Resumen ingeniería genética

Vista previa del material en texto

Cloning techniques
Para elegir el material de partida.
- ADN genómico puede tener intrones y ser repetitivo
- Para controlar la expresión del gen aislar las regiones promotoras
- ARNm transcriptoma = genes activos (abundancia de genes particulares)
- Muestra la secuencia codificante de los genes, sin intrones
- Sintetizar ADN in vitro después de la secuencia de aminoácidos de una proteína
- PCR utiliza para generar material para la clonación
Clonación a partir de ARNm
- Genes de mantenimiento metabolismo basal
- Diferente ARNm facilidad de aislamiento
- Sintesis de ADNc: por RT poli T se une y sirve como cebador
(fragmento corto de ADN monocatenario) para el poli A
genera hibrido ARNm puede degradarse por hidrólisis alcalina o
RNasaH una polimerasa hace otra hebra nucleasa S1
recorta los extremos de la región amplificada
Problemas:
● ARNm muy largo difícil sintetizar cDNA
● 3’ ARNm sobrerepresentadas (primeras)
● S1 elimina secuencias importantes 5’
● Mejoras: cola de oligo (dC)
● Obtiene ADNc longitud completa
● Sin necesidad de S1
- Si ARNm no poliadenilado cebadores de oligonucleótidos inicia la síntesis ADNc
- Secuencia aminoácidos conocida (proteína) sintetiza un oligonucleótido especifico
- Mas especifico que oligo (dT)
- Elección de vector: plásmido/fago/cósmido/fagémido
Clonación de ADNc en vectores de plásmidos
- No es necesario seleccionar muchos clones
- ADNc o ADN genómico + vector
- Ligadura de extremo romo
- Moléculas enlazadoras
- Residuos de homopolimeros
Ligadura de extremo romo
- Generado por S1 o PCR
- Proceso ineficiente: nada une al inserto y al vector
- Necesita mas ADN aumentar chance de ligadura
- Inserto y vector autoligan concatemeros
- Fosfatasa para evitar la auto-ligadura
Use of linkers
- Sintetizado químicamente
- ADNc por ligadura roma
- Corta con RE extremos adhesivos
- ADNc sitio de restricción en su secuencia protege incubación previa con metilasa
Uso de adaptadores
- Evita usar RE
- 5’ puede desforforilar para evitar el autoligado
Residuos de homopolimeros
- Enzima transferasa terminal
- dG-dC más utilizados
- Regiones de anneling más largas que las RE
- Más estable
- se puede ligar in vivo
- Mas especifico
- Pstl se regenera y se puede usar después.
Clonación de ADNc en vectores λ usando enlazadores.
a. cDNA ds se trata con ecoRI metilasa
b. Metila cualquier ecuencia interna de reconocimiento EcoRI
c. Agregan conectores EcoRIa losextremos del ADNc metilado y
los conectores se digieren con EcoRI.
d. La metilación evita la digestión interna ADNc con extremos
cohesivos EcoRI.
e. Puede ligar en el sitio EcoRI e un vector λ (λgt10). ADN
recombinante se empaqueta in vitro y se sembra en placa
selección y cribado.
Clonación de ADNc en vectores de fagos
- Gran cantidad de recombinantes
- Envasado in vitro
Clonación de ADN genómico en vectores de fagos
- Se quiere estudiar cosas que no están presentes en ADNc
- Ejem: intrones, secuencias regulatorias, bibliotecas genómicas.
Bibliotecas genómicas:
- Son colecciones de clones en células bacterinas o como fagos.
- Contiene un conjunto de clones que representa el genoma completo de un organismo
- Conjunto de fragmentos colados superpuestos
- Generados al azar
Tamaño de la biblioteca genómica
- Formula: N=ln(1-P)/ln(1-a/b)
- Donde
- N= # de clones necesario
- P= proba deseada de una secuencia particular (0.95 y 0.99)
- A= tamaño de los fragmento de ADN
- B= tamaño del genoma (mismas unidades de a)
Preparación de fragmentos de ADN para la clonación
- Peso molecular del ADN aislado y el método a usar
- ADN alto peso molecular y fragmentado aleatoriamente
- Mechanical shering forzar ADNcon una aguja o sonacion
- Necesita agregar enlazadores, adaptadores, colas de homopolímero para unirse al vector
Ligación, empaquetado y amplificación de bibliotecas.
