AUTOMAÇÃO EM IMUNOLOGIA

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AUTOMAÇÃO EM IMUNOLOGIA
CLÍNICA
1. ELISA ( ENZIME LINKED
IMMUNOSORBENT ASSAY)
Realizado para diagnosticar doenças
como dengue, AIDS, hepatites,
doença de Chagas, toxoplasmose,
rubéola, etc
Já foi amplamente utilizado, mas hoje
está sendo substituído por
quimioluminescência.
ou seja, pesquisa anticorpos!!!
PRINCÍPIO DO ELISA:
- Anticorpos ou antígenos
podem ser ligados à enzima de
maneira que, ao ser adicionado
à reação o substrato da enzima,
é gerado um produto colorido
que poderá ser medido por
espectrofotometria
- A reação é desenvolvida em
placas de plástico contendo
séries de pocinhos onde são
depositados os reagentes
- Antígenos ou anticorpos,
dependendo do objetivo do
método, são adsorvidos à placa
que, usualmente, é feita de
poliestireno ou polivinil,
materiais que possibilitam à
maioria dos antígenos,
adsorção adequada
De acordo com a proteína
adsorvido na placa para ELISA, o
exame pode ser considerado:
1] geração: lisado viral
2ª geração: peptídeo sintético
3ª geração: uso de antígeno ligados a
enzimas ( sanduíche)
4ª geração: antígenos e anticorpos
ligados a fase sólida ..
ELISA PRIMEIRA GERAÇÃO
- Os antígenos são originados de
um lisado do vírus ;
- Esses ensaios são pouco
específicos e, pelo fato de
detectarem apenas IgG, são
também menos sensíveis do
que os ensaios das gerações
posteriores.
- A janela de soroconversão dos
ensaios de primeira geração é
de 6 a 8 semanas (2 meses).
JANELA IMUNOLÓGICA: Período em
que o paciente está contaminado,
mas a sensibilidade do kit não
consegue detectar a quantidade
de anticorpos naquele momento.
explicando a técnica: antígenos
fixados na placa , o soro do paciente é
colocado na máquina. ( falta terminar).
ENSAIOS DE PRIMEIRA GERAÇÃO
ESTÃO SUJEITOS A RESULTADOS
FALSO-POSITIVOS
REAÇÃO CRUZADA: colocar
explicação;
ELISA 2º GERAÇÃO
- Em 1986, o diagnóstico
laboratorial do HIV começou a
ser realizado no Brasil.
- Em 1987, surgiu a segunda
geração de ensaios, que
empregaram o mesmo formato
indireto da primeira geração.
- A diferença entre essas duas
gerações foi a utilização de
antígenos recombinantes e
peptídeos sintéticos, originados
de regiões específicas de
proteínas do vírus.
- Em comparação com os
ensaios de primeira geração, os
de segunda são mais
específicos por conter uma
maior concentração de
proteínas (epítopos
imunodominantes) relevantes.
- Em média, a janela de
soroconversão dos ensaios de
segunda geração é de 28 a 30
dias.
ELISA 3º GERAÇÃO
- Utiliza antígenos recombinantes
ou peptídeos sintéticos
- Tem formato de sanduíche (
antígeno + anticorpo +
antigeno)
- Esse formato permite a
detecção simultânea de
anticorpos IgG e IgM.
- Dessa forma o anticorpo fica
entre dois antígenos e, por essa
característica, qualquer classe
de imunoglobulina IgG, IgM, IgA
ou IgE será detectada por esse
tipo de metodologia
- A modificação do formato dos
testes para ELISA sanduíche
tornou o ensaio mais sensível e
específico, pois todas as
classes de anticorpos IgG, IgM
e IgA passaram a ser
detectadas.
- Os ensaios de terceira geração
reduziram o período de janela
imunológica
- A janela de soroconversão dos
ensaios de terceira geração é
de 22 a 25 dias
-
explicar a tecnica;
ELISA COMBINADO OU 4º
GERAÇÃO
- Os testes ELISA de quarta geração
são capazes de detectar,
simultaneamente, a presença de
antígenos e (ou) anticorpos em uma
amostra.
Ag P24 , gp 160, gp120, etc. → Ac
para esses antígenos ( detecta esses
antígenos)
- Estes ensaios apresentam as
mesmas características dos ensaios
da geração anterior, mas são capazes
de detectar, também, o antígeno p24
do HIV.
