Tese_Etelvina_v04_12-4- 2018 (1) (1)

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FACULDADE DE VETERINÁRIA
DEPARTAMENTO DE PARA-CLÍNICAS
TRABALHO DE CULMINAÇÃO DE ESTUDOS
TEMA: Ocorrência e identificação das espécies de Eimeria sp em lesões intestinais macroscópicas de frangos de corte abatidos num Matadouro da Cidade de Maputo. 
	AUTORA
	SUPERVISOR
	Etelvina Piedade Tomás Nhauio
	Dr. Hermógenes Mucache
	
	CO-SUPERVISORES:
Dra. Regina Daniel Miambo
.
Maputo, Abril de 2017
DECLARAÇÃO DE HONRA
Declaro que o presente trabalho intitulado “Ocorrência e identificação das espécies de Eimeria sp em lesões intestinais macroscópicas de frangos de corte abatidos num Matadouro da Cidade de Maputo” foi por mim elaborado e que nunca foi usado para outro propósito, que não seja para minha candidatura o grau de licenciatura em Medicina Veterinária.
Maputo, Abril de 2018
_______________________________
(Etelvina Piedade Tomás Nhauio)
DEDICATÓRIA
“Dedico este trabalho primeiramente а Deus, por ser essencial na minha vida, autor do mеυ destino, mеυ guia, socorro presente na hora da angústia, ао mеυ pai Tomás Ticane Nhauio, minha mãe Sara João Vilanculos е a minha irmã Edvanusa Piedade Tomás Nhauio, pois sem eles este trabalho e muitos dos meus sonhos não se realizariam.”
AGRADECIMENTOS
Primeiramente а Deus por mais uma conquista na minha vida, е por todas oportunidades que tive durante toda minha vida, pela saúde, pela família que tanto tenho orgulho de ter e por sempre me dar forças para seguir em busca de novas conquistas. 
Agradeço а minha mãe Sara João Vilanculos, heroína qυе me dеυ apoio, incentivo nas horas difíceis, de desânimo е cansaço. Ao mеυ pai qυе apesar dе todas as dificuldades me fortaleceu е qυе para mim foi muito importante.
Obrigada meus irmãos е sobrinhos, que nos momentos dе minha ausência dedicados ао estudo superior, sempre fizeram entender qυе о futuro é feito а partir da constante dedicação no presente.
Devo uma enorme gratidão aos meus supervisores: Dr. Hermógenes Mucache, Dra. Regina Daniel Miambo e Dr. Marco Alves pelos ensinamentos, paciência, compreensão, críticas construtivas e creio que sem elas este trabalho não seria uma realidade. Muito obrigado!
De igual modo, manifesto a minha gratidão aos técnicos do Laboratório de Parasitologia, dr. Basílio e Dona Olga pelos ensinamentos e apoio prestados durante o processamento das amostras.
À minha irmã Edvanusa Piedade Tomás Nhauio o meu especial agradecimento pela sua compreensão, puxões de orelha e incansável dedicação.
À Megaive Manuel Sitoe pelo carinho, amor, companhia, paciência, cumplicidade ao longo desta caminhada.
Meus agradecimentos аоs amigos: Benvinda Siueia, Augusto Messa Júnior, Leotélio Sitoe, Armando Massango, Florêncio Bahule, Raimundo Mangane, Fáuzio Abdul, Doglas Cossa, Helga Carimo, Plácida Maholela, Dirce Manguena, Calisto Macarringue, Orlando Matlava, Albert Mauro Nicolau, Kelvin Matangala, companheiros dе trabalhos е irmãos nа amizade qυе fizeram parte dа minha formação е qυе vão continuar presentes em minha vida cоm certeza.
À Faculdade de Veterinária – Universidade Eduardo Mondlane e a todos docentes e membros do Corpo Técnico e Administrativo (CTA) por todas as oportunidades que me concederam de apreender e por todos os ensinamentos que me transmitiram sobre a arte da Medicina Veterinária e postura profissional, bem como pela paciência e incentivo desde o primeiro dia
A todos qυе direta оυ indiretamente fizeram parte dа minha formação, о mеυ muito obrigado.
LISTA DE ABREVIATURAS
% - Por cento 
°C – Graus celsius
µm – Micrómetros
DNA – Acido desoxirribonucleico
IM – Índice morfométrico 
km – Quilómetro quadrado
OOPG – Ooquistos por grama de fezes 
P1 – Unidade 1
P2 – Unidade 2
PCR – Reação em Cadeia da Polimerase.
SCARs – Regiões Amplificadas Caracterizadas por Sequências
LISTA DE TABELAS E GRÁFICOS 
Tabela I - Lesões macroscópicas características das espécies de Eimeria em galinhas (Saif, 2008; Gerhold Jr, 2014).	9
Tabela II - Concentração de fármacos usados no tratamento da cocidiose aviária (Spinosa, Górniak e Bernardi, 2011; Gerhold Jr, 2014).	11
Tabela III-Frequência de ocorrência de infeções por Eimeria sp pelo método de Willis por local de proveniência.	20
Tabela IV -Medianas de ooquistos por grama de fezes (OOPG) das 6 unidades avículas.	1
Tabela V - Características morfológicas das espécies de Eimeria identificadas em frangos de corte.	1
Tabela VI-Espécies insoladas e identificadas por unidade avícula	2
Tabela VII – Distribuição de espécies por amostras.	2
Gráfico I-Frequência de lesões observadas nas diferentes porções do trato gastrointestinal	18
Gráfico II-Frequência dos graus de lesão observadas nas diferentes porções do trato gastrointestinal	19
Gráfico III-Frequência de ocorrência de infeções por Eimeria sp pelo método de Willis por proveniência	21
Gráfico IV-Intervalos de ovos por gramas de fezes das 6 unidades avículas.	21
LISTA DE TABELAS ANEXAS
Tabela anexa I - Sistema de pontuação das lesões intestinais causadas pela E. acervulina.	38
Tabela anexa II - Sistema de pontuação das lesões intestinais causadas pela E. maxima.	38
Tabela anexa III - Sistema de pontuação das lesões intestinais causadas pela E. tenella.	39
Tabela anexa IV - Sistemas de pontuação das lesões causadas pela E. necatrix.	39
Tabela anexa V - Características dos ooquistos das principais espécies de Eimeria em Aves (Soulsby,1987; Saif,2008).	40
LISTA DE FIGURAS
Figura I - Ciclo de vida da E. tenella (Trees, 2002).	7
Figura II - Ooquistos esporulados das diferentes espécies de Eimeria sp identificadas.	23
ÍNDICE
RESUMO	1
1	INTRODUÇÃO	2
2	OBJECTIVOS	4
2.1	Geral	4
2.2	Específicos	4
3	REVISÃO BIBLIOGRÁFICA	5
3.1	O gênero Eimeria	5
3.2	Ciclo de vida	6
3.3	Epidemiologia	7
3.4	Patogenicidade	8
3.5	Lesões histopatológicas	8
3.6	Sinais clínicos	9
3.7	Diagnóstico	10
3.8	Tratamento	11
3.9	Controlo e profilaxia	11
3.9.1	Quimioprofilaxia	11
3.9.2	Imunoprofilaxia	12
3.9.3	Medidas sanitárias	13
4	MATERIAIS E MÉTODOS	14
4.1	Local de estudo	14
4.2	Determinação do tamanho da amostra	14
4.3	Colheita de amostras	14
4.4	Processamento das amostras	15
4.4.1	Exame macroscópico	15
4.4.2	Identificação de espécies de Eimeria	15
4.4.2.1	Teste qualitativo de Willis	15
4.4.2.2	Esporulação em dicromato de potássio (K2Cr2O7)	16
4.4.2.3	Determinação do número de ooquistos por gramas de fezes	16
4.4.2.4	Determinação dos índices morfométricos.	16
4.5	Análise de dados	17
5	RESULTADOS	18
5.1	Exame macroscópico	18
5.2	Teste qualitativo de Willis	20
5.3	Avaliação da carga parasitária pelo método de McMaster	21
5.4	Identificação dos ooquistos	22
6	DISCUSSÃO	24
7	CONCLUSÃO	28
8	RECOMENDAÇÕES	29
9	REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS	30
ANEXOS	36
Anexo I - Protocolo para realização da técnica de flutuação pelo método de Willis (Ueno e Gonçalves, 1998).	36
Procedimento	36
Anexo II - Protocolo para realização da contagem de ovos por gramas de fezes pelo método de MacMaster (Ueno e Gonçalves, 1998).	36
Procedimento	36
Anexo III-Protocolo para realização de esporulação de ooquisto de Eimeria em Dicromato de Potássio.	37
Procedimento	37
Anexo IV - Concentração dos ooquistos de Eimeria.	37
Procedimento	37
Anexo V - Sistemas de quantificação das lesões intestinais por Eimeria sp em aves segundo Duffy et al. (2005).	38
Anexo VI – Características dos ooquistos das espécies causadoras de coccidiose aviária	40
3
RESUMO
A cocidiose aviaria é uma doença causada por protozoários intracelulares do género Eimeria, é amplamente distribuída nas regiões de produção avícola. Constituí um problema de grande impacto económico na avicultura industrial em vários países do mundo devido as lesões graves que causa na mucosa do trato gastrointestinal das aves que levam a alterações no processo digestivo, comprometendo o processo normal de absorção de nutrientes resultando em altas taxas de mortalidade, morbilidade e perda de peso bem como o aumento da suscetibilidade a infeções bacterianas secundárias das aves afetadas. O objetivo do presente estudo, foi identificar as espécies de Eimeria em lesões intestinais macroscópicas em frangos de corte abatidosnum Matadouro da Cidade de Maputo.
O estudo decorreu de Maio a Junho de 2017, e durante este período foram colhidas 246 amostras de fezes de frangos de corte abatidos num matadouro, com lesões gastrointestinais sugestivas de coccidiose. As amostras foram testadas para presença de ooquistos de Eimeria sp, quantificação da infecção usando os testes de Willis e McMaster respetivamente. A identificação das espécies foi feita com base nas características métricas, morfológicas e localização das lesões no trato gastrointestinal.
