Coloração de Gram

Prévia do material em texto

Coloração de Gram – usada para diagnóstico clínico 
laboratorial, permitindo classificar as bactérias em: 
• Gram Positiva – bactérias que se coram em 
roxo; 
• Gram Negativas – bactérias que se coram em 
vermelho 
Tendo como base a estrutura dessas bactérias que 
diferenciam uma das outras. Lembrando que não são 
todas as bactérias que se coram pelo Gram, por 
exemplo as Micobactérias, tem bactérias que não 
possui parede celular como o gênero Micoplasma e 
também têm bactérias que são muito delgadas, cuja 
coloração de Gram não permite sua visualização. 
Para realizar esta técnica – precisa ser uma cultura 
recente, estar trabalhando com cultivo puro para 
evitar diferentes tipos celulares na lâmina, ou, se for 
isolamento primário, precisa preparar a lâmina a 
partir da colônia isolada para assegurar um único tipo 
celular bacteriano. Precisa obedecer ao tempo e a 
sequencia da adição dos reagentes (existem alguns 
modelos da técnica, com algumas mudanças desse 
tempo ou no reagente que é usado). E com a 
coloração de gram, pode-se evidenciar 3 formações: 
1° - reação se é positiva/negativa; 
2° - forma da célula bacteriana 
3° - qual arranjo que essas células bacterianas apresentam 
na coloração. 
 
Esta técnica é separada em dois momentos: o 
primeiro é o esfregaço em lâmina de vidro, e o 
segundo é quando corar essa lâmina propriamente 
dita para ser observada em microscópio óptico. 
▪ ESFREGAÇO 
 
 
 
 
 
 
Há três maneiras de preparar o esfregaço: 
1. Direto da amostra 
 Pode ser feito diretamente da amostra (COVID-19) 
com o objetivo de fazer a cultura bacteriológica ou 
exame direto da amostra do paciente. O swab deve 
ser passado fazendo uma pressão e girando ele no 
local da lesão, e depois esfrega esse swab na lâmina. 
Caso seja um alimento: abre o swab, mergulha no 
alimento, tira o excesso e em seguida o esfregue na 
superfície da lâmina (movimento circular ou zigue-
zague). 
Para levar esse swab para o laboratório, é colocado 
em um tubo de ensaio que contém um meio de 
transporte, podendo ser soro fisiológico ou algum 
meio de cultura próprio para manutenção da bactéria. 
2. A partir de uma colônia 
 
A partir de uma cultura em meio sólido, inicialmente 
será depositado na lâmina uma ou duas gotas de 
solução salina e depois retira o fragmento da colônia 
da placa ou do tubo de ensaio com um meio sólido, e 
depois misturamos com a solução salina, para em 
seguida, esfrega-lo na lâmina em movimento circular. 
3. A partir de suspensão líquida 
 
Não precisa de solução fisiológica, apenas vai 
homogeneizar essa suspensão líquida, vai usar uma 
alça de platina flambada (Bico de Bunsen), depois de 
retirar essa gota com a extremidade da alça de 
platina, faz o esfregaço dessa gota no centro da 
lâmina. 
Para terminar essa confecção do esfregaço, fazemos a 
secagem da lâmina (aproximar essa lâmina no bico de 
Bunsen e com o lado do esfregaço oposto à chama), 
Fundamentos de identificação macro e microscópic a 
Estruturas e aspectos com morfologia de colônia e métodos de coloração 
 
