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UNIVERSIDAD NACIONAL DE CÓRDOBA FACULTAD DE CIENCIAS QUÍMICAS LABORATORIO IV Módulo 4 “Cinética Enzimática” Informe de laboratorio: Determinación de los parámetros cinéticos de la actividad enzimática de fosfatasa alcalina y su inhibición por fosfato inorgánico ALUMNA Chanique, Maria Valentina PROFESOR Fornasier, Santiago José Septiembre 2024 Introducción La cinética enzimática es el estudio de la velocidad de las reacciones químicas que son catalizadas por las enzimas. La catálisis enzimática estudia los mecanismos de catalización por los cuales las enzimas pueden favorecer la reacción de ciertos sustratos y su conversión en productos mediante la aceleración de la velocidad de reacción, disminuyendo la energía de activación. Este actividad se define como: 𝐸 + 𝑆 ⇋ 𝐸𝑆 ⇋ 𝑃 + 𝐸 Para cuantificar la velocidad de reacciones catalizadas, Michaelis y Menten propusieron dos suposiciones que permitieron determinar los parámetros cinéticos más importantes para las reacciones de catálisis enzimática: la constante de Michaelis (KM) y la velocidad máxima (Vmax). Ambos parámetros son utilizados en la ecuación de Michaelis-Menten para calcular la velocidad inicial (Vo): 𝑉𝑜 = 𝑉𝑚𝑎𝑥× 𝑆[ ] 𝐾𝑀+ 𝑆[ ] En la catálisis enzimática existen a su vez, sustancias que inhiben la acción de las enzimas. Los inhibidores reversibles se unen de distintas formas a la enzima y alteran la cinética de la reacción, modificando los valores KM y Vmax. Dentro de ellos se diferencian tres tipos: competitivo, no competitivo y acompetitivo. En esta oportunidad, durante la actividad experimental se determinará si la reacción de la fosfatasa alcalina se ajusta al modelo de Michaelis-Menten. Esta información hará posible establecer el tiempo en que la velocidad aumenta linealmente y el tiempo más adecuado de incubación para obtener el valor de Vo. Seguido a esto se obtendrán los parámetros cinéticos en ausencia y presencia de un inhibidor para analizar su efecto sobre la reacción y de esta manera determinar qué tipo de inhibidor fue utilizado. Objetivos - Evaluar la actividad enzimática de Fosfatasa Alcalina y determinar su velocidad inicial. - Obtener experimentalmente los parámetros cinéticos del modelo de Michaelis y Menten. - Observar cómo estos parámetros son alterados por la presencia de un inhibidor. - Determinar el tipo de inhibición que ejerce el fosfato inorgánico sobre la actividad Fosfatasa. Metodología A) Determinación de condiciones de velocidad inicial. Se utilizaron 5 tubos de Khan, a 4 de ellos se les agregó cantidades específicas de Buffer Tris 10 mM pH 8, cofactores 10 mM y 1 mM, sustrato 3 mM y enzima.