Das 246 amostras colhidas, 177 amostras (71.95%), foram positivas a presença de ooquistos no exame de Willis e nas restantes 69 amostras (28.05%) não foram observados ooquistos. Em relação a intensidade da infecção grande parte dos animais (60.45%), apresentou altas contagens de ooquisto. Das 177 amostras positivas 145 foram examinadas para identificação das espécies usando as características métricas e morfológicas dos ooquistos. Nove espécies foram insoladas no estudo, e cinco foram identificadas com base nos guias de diagnóstico nomeadamente E. maxima (30,8%), E. praeocox (21.6%), E. brunetti (14.7%), E. tenella (6.7%), E. acervulina (0.8 %). Neste estudo foram observadas elevadas frequências de infecções mistas (95.9 %),envolvendo na maior parte das vezes 7 espécies de Eimeria numa única amostra. .Com base na localização das lesões no trato gastrointestinal foram diagnosticadas presuntivamente as seguintes espécies E. maxima (34.96 %), E. necatrix (38.62 %), E. tenella (26.02 %) e E. acervulina (0.41 %). 
Palavras-chave: coccidiose aviária; Eimeria; intestinos; lesões; ooquistos
INTRODUÇÃO
A produção avícola e suinícola industrial são as principais actividades pecuárias que com rapidez fornecem proteína animal para consumo humano (Almeida e Cardoso, 2001; Fornace et al., 2013). Em Moçambique a produção de frangos de corte tem merecido um lugar de destaque na economia nos últimos tempos porque além de constituir uma fonte de emprego e rendimento, contribui para a segurança alimentar da população rural e urbana (IIAM, 2012).
Para atender ao aumento incessante da produção avícola, buscando qualidade e baixo custo, tornou-se necessário a utilização de sistemas intensivos de criação. A adoção de métodos intensivos de produção com sistemas de biossegurança limitados, levou a um aumento da pressão de infeção por parte dos organismos patogénicos e desta forma bactérias, vírus, fungos, protozoários, endo e ectoparasitas, entre outros agentes patogénicos, passaram a ter uma importância neste sistema de criação (Tomasi, 2006; Fornace et al., 2013). 
Nesse contexto destaca-se a coccidiose aviária, que é uma doença causada por protozoários intracelulares do género Eimeria sp (Urquhart et al., 1998; Dinka e Tolossa, 2012). A transmissão da infeção ocorre através de ingestão de ooquistos esporulados nas fezes ou alimentos contaminados (Trees, 2002; Musa et al., 2010; Saif, 2008). A cocidiose é amplamente distribuída nas regiões de produção avícola, e constituí um problema de grande impacto económico na avicultura industrial em vários países do mundo, pois os protozoários do gênero Eimeria sp multiplicam-se no tecido epitelial do intestino das aves, causando desta forma lesões graves na mucosa que levam a alterações no processo digestivo, comprometendo o processo normal de absorção de nutrientes resultando em altas taxas de mortalidade, morbilidade e perda de peso das aves afetadas (Thebo et al., 1999; Dinka e Tolossa, 2012; Kheirabadi et al., 2014). Apesar da grande variedade de fármacos anticoccidicos e vacinas usadas no controlo e prevenção desta parasitose (Williams, 2002; McDonald e Shirley, 2009), os prejuízos directos causados pela coccidiose aviária incluem menor ganho de peso, altas taxas de mortalidade, aumento da frequência de infecções secundárias e dos custos com os tratamentos quimioterapêuticos. Os custos indirectos estão relacionados com uso fármacos anticoccidicos e vacinas na prevenção da infeção (Shirley et al., 2005).
O método de diagnóstico rotineiramente utilizado em granjas é centrado na classificação e nas características das lesões intestinais causadas pelas diferentes espécies (E. acervulina, E. maxima, E. tenella, E. brunetti e. necatrix) consideradas importantes na produção avícola por causarem lesões intestinais e alterações patológicas características em locais de predileção ao longo do intestino, facilitando assim o seu diagnóstico (Fraser et al., 1997).
No entanto, esta técnica apresenta desvantagens uma vez que não possibilita definir a presença de algumas espécies (E. praecox e E. mitis), por não causarem lesões macroscópicas que facilitem o seu diagnóstico; porém infeções experimentais em aves por estas espécies resultaram em enterites, diarreia e redução da eficiência alimentar, o que indica que estas duas espécies também são responsáveis pelas perdas verificadas nas granjas (Allen e Fetterer, 2002; Vertommen, 2004). Daí a necessidade de fazer o exame parasitológico das fezes das galinhas, para auxiliar na identificação das espécies para que não ocorram erros de diagnóstico.
Em Moçambique, a informação divulgada sobre as espécies de Eimeria sp que afetam os frangos de corte é escassa, porém em um estudo realizado nas aldeias do distrito de Sussundenga na província de Manica reportou se a existência de cinco espécies em galinhas criadas em sistemas extensivos, nomeadamente E. maxima, E. necatrix, E. brunetti, E. tenella e E. acervulina, sendo a E. tenella a mais frequente (50%) (dos Anjos et al., 2005).
As perdas observadas na indústria avícola demostram o impacto económico causado pela cocidiose na avicultura, e a sua importância na produção avícola, justificando desta forma a realização deste trabalho para que se possam conhecer as diferentes espécies de Eimeria sp que assolam os frangos de corte por forma auxiliar os produtores a desenhar medidas de prevenção e controlo desta parasitose, promover redução dos gastos na produção e aumentar a produtividade das granjas.
OBJECTIVOS
Geral
· Pesquisar as espécies de Eimeria responsáveis pela coccidiose em frangos de corte na Cidade Maputo.
Específicos
· Descrever as lesões macroscópicas gastrointestinais e fazer a correlação destas com as espécies de Eimeria em lotes de frangos abatidos num Matadouro da cidade de Maputo;
· Fazer o isolamento e identificação de ooquistos de Eimeria em frangos de corte abatidos num Matadouro da cidade de Maputo;
· Determinar a intensidade de infeção por Eimeria sp em aves abatidas num Matadouro da cidade de Maputo.
· Determinar a frequência de ocorrência das espécies de Eimeria em frangos de corte num Matadouro da cidade de Maputo.
REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
Coccidiose é um termo genérico usado para designar a invasão, em geral aguda, com destruição da mucosa intestinal por protozoários dos géneros Eimeria, Isospora, Cystoisospora ou Cryptosporidium; é uma doença de grande importância em aves domésticas, ruminantes, suínos e coelhos; a doença clínica ocorre em condições sanitárias inadequadas, superlotação, nutrição inadequada ou stress (Fraser et al., 1997).
Na galinha, os protozoários do género Eimeria são responsáveis pela coccidiose aviária, que atinge principalmente frangos de corte e matrizes e aves de postura provocando a destruição do tecido intestinal, levando a alterações no processo digestivo que culminam com a redução da ingestão de alimentos, perda de peso, absorção de nutrientes, bem como aumenta a suscetibilidade a infeções bacterianas secundárias (Kawazoe, 2000, Morris et al., 2007, Bostvironnois e Zadjian, 2011). Segundo Lanckriert et al. (2010), algumas doenças virais imunossupressoras como a bursite infeciosa e a anemia viral das galinhas, podem exacerbar a coccidiose. As infeções subclínicas são as mais comuns em frangos de corte, e apesar de serem subestimadas resultam na redução da conversão alimentar, baixa uniformidade do lote e redução no crescimento das aves (Hafez, 2008).
O gênero Eimeria
O agente etiológico da coccidiose aviária pertence ao filoApicoplemplexa, que é caracterizado por apresentar um complexo apical (que auxilia na penetração dos estágios invasivos nas células dos hospedeiros), subfilo Sporozoa, classe Coccidia, Família Eimeridae, género Eimeria (Urquhart et al., 1998; Taylor et al., 2007; Dinka e Tolossa, 2012).
O gênero apresenta 9 espécies descritas em galinhas, sendo 7 as que afetam as galinhas causando coccidiose, nomeadamente E. acervulina, E. tenella, E. necatrix, E. maxima, E. brunetti, E. mitis, E. praecox, (destas, as 3 primeiras causam as infecções mais severas) (Saif, 2008; Gerhold Jr, 2014). As espécies E. acervulina, E. tenella, E. maxima são as mais comuns em frangos de corte, seguidas de E. mitis, E. praecox e E. brunetti. A E. necatrix é tida como a causa mais comum de coccidiose em matrizes reprodutoras (Cornelissen et al., 2009). Estas espécies apresentam grande especificidade em relação ao hospedeiro, sendo específicas para as galinhas, não sendo transmitidas a outros animais e vice-versa, porém, mais de uma espécie pode infectar o mesmo indivíduo em simultâneo (Urquhart et al., 1998; Shirley et al., 2005).
Durante o ciclo evolutivo os parasitas apresentam várias formas morfológicas (espozoito, trofozoíto, esquizonte, merozoito, macro e macrogametócito) que são os estágios teciduais encontrados nas células intestinais do hospedeiro e o ooquisto (que é a forma infetante encontrada no meio ambiente) (Trees,2002; Saif, 2008; Gerhold Jr, 2014). Este último geralmente pode apresentar as seguintes formas: oval, esférica e elipsoide. O seu tamanho vária de 15 a 50 µm dependendo da espécie, quando esporulado apresenta quatro esporoquistos com dois esporozoítos (Soulsby,1987; Urquhart et al., 1998). Outros parâmetros úteis na diferenciação das espécies incluem a localização e aspetos macros/microscópicos das lesões no hospedeiro, localização do parasita nos tecidos, tamanho dos estágios evolutivos (esquizontes, merozoitos, gametocitos) e período pré-patente mínimo em infeções experimentais (Duszynski e Wilber, 1997; Saif, 2008).
