Identificação de enterobacteriaceae ok

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Identificação de Enterobacteriaceae
Enterobacteriaceae
Maior e mais variado grupo de Bacilos Gram Negativos;
Embora possam ser encontradas amplamente na natureza, a maioria habita os intestinos do homem e dos animais, seja como membros da microbiota normal ou como agentes de infecção.
A diferenciação dos gêneros e espécies é realizada por meio de uma série de provas bioquímicas. Algumas espécies, em um mesmo gênero, são muito semelhantes, sendo necessário grande número de provas para diferencia-las.
Entretanto, este problema não cria dificuldades de ordem prática, uma vez que a diferenciação entre as espécies é dispensável, sob o ponto de vista médico, na maioria das vezes. 
± 20 espécies -> 95% das infecções. 
35% das septicemias, 70% das ITUs, infecções gastrintestinais, meningite. 
Doenças em animais de produção e estimação -> Sepsis, diarréias e meningites em recém nascidos até processos como mastites, abortos, infecções urogenitais. 
Coleta 
As amostras devem ser coletadas no inicio da doença, sem qualquer tratamento.
Recipientes estéreis 
Remeter as amostras ao laboratório em um prazo máximo de 02 horas. 
Semeio imediato ou refrigerar entre 4 – 8ºC
Se isso não for possível, Introduzir um Swab na massa fecal e conserva-lo em meios de Stuart ou Cary-blair. 
Como fase preliminar, pode se realizar um exame microscópico direto das fezes, para detecção de leucócitos polimorfonucleares.
Isso indica processo inflamatório, característico da presença de Shigella spp, E. coli e salmonela spp. 
A ausência de leucócitos sugere infecção viral.
A primeira etapa para a identificação de uma Enterobactéria patogênica é o semeio da amostra em um meio de cultura seletivo e diferencial. 
As enterobactérias sempre crescem nos meios ricos (ágar sangue, chocolate), bem como nos meios seletivos: ágar Mac Conkey e Salmonella-Shigella.
Semeio por esgotamento 
MEIOS PARA ISOLAMENTO DE ENTEROBACTÉRIAS
Secreções: ágar sangue e MacConkey. Hemocultura, 
Líquidos nobres e biópsias: Ágar sangue, Ágar Chocolate e MacConkey.
Fezes: MacConkey e Ágar SS. 
Urina: CLED, CPS, ágar sangue, ágar chocolate. 
Secreção vaginal: Ágar sangue, Ágar chocolate e Ágar Thayer Martin.
Crescimento 
Isolamento 
Quando não há crescimento significativo na semeadura primaria, pode se inocular as amostras em caldos de enriquecimento ou seletivos: 
Tetrationato
Agar hektoen
Agar verde brilhante 
Provas Bioquímicas 
Para uma realização de uma completa diferenciação bioquímica das espécies pertencentes à família das Enterobactérias seriam necessárias dezenas de provas. No entanto, ressalta-se que normalmente utilizam-se procedimentos direcionados para os patógenos mais importantes do trato gastrointestinal. 
O diagnóstico das bactérias (e também o gênero) considerando-se as patogênicas e de interesse clinico, oferece um bom resultado no sentido de escolher a conduta terapêutica que deve ser empregada no caso em estudo.
As provas bioquímicas de identificação bacteriana se baseiam, de um modo geral, na degradação de substratos incorporados aos meios de cultura com produção de compostos finais do metabolismo.
As provas mais conhecidas são: 
• Fermentação de Glicose
• Fermentação de Lactose 
• Fermentação de carboidratos 
• Produção de Indol 
• Produção de H2S 
• Utilização de Citrato 
• Prova da Urease 
• Motilidade
• Atividade de descarboxilase (lisina, ornitina e arginina)
As bactérias podem ser identificadas por características do seu metabolismo, como a capacidade de degradar determinados substratos e produzir gases. 
FERMENTAÇÃO DA LACTOSE
ÁGAR MAC CONKEY: 
	Empregado para isolar e identificar enterobactérias e outros bacilos gram-negativos entéricos;	
 Os típicos fermentadores de LACTOSE formam colônias avermelhas a rosadas. 
 As bactérias não fermentadoras formam colônias incolores ou âmbar.
 Inibidores para gram-positivos: SAIS BILIARES e CRISTAL VIOLETA.
A LACTOSE é o ÚNICO carboidrato presente neste meio.
FERMENTAÇÃO DA LACTOSE
Escherichia, Enterobacter, Citrobacter e Klebsiella fermentam lactose produzindo ácido e gás;
Shigella e Salmonella não utilizam lactose em seu metabolismo. 
	MICRORGANISMO	CARACTERÍSTICAS DAS COLÔNIAS 
	Escherichia coli	Vermelhas a rosadas, não mucoides. Podem estar rodeadas por um precipitado opaco de sais biliares. 
