Coleta e fixação de materiais para técnica histológica

Prévia do material em texto

Técnicas histológicas 
 Coleta e fixação de materiais 
 biológicos para técnica histológica 
 Feito por: Jéssica Cristina da Silva 
 A - obtenção dos fragmentos de tecidos 
 ● Necrópsia 
 ● Peças cirúrgicas 
 ● Biópsia 
 B - abertura do cadáver 
 Deve-se evitar qualquer uma das fases de decomposição do cadáver, passada diversas 
 horas após a morte, o cadáver começa a apresentar certas fases de decomposição as quais 
 devem ser evitadas para a coleta do material, são elas: 
 ● Fase de rigidez cadavérica 
 ● Face dos livores ou manchas 
 ● Fase gasosa 
 ● Fase de coliquação 
 ● Fase de esqueletização 
 A fase de rigidez cadavérica se inicia 3 a 6 horas após a morte e dura 24 horas ela se inicia 
 pelas pálpebras, maxilares, pescoço e demais músculos. 
 A fase dos livores ou manchas também se inicia 3 a 6 horas após a morte, ela se dá pela 
 decomposição cadavérica por bactérias de putrefação de origem intestinal manchas 
 também podem surgir caso o corpo e esteja apoiado em algum lugar, essa fase é 
 caracterizada pela presença de manchas da putrefação. Ocorre também o timpanismo que 
 é a produção de gases dentro da cavidade abdominal, fazendo inclusive com que o 
 abdômen fique duro. Há o surgimento de enfisema que é o surgimento de bolhas gasosas 
 que normalmente acontece no tecido subcutâneo e sob cápsulas de órgãos. Um odor típico 
 está presente por ação da cadaverina. Ocorre também a maceração das mucosas e 
 também um pseudoprolapso do reto. 
 A abertura do cadáver do cão se da por uma incisão mento pubiana, ou seja, do queixo até 
 a região púbica. Nas aves a incisão é feita da parte anterior do pescoço ao esterno, no 
 abdômen e no púbis. 
 C - requisitos para coleta do material 
 Quando você faz uma coleta de material deve-se ter frascos com fixador em seu interior 
 para se colocar os fragmentos direto no fixador, nunca deve se colocar o material em soro 
 fisiológico ou água . 
 Em caso de tecido retrátil é preciso se estirar a peça e aderir em cartolina e então colocar 
 no fixador. Material viscoso deve ser colocado sobre papel celofane e placa de Petri com 
 fixador. Nunca deve se colocar o material gaze pois a gaze acaba penetrando na peça e 
 cortando as fibras marcando a peça. 
 O material nunca deve ser colocado em frascos menores que o seu volume normal, o frasco 
 deve ser adequado, devendo ser de boca larga para facilitar colocar e tirar o material, com o 
 fixador o material tende a inchar portanto se o vidro for pequeno a peça irá inchar no fixador 
 e será difícil retirá-la fazendo com que seja necessário uma pinça para retirá-la 
 danificando-a ou até mesmo sendo necessário quebrar o frasco. 
 Nunca deve-se abrir ou seccionar a peça sem orientação. 
 O tamanho do material deverá ser reduzido , processo esse chamado de clivagem . 
 Fixação de sistemas biológicos 
 Conceito 
 É a operação pela qual se obtém a estabilização das estruturas celulares e intercelulares, 
 ao mesmo tempo, preservando dentro do possível a morfologia e a estrutura que tinham 
 durante a vida. 
 Fixação dos tecidos 
 Métodos físicos 
 ● Secagem ao ar 
 ● Criofixação 
 Métodos químicos 
 ● Uso de substâncias químicas 
 Secagem ao ar 
 Ocorrem distorções nos componentes submicroscópicos, a evaporação da água gera 
 enormes forças de tensão superficial, essa secagem acaba levando a um colapso e 
 desarranjo das estruturas subcelulares. 
 Criofixação 
 As células são submetidas a congelamento rápido e super rápido cuja velocidade de 
 congelamento é de 1000°C/seg. 