- Estão fixados: anticorpos contra o
antígeno p24 e antígenos (proteínas)
do HIV-1 (como as proteínas gp160,
gp120 e gp41), antígenos do grupo O
e antígenos de HIV-2 .
ETAPAS DO ELISA 4º GERAÇÃO
Descrição:
I. Na fase sólida, estão fixados:
anticorpos contra o antígeno p24 e
antígenos (proteínas) do HIV-1 (como
as proteínas gp160, gp120 e gp41),
antígenos do grupo O e antígenos de
HIV-2 .
II. A presença de anticorpos, na
amostra, é detectada pela adição de
uma solução de proteínas
recombinantes e de peptídeos
sintéticos do HIV, conjugadas com
uma enzima. A presença de antígeno,
na amostra, é indicada pela adição de
uma imunoglobulina anti-p24
conjugada a uma enzima.
III. A revelação da reação acontece
pela adição de um substrato
(cromógeno e peróxido de hidrogênio
– H2O2) que resultará na formação de
cor, indicando a presença de
antígenos ou de anticorpos, na
amostra. A intensidade da cor será
medida em um espectrofotômetro.
IV. Cada conjunto diagnóstico indica
como calcular o ponto de corte (cut
off), a partir do qual as reações são
interpretadas como reagentes, não
reagentes ou indeterminadas.
RESULTADOS DOS EXAMES
Cada marca de Kit de ELISA define
um valor, acima (ou abaixo) do qual
o paciente é considerado reagente
(positivo) e abaixo (ou acima) do
qual o paciente é não reagente
(negativo)
o resultado é medido
numericamente:
100 pra baixo: negativo
acima de 100: positivo
Os resultados do ELISA podem
ser:
- POSITIVO
- NEGATIVO
- ZONA CINZENTA:
ZONA CINZENTA: Zona cinzenta
geralmente é determinada como zona
de segurança para Hemocentros
a partir de 90: zona cinzenta !
Pode variar de 10-30% para cima e
para baixo do valor considerado
normal, ou seja, o valor de corte
(“cut off”).
● Nos hemocentros, o exame que
cair na zona cinzenta é
considerado positivo, e o
sangue daquele doador não é
transfundido.
2. NEFELOMETRIA e
TURBIDIMETRIA
Também conhecidos como
imunoensaios de dispersão de luz,
baseiam-se na formação de
complexos Ag-Ac e a passagem de luz
por uma amostra contendo os
precipitados.
A Turbidimetria e a Nefelometria são
métodos analíticos inversos mas que
são utilizados juntos.
DIFERENÇA ENTRE
TURBIDIMETRIA E
NEFELOMETRIA:
A principal diferença entre
nefelometria e turbidimetria é que na
nefelometria a luz difundida, ou seja
aquela que atravessa a solução, é
medida, enquanto que na
turbidimetria, a luz não difundida (a
absorvida) é medida.
Ou seja, enquanto que na nefelometria
mede-se a luz dispersa pelos
imunocomplexos, num ângulo de 90º,
na turbidimetria mede-se a redução da
luz num ângulo de 180º
- O aparelho da nefelometria é
semelhante ao da turbidimetria,
porém o detector de luz é
localizado em diferentes
ângulos, dependendo do ângulo
que a maioria da luz dispersa é
encontrada.
- Para medir a maioria das
substâncias, é utilizada a
lâmpada de Tungstênio,
fornecendo luz na região
visível. Para maior
sensibilidade, utiliza-se
nefelômetros a laser.
APLICAÇÕES DA NEFELOMETRIA
Determinação de:
- frações do Complemento
- Imunoglobulina (IgG, IgA, IgM)
- Transferrina
- Haptoglobina
- Cadeias kappa e lambda
- Albumina e pré albumina
- Proteína C Reativa
- Fator reumatóide
- Alfa-2-macroglobulina
- Outras proteínas plasmáticas
- Determinação de ribonuclease
e sulfato em urinas
- Contagem de células
sanguíneas
- Mede complexos
antígeno-anticorpo
- Análise de enzimas que atuam
em substratos específicos
APLICAÇÕES DA TURBIDIMETRIA
- Permite avaliar amostras
sólidas, líquidas e gasosas
- Pode ser usada para
gelatinosos difíceis de filtrar
- Análise quantitativa de solução
coloidais e emulsões
- Ensaios quantitativos que
usam complexo
antígeno-anticorpo
- Medir quantidade de proteínas
em fluidos
- Determinação de
imunoglobulinas
- Determinação de proteínas do
Complemento
- Determinação de coagulação
- Não distingue células vivas ou
mortas
Baixa sensibilidade
3. CITOMETRIA DE FLUXO
É uma técnica utilizada para contar,
examinar e classificar partículas
microscópicas suspensas em meio
líquido em fluxo.