	Klebsiella sp. 
Enterobacter sp. 	Grandes, rosadas a creme, mucoides. 
	Serratia sp. 	Vermelha ou rosadas. Não mucoides.
	Proteus sp. 	Incolores e transparentes
	Salmonella sp
Shigella sp	Incolores e transparentes
GRAM POSITIVOS são inibidos
Agar tríplice açúcar ferro - TSI
A reação no TSI determina a habilidade dos microrganismos em degradarem carboidratos específicos incorporados ao meio, com ou sem produção de Sulfeto de Hidrogênio.
Considerando que todos os membros da familia são fermentadores de Glicose, a ausencia na alteração no meio de TSI caracteriza o principal indicio da presença de bastonetes Gram Negativos não fermentadores, para os quais deve ser adotado um esquema próprio de identificação.
O meio deve ser inclinado em bico de flauta, de cor vermelho-cereja e deve ser inoculado por picada central até o fundo, seguido de espalhamento na superfície e incubação durante 18-24h a 35ºC
	a) Ápice vermelho/base vermelha (alcalino/alcalino): AUSÊNCIA DE FERMENTAÇÃO DE CARBOIDRATOS. 
	b) Ápice vermelho/ base amarela (alcalino/ácido): FERMENTAÇÃO DE GLICOSE 
	c) Ápice vermelho/ base amarela e negra (alcalino/ácido/negra): FERMENTAÇÃO DE GLICOSE + PRODUÇÃO DE H2 S. 
	d) Ápice amarelo/base amarela (ácido/ácido):  FERMENTAÇÃO DE GLICOSE + LACTOSE + SACAROSE 
	e) Presença de gás (CO2) = bolhas ou meio fragmentado 
	f) H2S positivo = presença de precipitado negro
Geração de gases 
	Meio líquido -> presença de bolhas no tubo de Durham ;
	Meio sólido –> quebra ou deslocamento do meio de cultura;
Mobilidade indol ornitina - MIO
	Meio semi sólido e fornece resultados em termos de mobilidade bacteriana, produção de indol e descarboxilação da ornitina.
O meio é solidificado em posição vertical e a inoculação é feita com estilete através de uma picada reta central até o fundo do tubo.
Ocorre a produção de H2 S que é incolor.
O H2S reage com o ferro (indicador) formando um precipitado preto (sulfeto ferroso).
A mobilidade é detectada pela turvação completa do meio, a partir da linha de inoculação, considerando-se que as bactérias imóveis crescem apenas no ponto de inoculação.
A descarboxilação da ornitina resulta na alcalinização do meio, que se manifesta por uma coloração púrpura.
A produção de indol é evidenciada adicionando-se algumas gostas do Reativo de Kovacs, mudando a cor do meio para uma coloração rosa – vermelha quando positivo.
Meio de CITRATO DE simmons
A alcalinização produzida pela utilização do citrato é indicada pela mudança de coloração do meio ( VERDE -> AZUL);
Nesse teste, utilizam-se tubos com meio inclinado para a cultura ter mais acesso ao oxigênio, que é necessário para utilização do citrato ou meio de Citrato em Placas de petri. 
Incumba-se à 37ºC durante um período de 18 – 24 horas.
Tem como finalidade evidenciar a capacidade da bactéria de utilizar CITRATO como única fonte de carbono
Uma leitura antecipada ou tardia poderá conduzir resultados falsos.
Prova da urease
A capacidade do microrganismo produzir a enzima urease é verificada através da hidrolise da uréia incorporada ao meio, com formação de moléculas de carbonato de amônia, que irão alcalinizar o meio;
Amarelo - laranja -> Rosa;
Essa prova é de particular importância na identificação prévia do gênero Proteus, que possui forte atividade ureásica e produz viragem do meio dentro de poucas horas.
O meio é solidificado em tubos, de modo a formar uma superfície inclinada, devendo ser semeado com inóculo pesado, porém, apenas na superficie, seguindo de uma incubação a 37ºc durante um período de 18 a 24 horas
Descarboxilação de lisina, ornitina e arginina
Verifica a capacidade das bactérias de descarboxilar aminoácidos específicos no meiode cultura.
Entre as enterobactérias, apenas os gêneros Morganella, Providencia e Proteus possuem enzimas capazes de desaminar a fenilalanina em acido pirúvico, que é detectado pela adição do cloreto férrico a 10%.
Empregam-se normalmente três aminoácidos para identificação dos microrganismos: LISINA, ARGININA E ORNITINA (tubos separados). 
Indicador: púrpura de bromocresol
AGAR FENILALANINA
É usado para determinar a capacidade da bactéria de desaminar a fenilalanina dando como produto ácido fenilpirúrvico, no seu metabolismo tornando o meio ácido. Para evidenciar adiciona-se o Cloreto férrico a 10% se ficar verde é positivo, se ficar amarelo é negativo.
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