó una inhibicióna 25 ppm en la germinación de las semillas de L. perenne, sin embargo a 50 ppm, ya no se observó. En las plántulas de P. ixocarpa se observó que los extractos en lugar de inhibir aumenta la elongación de los tallos y las raíces, siendo más activo el extracto clorofórmico, probablemente este efecto sea un efecto de hormesis, es decir a bajas concentraciones se presenta un efecto estimulatorio y a altas concentraciones empieza a observarse el efecto inhibitorio (Duke et al., 2006). 7.2 Efecto de los extractos sobre la Síntesis de ATP in vitro Concentraciones crecientes de los extractos, se ensayaron en la síntesis de ATP de cloroplastos aislados de hojas de espinaca, para evaluar su efecto en la fotosíntesis, en la Figura 10 se observa que los tres extractos inhibieron la síntesis de ATP, al calcular los valores de I50 (concentración a la cual se inhibe el 50 % de la síntesis de ATP), se obtuvieron valores de 156 y 117 ppm para los extractos de n-hexano y de metanol, mientras que para el extracto de cloroformo no se obtuvo el valor de I50 si se obtuvo el valor de I25 (concentración a la cual se inhibe el 25 % de la síntesis de ATP) que fue de 80 ppm. Estos resultados sugieren que tanto el extracto de n-hexano como de metanol contienen metabolitos secundarios que inhiben la fotofosforilación. Resultados y Análisis de Resultados 36 0 50 100 150 200 0 20 40 60 80 100 % S in te si s AT P Concentración [ppm] Figura 10. Efecto de los extractos de C. annuum sobre la síntesis de ATP. (▲)Extracto hexánico, (■) Extracto clorofórmico, (●) Extracto metanólico. Los datos son el resultado de dos réplicas. 7.3 Efecto de los extractos sobre el transporte de electrones fosforilante Para corroborar el efecto inhibitorio de los extractos en la síntesis de ATP, se evaluó su efecto sobre el transporte de electrones fosforilante en cloroplastos aislados de hojas de espinacas (Figura 11). Este ensayo además, nos proporciona información de manera rápida, de si la inhibición en la síntesis de ATP se debe a una inhibición en el transporte de electrones, o si se debe a un efecto desacoplante (inhibición de la fotofosforilación y aumento en la velocidad de transporte de electrones). En la Figura 11 se observa que el extracto de n- hexano acelera el transporte de electrones fosforilante y aunado a esto se observo la inhibición de la síntesis de ATP (Figura 10), por lo que se sugiere que este extracto se comporta como un desacoplante. Por otro lado, Resultados y Análisis de Resultados 37 los extractos clorofórmico y metanólico inhibieron el transporte de electrones fosforilante (18 y 40 %, respectivamente a 150 ppm) lo que sugiere que estos extractos probablemente se comportan como inhibidores de la reacción de Hill, siendo más activo el metanólico. 0 50 100 150 50 100 150 200 250 % T ra ns po rte d e e- fo sf or ila nt e Concentración [ppm] Figura 11. Efecto de los extractos orgánicos de las partes aéreas de C. annuum sobre el transporte de electrones fosforilante. (▲) Extracto hexánico, (■) Extracto clorofórmico, (●) Extracto metanólico. De los resultados obtenidos en la germinación y crecimiento de las plántulas, así como en la síntesis de ATP y transporte de electrones fosforilante, podemos decir que los extractos hexánico y de metanol son buenos candidatos para el fraccionamiento biodirigido. Resultados y Análisis de Resultados 38 Para el fraccionamiento biodirigido 72 g del material vegetal pulverizado, se pusieron a macerar en un matraz Erlenmeyer de 1 L con 900 mL de hexano, hasta extracción exhaustiva, para obtener el extracto de n-hexano (4.27 g). Después con este mismo material vegetal se obtuvieron los extractos clorofórmico (6.45 g) y de metanol (6.96 g) como se describe en el punto 6.2. 