Ciclo de vida
Os coccídeos do género Eimeria apresentam um ciclo evolutivo direto com duas fases, a fase endógena, onde ocorre a multiplicação do parasita no interior das células intestinais do hospedeiro, constituída por uma etapa de reprodução assexuada (esquizogamia) e outra sexuada (gametogamia) que dará lugar a formação do zigoto. A outra fase é a exógena, onde ocorre a esporulação dos ooquistos no meio ambiente (Urquhart et al., 1998; Gerhold Jr, 2014).
O ciclo de vida inicia com ingestão do estágio infetante (ooquisto esporulado contendo esporozoítos) pelo hospedeiro susceptível, e este sofre acção mecânica e química (sais biliares e tripsina) que levam a libertação dos esporozoítos no lúmen intestinal. Os esporozoítos exercem acção sobre a parede intestinal, invadindo as células epiteliais na mucosa intestinal. Estes podem desenvolver se nas células nos locais de penetração (E. brunetti e E. praecox), ou serem transportados para outros locais (criptas) (E. maxima, E. necatrix, E. tenella e E. acervulina) onde formam os trofozoítos (Allen e Fetterer, 2002; Gerhold Jr, 2014). Desta forma iniciam a fase intracelular de crescimento e multiplicação assexuada (esquizogamia) que culmina com formação dos esquizontes e libertação dos merozoitos. A esquizogamia pode repetir-se desenvolvendo se novas gerações de merozoitos, dependendo da espécie (Urquhart et al., 1998; Saif, 2008; Gerhold Jr, 2014). A fase sexuada (gametogamia) inicia-se ao final da fase assexuada, na qual os merozoitos maduros são libertos e invadem novas células e diferenciam se em macro e microgametócitos, estimulados por fatores desconhecidos estes sofrem um processo de diferenciação em que cada macrogametócito dá origem a um macrogâmeta e cada microgametócito origina um grande número de microgâmetas biflagelados. Após maturação dos microgâmetas há ruptura das células hospedeiras, fertilização dos macrogametócitos pelos microgametócitos e fusão dos núcleos originado o zigoto. Este, forma uma parede quística em seu redor, dando origem ao ooquisto que é posteriormente expulso para o exterior da célula hospedeira atingindo o lúmen intestinal, sendo então eliminado nas fezes (Urquhart et al., 1998; Trees,2002; Saif, 2008). O período pré-patente pode ser de 4-6 dias dependendo da espécie (Urquhart et al., 1998; Trees,2002; Saif, 2008).
A fase externa, corresponde ao período patente, período em que o ooquisto está presente no ambiente, depende de fatores externos como temperatura, humidade e oxigénio. Nessa fase os ooquistos presentes, nas condições ideais, podem desenvolver-se em 4 esporoquistos com 2 esporozoítos cada (Trees, 2002; Saif, 2008; Gerhold Jr, 2014).
Figura I - Ciclo de vida da E. tenella (Trees, 2002).
Epidemiologia
A cocidiose aviária possui uma distribuição cosmopolita, tendo sido reportada em vários países do continente Americano, Asiático, Europeu e Africano (Anders e Jorgen, 1998; Saif, 2008). Klein (1996) isolou e caracterizou cinco espécies de Eimeria (E. acervulina, E. brunetti, E. mitis E. maxima e E. tenella) encontradas em infeções mistas e mono específicas em 74 granjas de frangos de corte na Europa, Américas Central e do Sul, África do Sul, Estados Unidos da América e Tailândia.
Factores como altas densidades de animais, humidade relativa alta, aves de diferentes categorias no mesmo espaço (principalmente aves de idades diferentes), alteração na alimentação, qualidade da ração entre outros fatores que possam comprometer a resistência as doenças, assim como no bem-estar das aves influenciam na distribuição e prevalência da coccidiose (Trees, 2002; Fraser et al., 1997).A cocidiose é endémica em regiões tropicais e subtropicais, devidos as condições ambientais e ecológicas que favorecem o desenvolvimento e propagação do agente causal ao longo de todo ano (Obasi et al., 2006). Aves de todas as idades são suscetíveis a cocidiose, mas a maior parte delas se infecta nas primeiras 3 a 6 semanas de vida devido à falta de maturidade do seu sistema imunitário, sendo muitas vezes os animais adultos portadores assintomáticos que disseminam o parasita (Trees, 2002; Saif et al., 2003; Chookyonix et al., 2009).
A transmissão entre as aves ocorre pela via fecal oral, através da ingestão do estágio infetante juntamente com água e alimentos contaminados por fezes de animais infetados. Os ooquistos são disseminados por via mecânica através de equipamentos, vestuário, insetos, veículos e outros animais para outros pavilhões e granjas (Taylor et al., 2007; Saif, 2008; Gerhold Jr, 2014), os trabalhadores são considerados como os vetores mais importantes na disseminação dos ooquistos através das roupas e utensílios (Charlton, 2006).
Os ooquistos são extremamente resistentes as variações ambientais e desinfetantes, podendo permanecer viáveis no ambiente por vários meses (Saif et al., 2003; Hafez, 2008 Gerhold, 2014). Segundo Saif et al., (2003) os ooquistos não esporulados são menos resistente em relação ao esporulado, contudo podem tornar se inviáveis quando expostos a altas bem como baixas temperaturas, exposições acima de 55ºC ou temperaturas abaixo dos 0ºC eliminam rapidamente os ooquistos.
Patogenicidade
Diversos fatores concorrem para a patogenicidade das espécies dentre os quais destaca se a idade, genética, fatores nutricionais do hospedeiro e as espécies de coccídeas. Das 7 espécies do género Eimeria que afetam as galinhas domésticas, são reportadas como altamente patogénicas a E. brunetti, E. maxima, E. necatrix, E. tenella, e E. acervulina. As espécies E. mitis e E. praecox são consideradas pouco patogénicas (Soulsby, 1987; Urquhart et al., 1998). Segundo Kahn (2005); Gerhold Jr (2014) a E. necatrix e E. tenella são as mais patogénicas devido a esquizogamia que ocorre na lâmina própria e nas criptas do epitélio do intestino delgado e ceco, causando hemorragias extensas, desprendimento da superfície da mucosa, resultando na perda contínua de fluidos e maior suscetibilidade a invasão bacteriana.
Lesões histopatológicasSegundo Mcmmullin (2001), infeções causadas por uma única espécie de Eimeria sp são raras em condições naturais, sendo as infeções mistas mais comuns. Porém muitos surtos de infeção clínica são atribuídos a uma espécie e ocasionalmente a combinação de duas a três espécies. Ao longo do ciclo de vida do parasita os diferentes estágios evolutivos de cada espécie desenvolvem-se em regiões de predileção no trato gastrointestinal e dependendo da magnitude da infeção podem causar lesões leves a graves (Gerhold Jr, 2014). Em algumas espécies o máximo dano tecidual ocorre quando a segunda geração de esquizontes se rompe libertando os merozoitos, outras espécies podem apresentar esquizontes dispersos o que causa poucos danos a mucosa, porém os gametócitos podem provocar uma forte reação inflamatória com infiltração celular no tecido (Urquhart et al., 1998; Saif, 2008; Raman et al., 2011).
Alterações microscópicas podem ser observadas na mucosa, e estas consistem em descamação e degeneração do epitélio, atrofia das vilosidades intestinais, hiperplasia difusa ou focal das paredes do intestino, edema, hemorragia, hiperemia, infiltração leucocitária junto as áreas de necrose, destruição das criptas e presença de esquizontes e gametocitos na mucosa e submucosa (Marquardt et al., 2000).
Tabela I - Lesões macroscópicas características das espécies de Eimeria em galinhas (Saif, 2008; Gerhold Jr, 2014).
	Espécie
	Localização
	Lesão
	E. tenella
	Ceco
	Hemorragia com manchas vermelhas brancas na parede do intestino.
	E. necatrix
	Intestino delgado
	Hemorragia, descarga mucoide e manchas brancas na parede de intestino
	E. brunetti
	Parte inferior do Intestino delgado
	Hemorragias leves, descarga mucoide, áreas necróticas e distensão do intestino.
	E. maxima
	Parte média do Intestino delgado
	Intestino distendido com pontos hemorrágicos e secreção mucoide 
	E. acervulina
	Parte superior do Intestino delgado
	Faixas transversais brancas na superfície intestinal serosa, hemorragia e exsudado mucoso
	E. praecox
	Duodeno
	Sem lesão mas ligeiramente hemorrágica, na superfície intestinal de Duodeno com ligeira secreção mucoide.
Sinais clínicos
A coccidiose pode apresentar se em três níveis crescentes de gravidade, coccidiose, uma infeção leve, não causando efeitos adversos, coccidiose subclínica e coccidiose clínica (Williams, 2001). A coccidiose em aves pode ser dividida em cecal (causada pela E. tenella, estágios gametogónicos (E. necatrix e E. brunetti) e intestinal (causada pela E. brunetti, E. acervulina. E. maxima, E. necatrix, E. mitis e E. praecox) (Urquhart et al., 1998).
