Sequenciamento de DNA

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Sequenciamento de DNA
--- Sequenciamento de DNA ---
Técnica usada para saber a ordem dos nucleotídeos em
um DNA.
Tem aplicações em:
• Biologia molecular
• Biologia evolutiva
• Metagenômica
• Medicina
• Perícia forense
● Sequenciamento: 1ª geração
❖ Método de Degradação Química
- Criado por Gilbert e Maxam (1976-1977).
- Modificação química do DNA seguido de
clivagem em bases específicas.
- O sequenciamento Maxam-Gilbert foi o primeiro
método amplamente adotado.
I. Modificação química do DNA; marcação na posição
final 5’do DNA
II. Purificação do DNA
III. Tratamento químico para quebrar o DNA (alterar,
remover ou clivar as bases)
IV. Correr no gel Método de Degradação Química
❖ Método de Interrupção de Cadeia
- Criado por F. Sanger et al. (1977 ou 97).
- Baseado na incorporação de
dideoxinucleotídeos (não tem O2, então impede
a ligação) que terminam o alongamento da
cadeia.
- É utilizado ainda hoje em muitas áreas.
- Originalmente, o DNA era desnaturado e
separado por eletroforese. (na eletroforese, o
começo do gráfico não é bom para análise,
então é desconsiderado).
- Posteriormente, sequenciamento com ddNTPs
marcados com fluoróforo.
- Utilização de capilares e cromatograma.
● Sequenciamento: 2ª geração
(proporciona sequenciamento de maior rendimento)
❖ Next Generation Sequencing (NGS).
(começa a gerar grande quantidade de dados)
- Fim da era de tecnologias baseadas em
eletroforese.
- Alta capacidade de geração de dados Métodos
alternativos à clonagem tradicional.
❖ Sequenciamento por Síntese
- Método baseado no uso de fluoróforos nas
bases introduzidas (diferença desse para a
Interrupção por cadeia é que esse não para, não
tem pausas) na fita de DNA.
- Tecnologia utilizada por sequenciadores Illumina
(Solexa).
I. Purificação do DNA e corte em pequenos fragmentos
(tags). Adaptadores são inseridos.
II. O DNA com se liga em oligonucleotídeos que
revestem uma lâmina (flow cell).
III. A geração de clusters começa. Várias fitas de DNA
são criadas por amplificação de ponte.
IV. Primers são adicionados e a polimerase adiciona
nucleotídeos marcados com fluoróforos (um por vez).
❖ Piro-sequenciamento
- Método baseado no princípio do
sequenciamento por síntese.
- Detecção de luz com base em uma reação em
cadeia quando o pirofosfato é liberado. (Tem luz
gerada por ATP, e 1 nucleotídeo é acrescentado
por vez)
- Roche 454 sequencing (Life Sciences).
I. Preparação da biblioteca de DNA. Fragmentos de
300-800 bp, adição de adaptadores.
II. DNA é fixado em beads e mergulhados em emulsão.
Ocorre amplificação por PCR na emulsão (reações
independentes).
III. As beads são colocadas em uma placa PTP. Cada
nanoporo da placa acomoda uma bead.
IV. Ocorre o sequenciamento. Um dNTP é adcionado
por ciclo. Nucleotídeos não incorporados são
degradados.
V. Resultados são processados por um software.
Sequenciamento de DNA
❖ Sequenciamento por Ligação:
(não precisa estudar detalhadamente)
- Método que utiliza a enzima ligase (não há
criação de uma segunda fita) e sondas
marcadas. (usa LIGASE e não POLIMERASE).
- No sistema SOLiD (Life Technologies), a
biblioteca de DNA é produzida utilizando beads e
PCR em emulsão. (Não há formação de nova
fita).
- Após uma série de ciclos de ligação, o produto
de extensão é retirado e um primer n-1 é
adicionado para a nova rodada.
- Após 5 rodadas, os resultados são lidos e a
sequência montada.
- Processo resumido: A ligase liga fragmentos de
DNA em outros fragmentos de DNA, que
recebem o nome de sondas e se hibridizam com
o DNA sequenciado.
❖ Sequenciamento por Semicondutor de Íons:
- Método baseado na detecção de íons hidrogênio
liberados durante a polimerização do DNA Life
Tech Ion Torrent /Ion Proton Systems (Thermo
Fisher).
- Utiliza chips semicondutores abaixo da placa de
sequenciamento (sensível à mudança de pH).
(Quando nucleotídeos são incorporados, há a
dissociação de íons de H+, deixando o meio
mais ácido, aí os chip entram em ação pra
identificar isso, e vão colocando 1 nucleotídeo
por vez pra ver se a acidez é diminuída).
- Considerada plataforma mais rápida para
sequenciamento de genomas.
- Íons hidrogênio são liberados quando um
nucleotídeo é incorporado. Um chip
semicondutor quantifica.
● Sequenciamento: 3ª geração
❖ Single Molecule Sequencing (SMS):
- Sequenciamento de moléculas únicas
(sequencia 1 fita), sem necessidade de
amplificação de DNA.
- Criação de técnicas que leiam fitas mais longas
de DNA.
❖ Sequenciamento em Tempo Real de Molécula
Única
- Utiliza uma polimerase imobilizada (polimerase
está presa, então o DNA vai passando por ela e
1 nucleotídeo é lido por vez) no fundo de um
poço.
- Nucleotídeos com fluoróforos são incorporados
ao DNA e o sinal é detectado.
- PacBio (Pacific Biosciences).
❖ Sequenciamento Nanoporo
- Baseado na análise de sinal elétrico gerado pela
passagem de um fragmento de DNA por um poro
transmembrana.
- Nucleotídeos diferentes = mudança na carga.
- Oxford Nanopore technologies.
- Processo resumido: Tem duas proteínas, a que
abre o DNA, e a fita simples passa pelo poro,
que está a proteína de poro, e essa passagem
causa alterações na membrana, o computador
vai captar esses sinais e dizer a sequencia de
nucleotídeos.
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OBS:
- Só consegue analisar genoma usando a 2°
geração pra frente.
- As plataformas mais importantes são: Illuma,
Sangar e Ion Torrent.
- SARS-COVID19 = vírus de RNA (tem que fazer
transcriptase reversa para virar DNA e ser
transcrita).
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Por: Dávylla Pinheiro.