7.4 Fraccionamiento biodirigido del extracto de n-hexano de C. annuum. Para obtener los metabolitos secundarios presentes en el extracto de n- hexano, responsables de la inhibición de la síntesis de ATP, se procedió a su bio-fraccionamiento por cromatografía en columna abierta (CCA). Del bio-fraccionamiento se obtuvieron 189 eluatos que se agruparon por su similitud en cuanto a su composición en cromatografía de capa fina (CCF) en 23 fracciones (Tabla 4). El efecto de cada una de estas fracciones sobre el transporte de electrones fosforilante fue evaluado obteniendo los valores de I50 correspondientes a esta actividad para cada fracción (Tabla 4). Como se puede observar en la Tabla 4, la fracción más activa fue la F12 con un valor de I50 de 32 ppm en el transporte de electrones fosforilante, por tanto F12 se fraccionó nuevamente en la búsqueda de el ó de los compuestos responsables de esta actividad inhibitoria. Tabla 4: Fracciones obtenidas de la CCA del extracto de n-hexano de C. annuum, así como sus valores de I50 obtenida en el transporte de electrones fosforilante. Disolvente Fracción Cantidad (g) I50 (ppm) Hex 100 1 0.0076 Ne 2 0.1209 Cs 3 0.1097 Cs 4 0.0106 Cs 5 0.0008 Ne 6 0.2944 56.5 Resultados y Análisis de Resultados 39 Hex:AcOEt 90:10 7 0.0262 131.28 8 0.0127 156.08 9 0.0790 49 10 0.2049 127.5 11 0.0093 Ne Hex:AcOEt 80:20 12 0.2044 32.66 13 0.0717 NA Hex:AcOEt 70:30 14 0.0106 NA Hex:AcOEt 60:40 15 0.0172 NA Hex:AcOEt 60:40 y 50:50 16 0.0036 Ne Hex:AcOEt 50:50 17 0.0125 NA AcOEt 100 18 0.0068 Ne 19 0.0175 NA 20 0.0050 Ne 21 0.0032 Ne Acetona 100 22 0.0158 NA 23 0.0050 Ne Ne: No se evaluó porque la cantidad de la fracción era insuficiente Cs= No se evaluó por tratarse de ceras insolubles. NA= No aplica porque no se obtuvo una inhibición del 50%. 7.5 Refraccionamiento de la Fracción 12. Para conocer la pureza de la fracción 12, se realizó una placa de cromatografía eluida en Hex-AcOEt 80:20, y se apreciaron manchas en el UV lejano ( = 365 nm) de color naranja rojizos, probablemente pigmentos, así como una mancha que pudiera ser el o los compuestos responsables de este efecto. Sin embargo los pigmentos eran los de menor polaridad, por tanto se invirtieron las fases agregando 1% de ácido acético a la fase de elución y de este modo separar los pigmentos del compuesto. Después, se corrió una Resultados y Análisis de Resultados 40 nueva CCA con una mezcla de elución Hex:AcOEt 80:20 mas 1 mL de ácido acético por cada 100 mL y se tomaron eluatos de 30 mL c/u, obteniendo 6 fracciones, de las cuales, la fracción F12-3 con un rendimiento de 0.0242 g fue la de mayor proporción, por lo que se continuó con su identificación. El espectro de HRMN de esta fracción, mostró señales de hidrógenos alifáticos característicos de ácidos grasos, los cuales fueron identificados por medio de un ensayo de CM-GS, para lo cual la fracción fue previamente metilada, como se describe en el punto 6.12. En el cromatograma (Espectro 1, Apéndice2), se observaron21 señales cuya caracterización por comparación de la Biblioteca de la USAI se muestra en la Tabla 5. Tabla 5: Componentes de la fracción F12-3 identificados por metilación y comparación con los datos presentes en la Biblioteca NIST MS Versión 2.0 (Espectro de masas LECO modelo PEGASUS) Pico # Nombre Fórmula Area % Peso Similitud 1 Nonanedioato de dimetilo C11H20O4 0.69165 216 841 2 Tetradecanoato de metilo C15H30O2 0.50991 242 825 3 4,8,12-trimetil – Tridecanoato de metilo C17H34O2 0.070785 270 806 4 12-metil- Tetradecanoato de metilo C16H32O2 0.34911 256 