 São utilizadas substâncias crioprotetoras para evitar a formação de cristais de gelo se 
 houver congelamento essas substâncias ligam-se a água entra e ou extracelular tornando 
 não disponível para a formação desses cristais. O glicerol o dimetilsulfóxido e a sacarose na 
 concentração 2, 0 - 2,3M tem ação crioprotetoras. 
 Fixação química 
 Os tecidos são imersos em soluções de agentes desnaturantes ou de agentes que 
 estabilizam as moléculas ao formar pontes como moléculas adjacentes. 
 Fixadores com ação coagulante sobre as proteínas precipitam permanentemente as 
 mesmas e não são incorporados às proteínas, são fixadores não aditivos , como o etanol. O 
 etanol não é utilizado na microscopia eletrônica. 
 Fixadores com ação não coagulante são incorporados aos tecidos são os fixadores aditivos 
 como aldeído fórmico, glutárico, acroleína e tetróxido de ósmio. 
 Requisitos para um fixador 
 ● Possuir rápido poder de coagulação 
 ● Possuir bom poder de penetração 
 ● Conservar bem a estrutura natural das células 
 ● Possibilitar ou emprego de qualquer método de coloração 
 Normas gerais da fixação 
 ● Intervalo de tempo entre a colheita e a fixação 
 ● Volume do líquido fixador 
 ● Contato das superfícies da peça com o líquido fixador 
 ● Espessura da peça 
 ● Tipo de fixador 
 A colheita deve ser feita imediatamente após a morte do animal. 
 O volume do líquido do fixador deve ser abundante, alguns livros recomendam 30 a 40 
 vezes o volume da peça , não pode se economizar com fixador. 
 O material deve entrar em contato com líquido fixador completamente , se a peça for pesada 
 ela irá para o fundo do frasco por isso de vez em quando deve se agitar o frasco para que a 
 peça se revire dentro do frasco e todos os locais da peça entrem em contato com o fixador. 
 A espessura da peça deve ser reduzida, a peça deve ser clivada tendo espessura em torno 
 de 3 mm , quanto mais delgada melhor pois o fixador penetrará melhor. 
 O tipo do fixador depende do estudo, de qual microscopia será utilizada. 
 Qualidades que devem possuir os fixadores 
 ● Atuar com rapidez, promovendo a morte e fixação das células antes do 
 aparecimento dos fenômenos post mortem. 
 ● Possuir alto poder de penetração a fim de segurar a fixação correta de todo o 
 material 
 ● Conservar, no possível, os detalhes estruturais que apresentam in vivo 
 ● Permitir ou favorecer as etapas posteriores da técnica histológica 
 ● Impedir ou não provocar o aparecimento de estruturas artificiais 
 ● Não retrair excessivamente os tecidos 
 ● Devem produzir coagulação total das proteínas 
 ● Não deve encolher o tecido em excesso, escurece-lo ou torná-lo quebradiço ou 
 friável 
 ● Favorecer a observação das estruturas 
 ● Não impedirá posterior coloração dos tecidos 
 ● Conservar ou aumentar afinidade dos tecidos pelos corantes 
 ● Impedir o desaparecimento dos elementos solúveis dos tecidos, após a fixação 
 Lembretes 
 ★ Na escolha do fixador de se levar em conta a velocidade de penetração dos tecidos 
 e a finalidade do exame a ser realizado 
 ★ Poder de penetração do fixador é a propriedade que o mesmo possui de difundir-se 
 através dos tecidos 
 ★ Como regra geral nunca o fragmento de tecido a ser fixado deve ter a espessura 
 maior que 5 mm 
 ★ Para uma adequada fixação é necessário que o volume do líquido fixador seja pelo 
 menos 30 vezes maior que o volume do tecido nele mergulhado 
 ★ A temperatura aumenta a velocidade de fixação aumentando a penetração do 
 fixador através do tecido, por exemplo, formol 10% em temperatura ambiente leva 
 12 horas, em temperatura de 50°C levará 1 hora. 