 Coloração de Gram 
 
 
 
 
nisso a lâmina irá secar e fazer a ultima etapa que é 
fixar o esfregaço (matar as células e fixar na superfície da 
lâmina, colocando o fundo da lâmina na chama de Bunsen 
com um movimento de vai-e-vem). 
▪ CORAR COM CRISTAL VIOLETA – 1min. 
Após o esfregaço, secagem e fixação da lâmina, o 
próximo passo é a coloração. 
O primeiro corante é o cristal violeta (genciana), 
depositando esse cristal violeta na lâmina e cobrindo 
todo o esfregaço, após espalhar por toda a lâmina, 
conta-se 1 minuto. Nesse 1 minuto, a bactéria vai ficar 
com a parede celular corada em roxo, independente 
de ser positiva ou negativa, e após esse 1 minuto 
inclinamos a lâmina para esse excesso de cristal 
violeta escorrer e em seguida lavar a lâmina com 
água; esta água tem que ser despejada na 
extremidade da lâmina para escorrer na superfície da 
lâmina (não pode jogar a água direto no esfregaço 
senão pode tirar uma parte do esfregaço e isso não é 
bom). Depois de lavar a lâmina para tirar o excesso do 
cristal violeta, usaremos um 2° reagente que se chama 
Lugol. 
Lugol tem sua importância para a fixação do cristal 
violeta na parede celular, é uma solução a base de 
iodo e diodeto de potássio. Quando o lugol reage com 
o cristal violeta, vai se formar um complexo chamado 
iodopararosanilina (cristais que vão se fixar na parece 
celular da bactéria). Terminado o tempo de contato 
de lugol com essa lâmina, de 1 minuto, inclinamos a 
lâmina para retirar o excesso e adicionamos álcool por 
somente 30 segundos e essa etapa do álcool que irá 
diferenciar a bactérias (Etapa de descoloração). 
O que acontece nesta etapa? 
Quando adicionamos o álcool, na bactéria gram 
positiva esse álcool não vai conseguir remover o 
cristal violeta, as purinas vão se fechar e os cristais 
iodopararosanilina (por serem macro moléculas) vão 
ficar retidos na parede celular onde tem uma camada 
espessa de peptídeoglicano. Já no caso das bactérias 
gram negativas, o álcool irá promover uma dissolução 
dos lipídeos (parede celular das bactérias gram negativas 
possui estrutura com maior concentração de lipídeos, por 
conta do LPS e por conter membrana externa, adicional que 
é a membrana citoplasmática), esses lipídeos serão 
dissolvidos, a BGN possui uma camada delgada de 
peptideoglicano, ou seja, os cristais não ficam bem 
fixados nesta parede e o cristal violeta é todo 
removido da parece celular destas bactérias. 
Depois da etapa da descoloração, a BGP 
permanecerá roxo e a BGN ficará incolor. Lavamos 
novamente com água (depois do álcool) e usar um 
Contra-Corante (Safranina) , com a tonalidade 
rosa avermelhado, deixar esse corante na lâmina 
por 30s, e como a parede do BGP ficou roxo, 
vulgamente com os canais de purinas fechados e 
o cristal violeta ali fixado, essa bactéria não será 
corada pela Safranina, já a BGN como ficou com 
sua parece incolor, absorve a coloração Safranina 
e passa a ficar com a respectiva cor. 
 
Por fim, a BGP fica corada em roxo e a BGN ficará 
corada em vermelho/rosado. Terminado toda essa 
sequência, prepararemos a lâmina para a visualização 
microscópica. 
Após a fucsina, inclinaremos a lâmina para retirar seu 
excesso, em seguida lavar em água e secar (com 
papel toalha). Depois com a lâmina seca, vamos 
adicionar 1 gota de óleo de imersão (óleo de cedro), 
esse óleo vai funcionar como lente para convergir o 
raio luminoso do microscópio para dentro da objetiva 
(com aumento de 100x), e essa objetiva também é de 
imersão, ou seja, sua extremidade tem que encostar 
na gota do óleo (não precisa espalhar o óleo). 
Cuidados: não pode usar objetivas menores para visualizar 
as bactérias, e nem encostar o óleo de imersão nas 
objetivas menores. 
Com isso, faz a leitura dessas 3 informações citadas 
(reação de gram, se é positiva ou negativa/a forma da 
célula bacteriana e o arranjo celular). 
 
 
 
 
 
 
Cocos gram positivos corados em roxo com arranjos em cachos 
(staphilo)