786 5 6,10,14-trimetil-2- Pentadecanona C18H36O 0.81654 268 908 6 5,9,13-trimetil- Tetradecanoato de metilo C18H36O2 0.25702 284 900 7 Hexadecanoato de metilo C17H34O2 43.743 270 946 8 Ácido n-Hexadecanoico C16H32O2 0.29956 256 906 9 Heptadecanoato de metilo C18H36O2 2.1886 284 836 10 Octadecanoato de metilo C19H38O2 1.7344 298 791 Resultados y Análisis de Resultados 41 11 11-Octadecenoato de metilo C19H36O2 0.65043 296 886 12 Octadecanoato de metilo C19H38O2 20.502 298 946 13 Eicosanoato de metilo C21H42O2 8.5925 326 897 14 Tridecanoato de metilo C14H28O2 1.6927 228 884 15 Docosanoato de metilo C23H46O2 7.9426 354 881 16 Tridecanoato de metilo C14H28O2 1.8368 228 878 17 Ciclopentanoundecanoato de metilo C17H32O2 4.3930 268 809 18 Tridecanoato de metilo C14H28O2 0.34149 228 871 19 Tridecanoato de metilo C14H28O2 1.4353 228 826 20 Octadecanoato de metilo C19H38O2 1.4943 298 830 21 Ciclopentanoundecanoato de metilo C17H32O2 0.45894 268 826 En la Tabla 5, se encontraron principalmente ácidos grasos saturados y de número de carbono par como componentes de la fracción F12-3. Estos ácidos grasos de cadena par comúnmente se encuentran en mayor proporción en diferentes plantas (Weete et al., 1970; Beyer, 1987; Morales 2010). En el laboratorio, en un trabajo previo, en las hojas de la planta Cecropia obtusifolia, se identificaron los ácidos: mirístico (C:14), palmítico (C:16), esteárico (C:18), araquídico (C:20) y behénico (C:22) y se observó que para el caso de los ácidos palmítico y esteárico el valor de I50 en el transporte de electrones fosforilante fue de 618 y 200 M respectivamente, mientras que los ácidos araquídico y behénico no se probaron debido a su poca solubilidad en DMSO, (Morales, 2010). Sin embargo, en este trabajo, en la fracción F12-3, también se encontraron por primera vez los ácidos: tridecanoico, heptadecanoico y ciclopentaundecanoico ya que no han sido reportados previamente en esta planta. Resultados y Análisis de Resultados 42 Los ácidos grasos con número impar de átomos de carbono sólo existen en trazas en los alimentos (Belitz, 1998). En el caso del ácido tridecanoico sólo se ha reportado como componente al 0.1 % en la grasa butírica (Kuang, 1992), y en hojas de mangle (Mirsa et al., 1987). El ácido margárico (ácido heptadecanoico), H3C-(CH2)15COOH, se ha reportado en raíces, tallos, retoños y semillas de Salicornia bigelovii, junto con los ácidos mirístico, esteárico, y araquidónico (Weete et al., 1970). Además también se sabe de la existencia de estos ácidos en las hojas de algunos mangles (Misra et al., 1987). Y en menor cantidad se ha encontrado en el aceite esencial de las hojas de Chansmanthera dependens, una planta utilizada en el tratamiento de diversas enfermedades (Ogunlesi et al., 2010). En la Tabla 6, se muestran algunas fuentes de ácido heptadecanoico reportadas. Tabla 6: Cantidad de ácido heptadecanoico en diversos aceites y grasas (Badui, 1994). Aceite o grasa Cantidad (%) Aceite o grasa Cantidad (%) Mantequilla 0.7 Palma 0.1 Grasa de Pollo 0.1-0.3 Aceite de Cacahuate 0.1 Cacao 0.3 Soya 0.1 Maíz 0.1 Girasol 0.1 Semilla de Algodón 0.1 Sebo de Res 1.5 Manteca de Cerdo 0.4-0.5 Sebo de Cordero 2.0 Extractos de Excoecaria agallocha que contienen los ácidos: palmítico, linoleico, mirístico, láurico, tridecanoico, heptadecanoico, linolénico, pentadecanoico y esteárico entre otros, presentan actividades antibacterial y Resultados y Análisis de Resultados 43 antifúngica (Agoramoorthy et al., 2007; Liu et al., 2008). Los ácidos grasos tridecanoico y heptadecanoico también presentan una excelente actividad antioxidante, siendo el ácido tridecanoico el que mayor actividad presenta (Henry et al., 2002). En la literatura se reportó el ácido de cadena impar (ácido pelargónico C:9) que presenta actividad herbicida (Duke et al., 2002), por lo que, con los ácidos tridecanoico y heptadecanoico, obtenidos comercialmente de Sigma- Aldrich se procedió a medir su efecto en las actividades fotosintéticas (Síntesis de ATP y transporte de electrones fosforilante), así como en la germinación y crecimiento de las plántulas mono y dicotiledoneas. 