𝑀𝑔𝐶𝑙 2 𝑍𝑛𝑆𝑂 4 Luego fueron llevados a incubar, cada tubo durante diferentes tiempos. Al alcanzar el tiempo de incubación de cada tubo, se le agregó a cada uno 0,1 M para inhibir la catálisis𝑁𝑎𝑂𝐻 enzimática, ya que lleva a la reacción a un pH alcalino en el cual ya no reacciona. Al 5to tubo se lo utilizó como blanco, se le agregó iguales cantidades de las mismas sustancias, con la diferencia de que la enzima se agregó luego de la incubación. Finalmente se midió con un espectrofotómetro la absorbancia de cada tubo a 410 nm. B) Determinación de los parámetros cinéticos Km y Vmáx. Efecto de inhibidores. Parte 1: En primer lugar, se realizó la experiencia sin presencia de un inhibidor para luego poder realizar una comparación. Se utilizaron 8 tubos de Khan, a 7 de ellos se les agregó cantidades específicas de Buffer Tris 10 mM pH 8, cofactores 10 mM y𝑀𝑔𝐶𝑙 2 𝑍𝑛𝑆𝑂 4 1 mM, sustrato 3 mM y enzima. Luego fueron llevados a incubar durante 5 minutos. Al alcanzar el tiempo de incubación se agregó a cada uno 0,1 M para inhibir la catálisis𝑁𝑎𝑂𝐻 enzimática, ya que lleva a la reacción a un pH alcalino en el cual ya no reacciona. Al 8vo tubo se lo utilizó como blanco, se le agregó iguales cantidades de las mismas sustancias, con la diferencia de que la enzima se agregó luego de la incubación. Finalmente se midió con un espectrofotómetro la absorbancia de cada tubo a 410 nm. Parte 2: Seguido a esto, para estudiar si el ion fosfato inorgánico ejerce alguna acción inhibitoria sobre la catálisis, se repitió la experiencia pero ahora en presencia del posible inhibidor, es decir, se agregó cantidad específica de Fosfato 5 mM a cada tubo. Parte 3: Se realiza una comparación entre los parámetros obtenidos de soluciones en ausencia y presencia de inhibidor. Resultados obtenidos y discusión A) Determinación de condiciones de velocidad inicial. Curva de producto vs. tiempo. Tabla 1. Datos soluciones (obtenidos). Tubo Nº Cofactores (μL) Buffer pH 8 (μL) Sustrato 3 mM (μL) Enzima (μL) Tiempo de incubación (min) Abs. (410 nm) Producto formado (μM) 1 65 540 25 30 5 0,758 109 2 65 540 25 30 10 0,596 85,5 3 65 540 25 30 15 0,840 121 4 65 540 25 30 20 0,748 107 Blanco 65 540 25 30 5 0 0 Cálculos para obtener la concentración de producto formado: Ejemplo con el tubo 1: Gráfico 1. Curva Concentración de producto vs. Tiempo (obtenida). Como se puede observar, los valores obtenidos presentan mucha dispersión y no siguen la tendencia esperada, la cual indica que a mayor tiempo de incubación más producto se va a formar y por lo tanto mayor será la absorbancia. Este resultado pudo deberse a la utilización de materiales sucios, a errores en el momento de pipetear las soluciones con las micropipetas o a errores al cronometrar el tiempo de incubación ya que son pasos que necesitan realizarse con gran cuidado y atención. Para poder realizar un estudio más adecuado, se utilizaron los datos de absorbancia obtenidos por otra mesada de trabajo. A continuación se presentan los siguientes, indicados como datos y resultados esperados. Tabla 2. Datos soluciones (esperados). Tubo Nº Abs. (410 nm) Producto formado (μM) 1 0,299 43 2 0,444 63,9 3 0,696 100 4 0,669 96,1 Blanco 0 0 Los cálculos para obtener la concentración de producto formado fueron realizados de la