Os sinais clínicos da doença estão associados à destruição do tecido durante libertação dos merozoitos e ooquistos maduros da superfície da mucosa durante as últimas gerações de esquizogamia e ao longo da gametogamia. A sintomatologia clínica observada na coccidiose cecal caracteriza-se por diarreia amarelada, a medida que a doença progride estas tornam-se avermelhadas, as aves apresentam anemia, tendem a amontoarem-se, penas eriçadas com sinais de depressão, redução acentuada no consumo de alimento frequentemente seguido da morte do animal devido as hemorragias. A cocidiose intestinal apresenta um decurso crónico, os sinais clínicos observados são os mesmos que na cocidiose cecal, porém apenas algumas espécies (E. brunetti, E. necatrix) causam lesões que culminam com aparecimento de sangue nas fezes (Amer et al., 2010; Urquhart et al., 1998, Gerhold Jr, 2014). 
Para além dos sinais clínicos acima referidos, aumenta a suscetibilidade a outros agentes patogénicos como Clostridium sp., Salmonella e E. coli devido as lesões e a redução da imunidade das aves, sendo aves mais jovens geralmente as mais suscetíveis, apresentados rapidamente os sinais de doença (Williams, 2005; Bostvironnois e Zadjian, 2011).
Diagnóstico
O diagnóstico da coccidiose é feito com base na observação da história clínica, sinais clínicos dos animais afetados, e sustentado pela identificação de ooquistos no exame coprológico. Porém, a presença de ooquistos nem sempre está correlacionada a presença de doença clínica. Outros factores devem ser tidos em conta para essa conclusão, como o nível lesional da mucosa intestinal, sinais clínicos ou maus índices produtivos (Gussem, 2009).
A identificação dos ooquistos de Eimeria sp é feita pelo exame microscópico das fezes através da técnica qualitativa de flutuação baseada na utilização de soluções saturadas de cloreto de sódio ou de açúcar onde observam-se os ooquistos. A determinação da carga parasitária é feita através da técnica quantitativa de MacMaster para contagem dos ovos por grama de fezes (OOPG) (Ueno e Gonçalves, 1998; Gussem, 2009; Zajac et al.,2012).
A identificação das espécies é feita com base nos parâmetros anteriormente mencionados (morfologia, localização e aspetos macro/microscópicos das lesões no hospedeiro, localização do parasita nos tecidos, tamanho dos estágios evolutivos e período pré-patente mínimo nas infeções experimentais a partir de ooquistos esporulados) (Allen e Fetterer, 2002; Saif, 2008). Para tal, as amostras de fezes positivas para ooquistos de Eimeria sp são misturadas com uma solução de dicromato de potássio (K2Cr2O7) a 2,5%, filtradas e acondicionadas em placas de Petri a temperatura ambiente até que os ooquistos esporulem (Duszynski e Wilber, 1997;Soulsby, 1987). 
Para além da observação destes paramentos foram desenvolvidas novas técnicas, baseadas na reacção em cadeia da polimerase (PCR – do inglês Poymerase Chain Reaction), como a técnica de PCR multiplex baseada em marcadores moleculares SCARs (Sequence-Characterized Amplified Regions/Regiões Amplificadas Caracterizadas por Sequências) que permitem a diferenciação e diagnóstico das sete espécies de Eimeria sp (Fernandez et al., 2003) e PCR em tempo real (Kawahara et al., 2008; Morgan et al., 2009).
Tratamento
O tratamento é, preferencialmente, feito pela administração de fármacos (Tabela 2) na água de bebida ou na ração, podendo também ser associada a antibioterapia e administração de níveis mais elevados das vitaminas A e K, para acelerar a recuperação das aves e para prevenção de infeções bacterianas secundárias (Gerhold Jr, 2014).
As espécies Eimeria sp responsáveis pela coccidiose são capazes de desenvolver resistência para todos os fármacos descritos. O desenvolvimento de estirpes resistentes é facilitado pelo uso de doses baixas por longos períodos de tempo. Quando ocorrem surtos clínicos devido ao desenvolvimento de estirpes resistentes é aconselhável realizar um teste de sensibilidade para estabelecer o tratamento (Hafez, 2008; Gussem, 2009).
Tabela II - Concentração de fármacos usados no tratamento da cocidiose aviária (Spinosa, Górniak e Bernardi, 2011; Gerhold Jr, 2014).
	Fármaco
	Veículo
	Nível
	Duração do tratamento
	Amprolium
	Água
	0.012 – 0.024 %
	3 – 5dias; 1 – 2 semanas
	Clortetraciclina
	Ração
	0.022 % + 0.8 % de Ca
	Não mais de 3 semanas
	Oxitetraciclina
	Ração
	0.022 % + 0.5 – 0.8 % de Ca
	Não mais que 5 dias
	Toltrazurila
	Água
	2 ppm
	2 dias
	Sulfadimetoxina
	Água
	0.05%
	6 dias
	Sulfametazina
	Água
	0.1%; 0.05%
	2 – 4 dias
Controlo e profilaxia
Segundo Gussem (2009), o controlo da coccidiose aviária passa pela adoção de uma série de medidas sanitárias e de maneio adequadas, quimioprofilaxia e imunoprofilaxia das aves.
Quimioprofilaxia
Esta é feita com base em fármacos administrados na ração das aves, denominados anticoccídicos, muitas vezes alguns desses fármacos são usados no tratamento das aves doentes, através da administração destes preferencialmente na água de bebida (Gerhold Jr, 2014).
Estes consistem em dois grupos usados atualmente na indústria avícola, os fármacos sintéticos (amprolium, nicarbazina, robenidina, diclazuril, zoaleno, decoquinato, halofuginona) e antibióticos ionóforos (salinomicina, narasina, maduramicina, semduramicina e o lasalocido) (Chapman, 2007; Gussem, 2009; Gerhold Jr, 2014). Segundo Mcdougald (2003), os fármacos usados no controlo da cocidiose são únicosquanto ao seu modo de ação, a forma como o crescimento intracelular dos parasitas é interrompido ou eliminados (efeitos coccidiostático e coccidiocida), bem como o seu efeito sobre o crescimento e desempenho das aves, sendo muito poucos os que são igualmente eficazes contra todas as espécies de Eimeria sp. A eficiência do uso de anticoccídicos pode ser afetado pelo surgimento do fenómeno de resistência, para evitar o surgimento deste fenómeno e obter melhores resultados na saúde e alimentação das aves, recomenda-se o uso de programas de rotação de medicamentos acompanhada de monitoramento constante dos ooquistos nas fezes (Hafez, 2008; Spinoza, Górniak e Bernardi, 2011).
Imunoprofilaxia
A Eimeria sp produz uma resposta imune multifatorial e complexa, estando a infeção circunscrita ao trato intestinal, o tecido linfoide associado ao intestino (GALT) atua como primeira linha de defesa (processamento e apresentação de antigénios, produção de anticorpos intestinais e ativação da imunidade celular) (Shirley, Smith e Blake, 2007; Lillehoj et al., 2000). Segundo Shirley, Smith e Blake (2007) a resposta imunológica de maior importância contra a coccidiose é fundamentalmente celular, através das células T, enquanto as células B e a natural killers têm uma função menos relevante (Klotz et al.,2007). As vacinas comerciais consistem em ooquistos vivos e esporulados das várias espécies de Eimeria administradas em doses baixas (Chapman et al., 2002). Segundo Martins et al. (2012), as vacinas usadas na industria avícola podem ser classificadas em: vivas, inativadas e vacinas de proteínas e DNA recombinantes. Segundo David (2000); Saif (2008) a imunidade desencadeada pelas vacinas é específica para as estirpes da vacina, isto é, as vacinas não imunizam contra espécies de Eimeria que não estão incluídos na fórmula de vacina. 
Segundo Lillehoj et al. (2000), as vacinas vivas podem ser divididas em atenuadas e de estirpes virulentas. As vacinas de estirpes virulentas foram as primeiras a ser usadas contra a coccidiose, destacando-se a Coccivac® (1952) e a Imunocox® (1985). Ainda hoje são usadas, em diferentes formas e veículos como através da água de beber, em gel e em spray. As vacinas atenuadas (Paracox® (1989) e Livacox® (1992) são obtidas por meio de passagens sucessivas em ovos embrionados, seleção de estirpes precoces e irradiação (Lillehoj et al. 2000). Nesta classe de vacinas estão incluídas as vacinas de nome comercial Paracox® (1989) e Livacox® (1992). As vacinas atenuadas oferecem a desvantagem de reversão da atenuação, que pode resultar em lesões intestinais intensas que causam perda de peso; além disso, estas vacinas não devem ser administradas em simultâneo com agentes coccidiostáticos, pois, estes últimos inibem o ciclo do parasita, resultando em não imunização das aves, pelo facto de só haver estimulação do sistema imunitário quando há invasão das células intestinais pelo agente atenuado da vacina (Martins et al., 2012).
Medidas sanitárias
Segundo Urquhart et al. (1998); Gussem (2009), a quimioprofilaxia e a imunoprofilaxia são inúteis quando não são acompanhadas de práticas sanitárias adequadas, pois certos tipos de maneio nos aviários criam condições ideais (temperatura e humidade) para que ocorra a esporulação de ooquistos, associadas à altas densidades de animais aumentando o risco de infeção. Deste modo a prevenção da coccidiose baseia-se na combinação de boas práticas de maneio e dos métodos acima referidos.