7.6 Efecto de los ác. tridecanoico y heptadecanoico sobre la Síntesis de ATP in vitro En la Figura 12 se muestra el efecto inhibitorio de los ácidos grasos tridecanoico y heptadecanoico en la síntesis de ATP de 40% y 15 % respectivamente a 300 M. 0 50 100 150 200 250 300 60 70 80 90 100 % S ín te sis d e AT P Concentración [M] Figura 12: Influencia de los ácidos tridecanoico y heptadecanoico sobre la Síntesis de ATP. (■) Ácido tridecanoico, (▲) Ácido heptadecanoico Resultados y Análisis de Resultados 44 7.7 Efecto de los ác. tridecanoico y heptadecanoico sobre el transporte de electrones fosforilante Para corroborar el efecto inhibitorio sobre la síntesis de ATP y determinar si este efecto se debe a una inhibición en el transporte de electrones o a un efecto desacoplante, se evalúo el efecto de estos ácidos sobre la velocidad de transporte de electrones fosforilante (Figura 13). Los dos ácidos grasos aumentan el transporte de electrones fosforilante, es decir, ambos actúan como desacoplantes, y muestran el mismo patrón de inhibición que en la síntesis de ATP, es decir, el ácido que más inhibe la síntesis de ATP (ácido tridecanoico) es el que presenta un mayor efecto desacoplante. 0 50 100 150 200 250 300 100 110 120 130 140 150 % T ra ns po rte d e e- fo sf or ila nt e Concentración [M] Figura 13: Influencia de los ácidos tridecanoico y heptadecanoico sobre el transporte de electrones fosforilante. (■) Ácido tridecanoico, (▲) Ácido heptadecanoico Resultados y Análisis de Resultados 45 Si comparamos estos resultados con los de la Tabla 4, se observa que la fracción 12 en la que estaban contenidos los ácidos, inhibe la velocidad del transporte de electrones, mientras que los ácidos grasos puros actúan como desacoplantes, por ello, se procedió a hacer una mezcla de los ácidos empleando además, los ácidos grasos mirístico, esteárico, behenico, palmítico y oleico; de acuerdo a las proporciones en que se encontraron en la fracción (Tabla 5). En la Figura 14 se muestra el efecto inhibitorio de la mezclasobre el transporte de electrones fosforilante, con un valor de I50 de 66.4 ppm, que es mayor a la de la fracción 12 (I50 de 32.7 ppm), lo que demuestra que el efecto que se tiene en la fracción es debido a la suma de los efectos de cada uno de los ácidos presentes en ella; aunque en la mezcla faltaron varios ácidos grasos que si están presentes en la fracción. Además que la fracción 12 se re fraccionó para obtener compuestos más puros. 0 50 100 150 200 20 40 60 80 100 % T ra ns po rte d e e- fo sf or ila nt e Concentración [ppm] Figura 14: Influencia de la mezcla de los ácidos grasos presentes en la fracción 12 sobre el transporte de electrones fosforilante. Resultados y Análisis de Resultados 46 7.8 Efecto de los ác. tridecanoico y heptadecanoico sobre la germinación y la elongación de tallos y raíces de L. perenne y P. ixocarpa. Para determinar el posible efecto pre-emergente de los ácidos tridecanoico y heptadecanoico, se midió la germinación, elongación de tallos y raíces de plantas mono y dicotiledóneas (P. ixocarpa y L. perenne). 