- Fraccionamiento de muestras:: electroforesis en gel, centrifugación.
- Inserto de ADN se trata con fosfatasa para reducir la autoligacion o formación de concatomeros.
- El vector + inserto + vector + inserto + vector + inserto, etc. se puede ligar y empaquetar in vitro.
- Biblioteca primaria, partículas de fagos recombinantes individuales para secuencia de interés.
Clonación a secuencia de cDNA
- Elegir un promotor (mas rendimiento de la proteina)
- Si el producto es toxico para la celula el promotor debe ser mas débil
- Procariotas: - 10 (Prinbox box) y -35
- Eucariota: -25 (TATA box) y -75 (CAAT box)
- Inducible y reprimible
Clonación de grandes fragmentos de ADN en vectores
BAC y YAC
- Reduce num de clones a realizar en una
biblioteca
- Se producen dos brazos, como de los vectores
de fagos
- Inserto de ADN se prepara como fragmentos
muy largos liga en el sitio de clonación para
producir cromosomas artificiales.
Restricciones de clonación
- Vector y corte de inserción con enzimas compatibles
- Clonar el vector de expresión, el gen debe comenzar justo debajo del promotor
- El uso de 2 enzimas
diferentes orientacion adecuada
- Digerir mucho material: 1ug de
vector y 1.5-2 de inserto
- Run gel. Neg control= uncut, para
comparar tamaños
- Saltar bandas en el gel (purifica ADN)
- Ligadura: proporción de vector a insertar 1:3
- Neg. Control = inserción añadida
- Digestión del vector completa
- Usa agarosa LMP y gel: purifica el vector
- 1-2 ul de reaccion de ligadura en células DH5 o
TOP10
- Para menos de 1ng de ADN células de alta
competencia
- Use células electrocompetentes para ADN grande
>10 kb
- Transformar ligadura inserto+vector y solo cortar
el vector
Cloning techniques 2
Golden Gate Assembly
- La tecnología de clonación se basa en enzimas de restricción Tipo IIS, descubiertas en 1996.
- Las enzimas tipo IIS son de las enzimas de restricción "tradicionales" separan fuera de su
secuencia de reconocimiento, creando cuatro protuberancias flanqueantes de bases.
- Estos salientes no forman parte de la secuencia de reconocimiento personalizar para dirigir el
ensamblaje de fragmentos de ADN.
- Cuando se diseñan correctamente, los sitios de reconocimiento no aparecen en la construcción
final, lo que permite una clonación precisa y sin cicatrices.
Desventajas
- No es 100% independiente de la secuencia (para evitar:domesticar el fragmento pcr crea
mutaciones puntuales silenciosa, elimina el gen de interés)
- No aptos para la domesticación, considere el uso de un método alternativo (Gateway o gibson)
- 256 secuencias las que difieren solo e una base pueden dar ligandos no deseados.