 ★ O tempo de fixação varia de acordo com o poder de penetração do fixador volume 
 da peça e a temperatura de fixação, Zenker afirma que leva de 12a 24 horas, Bouin 
 afirma de 1 a 3 dias. 
 ★ Em um laboratório de histologia o termo material é geralmente utilizado para 
 qualquer fragmento de tecido ou órgão destinado ao exame microscópico 
 ★ A orientação do corte do material (clivagem) é muito importante para o exame 
 microscópico, em órgãos tubulares a secção deve ser feita perpendicularmente ao 
 órgão num plano transversal ou longitudinal. 
 ★ O fixador ideal não existe, cada um terá uma característica. 
 Principais substâncias fixadoras 
 Fixadores simples 
 Aldeído fórmico (formol), ácido acético, ácido fórmico, álcool etílico, álcool metílico, acetona, 
 bicloreto de mercúrio e dicromato de potássio. 
 Misturas fixadoras 
 São combinações de fixadores simples e são conhecidas pelo nome dos autores que as 
 utilizaram pela primeira vez 
 Líquido de Zenker - bicromato + sublimado + acético 
 Líquido de Helly - bicromato + sublimado + formol 
 Líquido de Bouin - picro + formol + acético 
 Prática da fixação 
 1. Colheita do material 
 2. Escolha do fixador 
 3. Tamanho da peça e volume do fixador 
 4. Tempo de fixação 
 5. Tratamento subsequente do material fixado (varia com o tipo de fixador), por 
 exemplo, quando o fixador é o líquido de Bouin, após a fixação, o material é retirado 
 do fixador e colocado em álcool. 
 Métodos de fixação 
 ➢ Fixação por imersão 
 O material é imerso imediatamente no líquido fixador. A fixação in vivo pode ser feita por 
 gotejamento de solução fixadora gelada sobre a superfície do órgão, não deve existir 
 cápsula fibrosa no órgão. 
 ➢ Fixação por perfusão 
 É de qualidade superior a fixação por imersão pois o fixador penetra tanto a nível pericelular 
 quanto a nível celular 
 Fatores importantes 
 Composição iônica 
 Osmolaridade efetiva 
 Temperatura 
 Solução fixadora 
 Pressão de perfusão 
 Descalcificação 
 Para que se possa examinar o tecido ósseo ou áreas de calcificação, deve-se antes de 
 incluir e cortar o tecido proceder-se a descalcificação (remoção do cálcio tecidual), ou seja, 
 em outras palavras a parte mineral será retirada restando apenas a parte orgânica. 
 Requisitos para uma boa descalcificação 
 ● Material muito bem fixado 
 ● Grande volume de descalcificador renovado constantemente, a medida que o cálcio 
 vai saindo do tecido ele vai impregnando o líquido até o momento em que não há 
 mais ação, por isso deve ser renovado 
 ● Ponto ótimo de descalcificação, para saber, é introduzida uma agulha no tecido, se a 
 agulha penetrar completamente o tecido está completamente descalcificado, se não 
 penetrar completamente ainda não está totalmente descalcificado 
 ● Neutralização ou eliminação do descalcificador contido na peça - sulfato de sódio a 
 5% 
 Descalcificadores 
 Ácido nítrico (HNO3) 
 É um descalcificador rápido , não causa o intumescimento dos tecidos e proporcionam maior 
 nitidez nas colorações geralmente é utilizada em concentrações de 5 a 10% não se 
 devendo expor o tecido a esta solução por mais de 48 horas , é muito prejudicial ao tecido. 
 Ácido etilenodiaminotetraacético ou EDTA 
 A principal desvantagem é que a descalcificação ocorre lentamente com tempo de 
 incubação de até várias semanas dependendo do grau de mineralização 
 Métodos de estudo 
 Descalcificação para observação da porção orgânica: células, matriz extracelular, fibras de 
 colágeno tipo I, glicosaminoglicanos, substância fundamental 
 Desgaste para observação da porção mineral: cálcio, fósforo, cristais de hidroxiapatita 
 Materiais utilizados para necrópsia 
 Kit de necrópsia 
 Faca de magarefe para animais grandes