7.8.1 Efecto de los ácidos tridecanoico y heptadecanoico sobre la germinación de Lollium perenne. Como se observa en la Figura 15 a), a medida que aumenta la concentración del ácido tridecanoico, desde de 50 hasta 500 M, disminuye ligeramente la elongación de la raíz y la germinación, observándose mayor efecto sobre la raíz a la mayor concentración (58% de inhibición), también a esta concentración el tallo y la germinación disminuyeron aproximadamente 30 y 28 % respectivamente (valores de p para estas actividades << a 0.05). Como se observa en la Figura 15 b, la actividad del ácido heptadecanoico es menor a la del ácido tridecanoico, pues solo a 250 M la elongación de tallo y raíz disminuyeron 35 y 20% respectivamente, pero la germinación aumentó ligeramente. Finalmente con 500 M ya se observo un efecto significativo sobre la plántula, pues la elongación del tallo y la raíz disminuyeron alrededor de un 43% y un 23%, y la germinación disminuyó hasta un 25%. En general, conforme se aumenta la concentración de los ácidos aumenta la inhibición de las actividades medidas, es decir la actividad inhibitoria es dependiente de la concentración, siendo más activo el ácido tridecanoico. Resultados y Análisis de Resultados 47 0 20 40 60 80 100 500250100500 [% ] Ácido Tridecanoico [] 0 20 40 60 80 100 500250100500 [% ] Ácido Heptadecanoico [] Figura 15: Efecto sobre la germinación, elongación de tallo y raíz de Lolium perenne debido a los ácidos tridecanoico (a) y heptadecanoico (b) analizados con cuatro concentraciones diferentes, 50, 100, 250 y 500 μM. El control representa el 100%. 7.8.2 Efecto de los ácidos tridecanoico y heptadecanico sobre la germinación de Physalis ixocarpa En la Figura 16a, se observa el efecto del ácido tridecanoico sobre la elongación del tallo y la raíz de Physalis ixocarpa, así como en su germinación. A la concentración de 50 M, la elongación de raíz y tallo aumentan en un 32 y 16 % respectivamente, sin embargo la germinación disminuyó 6%. A 100 M, las elongaciones de tallo y raíz disminuyeron con respecto a la concentración anterior, aunque aún están por encima de los controles con un 4 y 3 % respectivamente, y el porcentaje de semillas germinadas disminuyó 10%. A 100 M, los tres parámetros se encuentran por debajo del control, observándose una disminución del 4, 23 y 25 % en la elongación de la raíz, el tallo y la germinación respectivamente. Finalmente a 500 M, la elongación de la raíz, el tallo y el porcentaje de semillas germinadas disminuyeron a 13, 23 y 25 % respectivamente. Observándose la misma tendencia que con la planta dicotiledónea, sin embargo se observa una mayor inhibición de la elongación de la raíz sobre la planta dicotiledónea (Lollium perenne). a) b) Resultados y Análisis de Resultados 48 El ácido heptadecanoico, con una concentración de 50 M prácticamente no inhibe la elongación de la raíz, aumenta la elongación del tallo en un 6% e inhibe el porcentaje de germinación en un 11%; con 100 M, la raíz y la germinación ya se encuentran un poco más inhibidas (15 y 18 % respectivamente), mientras que la elongación de tallos es prácticamente igual al control. A 250 M la raíz, el tallo y la germinación se inhibieron 15, 17 y 21 % respectivamente. Finalmente con 500 M estas inhibiciones aumentaron a 36, 23 y 25 % respectivamente. 