TOPO CLONING
- Clonación basada en topoisomerasa
- Sin necesidad de RE o ligasa
- Taq polimerasa deja una "A" en los extremos 3'
- La topoisomerasa I del virus Vaccinia reconoce la
secuencia 5 ́-(C/T)CCTT-3’ y corta dejando una “T” libre
- La enzima permanece unida al sitio del corte y utiliza
energía para unir la T a un extremo 5'OH de otra
molécula
- Algunos kits tienen el sitio de la topoisomerasa dentro
del gen de la beta galactosidasa para permitir la detección azul/blanca
- Incubar 5min el producto del pcr con el vector TOPO
- No hay que agregar P a los extremos 5’ de los cebadores
- Transformar en celula bacteriana
- Colonias blancas de la placa taq con enzima corrector 10:1
- Purificar el gel con aATP 10-15 min a 72C
GATEWAY CLONING
- In vitro eventos de recombinación del fago
lambda infectando bcterias
- Modificacions de los att
- Genera un clon de entrada y el ADN se mueve
por cualquier expresión en una sola recombinación
- Es mas rápido (1 dia, ligadura y restricción 2)
- Fragmento de ADN insertado permanece en el
marco
- Alta eficiencia: +antibióticos –CCdB >99%
- Se pueden clonar todos los tipos de fragmento de ADN, disponible para todo tipo de organismo
desde mamíferos hasta E. coli
Dos tipos de reacción:
- Reacción BP sitios attB que
flanquean el inserto y los attP del vector
donante catalizada por la mezcla de
enzimas BP clonasas generan el clon de
entrada que contiene ADN de interés por
sitios attL. Subproducto genccdB sale del
donante.
- Reacción LR sitios attL del clon de
entrada genera sitios attR del vector
destino catalizada por la mezcla de LR
clonasas resultado clon de expresión con
ADN en attB gen ccdB sale del destino.
- Después de las reaccions toca transformar células de E. coli competentes y seleccionar los clones
positivos.
- Clon de entrada y vector destino llevan diferentes marcadores de resistencia a los antibióticos (color
del plasmido), permite seleccionar el clon de expresión.
GIBON ASSEMBLY
- Ensamblaje fácil de multiples
fragmentos ADN lineal
clonación básica de un inserto
en el vector de su elección
- Fragmentos de ADN con
regiones de homología en los
extremos creados por PCR
- Los fragmentos se incuban con
master mix tres enzimas
1. Exonuclesa (mastica los extreos 5’)permite a monocatenarias se hibriden
2. Polimerasa para rellenar huecos
3. Ligasa de ADN para sellar las muescas de los huecos reocidos y rellenados
Selection, screening and analysis of recombinants
● “La selección es donde se aplica algún tipo de presión (por ejemplo, la presencia de un antibiótico)
durante el crecimiento de las células huésped que contienen ADN recombinante”
● “El cribado (screening) es un procedimiento mediante el cual una población de células viables se
somete a algún tipo de análisis que permite identificar las secuencias deseadas”
Métodos de selección
- Antibióticos
- Uso de sustratos cromogénicos
- X-gal, es un sustrato incoloro para B-galactosidasa
- Uso de IPTG (iso-propil-tiogalactosido) en lugar de
lactosa real: un inductor de B-galactosidasa pero no un
sustrato
Selección por morfología de placa:
• El vector sin inserto contiene el gen del represor cI que provoca
la lisogenia, generando placas turbias.
• Cuando se inserta una secuencia en el gen cI, las placas son
transparentes.
Detección mediante hibridación de ácidos nucleicos
- Bueno si hay un alto grado de homología:
- sondas homólogas (del mismo organismo)
- sondas heterólogas (de un organismo relacionado)
• Tipos de sondas
- cDNA: método más/menos o simplemente usando un cDNA conocido
- ADN genómico
- Oligonucleótidos
- ARN
a. Utiliza sondas derivadas de los extremos de clones
superpuestos para permitir el paseo a lo largo de la
secuencia. Se va identificando y le da la sonda para que
pueda avanzar. Y asi se ensambla una secuencia continua
larga.
b. Las regiones que son difíciles de clonar se saltan.
Sondas aislar fragmentos de sitios distantes en un solo clon
circularizando un fragmento grande y asila la región con la
sonda original y la distante. Se usa para aislar un clon que
contine secuencias de la región distante.
How to deal with the degeneracy of the code
● Se puede sintetizar una sonda mixta que cubra todas las secuencias posibles variando las
combinaciones de bases en las posiciones de oscilación degeneradas.
