2 PROCESSOS PATOLOGICOS

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DEFINIÇÃO
Características dos exames histopatológicos: coleta, fixação, desidratação, clarificação, inclusão, uso do micrótomo e principais técnicas de coloração de amostras histopatológicas. Padrões de atividade celular. Lesões celulares irreversíveis (necrose).
PROPÓSITO
Compreender os exames histopatológicos é importante para entender os fundamentos do teste e garantir o preparo do material de forma que conserve as estruturas teciduais da região a ser analisada e fornecer um diagnóstico preciso. Conhecer os padrões de atividade celular e os tipos de necrose é essencial para entender as alterações celulares nas principais lesões dos processos patológicos.
OBJETIVOS
MÓDULO 1
Demonstrar a preparação do tecido para amostras histopatológicas
MÓDULO 2
Descrever os padrões de atividade celular
MÓDULO 3
Exemplificar os tipos de necrose
INTRODUÇÃO
Histologia, que deriva do grego hystos (tecido) e logia (ciência), é a ciência que estuda formação, estrutura, funcionamento e organização dos tecidos de diferentes órgãos animais e vegetais. Assim como a Citologia, a Histologia surgiu após o desenvolvimento dos primeiros microscópios ópticos e do descobrimento das células pelo cientista Robert Hooke, durante o século XVII.
A partir da análise microscópica de preparados de tecidos foi possível estudar a arquitetura tecidual normal e verificar as alterações encontradas em processos patológicos. Além disso, as técnicas histológicas permitem estabelecer o diagnóstico de malignidade e benignidade de uma lesão, definir os tipos de câncer, o estadiamento, complementar o exame citopatológico no diagnóstico do câncer do colo do útero e é o padrão-ouro (técnica de referência) para detectar rejeições, toxicidade e disfunções nos transplantes.
Fonte: pressfotoe/Freepik
Você sabia que essa técnica pode ser feita a partir de tecidos de organismos vivos ou mortos, com diferentes etapas como coleta, fixação dos tecidos, processamento, inclusão, microtomia e diferentes tipos de coloração? Você imagina como é realizado o corte do tecido para análise microscópica? Como devemos preparar o tecido para não alterar a estrutura tecidual? Será que a coloração dos preparados histopatológicos tem o mesmo fundamento do que os usados nas preparações citopatológicas? Após a coloração, como observamos as células metabolicamente ativas e as células com alterações teciduais irreversíveis, como acontece na necrose?
Fonte: luchschenF/Shutterstock
Vamos juntos nessa jornada conhecer sobre os fundamentos dos testes histopatológicos e verificar algumas alterações celulares nos processos patológicos gerais.
MÓDULO 1
Demonstrar a preparação do tecido para amostras histopatológicas
Fonte: pressfoto/freepik
COLETA E FIXAÇÃO DO MATERIAL
COLETA DO MATERIAL
Os exames histopatológicos têm como objetivo principal a análise microscópica de um determinado tecido para verificar possíveis alterações e anormalidade, observando toda a arquitetura tecidual.
Qual é a diferença entre exame citopatológico e histopatológico?
Exames citopatológicos analisam as alterações morfológicas apenas das células.
De forma diferente, no exame histopatológico é possível averiguar a extensão ou a invasão tecidual no caso de uma lesão maligna.
Esse exame é um teste de extrema tecnicidade, invasivo, traumático e faz-se necessária anestesia local ou geral para a coleta das amostras. Além disso, ele demanda uma série de etapas importantes, com a exigência de tempo e mão de obra para a preparação dos tecidos para a análise no microscópio e interpretação dos resultados. Após a coleta do material, é necessária uma série de etapas para a preparação do tecido. São elas: fixação, processamento histológico (dividido em desidratação, impregnação e clarificação), inclusão (formação dos blocos), cortes em pequenas secções e a preparação para a coloração. Ao longo desse módulo, vamos conhecer cada uma dessas etapas, vamos juntos?
Fonte: ShutterstockFigura 1. Ilustração da biopsia de um tecido. Na foto um pedaço do tecido é removido (biopsia incisional)
A coleta é feita por um médico, com a coleta de amostras de organismos vivos por meio de biópsias ou cirurgia (Figura 1). As biópsias podem ser realizadas por diferentes técnicas dependendo da localização anatômica, morfológica, tamanho e profundidade da lesão. Dentre as técnicas, destacam-se a biopsia incisional (remove um pedaço do tecido lesado), excisional (remove todo o tecido lesado), curetagem, “tesoura” ou punção. Além disso, podem ser coletadas também amostras de indivíduos post mortem pela necrópsia.
Para a coleta são utilizados materiais cirúrgicos como pinças, lâminas, bisturi e etc. Devido à fragilidade dos tecidos, todo o processo deve ser feito com extremo cuidado, usando os instrumentos corretos para cada tipo de órgão, evitando a danificação do tecido e algumas alterações estruturais que poderiam simular uma lesão. Um exemplo clássico é a agressão do tecido conjuntivo fibroso quando a coleta é feita com auxílio de uma pinça com “dentes”. Esse instrumento é inadequado para coleta nesse tipo de tecido, pois provoca uma lesão patológica semelhante à da necrose fibroide.