FACS ( SEPARADOR CELULAR
ATIVADO POR FLUORESCÊNCIA)
- É resultante do aprimoramento
tecnológico, que se utiliza da
automação das análises e faz a
diferenciação celular pelo
emprego prévio de anticorpos
fluorescentes.
- Assim, fornece informações
rápidas e precisas com a
identificação de inúmeras
características intrínsecas ou
extrínsecas contidas nas
células.
- Reconhece com precisão o
tamanho, e a granulosidade,
pormeio da leitura da
intensidade da fluorescência
refletida em células
previamente marcadas com
anticorpos monoclonais
fluorescentes.
Pode ser usado em:
● Imunologia para a detecção ou
identificação de subtipos de
células implicadas na
imunidade.
● Hematologia foi uma das
primeiras a se beneficiar com a
citometria de fluxo. Utilizado
para diagnóstico ou terapêutica
das doenças hematológicas.
● Oncologia: a detecção da célula
patológica é a aplicação mais
desenvolvida. Esta detecção
está relacionada à medição de
um conteúdo anormal de DNA
no núcleo da célula tumoral.
● CITOMETRIA DE FLUXO:
importante→ Utilizado para
contagem de linfócitos T CD4
Um indivíduo saudável tem cerca de
800 a 1500 células TCD4 por
microlitro de sangue.
- Quando o número de células CD4 é
inferior a 200 por microlitro de sangue,
a defesa imunitária deixa de ser
eficiente.
Quando olhamos este esfregaço de
células sanguíneas, nós identificamos
um linfócito e vários eritrócitos.
Contudo, não conseguimos saber se
este é um linfócito B ou T , por
exemplo:
linfócito :
Mas se nós identificarmos quais
proteínas estão presentes na
membrana desta célula, nós
poderemos saber qual célula é esta.
Por exemplo: a diferenciação pode ser
feita com o citômetro de fluxo.
4. QUIMIOLUMINESCÊNCIA
características gerais:
- Método imunológico baseado
na emissão de energia
luminosa: Reação Química;
- Quantifica antígenos-anticorpos
em fluídos corporais utilizando
substâncias luminescentes:
luminol, ésteres de acridina,
biotina..
- Durante uma reação química,
os reagentes se transformam
em estados intermediários
eletronicamente excitados, e ao
passarem para um estado de
menos excitado, liberam a
energia absorvida na forma de
luz;
- As reações mais utilizadas:
oxidação do luminol, ésteres
de acridina;biotina,
● Um dos métodos de escolha
para substituir o
Radioimunoensaio e ELISA
VANTAGENS:
Ensaio com elevada sensibilidade e
especificidade
Exame basicamente automatizado e
rápido (30 minutos)
Várias amostras podem ser analisadas
e distintas moléculas podem ser
quantificadas de uma só vez.
DESVANTAGENS;
Exige equipamentos especiais;
Custo elevado.
TÉCNICA DE
QUIMIOLUMINESCÊNCIA
1. Fase sólida em que uma
microesfera magnética é revestida
com anticorpo
monoclonal contra antígeno analisado
2. Adição do antígeno do soro do
paciente, que é incubado com
agitação
3. Lavagem para retirada de
componentes não fixados
4. Adição de anticorpo monoclonal
específico para o antígeno
pesquisado,
conjugado à enzima
OBS: Utilizam-se anticorpos ligados a
um marcador luminescente
(cromógeno que pode ser o próprio
luminol ou mais modernamente
derivados da acridina, como biotina,
etc)
5. Incubação (10 minutos)
6. Lavagem para retirada de anticorpo
conjugado não ligado
7. Adição de substrato da enzima
8.Incubação 5 minutos
9. Adiciona-se o substrato
quimioluminescente ( Peróxido ou
hidróxido de hidrogênio, permitindo a
hidrólise na presença da enzima,
produzindo substâncias instáveis que
culminam na emissão de luz.