● La inosina (un nucleósido natural) puede usarse en partes altamente degeneradas de la secuencia
● (Un par de bases oscilantes es un emparejamiento entre dos nucleótidos en moléculas de ARN
que no sigue las reglas de pares de bases de Watson-Crick)
Southern: fragmentos de ADN, generados por digestión de restricción, se someten a electroforesis en gel
de agarosa
Northern blotting: lo mismo pero con ARN
• Se usa más a menudo como un método para medir los niveles de transcripción durante la expresión de
un gen en particular.
Dot blotting: las muestras de ácido nucleico no se someten a electroforesis pero se manchan en los filtros.
La hibridación se puede llevar a cabo como para las transferencias Northern y Southern. Esto es
particularmente útil para obtener datos cuantitativos en el estudio de la expresión génica.
Blotting Western: Para proteínas. Puede ser útil para medir la cantidad de una proteína en particular en la
célula en un momento dado.
Ingeniería Genética y Biotecnología
Fabricación de proteínas
- Las proteínas nativas se sintetizan directamente a partir del extremo N del ADNc, mientras que las
proteínas de fusión contienen secuencias de aminoácidos N-terminales cortas codificadas por el
vector.
- Sistemas de expresión de baculovirus. Los baculovirus infectan células de insectos, no células de
mamíferos. Requiere medios de cultivo más complejos que las células de levadura. Buenos PTM.
- Líneas celulares de mamíferos. Medios caros. Células frágiles. Los promotores comunes se basan en
el virus de los simios (SV40) o el citomegalovirus
Proteínas nativas y de fusión
a. Una proteína nativa de su propio extremo N.
La secuencia codificante del gen clonado (sombreado) no
está precedida por la secuencia codificante bacteriana; por
lo tanto, el ARNm codifica solo residuos de aminoácidos
especificados por inserción.
b. La fusión de genes contiene codones
bacterianos (sombreados); por lo tanto, la proteína
contiene parte de la proteína bacteriana. En este ejemplo,
los primeros tres residuos de aminoácidos N-terminales
son de origen bacteriano (sombreados). El sitio de unión al
ribosoma, o secuencia Shine-Dalgarno, está marcado como
SD.
Ingeniería de proteínas
● Implica alterar la estructura de las proteínas a través de alteraciones en la secuencia del gen.
● Alteración de la actividad catalítica de una enzima por modificación de los residuos alrededor del
sitio activo
● Mejora del estado nutricional de una proteína de reserva
● Mejora en la estabilidad de una proteína utilizada en la industria o la medicina
● Las proteínas que han sido modificadas mediante la incorporación de cambios mutacionales se
conocen como "muteínas"
Diseño racional
- Necesita conocimientos previos sobre la proteína, su secuencia, el posible efecto que tendría una
mutación
- Mutagénesis dirigida al sitio. Uso de cebadores con la mutación a introducir
- Evolución dirigida. Se genera una gran cantidad de alteraciones diferentes y se selecciona la
variante deseada mediante un proceso que imita la selección natural.
- Mutagénesis aleatoria con PCR propensa a errores o mezcla aleatoria de ADN mezclando
fragmentos de ADN de variantes conocidas
- Síntesis de la secuencia. ($) Dependiendo de la longitud R
Muta génesis dirigida por oligonucleótidos
a) El requisito para la mutagénesis in vitro es una plantilla de ADN
monocatenario +gen clonado (línea gruesa). Se sintetiza un
oligonucleótido que es complementario a la parte del gen que se va a
mutar (mutación deseada). La plantilla ss a menudo se produce
utilizando el sistema de clonación M13.
b) La molécula se vuelve bicatenaria en una reacción que usa ADN
polimerasa y ligasa ADN híbrida de tipo salvaje/mutante con un
desajuste en la región mutada.
c) Al introducirse en E. coli, la molécula se replica doble cadena
tipo salvaje (WT) y mutante (M). El mutante porta la mutación original y
su base o secuencia complementaria (estrella negra). La identificación
del ADN mutado puede llevarse a cabo por hibridación con la secuencia
de oligonucleótidos mutantes, que está radiomarcada.