0 20 40 60 80 100 120 140 500250100500 [% ] Ácido Tridecanoico [] 0 20 40 60 80 100 0 50025010050 [% ] Ácido Heptadecanoico [] Figura 16: Efecto sobre la germinación, elongación de tallo y raíz de Physalis ixocarpa debido a los ácidos tridecanoico (a) y heptadecanoico (b) analizados con cuatro concentraciones diferentes, 50, 100, 250 y 500 μM. El control representa el 100%. Como se observa, ambos ácidos grasos presentan una tendencia inhibitoria similar, sin embargo, el ácido heptadecanoico a la mayor concentración inhibe más la elongación de la raíz que el ácido tridecanoico con la misma concentración, siendo ahora más activo que el ácido tridecanoico contrario a lo observado en L. perenne. De las 23 fracciones, las fracciones F1, F5, F11, F16, F18, F20, F21 y F22 tuvieron un rendimiento menor a 10 mg, y en la cromatográfia de capa fina, se a) b) Resultados y Análisis de Resultados 49 observó que se trataban de mezclas complejas de compuestos, por lo que no se continúo su caracterización. Las fracciones F2, F3 y F4, precipitaron de forma espontánea, por lo que se llevó a cabo su caracterización por medio de métodos espectroscópicos. El Espectro de Infrarrojo (IR) (Espectro 2, Anexo 2) mostró señales correspondientes a metilos y metilenos alrededor de 2900 y 2800 cm-1, confirmando los metilos alrededor de 1400 cm-1, estos datos fueron muy similares a los reportados por Morales, 2010; que corresponden a hidrocarburos de altos peso molecular (ceras) Las fracciones F7 y F8 presentaron efecto inhibitorio en la velocidad del transporte de electrones fosforilante (Tabla 4) con valores de I50 mayores a 100 ppm y con el 50 % de inhibición a la máxima concentración evaluada (200 ppm), por lo que tampoco fueron caracterizadas. La fracción 10, presentó un valor de I50 de 127.5ppm en el transporte de electrones fosforilante, sin embargo a una concentración de 200 ppm ocurrió una inhibición del 90%, por lo que se procedió a la caracterización. El espectro de Infrarrojo (IR) (Espectro 3, Anexo 2) presentó señales para grupos hidroxilo en 3418 cm-1, metilos y metilenos en 2933 y 2865 cm-1 y la presencia de más de 4 metilos y metilenos en 1463 cm-1. El espectro de Resonancia Magnética Nuclear de Hidrógeno (1H-RMN) (Espectro 4, Apéndice 2), mostró señales para hidrógenos alifáticos, muy similar a la mezcla de esteroles reportados por Jiménez (1989); Morales (2010), y Soto (1975). El análisis del Espectro de Masas acoplado a Cromatografía de Gases (CG-MS) (Espectro 5, Apéndice 2) mostró tres compuestos con tiempos de retención de 16.59, 19.03 y 17.43min, cuyos espectros de masas fueron comparados con los datos de la literatura y con la base de los compuestos de la Biblioteca de la Unidad de Servicios de Apoyo a la Investigación (USAI), se identificaron como ergosterol, campesterol y estigmasterol, respectivamente. Resultados y Análisis de Resultados 50 La fracción F6, presentó un color naranja-rojizo. Esta fracción se analizó por CG-Espectrometría de masas, y a pesar de ser una muestra sumamente colorida, al inyectar en el espectrómetro la fracción parecía diluida. El cromatograma de esta fracción (Espectro 6, Apéndice 2) indico la presencia de 24 picos, que al compararse con la biblioteca de la USAI, la mayoría de los componentes se identificaron como ácidos grasos, alcoholes y otros compuestos (Tabla 7). Tabla 7: Componentes probables de la fracción F6 identificados por comparación con los datos de la Biblioteca NIST MS Versión 2.0 (Espectro de masas LECO modelo PEGASUS) Pico # Nombre Fórmula Área % Peso Similitud 1 3,7,11,15-Tetrametil-2- hexadecen-1-ol C20 H40O 7.9797 296 889 2 6,10,14-trimetil-2- Pentadecanona C18H36O 3.2041 268 921 3 3,7,11,15-Tetrametil-2- hexadecen-1-ol C20H40O 2.8361 296 875 4 3,7,11,15-Tetrametil-2- hexadecen-1-ol C20H40O 4.5862 296 904 5 Tridecanoato de metilo C14H28O2 8.9474 228 933 6 Pentadecanoato de etilo C17H34O2 3.2925 270 894 7 9,12- Ácido octadecadienoico, de metilo C19H34O2 8.7064 294 939 8 2-undecil- trans- Ciclopropanopentanoato de metilo C20H38O2 8.7450 310 861 9 Tridecanoato de metilo