As boas práticas de maneio visam impedir ou reduzir a ingestão de ooquistos esporulados pelos animais, devendo-se desta forma dar mais atenção a higiene e desinfeção das instalações. As boas práticas de maneio consistem em fazer gestão de sistemas de abastecimento de água, garantindo desta forma que a água provenha de fontes seguras, utilizar bebedouros que impeçam que a água atinja a cama, usar sistemas de ventilação adequados para reduzir a humidade e manter a cama seca, fazer um bom controlo da qualidade da ração e manter a densidade recomendada para os animais (Urquhart et al., 1998; Hafez, 2008; e Taylor et al., 2007).
MATERIAIS E MÉTODOS
Local de estudo
O estudo foi realizado num matadouro da província de Maputo, localizado na cidade da Matola, com capacidade de abater 2.500 aves/hora e 12.500 aves por dia, o qual recebe aves para abate, provenientes de pequenos e grandes avicultores da cidade e província de Maputo. A província de Maputo está localizada no extremo Sul do País. A Norte faz fronteira com a província de Gaza, numa extensão de 186,6 Km, a Sul e Oeste com a África do Sul e Reino da Suazilândia, numa extensão de 394,3 Km, a Este com o Oceano Índico e a cidade de Maputo, com 174,2 e 26 Km de extensão, respetivamente (INE, 2009). A província possui um clima tropical a subtropical, sendo mais húmido na zona costeira e sub-árido no interior. Existem duas estações predominantes, sendo uma quente onde se regista maior pluviosidade que vai de Outubro a Março, e outra fresca e seca que vai de Abril a Setembro. A temperatura média anual é de 23°C durante o verão, onde também ocorrem, esporadicamente, temperaturas na ordem dos 40°C e na época fresca, raramente atingem níveis abaixo dos 10°C, exceto na cadeia dos Libombos, onde chegam a descer abaixo de 5°C, mas nunca abaixo dos 0° C (INE, 2009). 
Amostragem 
Para a elaboração do presente trabalho, foi feito um estudo descritivo. O número de animais existentes em cada propriedade variou de 5.000 a 12.000 (frangos em idade de abate). Os animais em estudo não foram selecionados aleatoriamente, tendo sido colhidas apenas amostras de animais abatidos que apresentaram lesões no trato gastrointestinal sugestivas de coccidiose de acordo com o efectivo de cada unidade avícula, variando o número de animais amostrados por unidade de 6 a 42.
 Determinação do tamanho da amostra
Para determinação do número de amostras a analisar para realização do presente estudo, recorreu-se a equação 1 descrita por Thrusfield (2005), considerando uma prevalência estimada de 50 %, um grau de precisão de 5% e um nível de confiança de 95%.
Onde:
· n – é o tamanho da população;
· p – prevalência esperada de 50%;
· d – grau de precisão de 5%.
Colheita de amostras
Através do cálculo obteve-se uma amostra de 384, durante a colheita das amostras não foi possível obter o tamanho desejado devido a escassez de lesões no trato intestinal sugestivas de coccidiose em alguns lotes. 
O estudo decorreu durante um período de dois meses (Maio a Junho de 2017), com amostras colhidas em matadouro e com aves provenientes de 6 unidades avícolas da cidade e província de Maputo (Catembe, Namaacha, Mulotana, Tshumene, Liberdade e Matola). 
Para colheita das amostras foram selecionados intestinos das aves abatidas que apresentassem lesões sugestivas de coccidiose, durante o processamento tecnológico na linha de inspeção do trato gastrointestinal e das vísceras. Os intestinos foram examinados macroscopicamente e foi determinado o grau de lesão, posteriormente foi feita a acolheita de amostras de fezes frescas diretamente dos intestinos. As amostras de fezes colhidas foram depositadas em frascos, identificados com o número da amostra, proveniência e data da colheita, e estas foram mantidas a temperatura ambiente durante 2h, e posteriormente transportadas ao Laboratório de Parasitologia no Departamento de Para-clínicas da Faculdade de Veterinária (FaVet) – Universidade Eduardo Mondlane (UEM) onde foram imediatamente processadas. As amostras não examinadas de imediato foram refrigeradas a uma temperatura de 4ºC para manter a integridade dos ooquistos.
Processamento das amostras
Exame macroscópico
Os intestinos das aves abatidas que apresentavam lesões sugestivas de coccidiose foram divididos em quatro porções, (1) parte superior do intestino delgado (duodeno e jejuno), (2) intestino médio (ílio), (3) parte inferior (região distal do ílio e recto) e (4) sacos cegos.
O lúmen intestinal foi exposto, através de uma incisão em toda a sua extensão (desde o duodeno até ao reto, incluindoos sacos cegos) e examinado macroscopicamente segundo os procedimentos descritos por Lobango et al. (2005), onde o conteúdo e as paredes das porções intestinais foram examinados para alterações patológicas como a presença de petéquias, espessamento da parede intestinal e a presença de coágulos. De acordo com a localização e apresentação das lesões foi determinada, preliminarmente a espécie de Eimeria e as lesões foram classificadas em quatro graus de acordo com a espécie suspeita seguindo a descrição de Duffy et al. (2005) (Anexo V).
Identificação de espécies de Eimeria
Para identificação das espécies de Eimeria as amostras de fezes provenientes do exame macroscópico foram submetidas a análises faseadas que foram desde a realização do teste qualitativo de Willis até a aferição das medidas (comprimento e largura) dos ooquistos esporulados e a determinação dos seus índices morfométricos.
Teste qualitativo de Willis
As amostras de fezes foram examinadas de forma individual usando a técnica de flutuação de Willis em solução saturada de cloreto de sódio, para presença de ooquistos de Eimeria sp segundo as descrições de Ueno e Gonçalves (1998) e de Zajac et al. (2012) (Anexo I). Para tal, foram pesadas 2 g de fezes de cada amostra e misturadas a 20 ml de solução saturada de cloreto de sódio, posteriormente filtrada e colocada num copo de Borrel. Sobre este foi colocada uma lamela e deixada em repouso durante 15 minutos, posteriormente a lamela foi colocada sobre uma lâmina e observada ao microscópio óptico na objetiva de 10X. Considerou-se positivas todas as amostras que apresentaram pelo menos um ooquisto de Eimeria sp por esta técnica. As amostras positivas foram posteriormente submetidas a esporulação em dicromato de potássio para posterior identificação das espécies.
Esporulação em dicromato de potássio (K2Cr2O7)
A identificação especifica das espécies foi feita a partir dos ooquistos esporulados, para tal cada amostra positiva ao teste de Willis foi misturada a uma solução de dicromato de potássio (K2Cr2O7) a 2,5%, filtrada e posteriormente colocada em placas de Petri, permitindo deste modo a aeração dos ooquistos até a esporulação a temperatura ambiente (24 a 30ºC) conforme descrito por Duszynski e Wilber (1997) e por Carvalho et al. (2011). A suspensão foi observada diariamente ao microscópio óptico, até que ocorresse a esporulação dos ooquistos. Para cada amostra retirou se 15 ml do conteúdo esporulado e este foi acondicionado em tubos e refrigerado a 4º C para a conservação dos ooquistos, até ao momento em que foram avaliados para determinação dos índices morfométricos.
Determinação do número de ooquistos por gramas de fezes
Para além dos exames acima mencionados as amostras positivas também foram submetidas a contagem dos ooquistos por gramas de fezes (OOPG) pela técnica de MacMaster para determinação da carga parasitária. Para tal pesou-se, exactamente, 2 g de fezes e estas foram misturadas a 42 ml de solução saturada de cloreto de sódio, e esta foi posteriormente filtrada e colocada em camaras de MacMaster, deixou se repousar durante 5 minutos e levou-se a observar ao microscópio com objectiva de 10x. Para determinação do número de ooquistos por grama de fezes (OOPG), multiplicou-se a soma dos ovos encontrados em ambos compartimentos por 100 (Equação 2).
Onde:
· Y – corresponde ao número total de ooquistos observados
Os resultados foram expressos em ooquistos por grama de fezes (Ueno e Gonçalves, 1998; Zajac et al., 2012).
Determinação dos índices morfométricos
Após a esporulação e conservação dos ooquistos, estes foram recuperados a partir da técnica de flutuação usando a solução saturada de cloreto de sódio, que consistiu na retirada do sobrenadante (solução de dicromato de potássio) e adição da solução hipersaturada de cloreto de sódio no sedimento contido no tubo até formar um menisco convexo. Uma lamela foi em seguida colocada sobre o tubo e deixou-se a solução em repouso durante 10 min, de modo a permitir que os ooquistos flutuassem e aderissem a lamela. Esta lamela foi então removida cuidadosamente de forma vertical, colocada sobre uma lâmina e levada a observar ao microscópio óptico Olympus BX 53 acoplado a câmera Olympus DP26 usando macrómetro ocular com ampliação 20x e posteriormente os ooquistos observados foram medidos através do software cellSense.
Para cada uma das amostras positivas ao teste de Willis, submetida a esporulação em dicromato de potássio (K2Cr2O7) foram aferidos o comprimento, a largura e a sua forma determinada visualmente. Este procedimento foi repetido em 50 ooquistos (sempre que possível) selecionados aleatoriamente da amostra. O índice morfométrico foi obtido em função do comprimento e da largura aferidos, segundo a fórmula na Equação 3, descrita por Hamidinejat et al. (2010).