Del laboratorio a la planta de producción
- Downstream processing (DSP) implica la separación del producto de cualquier co-producto o
desecho, y llevarlo a una etapa en la que la formulación sea adecuada para su distribución.
- A menudo, el producto se suspenderá o disolverá en un líquido, quizás como resultado de un
proceso de fermentación por lotes.
- Puede ser secretado por las células al medio, o puede permanecer en las células y tiene que ser
liberado de ellas.
- Las células pueden ser frágiles o robustas
- El producto puede ser sensible al calor o resistente al ataque químico
- En la mayoría de los casos, hay cuatro etapas clave en DSP: separación, concentración, purificación y
formulación.
- Separación: filtración, centrifugación y sedimentación. El producto puede estar en el pellet o en el
sobrenadante
- Si en el sobrenadante: precipitación, evaporación o adsorción
- La purificación final y la formulación pueden implicar cromatografía, cristalización o liofilización.
- Enfocar
- Limpieza- Redacción
Ejemplos de aplicaciones biotecnológicas de la tecnología rDNA
Producción de enzimas
● Utilizado en elaboración de cerveza, procesamiento de alimentos, fabricación de textiles, la
industria del cuero, los detergentes en polvo, las aplicaciones médicas y la investigación científica
básica…
● Con el tiempo, más recombinante que natural
● Preparados de alto volumen/bajo costo para uso en operaciones a escala industrial o son productos
de bajo volumen/alto valor que pueden tener un mercado muy específico y relativamente limitado
● Las enzimas recombinantes se pueden diseñar => nuevo polimerasas o RE P
Producción de terapéuticos
● Menos debate y más aceptación por parte del público
● Proteínas para suplementación en enfermedades
● Vacunas recombinantes
● Insulina recombinante. 10% de los pacientes con diabetes tipo I y 90% con tipo II
● La insulina fue la primera proteína en ser secuenciada - por Frederick Sanger a mediados de la
década de 1950
Activador tisular del plasminógeno (TPA)
● El TPA actúa sobre una proteasa precursora inactiva llamada plasminógeno, que se convierte en la
forma activa llamada plasmina
● Esta proteasa ataca el coágulo al romper la fibrina, la proteína que participa en la formación del
coágulo. TPA se utiliza como tratamiento para las víctimas de ataques al corazón
● El TPA recombinante fue producido a principios de la década de 1980 por la empresa Genentech
utilizando tecnología de ADNc.
● Primera proteína terapéutica de origen recombinante que se produce a partir de células de
mamífero cultivadas
Aplicaciones médicas de la manipulación de genes
Diagnóstico y caracterización de condiciones médicas
- 5% de los bebés nacen con un trastorno (una anomalía congénita)
- Muchos de ellos tienen una base genética
- 1/3 de las admisiones pediátricas tienen un componente genético, 70% si ingresan más de una vez
- Muchas enfermedades en la edad adulta también tienen una base genética
Diagnóstico de infecciones y enfermedades genéticas
Diagnóstico
● VIH: mejor que ELISA es verificar la presencia del
genoma viral en los linfocitos T
● Lo mismo para la tuberculosis, el VPH y la
enfermedad de Lyme
● Patrones de herencia
● Autosómico/ligado al cromosoma X
● Monogénico / poligénico / multifactorial
● Penetración / expresividad
● Dominancia/codominancia incompleta
La fibrosis quística (FQ)
- Enfermedad genética más común caucásicos occidentales frecuencia de alrededor de 1 en
2000--2500 nacidos vivos.
- Frecuencia de portador: 1 en 20-25 personas
- La esperanza de vida es de solo unos 30 años
- Gen CFTR encontrado por clonación posicional
- El gen tiene un tamaño de unos 250 kbp y codifica 27 exones que producen una proteína de 1480
aminoácidos
- Deleción de 3 pb en el cromosoma 10 -> Phe faltante, lo que afecta el plegamiento de la proteína.