C14H28O2 2.7847 228 935 Resultados y Análisis de Resultados 51 10 1,E-11,Z-13-Octadecatrieno C18H32 1.8074 248 871 11 Eicosanoato de etilo C22H44O2 1.3708 340 826 12 Tridecanoato de metilo C14H28O2 2.2594 228 910 13 Ácido ftálico, monociclohexil ester C14H16O4 0.46250 248 857 14 1,2-Ácido benzenodicarboxílico, mono(2-etilhexil) ester C16H22O4 4.2440 278 947 15 Ácido ciclopropanocarboxílico, 3- (2,2-diclorovinil)-2,2-dimetill-, (3-fenoxifenil) metil ester, (1R-trans)- C21H20Cl2O3 0.23865 390 950 17 ç-Tocoferol C28H48O2 0.097895 416 817 18 Vitamina E C29H50O2 0.099966 430 894 19 Fitonadiona C31H46O2 2.8440 450 759 20 11-Hexadecinal C16H28O 2.0828 236 805 21 3,7,11,15-Tetrametil-2- hexadecen-1-ol C20H40O 17.832 296 859 22 9-Eicosino C20H38 9.0483 278 796 23 3,7,11,15-Tetrametil-2- hexadecen-1-ol C20H40O 4.1442 296 821 24 Fitol C20H40O 1.5566 296 783 La fracción F9 sólo se analizó por resonancia magnética nuclear de hidrógeno (Espectro 7, Apéndice2), en donde se observaron picos característicos de ácidos grasos Resultados y Análisis de Resultados 52 7.9 Caracterización de los cristales del extracto metanólico Cuando se disolvió el extracto metanólico con el objetivo de filtrarlo con carbón activado para eliminar los pigmentos, se observó la presencia de cristales, por lo que se procedió a su separación como se describe en el punto 6.8. Los cristales obtenidos se clasificaron en tres grupos (MeOH1, MeOH2 y MeOH2p), de acuerdo a sus características macroscópicas como son tamaño y color: el grupo MeOH1 presentó coloración verdosa y de tamaño similar a MeOH2, sólo que éste último tenía una coloración café, y MeOH2p tenía una coloración más clara entre café claro y blanco y un tamaño de partícula menor, casi polvo (separados por tamizado). El rendimiento para cada uno de ellos fue: 2.2, 2.5 y 7%. Cuando se trató de medir el punto de fusión de los cristales (utilizando un aparato Fisher), los cristales no fundieron a una temperatura aproximada de 250 °C, , por lo que se sospechó de que no se trataban de compuestos orgánicos. Como los cristales parecían ser compuestos inorgánicos, se enviaron al laboratorio de Análisis Elemental de la USAI, cuyos resultados aportaron una composición de entre 0.5 a 1 % de Carbono, 0.1 a 0.3 % de Hidrógeno, 0.3 a 1 % de Nitrógeno y ausencia de azufre, confirmándonos así que los cristales son básicamente sales inorgánicas. Al realizar la prueba de cloruros a los cristales, resultó positiva. Después al hacerles la prueba de las perlas de Borax, tomaron una coloración violeta, que indico la presencia de potasio (K), con lo que podemos sugerir que se trata de Cloruro de potasio (KCl) (Gómez, 2006). Conclusiones 53 8. CONCLUSIONES En este trabajo, por primera vez se encontraron ácidos grasos de cadena impar en el extracto de n-hexano de la planta C. annuum. Los ácidos comerciales tridecanoico y heptadecanoico probados en el ensayo de transporte de electrones fosforilante de cloroplastos aislados, debido a que fueron detectados como ácidos grasos presentes en la planta, se comportaron como desacoplantes, lo que sugiriere que son los causantes del comportamiento desacoplante del extracto de n-hexano. Del extracto metanólico precipitaron cristales que se identificaron como Cloruro de potasio. No se encontraron capsaicinoides en las plantas cosechadas después de 25 días de germinación, las cuales todavía no presentaban flor apical, corroborando lo reportado por Estrada et al., (2002), quienes mencionan que los capsaicinoides aparecen a partir de la formación de la flor apical. Perspectivas 54 9. PERSPECTIVAS Probar in vivo los ácidos grasos con cadena impar que presentaron