A identificação das espécies de Eimeria foi feita com base no comprimento, na largura, na morfologia observada e no índice morfométrico de cada espécie segundo o guia de diagnóstico fornecido Soulsby (1987); Saif, (2008) (Anexo VI).
Análise de dados
Os dados sobre as amostras foram introduzidos numa planilha do Microsoft Excel. Todas as análises foram feitas a partir no programa estatístico Stata (versão 14, StataCorp LP, Colege Station, Texas, Estados Unidos da América) onde os dados das variáveis categóricas foram sumarizados em tabelas de frequências e os dados de variáveis contínuas foram sumarizados através do cálculo de medidas de tendência central (média) e de dispersão (desvio padrão).
RESULTADOS
Durante o período do estudo (Maio a Junho de 2017), foram colhidas 246 amostras de intestinos em aves com lesões gastro intestinais sugestivas de infeção por Eimeria sp provenientes de 8 unidades avícolas da cidade e da província de Maputo, nomeadamente uma de Catembe (40 amostras – 16.3 %), duas unidades de Namaacha (P1 com 42 amostras – 17.1 %; e P2 com 40 amostras – 16.3 %), uma de Mulotana (40 amostras – 16.3 %), uma de Tshumene (8 amostras – 3.25 %), uma de Liberdade (6 amostras – 2.4 %) e duas unidades de Matola (P1 com 40 amostras – 16.3 %; P2 com 30 amostras – 12.20 %).
Exame macroscópico
Das 246 amostras de intestinos com lesões gastro intestinais sugestivas de infeção por Eimeria sp examinadas macroscopicamente no matadouro, grande parte apresentou lesões a nível do intestino delgado, que são sugestivas de infecção por E. necatrix, seguida por lesões a nível do jejuno e do íleo sugerindo infecção por E. maxima e lesões a nível do jejuno, íleo e cecos sugestivas de infecção por E. acervulina. As frequências de ocorrência das lesões ao longo do intestino são apresentadas no gráfico I.
Gráfico I-Frequência de lesões observadas nas diferentes porções do trato gastrointestinal
A localização e as características das lesões causadas por espécies específicas de Eimeria foram usadas para auxiliar a identificação das espécies. As lesões pela E. necatrix caracterizaram-se pela presença de petéquias dispersas, manchas brancas na serosa do intestino, por vezes acompanhadas por hemorragias maciças com conteúdo mucoso acastanhado no intestino médio. As lesões, sugestivas de infeção por E. maxima, usualmente observadas no jejuno, íleo e por vezes na ansa duodenal foram caracterizadas pela presença de muco amarelo-alaranjado, petéquias e espessamento das paredes intestinais. As lesões sugestivas de infeção por E. acervulina, foram observadas com menor frequência, estavam localizadas no duodeno e íleo, e caracterizaram-se por estrias brancas, parede intestinal espessada e lúmen intestinal reduzido de tamanho, as estrias brancas eram mais visíveis a partir da serosa. Lesões sugestivas de infeção por E. tenella observadas nos sacos cecos foram caracterizadas por paredes cecais espessadas, petéquias (por vezes ausentes), conteúdo cecal hemorrágico, que por vezes apresentava-se normal.
Das lesões observadas a nível do intestino delgado (sugerindo infecção por E.necatrix) verificou-se elevadas frequências de lesões de grau 2, seguidas das lesões de grau 3 e 1, sendo as de grau 4 menosfrequentes. Das lesões a nível do jejuno e do íleo, (sugerindo infecção por E.maxima) verificou-se maior frequência de lesões de grau 2, seguidas das lesões de grau 1 e 3 sendo de grau as menos frequentes. Das lesões a nível dos sacos cecos (sugerindo infecção por E.tenella), observou-se maiores frequências de lesões de grau 2, seguidas de lesões de grau 1 e 3 sendo as de grau 4 as menos frequentes
Das lesões a nível do jejuno, íleo e cecos (sugerido infecção por E.acervulina) fora observadas apenas lesões do grau 3. As frequências de ocorrência dos diferentes graus de lesão ao longo do intestino são apresentadas no gráfico II.Gráfico II-Frequência dos graus de lesão observadas nas diferentes porções do trato gastrointestinal
No presente estudo foram observadas com maior frequência (111 / 246 – 45.12 %) lesões de grau 2, seguidas das lesões de grau 1 (65/246 - 26.42%) e 3 (52/ 246 – 21.14%).
Quando analisados estes dados de acordo com o local de ocorrência nos intestinos das aves (grau de lesão vs. localização) observou-se que no duodeno e no ílio foram mais frequentes lesões de grau 3 (100%), nos cecos as lesões de grau 2 (39.06 %), no intestino delgado as lesões de grau 2 (43.165%) e jejuno e ílio com lesões de grau 2 (52.33%). A maior intensidade de lesões foi observada no intestino delgado (11,58 %) por lesões sugestivas de infeção pela E. necatrix seguida pelos sacos cecos, (7.81%) por lesões sugestivas de infeção pela E. tenella).
Teste qualitativo de Willis
Das 246 amostras de fezes examinadas pelo teste de Willis, observou-se ooquistos de Eimeria sp em 177 amostras (71.95%), e nas restantes 69 amostras (28.05%) não foram observados ooquistos Eimeria sp. As unidades avículas de Namaacha-P1 (15.4 %), Mulotane (15.4 %), Cidade de Matola-P1 (15.0%) foram as que presentaram maiores frequências de ocorrência de infeções por Eimeria sp e unidade de Tchumene (0.4%) a mais baixa (Tabela III).
Tabela III-Frequência de ocorrência de infeções por Eimeria sp pelo método de Willis por local de proveniência.
	Proveniência das amostras.
	Amostras positivas (%)
	Amostras negativas (%)
	Tchumene
	1 (0.4)
	7 (2.85)
	Namaacha – P1
	38 (15.4)
	4 (1.63)
	Namaacha – P2
	29 (11.8)
	11 (4.47)
	Liberdade
	5 (2.0)
	1 (0.41)
	Mulotane
	38 (15.4)
	2 (0.81)
	Cidade de Matola – P1
	37 (15.0)
	3 (1.22)
	Matola – P2
	8 (3.3)
	22 (8.94)
	Catembe
	21 (8.5)
	19 (7.72)
	Total
	177 (71.95)
	69 (28.05)
Gráfico III-Frequência de ocorrência de infeções por Eimeria sp pelo método de Willis por proveniência
Avaliação da carga parasitária pelo método de McMaster
O número de ooquistos por grama de fezes (OOPG) contados das 177 amostras positivas ao teste de Willis das 6 unidades avículas amostradas variou de 0 a seis milhões (6.000.000). Foram predominantes (60.45%) altas contagens de ooquistos (≥ 100.000), com uma mediana dos OOPG de 3.785.0. As contagens mais altas (≥ 100.000), foram observadas nas unidades Matola – P1 29 (78.4%), Mulotane 29 (76.3%), Namaacha – P1 28 (71.8%), Namaacha P2 12 (41.4%) (Gráfico IV e Tabela V).
Gráfico IV-Intervalos de ovos por gramas de fezes das 6 unidades avículas.
Tabela IV -Medianas de ooquistos por grama de fezes (OOPG) das 6 unidades avículas.
	Intervalos de OOPG
	Namaacha – P1 (%)
	Namaacha – P2 (%)
	Liberdade (%)
	Mulotane (%)
	Matola – P1 (%)
	Matola – P2 (%)
	Tchumene (%)
	Catembe (%)
	Total (%)
	10
	1 (2.6)
	0 (0)
	0 (0)
	0
	0 (0)
	2 (25)
	0 (0)
	0 (0)
	3 (1.69)
	1 – 49
	0 (0)
	0 (0)
	0 (0)
	0
	0 (0)
	0 (0)
	0 (0)
	0 (0)
	0 (0)
	50 – 999
	1 (2.6)
	2 (6.9)
	0 (0)
	0
	0 (0)
	1 (12.5)
	0 (0)
	3 (15)
	6 (3.39)
	1000 – 4999
	3 (7.6)
	5 (17.2)
	1 (20)
	1 (2.6)
	0 (0)
	3 (37.5)
	1 (100)
	3 (15)
	15 (8.47)
	5000 – 9999
	5 (10.2)
	0 (0)
	0 (0)
	3 (7.9)
	0 (0)
	2 (25)
	0 (0)
	0 (0)
	10 (5.65)
	10000 – 49999
	2 (5.1)
	6 (20.7)
	1 (20)
	2 (5.3)
	4 (10.8)
	0 (0)
	0 (0)
	6 (30)
	23 (12.99)
	50000 – 99999
	0 (0)
	4 (13.8)
	2 (40)
	3 (7.9)
	4 (10.8)
	0 (0)
	0 (0)
	0 (0)
	13 (7.34)
	≥ 100000
	28 (71.8)
	12 (41.4)
	1 (20)
	29 (76.3)
	29 (78.4)
	0 (0)
	0 (0)
	8 (40)
	107 (60.45)
	Mediana (IIQ)
	276.100 (12.000 – 751.700)
	54.000 (11.900 - 676.000)
	80.000 (15.000 – 80.000)
	702.000 (142.000 – 4.304.400)
	310.200 (120.000 – 2.988.000)
	7.500 (1.500 – 13.300)
	1.500 (0)
	37.850 (3.550 – 152.300)
	37850 (0 – 406.000)
Identificação dos ooquistos
Em relação a identificação das espécies de Eimeria, do total de 177 amostras positivas pelo método de Willis, 145 (59 %) amostras foram examinadas para identificação das espécies e 32 foram perdidas durante o processo de esporulação. Para identificação das espécies de coccídeos foram utilizadas características métricas e morfológicas dos ooquistos segundo Soulsby (1987); Saif, (2008): ooquistos subesféricos tiveram uma média da relação entre o comprimento e largura de 1.05 e os ooquistos ovoides de 1.03 -1.43. Nas 145 amostras examinadas, foram avaliados e medidos seis mil trezentos e sessenta e dois (6.362) ooquistos, desses, foi possível identificar 9 espécies das quais cinco (5) espécies foram confirmadas segundo os guias de diagnóstico como E. maxima (30.8%), E. praeocox (21,6%), E. brunetti (14.7%), E. tenella (6.7%), E. acervulina (0.8%). As outras quatro (4) espécies não foram abrangidas pelos guias de diagnóstico. A Tabela VI demonstra as médias das dimensões (comprimento, largura e índice morfométrico), as frequências e as características morfológicas dos ooquistos das 9 espécies de Eimeria identificadas.
Tabela V - Características morfológicas das espécies de Eimeria identificadas em frangos de corte.
	Espécie
	Ooquistos observados e medidos
	Comprimento (µm)
	Largura
(µm)
	IM
	Morfologia
	Espécies confirmadas
	