Enfermedad de Huntington
- Polimorfismo de longitud de fragmentos de restricción (RFLP) llamado G8, estrechamente
relacionado con el locus HD
- G8 identificado en 1983, se segrega con el gen HD en el 97% de los casos
- Cerca del final del brazo corto del chr 4
- Repetición de trinucleótido
- Correlación entre el número de repeticiones y la edad de aparición de la enfermedad
- Amplificación por PCR y electroforesis en gel para determinar el número de repeticiones => destino
genético del individuo con respecto a HDH
- Mutaciones en el HTT (Huntingtin) células nerviosas.
- La mutación HTT: segmento conocido como repetición del trinucleótido CAG. Normalmente se
repite de 10 a 35 veces dentro del gen. En personas con enfermedad de Huntington, el segmento
CAG se repite de 36 a más de 120 veces.
- “Anticipación”: en la meiosis masculina suele haber un aumento en el número de repeticiones, lo
que hace que los síntomas aparezcan antes en cada generación posterior.
Los SÍNTOMAS incluyen:
✔ Agitación emocional (depresión, apatía, irritabilidad,
ansiedad, comportamiento obsesivo)
✔ Pérdida cognitiva (incapacidad para concentrarse,
planificar, recordar o tomar decisiones; perspicacia
deteriorada)
✔ Deterioro físico (pérdida de peso, movimientos
involuntarios, disminución de la coordinación, dificultad para
caminar, hablar, tragar)
Terapia de genes
Dos posibles enfoques de la terapia génica:
1. Introducción del gen del transgén en las células somáticas del tejido afectado o
2. Introducción en las células reproductivas (células de la línea germinal)
•Tienen implicaciones éticas muy diferentes
• La terapia de reemplazo de genes requiere la recombinación entre el gen defectuoso y la copia
funcional insertada
• La alternativa es utilizar la terapia de adición de genes. Este enfoque es útil solo si el defecto del
gen no es dominante, en el sentido de que un alelo dominante aún producirá la proteína
defectuosa, que puede superar cualquier efecto del transgén. Ej. por ARNm antisentido
- Terapia génica ex-vivo: extracción de células del paciente, edición de las mismas. sistema
sanguíneo.
- Terapia génica in vivo: para distrofias musculares, aplicando in situ la cura
- Los principales sistemas virales terapia génica se basan en retrovirus, adenovirus y virus
adenoasociados.
- Otros: ADN desnudo, liposomas, lipoplejos (más complejos estructuras que se asemejan a partículas
virales)
- En la actualidad la terapia génica es todavía una aplicación experimental
- En 1999, un joven llamado Jesse Gelsinger estaba recibiendo terapia génica para la deficiencia de
ornitina transcarbamilasa.
- Lamentablemente, sufrió una reacción adversa al vector y murió a los pocos días del tratamiento.
RNAi: matando al mensajero
● El RNAi o RNA de interferencia es un mecanismo limitar la invasión de genes exógenos (virus) y
reprimir estos genes propios.
(A) El RNAi se estima por la presencia de RNA de doble cadena (dsRNA) de varios orígenes* que pasan a ser
cortados por la Enzima Dicer.
(B) Una de las cadenas (20-21 bp) se combina con proteínas para formar el complejo RISC (RNA-duced
silencing complex)
(C) Dicha cadena se aparea entonces con mRNA para inhibir su traducción (función miRNA) o degradarlo
(función siRNA)
(*) MiARN sintético, viral o endógeno (transcripción de repeticiones invertidas de ADN)
miARN = microARN
siARN = ARN pequeño de interferencia
*Cualquier producto génico puede ser el objetivo.
- Sin necesidad de recombinación o expresión de un gen secuencia, como es el caso de la terapia
génica
- Inconveniente: el efecto es transitorio y requiere continua entrega de dsRNA
- Posibles condiciones de uso: macular relacionado con la edad degeneración, retinopatía diabética,
fibrosis quística, VIH infección, hepatitis C, infecciones respiratorias, HD y muchos otros