10.A quantidade de conjugado
anticorpos é medido pela intensidade
de luz emitida através de um
fotomultiplicador em unidades relativas
de luz (RLU)
APLICAÇÕES:
- Dosagens de hormônios
- Doenças infecciosas (hepatite e
HIV, Covid )
- Marcadores tumorais
- Outras proteínas séricas]
Reação em Cadeia de Polimerase
(PCR ou polimerase chain reaction)
Reação em Cadeia de Polimerase
(PCR)
É uma reação que promove, in vitro,
a amplificação de um segmento
específico de DNA dentro de um
genoma região
de interesse.
Aparelho: termociclador
DUPLICAÇÃO EM FITA DE DNA
REAGENTES NECESSÁRIOS
● DNA molde
● Iniciadores (primers)
Sequência curta de nucleotídeos que
fornece um ponto de partida para a
síntese de DNA.
São projetados de modo que
englobam a região de interesse.
Dois primers são usados para cada
reação.
Determina a região que será copiada
ou amplificada
. Se ligam ao molde por pareamento
de bases.
. DNA polimerase (Taq)
Nucleotídeos: adenina, guanina,
citosina, timina
Cada ciclo é repetido em torno de
25-36 vezes, e promove a
amplificação da região alvo
determinada conforme afinidade das
sequências iniciadoras. Assim, o
iniciador reconhece por
complementaridade o início do local a
ser amplificado, efetua a ligação e
sinaliza para a polimerase o início da
sequência a ser replicada.
TÉCNICA DE PCR
Inicialmente ocorre a extração do
material genético da célula, que será o
DNA molde.
Será adicionada uma mistura junto ao
DNA MOLDE que contém
NUCLEOTÍDEOS, PRIMERS DNA
POLIMERASE
Este material vai para um aparelho
conhecido como termociclador,
aquecendo e esfriando o material ali
contido em ciclos de temperatura
pré-estabelecidos, que são
necessários, pois permitem que o
DNA seja sintetizado
TÉCNICA
O aquecimento e o resfriamento, para
que o DNA seja sintetizado, acontece
da seguinte forma:
Desnaturação — aquecimento a 95ºC,
com o objetivo de separar a reação
por meio da desnaturação. O
resultado desse aquecimento é um
molde de fitas simples de DNA;
Anelamento — a mistura é resfriada
entre 57-63 ºC. Essa etapa é
importante para que os primers
possam ligar-se ao molde de fita
simples de DNA (resultado do
aquecimento);
Extensão — para finalizar, em 72ºC,
as bases nitrogenadas fazem com que
os primers estendam-se, sintetizando
novas fitas de DNA.
O processo é refeito de 25 a 36 vezes
para que aconteça a cópia das
sínteses de DNA de forma
exponencial.
O processo dura cerca de 2-4 horas e
o material pode ser analisado em gel
de agarose ou de poliacrilamida
(matriz sintética).
ETAPAS DA PCR
ELETROFORESE
Os resultados de uma reação PCR
tornam-se visíveis através do uso da
eletroforese em gel.
Eletroforese em gel é uma técnica na
qual fragmentos de DNA são puxados
por uma corrente elétrica através de
uma matriz de gel, e que separa os
fragmentos de DNA de acordo com o
tamanho e carga elétrica.
Fragmentos de DNA formam
"bandas" no gel, que podem ser vistas
a olho nu se o gel for pigmentado com
um corante que se liga ao DNA.
PCR EM TEMPO REAL ( RT-PCR)
A tecnologia de PCR em Tempo Real
(RT-PCR) é uma evolução do método
de PCR Convencional, possuindo o
mesmo princípio.
A sigla RT-PCR significa PCR
quantitativa em Tempo Real
As vantagens é que são ensaios muito
mais sensíveis, específicos e rápidos,
principalmente quando comparados
aos testes convencionais, que levam
de 2 a 3 horas para emitir o resultado.