	n (%)
	Média (desvio padrão)
	Média (desvio padrão)
	Média (desvio padrão)
	
	
	a) Eimeria sp
	423 (6.7 %)
	22.43 (1.63)
	19.45 (1.45)
	1.15 (0.04)
	Ovóide
	E. tenella
	b) Eimeria sp
	282 (4.4 %)
	17.45 (1.49)
	16.66 (1.54)
	1.05 (0.03)
	Subsférico
	
	c) Eimeria sp
	1956 (30.8 %)
	27.03 (7.47)
	19.68 (6.16)
	1.39 (0.41)
	Ovóide
	E. maxima
	d) Eimeria sp
	51 (0.8 %)
	19.29 (1.12)
	15.46 (0.92)
	1.25 (0.04)
	Ovóide
	E. acervulina
	e) Eimeria sp
	456 (7.2 %)
	20.45 (1.70)
	17.65 (1.44)
	1.16 (0.04)
	Ovóide
	
	f) Eimeria sp
	316 (4.9 %)
	19.93 (0.61)
	18.91 (0.82)
	1.06 (0.04)
	Ovóide
	
	g) Eimeria sp
	1373 (21.6 %)
	22.63 (1.86)
	18.26 (1.53)
	1.24 (0.03)
	Ovóide
	E. praeocox
	h) Eimeria sp
	37 (0.6 %)
	17.93 (1.58)
	15.64 (1.44)
	1.15 (0.02)
	Ovóide
	
	i) Eimeria sp
	938 (14.7 %)
	24.63 (1.23)
	18.76 (0.92)
	1.31 (0.03)
	Ovóide
	E. brunetti
	Não identificada
	530 (8.3 %)
	68.42 (305.07)
	49.11 (207.89)
	1.33 (0.22)
	NA
	
Tabela VI-Espécies insoladas e identificadas por unidade avícula
	 
	 
	Unidades
	Espécies
	 Liberdade
	E. brunetti, E. necatrix, E. tenella, E. maxima, E. praecox, Eimeria sp (f) e (b) Eimeria sp.
	Catembe
	
	Cidade da matola-P1
	
	Matola-P2
	
	Mulotana	Comment by HP: 
	E. acervulina, E. brunetti, E. tenella, E. maxima, E. praecox, Eimeria sp (b),Eimeria sp (e), Eimeria sp (f) e Eimeria sp (h)
	Namaacha-P1 
	
	Namaacha-P2 
	E. acervulina, E. brunetti, E. maxima, E. praecox, Eimeria sp (b),Eimeria sp (e) e Eimeria sp (f)
	Tchumene
	E. brunetti, E. tenella, E. maxima, E. praecox, Eimeria sp (b),Eimeria sp (e) e Eimeria sp (f)
Neste estudo foi observada uma elevada frequência de infecções mistas (95.9 %), sendo identificadas, na maior parte das vezes 7 espécies de Eimeria numa única amostra. Na Tabela VII são apresentadas as frequências das infeções mistas e monoespecíficas observadas. Nas infeções mistas foi observada a E. maxima associada a qualquer uma das outras 8 espécies.
Tabela VII – Distribuição de espécies por amostras.
	Nº de espécies presentes por amostra
	Nº de amostras
	% das amostras
	1
	6
	4.1
	2
	2
	1.4
	3
	3
	2.1
	4
	3
	2.1
	5
	11
	7.6
	6
	29
	20.0
	7
	53
	36.6
	8
	30
	20.7
	9
	8
	5.5
	Total
	145
	100
Na Figura II estão ilustrados os ooquistos esporulados das diferentes espécies de Eimeria identificadas no presente estudo.
	
	
	
	
	
	E. tenellab) Eimeria sp
	 E. maxima
	E. acervulina
	e)Eimeria sp
	
	
	
	
	
