Biologia molecular: Inserto de vetor de clonagem

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Inserto do vetor de clonagem
Com o objetivo final da produção de proteínas que auxiliem no diagnóstico mais
sensível de co-infecção pelo vírus da imunodeficiência humana (HIV, sigla em inglês) e
leishmaniose visceral (LV) foi realizado um estudo para encontrar o sequenciamento correto
do gene que expressa as proteínas dos antígenos. Após a finalização do estudo é necessário
amplificar a sequência encontrada, já que apenas a PCR não garante a quantidade necessária
do material genético. Pensando nisso, para amplificação desta sequência de genes introduz-se
o vetor de clonagem, plasmídeo com inserto da sequência desejada, em bactérias
selecionadas.
Para que o plasmídeo seja inserido dentro da célula bacteriana é necessária a presença
de bactérias quimiocompetentes, para fazer isso é preciso recolher parte da bactéria que
cresceu em meio LB ou 2xyt sem antibiótico e transferir 2 ml dessas para outro meio o qual
será centrifugado. Após a centrifugação deve-se descartar o sobrenadante e ressuspender o
pellet em 10ml de CaCl2 50 mM. Então, deve incubar a solução e novamente deve
centrifugar e ressuspender o pellet com 1 ml de CaCl2 50 mM, o qual depois de incubado
deve ser unido a 15% de glicerol (v/v). Para finalizar deve-se dividir em pequenas frações
iguais e estocar a -80ºC. Todo o processo deve ser feito em banho de gelo para ser bem
sucedido. Espera-se que ele resulte em bactérias com as suas membranas porosas para que o
plasmídeo entre.
Com a presença do plasmídeo recombinante e da bactéria quimiocompetente basta
realizar a transformação para que o plasmídeo desejado entre na célula. Para isso
acrescenta-se à bactéria, em banho de gelo, o plasmídeo e após um tempo agindo faz-se um
choque térmico introduzindo a mistura a 42ºC e depois no gelo novamente. Depois,
adiciona-se o meio LB e coloca-se a bactéria no shaker ou na estufa, em 37º temperatura
ótima de crescimento, por um período de tempo. Assim, espera-se que as bactérias que estão
no meio tenham suas membranas estabilizadas e se repliquem juntamente com o plasmídeo
com o inserto. Para confirmar a presença do plasmídeo nas células realiza-se o plaqueamento
das bactérias em meio com antibiótico e com a presença de X-gal e IPTG, logo as bactérias
que não receberam inserto formarão colônias de coloração azul, pois elas são capazes de
produzir beta-galactosidase ativa, sob ação do IPTG, que degrada o X-Gal. Enquanto as
células que receberam inserto ficarão brancas já que não produzem a mesma enzima.