misma manera que para la Tabla 1. Gráfico 2. Curva Concentración de producto vs. Tiempo (esperada). En el gráfico se puede observar que la tendencia lineal, en donde se cumplen las condiciones de Vo, solo se da hasta los 5 minutos, ya que pasado ese tiempo la linealidad deja de existir y comienzan a existir variaciones. Esta elección de tiempo no es del todo confiable, ya que utilizando sólo 2 puntos siempre se obtendrá una recta, lo correcto sería obtener más de dos puntos que cumplan con la linealidad, pero debido a que a tiempos mayores las condiciones necesarias de Vo dejan de cumplirse y a tiempos menores se obtendrían concentraciones de productos muy bajas, se calcula el valor de Vo utilizando solo dos puntos (0 y 5). La Velocidad inicial se calculó como 𝑉𝑜 = [𝑃]𝑖 𝑡𝑖𝑒𝑚𝑝𝑜 = 43,0 µ𝑀 5 𝑚𝑖𝑛 = 8, 6 µ𝑀/𝑚𝑖𝑛 Según el modelo de Michaelis-Menten, en el caso que se aumente la concentración de enzima la Vo dejará de aumentar y empezará a disminuir, por lo que las suposiciones del modelo de Michaelis-Menten dejarán de ser efectivas. Si la concentración de sustrato se incrementa, se llegará a un punto en el que la enzima se satura y la velocidad de reacción deja de variar, alcanzado de esta manera un valor máximo. B) Determinación de los parámetros cinéticos Km y Vmáx. Curva de Velocidad inicial vs. Concentración de sustrato. Efecto de inhibidores. Parte 1: Experiencia de soluciones sin posible inhibidor. Tabla 3. Soluciones sin inhibidor. Tubo Nº Cofactores (μL) Sustrato 3 mM (μL) Buffer pH 8 (μL) Enzima (μL) Abs. (410 nm) Sustrato (μM) Producto formado (μM) Vo (μM/m in) 1 𝑆[ ] (1/μM) 1 𝑉𝑜[ ] (min/μM) 1 65 5 560 30 0,059 23 8,48 1,70 0,04 0,59 2 65 10 555 30 0,061 45 8,75 1,75 0,02 0,57 3 65 15 550 30 0,121 68 17,38 3,48 0,01 0,29 4 65 25 545 30 0,181 114 25,91 5,18 0,009 0,19 5 65 100 465 30 0,246 454 35,21 7,04 0,002 0,14 6 65 300 265 30 0,294 1364 42,25 8,45 0,0007 0,12 7 65 550 15 30 0,286 2500 41,10 8,22 0,0004 0,12 Bco. 65 25 540 30 0 - - - - - Cálculos realizados. Tubo1 a modo de ejemplo. Gráfico 3. Velocidad inicial vs. Concentración de Sustrato, ajuste no lineal con la ecuación de Michaelis-Menten. Eje X: [S] (μM) Eje Y: Vo (μM/min) a= 8.848 ± 0.399 b= 107.3 ± 18 Vmáx= a= 8,848 KM= b= 107,3 Gráfico 4. 1/Vo vs. 1/[S], regresión lineal ecuación de Lineweaver-Burk. Eje X: 1/[S] (1/μM) Eje Y:1/Vo (min/μM) a= 13.31 ± 2.58 b= 0.132 ± 0.046 Vmáx= 1/b=7,58 KM= Vmáx x a= 100,83 Cálculos de error: ∆𝑉𝑚𝑎𝑥 = ∆𝑏 𝑏2 = 2, 64 ∆𝐾𝑀 = 𝐾𝑀 × ∆𝑎 𝑎( )2 + ∆𝑉𝑚𝑎𝑥 𝑉𝑚𝑎𝑥( )2 = 39, 32 Parte 2: Experiencia de soluciones con posible inhibidor. Tabla 4. Soluciones con inhibidor (obtenidos). Tubo Nº Cofactor es (μL) Sustrato 3 mM (μL) Buffer pH 8 (μL) Enzima (μL) Fosfato (μL) Abs. (410 nm) Sustrato (μM) Producto formado (μM) Vo (μM/min) 1 65 5 495 30 65 0,191 23 27,4 4,48 2 65 10 490 30 65 0,369 45 52,3 10,46 3 65 15 485 30 65 0,477 68 68,5 13,70 4 65 25 475 30 65 0,497 114 85,7 17,14 5 65 100 400 30 65 0,673 454 96,6 19,33 6 65 300 200 30 65 0,726 