	f) Eimeria sp
	 E. praecox
	h) Eimeria sp
	I) E. brunetti
	
Figura II - Ooquistos esporulados das diferentes espécies de Eimeria sp identificadas.
DISCUSSÃO
A ocorrência de aves com coccidiose detectadas neste estudo foi de 71.95%, o que indica um alto nível de infeção nas aves. Isto pode estar relacionado as características climáticas do país (Moçambique), uma vez que os climas tropicais e húmidos oferecem condições de temperatura e humidade que são favoráveis para a esporulação dos ooquistos e para manutenção da sua viabilidade no meio ambiente, contribuindo para uma maior exposição das aves aos parasitas (Obasi et al., 2001; Taylor et al., 2007). 
Segundo Etuk et al. (2004) a ocorrência de altos níveis de coccidiose é observada na época chuvosa, influenciada pela humidade característica desta época, que cria condições favoráveis para a esporulação de ooquistos, tornando-se infectantes. No entanto a colheita das amostras no presente estudo, foi feita durante época seca. Este alto nível de infeção verificado pode ser justificado pela tendência dos avicultores de manter a temperatura num nível ideal (relativamente elevada em relação as temperaturas baixas deste período) para as aves dentro dos aviários, alterando as condições ambientais dentro dos aviários e deste modo, criando condições favoráveis (temperatura e humidade) para a esporulação dos ooquistos o que pode contribuir para os altos níveis de infeção aqui reportados.
Outro factor importante que influencia para a ocorrência de altos níveis de infeção é a localização dos aviários em Moçambique, visto que boa parte dos avicultores de pequena a média escala estão localizados nas regiões urbanas e periurbanas (FAO, 2013), levando a que haja muita proximidade das infraestruturas dos aviários (muitas vezes os pavilhões estão a poucos metros uns dos outros). Estes factores, aliados a fraca adopção de medidas de biossegurança para prevenir a introdução de agentes patogénicos por visitantes e por trabalhadores dos aviários, contribuem para o desenvolvimento e disseminação de doenças entre os aviários, uma vez que os trabalhadores são indicados como os principais vetores de disseminação de ooquistos através do vestuário e veículos entre os aviários (David, 2000; Etuk et al., 2004; Charlton, 2006; Taylor et al. 2007; Gerhold Jr, 2014).
Para além dos factores acima mencionados o uso de coccidiostáticos na ração e alterações do ambiente podem contribuir para a ocorrência de altos níveis de infeção. Segundo Urquhart et al. (1998) a administração de baixas concentrações de fármacos na ração bem como as mudanças repentinas no ambiente interno dos aviários (humidade e temperatura) podem levar a esporulação massiva dos ooquistos e ingestão destes pelas aves a um nível em que o fármaco não mais consegue controlar. Todos esses fatores favoráveis à esporulação e dispersão de ooquistos explicam os altos níveis de ocorrência de coccidiose, uma vez que os ooquistos são extremamente resistentes e podem permanecer viáveis por longos períodos no ambiente (Berchieri Júnior e Macari, 2000; Shirley et al.,2005). Entretanto, ocorrências igualmente altas foram observadas por Al-Natour et al. (2002) 78% no norte da Jordânia e na Etiópia 70.9% (Gari et al., 2008; Oljira et al., 2012) este último com clima tropical semelhante ao apresentado em Moçambique.
A não observação de ooquistos em 28.05% das amostras de fezes colhidas de intestinos com lesões sugestivas a Eimeria sp pelo teste de Willis pode ser justificada pela presença de outras doenças no trato gastrointestinal, que causem lesões semelhantes as observadas na coccidiose, como é o caso da síndrome hemorrágica, da enterite ulcerativa e necrótica (causada por bactérias do gênero Clostridium) que causa lesões intestinais que vão desde hemorragias punctiformes até ulcerações na mucosa (Schocken-Iturrino, 2006). A ocorrência destas lesões também pode ser justificada pelo uso de fármacos anticoccídicos que reduzem a produção de ooquistos pelo parasito.
Quanto aos achados do exame macroscópico: as lesões observadas nas diferente porções do trato gastrointestinal são similares as descritas por Ayana et al. (2017) para as espécies (E. maxima, E. necatrix, E. tenella, E. acervulina).
As altas frequências de lesões pela E. necatrix que podem ser justificadas pelo facto das lesões desta espécie serem mais graves e localizaram-se em regiões muito próximas do local de predileção de outras espécies (E. maxima), para além disso as lesões apresentam diferenças muito sutis entre elas, dificultando desta forma o diagnóstico de outras espécies. Este facto é sustentado por Williams (2002) ao afirmar que as infeções naturais por Eimeria sp são de forma geral mistas (mais de uma espécie), deste modo características morfológicas e alterações patológicas causadas por espécies que parasitam as mesmas regiões ou regiões muito próximas ao longo do trato intestinal podem ser semelhantes devido a sobreposição das espécies, dificultando o diagnóstico preciso das mesmas. As espécies consideradas pouco patogénicas (E. mitis, E. mivati, E. hagani e E. praecox), não foram identificadas no exame macroscópico por estas não causarem lesões macroscópicas significativas que facilitem sua identificação (McDougald, 2003).
Quanto ao grau de lesão nas 4 porções do intestino observou-se maior grau de intensidade de lesões no intestino delgado (lesões sugestivas de infeção por E. necatrix) seguida pelos sacos cecos (lesões sugestivas de infeção por E. tenella). Este alto grau de severidade das lesões apresentado por estas duas espécies pode ser associado as características do ciclo de vida do parasita, visto que durante a sua fase de esquizogamia, onde os esquizontes (contendo os merozoítos), que se desenvolvem na lâmina própria e nas criptas do epitélio do intestino delgado e ceco, durante a libertação dos merozoítos, provocam hemorragias extensas devido a roptura dos vasos sanguíneos, podendo ocorrer o desprendimento da mucosa, resultando em perda contínua de fluídos (Kahn, 2005; Gerhold Jr, 2014).
De acordo com Soulsby (1982) e Gerhold Jr (2014) a intensidade da infeção por ooquistos de Eimeria sp foi classificada como grave para 60.45% das amostras (com contagens acima de 100.000 OPGs). As unidades de Namaacha-P1,Mulotane, Matola-P1 e Namaacha-P2,registaram maior número de amostras com infeções graves. A predominância de infeções graves pode ser atribuído aos seguintes fatores: época da colheita das amostras (época seca) devido a tendência dos avicultores de manter a temperatura dos aviários num nível ideal (relativamente elevada em relação as temperaturas baixas deste período), mau manuseamento dos bebedouros o que pode levar ao aumento da humidade no interior dos aviários associados a ineficiência das medidas de controlo tais como deficiência na aplicação de medidas de biossegurança das instalações (limpeza, desinfecção, vazio sanitário, controlo do fluxo de pessoas), ineficiência dos fármacos anticoccídicos usados no controlo da coccidiose (desenvolvimento de resistência ou doses ineficazes), dentre outras técnicas que auxiliam no controlo da coccidiose na avicultura industrial aumentando desta forma a disponibilidade dos ooquistos no ambiente e criando condições favoráveis para a esporulação e ingestão dos ooquistos pelas aves (Urquhart et al.,1998; Trees 2002). 
No presente trabalho foram insoladas 9 espécies das quais cinco (E. tenella, E. maxima, E. acervulina, E. praeocox, E. brunetti) foram identificadas com base na morfometria dos ooquistos obtidos a partir das amostras fecais segundo os guias de diagnóstico de Soulsby (1992) e Saif (2008). As restantes 4 espécies insoladas apresentaram discrepância nas médias dos indicies morfométricos apresentadas nos guias de diagnostico dos autores. As espécies identificadas estão de acordo com as lesões observadas no trato intestinal, com exceção da E. necatrix, cujas lesões foram observadas porem não foram identificados ooquisto, o podeser justificado pela fraca proliferação da espécie (Saif, 2008). A diferença nas médias dos índices morfométricos pode ser atribuída a vários factores tais como o metabolismo dos parasitas bem como das aves segundo Costa (2000) e Sun et al. (2009) estes factores podem causar variações das medidas (comprimento e largura) dos ooquistos bem como do índice morfométrico.
 Quanto ao número de espécies identificadas com base na morfométrica dos ooquistos os resultados diferem dos obtidos por Luchese et al. (2007) no Brasil onde foram insoladas e identificadas 7 espécies (E. maxima, E. brunetti, E. necatrix, E. mitis, E. mivati, E. tenella, E. acervulina em frangos de corte de criação industrial e alternativa) e de Dinka e Tolossa (2012) na Etiópia, que identificaram 4 espécies (E. tenella – 45 %, E. necatrix – 34.33 %, E. acervulina – 31.33 % e E. brunetti – 27.67 %) e de um estudo realizado por Gharekhani et al. (2014) no Irão onde também foram identificadas 4 espécies (E. acervulina – 75.7 %, E. tenella – 54.3 %, E. necatrix – 28.6 % e E. maxima – 20 %). A discrepância no número de espécies identificadas verificada, pode ser associada as diferenças nos sistemas de maneio usados nos aviários, ao desenvolvimento de resistência de algumas espécies aos anticoccídicos usados localmente (Chapman, 2005), sendo muito poucos os anticoccídicos que são igualmente eficazes contra todas as espécies de Eimeria (McDougald, 2003). 
 No presente estudo foram identificadas quatro espécies consideradas de grande importância económico, a E. maxima (30.8 %), E. brunetti (14.7%), E. tenella (6.7%) e E. acervulina (0.8%). Estes resultados são similares aos obtidos por dos Anjos et al. (2005) em galinhas criadas em sistemas extensivos na província de Manica, Dinka e Tolossa (2012) na Etiópia, Fornace et al. (2013) na Tanzânia, Gana, e Zâmbia em criações intensivas em pequena escala, nas regiões periurbanas, Bachaya et al. (2013) no Paquistão, com exceção da E. brunetti, o que sugere que estas 4 espécies encontram-se amplamente distribuídas.
Das espécies identificadas no estudo a E. maxima (30.8 %) foi a mais predominante seguida pela E. praeocox (21.6%), este resultado esta de acordo com obtido Molla et al. (2015). Porém em estudos conduzidos por dos Anjos et al. (2005); Ayana et al. (2017) e Nasim (2016) em Moçambique, Etiópia e irão respetivamente reportaram a E. tenella (58%,62.2% e 24%) como sendo a espécie mais frequente. Esta diferença verificada nos resultados pode ser justificada pelas diferenças nos sistemas de maneio das aves em como nos métodos profiláticos usados na prevenção da doença. Este facto é sustentado por Urquhart et al. (1998), ao afirmar que grande parte dos coccidiostáticos são usados para combater infeções causadas pela E. tenella por ser considerada uma das espécies mais patogénicas o que pode ter causado um aumento da prevalência das outras espécies (E. brunetti, E. mitis, E. praeocox, E. acervulina e E. maxima) causadoras de coccidiose aviária. 
Infeções mistas envolvendo 7 espécies foram maioritariamente registadas no presente estudo (36.6%),veste resultado é sustentado por Williams (2002);Shirley et al. (2005) ao afirmar que as infeções naturais por Eimeria sp são de forma geral mistas (mais de uma espécie).
CONCLUSÃO
Os resultados do presente trabalho permitem as seguintes conclusões: 
· Os frangos de corte eram portadores de infeção mista por nove espécies do gênero Eimeria isoladas com base nas características morfométricas, das quais cinco foram identificadas nomeadamente E. maxima (30.8%), E. praeocox (21.6%), E. acervulina (0.8%), E. brunetti (14.7%) e E. tenella (6.7%). A E. maxima (30.8%) e E. praeocox (21.6%), apresentaram as frequências de ocorrência mais altas.
· Lesões sugestivas de infeção por E. necatrix no intestino delgado (38.62%) foram observadas com maior frequência e caracterizavam-se pela presença de petéquias dispersas, manchas brancas na serosa do intestino, por vezes acompanhadas por hemorragias maciças com conteúdo mucoso acastanhado no intestino médio.
· Apesar do uso de drogas anticoccídicos na ração, altos níveis infeções por coccídeos do género Eimeria foram observada.
· Apesar dos resultados observados a identificação das espécies de Eimeria com base na morfologia não é um método eficiente, uma vez que as medidas dos ooquistos (comprimento e largura índice morfométrico), podem sofrer variações devido a vários factores tais como o metabolismo dos parasitas bem como das aves levando a conclusões enganosas em relação as espécies presentes.
Recomendações
· Que se faça um trabalho similar usando técnicas mais avançadas para identificação das espécies visto que a identificação tradicional (através da morfologia) das espécies é complicada uma vez que as infeções naturais por Eimeria sp são mistas onde as características morfológicas e patológicas das espécies são geralmente similares o que dificulta o diagnostico preciso das espécies.
· Cociecializar os avicultores sobre a importância da coccidiose e das perdas causadas pela doença de forma investir na profilaxia uma vez que esta parece ser a melhor estratégia, pois o custo é menor comparado com o tratamento, além de minimizar a ocorrência de perdas significativas na produção.
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