actividad desacoplante en la fotosíntesis medida in vitro, asperjándolos a diferentes concentraciones en plantas de malezas mono y dicotiledóneas crecidas en el invernadero, y esperando que inhiban el crecimiento de las malezas, al carecer las plantas de ATP. Sembrar nuevamente plantas de C. annuum y obtener los exudados acuosos de raíz para probar su efecto sobre el crecimiento de otras plantas (malezas). Apéndices 55 10. APÉNDICES 10.1 Apéndice 1. Medios Medio de aislamiento de cloroplastos Componente mM Sacarosa 400 KCl 20 Mg Cl2 6H2O 5 Tricina 30 Ajustar a pH=8.0 con KOH Medio Bomba + Síntesis de ATP Componente mM Sacarosa 100 KCl 10 Mg Cl2 6H2O 5 Tricina 1 KCN 0.5 MV 50M Ajustar a pH=8.0 con KOH Medio de Transporte de electrones Componente Con MV (mM) Sin MV (mM) Sacarosa 100 100 KCl 10 10 Mg Cl2 6H2O 5 5 Tricina 15 15 KCN 0.5 0.5 MV 50M ---- Ajustar a pH=8.0 con KOH Sulfato sérico amoniacal Para preparar 350 mL de solución, se emplean 350 g de hielo, 12 g de Sulfato sérico amoniacal, 22 mL de ácido sulfúrico concentrado (H2SO4). En un vaso de precipitados se coloca el hielo (baño de hielo) en seguida debe agregarse cuidadosamente el H2SO4 concentrado y el Sulfato Sérico amoniacal, para homogenizar la solución se debe agitar la mezcla con una varilla de vidrio hasta disolver porcompleto. En caso de no disolverse completamente, se debe filtrar Apéndices 56 Espectro 1: Cromatograma de Gases de la Fracción Fr12-3 o 900000 800000 700000 600000 500000 400000 300000 200000 100000 o Hn, (5) ¡ I M, , , 200 300 400 1, 1 1 1 , 500 600 700 800 900 1000 -Ale o 900000 800000 700000 600000 500000 400000 300000 200000 100000 o Tme (5) ¡ I M, , , 200 300 400 \, I 1 1 , 500 600 700 800 900 1000 -Ale Apéndices 57 Espectro 2: Espectro de Infrarrojo de la Fracción Fr3 100.0 \ r .J05 I Ol .. Un.97 &S 729.~ 119.07 80 75 1412;19 1461.4' 70 " 60 " ' 9561 'O %T ., 40 3S 30 " 20 " 10 , W 2916.03 0.0 4000.0 ,... 3200 2800 2000 1800 1600 1400 1200 1000 800 600 400.0 011-1 o 100.0 \ r T I 9l 119.05 .. Un.97 &S "'.~ 119.07 80 " 1.n¡79 1<161.49 70 " 60 " ''''1 'O %1 ., .. " 30 " 20 " 10 , W 2916.03 0.0 ..... 0 ,... 3200 2100 2000 1800 1600 1 ... 1200 1000 800 ... .... 0 .. · 1 o Apéndices 58 Espectro 3: Espectro de Infrarrojo de la fracción Fr10 100.0 .S 1738.37 .. 1642." 117). 838." 590.41 SS I 192.44 S.'" 801.32 .$O1 .3. I 1Ill.1 737.93 lO '240 ... 9S7.42 1107. 'DeA. 7S 3411.13 , ... 70 1463.S7 1375.88 IOSl.72 6S 60 SS SO %T 'S .. 3S .18 JO 25 20 " .0 29)3.39 S 0.0 4000.0 3200 2000 2400 .000 ...... .- .400 .200 '000 too 600 400.0 o 100.0 9S 1738.37 -/ 90 1642.94 a38.5, 590.41 SS S.'" 801.32 .$O1 .l8 7l7.9l lO 957.42 1S 3411.13 ... 70 1463.57 1375.18 lOSl.72 6$ .. SS SO %T 'S .. " .JI 30 2S 20 " 10 29)3.3.9 S 0.0 4000.0 3200 2800 2400 '800 ..... , '600 , ... '200 '000 lOO 600 ....0 o Apéndices 59 Espectro 4: Espectro de RMN de hidrógeno de la Fracción Fr10 ¡ ' .0 7.0 6.0 ' .0 ' .0 3.0 2 .0 >.0 ppm(l1) o ,~ , ~ '1 I,J)\Y ) ~ , ; ; ; , i .,- ••• 7 .• ••• , .• ..• 3 .• 2 .• , . ppm (n ) o Apéndices 60 Espectro 5: Cromatograma de Gases de la Fracción Fr10 Apéndices 61 Espectro 6: Cromatograma de Gases de la Fracción Fr6 225000 200000 175000 15 0000 125 000 100000 75000 50000 25000 O I L L j I , nne (5) 200 400 600 800 1000 1200 1400 1600 -- Ale o 225000 200000 175000 150000 125000 100000 75000 50000 25000 O I L L j I , TOne (5) 200 400 600 800 1000 1200 1400 1600 -- Ale o Apéndices 62 Espectro 7: Espectro de RMN de hidrógeno de la Fracción Fr9 J. ,. ' .0 7.0 0.0 o , .• 4" y ¡ 3.' 2.' ' .0 J. ' .0 7.0 1 .0 ••• o 4.0 y ¡ 3.0 2.' 1.0 Bibliografía 63 11. BIBLIOGRAFÍA 1. 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