Exercícios de Revisão Engenharia Genética

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Sistemas de Clonagem Alternativos
· Quais as limitações da clonagem clássica?
· Sobre o vetor pGEM-T Easy, qual das afirmativas abaixo está INCORRETA?
1. Um gene pode ser inserido no vetor por clonagem clássica, usando duas enzimas
2. 
3. Um gene pode ser inserido no vetor por clonagem clássica, usando apenas uma enzima
4. 
5. Os promotores podem ser usados para produzir um RNA a partir do gene clonado
6. 
7. Os promotores podem ser usados para produzir uma proteína a partir do gene clonado
8. 
9. A digestão do plasmídeo com qualquer enzima que corte o MCS impede a clonagem por T-A
Detecção e Seleção de Clones Recombinantes
· Como identificar qual colônia contém o DNA correto?
· Bactéria naturalmente resistente a determinado antibiótico: Posso usar o mesmo antibiótico para seleção?
· Meio seletivo contendo ampicilina: Seleção funciona?
· Como podemos identificar as colônias que possuem o inserto corretamente inserido no vetor, dentre todas as colônias que cresceram na placa com o meio seletivo?
· Isolei colônias que contém o vetor -> e agora?
· Utilizando quais pares a amplificação ocorre:
1. Se existir inserto na amostra?
2. Se o inserto estiver no sítio de clonagem do vetor?
3. Se o inserto estiver no sítio de clonagem E na orientação correta?
Expressão de Proteínas Recombinantes
· Para produzir uma proteína funcional em qual organismo devo expressar? Qual vetor utilizar? (compatibilidade)
· Quando o gene de interesse é expresso? Por quê?
· Sobre purificação:
1. Qual etiqueta utilizar?
2. Como purificar a proteína recombinante?
3. Como remover a etiqueta?
· Se a etiqueta for C-terminal, o que acontece se um stop códon for incluído?
· Em que situações não se deve usar adicionar o stop códon ao primer reverso? E o start códon?
· Para clonagem utilizando os sítios SalI e HindIII, qual dos vetores deveria ser usado?
· 
· O fato de o amplicon ter start códon faz diferença?
Análise de Clones Recombinantes
· Após a transformação e plaqueamento das bactérias, o que deve ser feito para que possamos obter bactérias contendo o DNA recombinante desejado? Descrevam e expliquem as etapas.
· A sequência abaixo corresponde ao inserto (entre as barras verticais “|”) dentro do sítio de clonagem do vetor. Com base nessas sequências, desenhe pares de primers com 8 nt de comprimento cada com os objetivos de:
5'-...TGACATGT|ATGTTATATCTCGGC...TGATGTGCGGAGGTAG|ATTAGACCG...-3'
a) Amplificar exclusivamente o inserto
F:______________________________ R:_________________________________
b) Demonstrar que o inserto está dentro do plasmídeo, independente de orientação
F:______________________________ R:_________________________________
c) Demonstrar que o inserto está dentro do plasmídeo na orientação demonstrada
F:______________________________ R:_________________________________
· Após a clonagem do inserto em pGEM-T Easy e transformação, colônias brancas foram selecionadas e analisadas por toothpick (análise do tamanho dos plasmídeo) e PCR de colônia (utilizando primers que amplificam apenas plasmídeos nos quais o inserto está na orientação desejada). Os resultados estão representados nas figuras abaixo (M: marcador molecular; P: plasmídeo controle). Interprete as imagens, selecione todas as colônias que contém o inserto da forma correta e explique o porquê da escolha.
Toothpick PCR de colônia
· Foi feita a digestão do plasmídeo, e o produto da digestão, bem como o plasmídeo não digerido, foram analisados em um gel de agarose (abaixo). No entanto, não foi marcado em qual canaleta foi aplicado qual produto. Deduza o que foi aplicado em cada canaleta e discuta o resultado obtido.
 
 M 1 2