Na RT-PCR, o resultado é visualizado
imediatamente, dispensando a
eletroforese. Isto é possível pela
adição de sondas fluorescentes às
reações de PCR. A amplificação do
DNA-alvo é monitorada durante o
processo de RT-PCR. A medida que o
DNA é amplificado, o nível de
fluorescência cresce
proporcionalmente.
O equipamento é capaz de detectar a
fluorescência eventualmente
produzida pela amostra e assim a
técnica permite acompanhar a reação
e a apresentação dos resultados em
tempo real.
EXEMPLO DE UMA ANALISE
FORENSE
Suponha que você esteja trabalhando
em um laboratório de ciências
forenses.
Você acabou de receber uma amostra
de DNA de um cabelo deixado em
uma cena de crime, juntamente com
amostras de DNA de três possíveis
suspeitos.
Seu trabalho é examinar um marcador
genético em particular e verificar se
algum dos três suspeitos coincide com
o DNA do cabelo para esse marcador.
APLICAÇÃO:
A PCR é usada em diagnósticos de:
a. Doenças genéticas (ex.: fibrose
cística)
b. Análises forenses de DNA
c. Clonagens de DNA
d. Testes de paternidade
e. Sexagem de embriões
f. Detecção de agentes infecciosos
(HIV, citomegalovírus, Hepatites B e C,
herpes vírus simples, Helicobater
pylori, Mycobacterium tuberculosis,
Chlamydia trachomatis, Pneumocistis
carinii).
g. Risco de Doenças Cardiovasculares
PCR PARA COVID - 19
PCR: Coleta até o
quinto dia de sintomas do Covid
PCR: coletar 2 swabs: um para as
duas nasofaringes e outro swab para
orofaringe . Colocar os dois swabs no
mesmo tubo contendo solução salina.
Congelar, se for enviar para
laboratório de referência.
Do sétimo ao décimo dia, pesquisar
IgG ou IgM através de
quimioluminescênia(quantitativo) ou
teste rápido
SENSIBILIDADE e ESPECIFICIDADE
Para confirmação de uma hipótese
diagnóstica é necessário se apoiar em
exames laboratoriais com elevada
sensibilidade e especificidade
A população em geral se divide em
4 categorias em relação ao traço
que se quer investigar:
1. Os verdadeiros positivos
(indivíduos que têm a doença e nos
quais o teste foi positivo),
2. Os verdadeiros negativos
(indivíduos que não têm a doença e
nos quais o teste foi negativo)
3. Os falsos positivos (indivíduos
que não têm a doença e nos quais o
teste foi positivo)
4. Os falsos negativos (indivíduos
que têm a doença e nos quais o teste
foi negativo)
SENSIBILIDADE
● É a capacidade que um teste tem
de discriminar, dentre os suspeitos de
uma patologia, aqueles efetivamente
doentes
Segundo Galen e Gambino, 1975 :
“Sensibilidade é a positividade da
doença”
Por exemplo: Dentre 100 pacientes
doentes:
Um teste com 99% de sensibilidade
deixaria de confirmar a hipótese
diagnóstica de 1 indivíduo dentre 100
efetivamente doentes.
Sensibilidade = verdadeiros positivos
X100 / verdad. pos + falsos
neg(doentes)
S = A / A+C
A soma dos verdadeiros positivos e
falsos negativos corresponde ao
total de indivíduos doentes
ESPECIFICIDADE
● É a capacidade que um teste tem
de ser negativo em face de uma
amostra de indivíduos que
sabidamente não tem a doença em
questão
Segundo Galen e Gambino, 1975:
ESPECIFICIDADE é a
“negatividade da saúde”
Por exemplo: Um teste com 98% de
especificidade, rotularia como doentes
2 dentre 100 indivíduos que
efetivamente não
Especificidade = verdadeiros
negativos X100 / verdad neg + falsos
pos
E = D__
B+D
RESUMINDO;
VALOR PREDITIVO POSITIVO
Após os exames laboratoriais, os
indivíduos se dividirão em 2 grupos:
aqueles nos quais o teste foi positivo e
aqueles nos quais o teste foi negativo.
É necessário identificar, dentre o total
de positivos, quais os verdadeiros
positivos
A qualidade de um teste de
corretamente identificar tais indivíduos
denomina-se
“valor preditivo positivo”
VPP= A / A+B
A= verdadeiro positivo
B= falso positivo