1364 104 20,84 7 65 550 - 30 65 0,783 2320 108 22,48 Bco. 65 25 475 30 65 0 - - - Se realizaron los mismos cálculos que en la parte A. Gráfico 5. Velocidad inicial vs. Concentración de Sustrato, ajuste no lineal con la ecuación de Michaelis-Menten (obtenido). Eje X: [S] (μM) Eje Y: Vo (μM/min) a= 21.973 ± 0.771 b= 47.13 ± 7 Vmax ap. = a= 21.973 KM ap. = b= 47.13 Analizando los parámetros cinéticos obtenidos y comparando los mismos con los resultados alcanzados utilizando las soluciones sin inhibidor, es claro que Vmáx aparente > Vmáx y KM aparente KM. En búsqueda de un análisis correcto, se utilizaran los datos proporcionados por el profesor. A continuación se presentan los siguientes como datos y resultados ESPERADOS. Tabla 5. Soluciones con inhibidor (esperados). Tubo Nº Cofactores (μL) Sustrato 3 mM (μL) Buffer pH 8 (μL) Enzima (μL) Fosfato (μL) Abs. (410 nm) Sustrato (μM) Producto formado (μM) Vo (μM/m in) 1 𝑆[ ] (1/μM) 1 𝑉𝑜[ ] (min/μ M) 1 65 5 495 30 65 0,024 23 3,44 0,69 0,04 1,45 2 65 10 490 30 65 0,054 45 7,75 1,55 0,02 0,64 3 65 15 485 30 65 0,088 68 12,6 2,52 0,01 0,40 4 65 25 475 30 65 0,135 114 19,4 3,88 0,009 0,26 5 65 100 400 30 65 0,333 454 47,8 9,56 0,002 0,11 6 65 300 200 30 65 0,350 1364 50,3 10,06 0,0007 0,10 7 65 550 - 30 65 0,408 2320 56,1 11,22 0,0004 0,09 Bco. 65 25 475 30 65 0 114 0 0 0 0 Se realizaron los mismos cálculos que en la parte A. Gráfico 6. Velocidad inicial vs. Concentración de Sustrato, ajuste no lineal con la ecuación de Michaelis-Menten (esperado). Eje X: [S] (μM) Eje Y: Vo (μM/min) a= 12,449 ± 0.748 b= 230,3 ± 49 Vmáx ap. = a= 12,449 KM ap. = b= 230,3 Gráfico 7. 1/Vo vs. 1/[S], regresión lineal ecuación de Lineweaver-Burk (esperado). Eje X: 1/[S] (1/μM) Eje Y:1/Vo (min/μM) a= 34,07 ± 1.77 b= 0,0358 ± 0.031 Vmáx ap. = 1/b=27,93 KM ap. = Vmáx x a= 951,68 Cálculos de error: ∆𝑉𝑚𝑎𝑥 𝑎𝑝. = ∆𝑏 𝑏2 = 21, 19 ∆𝐾𝑀 𝑎𝑝. = 𝐾𝑀 𝑎𝑝. × ∆𝑎 𝑎( )2 + ∆𝑉𝑚𝑎𝑥 𝑉𝑚𝑎𝑥( )2 = 827, 96 Parte 3: Comparación entre parámetros. Tabla 6. Comparaciones de los valores obtenidos, sin y con inhibidor. Sin inhibidor Con inhibidor KM (uM) Error (uM) Vmáx (uM/min) Error (uM/min) KM ap (uM) Error (uM) Vmáx ap (uM/min) Error (uM/min) Regresión hiperbólica 11𝑥101 2𝑥101 8, 8 0, 4 23𝑥101 5𝑥101 12, 4 0, 7 Lineweaver-Burk 10𝑥101 4𝑥101 8 3 10𝑥102 8𝑥102 3𝑥101 2𝑥101 Un inhibidor competitivo tiene afinidad por el sitio activo de una enzima, en el cual también se une el sustrato, es decir inhibidor y sustrato compiten por la enzima. Entonces, como el inhibidor interfiere en la unión del sustrato con la enzima, el valor de KM aumenta ya que la afinidad de la enzima por el sustrato disminuye. Por otro lado, el valor de Vmáx se mantiene relativamente igual, ya que no interfiere en la formación del complejo ES. Con los resultados obtenidos se puede concluir entonces que el Fosfato Inorgánico actúa como un inhibidor competitivo ya que, ante la presencia del mismo, los parámetros cinéticos varían de la siguiente manera: Vmáx ≈ Vmáx ap y KM