COLETA
É importante ressaltar que toda coleta de material biológico deve ser feita com os equipamentos de proteção individual (luvas, máscara, jalecos e óculos de proteção). O descarte desses materiais deve ser realizado como resíduo infectante e deve seguir as normas de descarte de resíduo da instituição.
COLETA
É importante ressaltar que toda coleta de material biológico deve ser feita com os equipamentos de proteção individual (luvas, máscara, jalecos e óculos de proteção). O descarte desses materiais deve ser realizado como resíduo infectante e deve seguir as normas de descarte de resíduo da instituição.
ATENÇÃO
Todo o material coletado deverá conter a identificação correta do paciente, data da coleta e da assinatura do médico responsável. O material deve ser seguido do pedido, que deve contemplar a descrição da biópsia, suspeita diagnóstica, assinatura e carimbo do médico. Nas coletas que visem um diagnóstico, é necessária a análise dos aspectos macroscópicos como cor, tamanho e aparência do material coletado. Esses dados auxiliam na análise histopatológica e na conclusão diagnóstica.
FIXAÇÃO DO MATERIAL
Após a remoção do organismo, a amostra coletada deve ser imediatamente colocada em líquido fixador para manter a arquitetura e constituição química dos tecidos. Essa etapa é conhecida como a fixação, uma das etapas mais importantes das técnicas histológicas (Figura 2).
Fonte: BRASIL, 2012bFigura 2: Foto ilustrativa da diferença nas características macroscópicas no tecido antes e depois da etapa da fixação.
A fixação consiste na utilização de procedimentos químicos ou físicos para bloquear o sistema enzimático capaz de destruir o tecido (autólise). Ela tem como objetivo:
· Interromper o metabolismo celular.
· Estabilizar as estruturas e os componentes bioquímicos intra e extracelulares.
· Preservar e conservar os elementos teciduais.
· Garantir que as amostras coletadas estejam muito próximas da realidade encontrada no paciente.
· Impedir a contaminação por outros organismos, como fungos e bactérias.
· Facilitar a entrada de substâncias que serão utilizadas nas próximas etapas dos exames histológicos.
· Aumentar a rigidez do tecido.
AUTÓLISE
Destruição do tecido vivo ou morto pelas enzimas do próprio organismo; autodigestão do tecido. Após a retirada do organismo de uma amostra tecidual ou a morte do organismo, os tecidos deixam de ser oxigenados, o que gera um acúmulo de dióxido de carbono (CO2). O acúmulo de CO2 gera uma instabilidade da membrana lisossômica com o extravasamento das enzimas proteolíticas que passam a agir sobre a matéria orgânica, digerindo, assim, as células que compõem os tecidos.
Na literatura, existe uma série de fixadores e protocolos de fixação que podem ser utilizados, não existindo um fixador ideal.
Mas como devemos escolher o melhor fixador?
Existem fixadores que são melhores para verificar determinadas estruturas celulares.
Enquantooutros são excelentes para preservar a estrutura antigênica (importante na análise imuno-histoquímica).
Entretanto, mesmo com as especificidades de cada um, os fixadores podem trazer inúmeras desvantagens como a variação na qualidade de colorações histoquímicas e imuno-histoquímicas, perda molecular, inchaço ou retração dos tecidos, interferência na análise bioquímica, entre outros fatores. O fixador ideal seria uma única solução que poderia ser utilizada para todas as análises, que tivesse um baixo potencial de modificação dos tecidos, preservasse as estruturas bioquímicas e apresentasse um alto e rápido poder de penetração. Mas como essa não é a realidade dos laboratórios histopatológicos, é essencial saber o tipo de análise e material que será coletado para escolher o melhor fixador.
Os mecanismos com os quais os fixadores agem são diferentes e não muito bem elucidados, mas, basicamente, eles atuam por mecanismos físicos (calor, temperatura, agitação molecular e ondas eletromagnéticas), químicos (a partir de substâncias químicas isoladas ou em forma de mistura) ou pela associação dos dois processos. Vamos conhecê-los?
FIXAÇÃO FÍSICA
A fixação física mais utilizada é o congelamento do tecido. Essa técnica é muito empregada para o diagnóstico rápido durante uma cirurgia. O congelamento torna o tecido rígido e pronto para ser seccionado (clivado em unidades menores) em aparelhos próprios (micrótomos para tecidos congelados, chamados de criostato ou criomicrótomo), pulando as etapas do processamento histológico e inclusão realizadas após a fixação química (vamos estudar mais a frente essas etapas).
A fixação do tecido por congelamento é importante também para o estudo histoquímico de enzimas e outras proteínas, pois o congelamento não inativa as proteínas em suas conformações naturais e local de origem. Além disso, os cortes por congelamento são ideais para o estudo de lipídeos, pois o tecido encontra-se pronto para a clivagem, pulando a etapa de clarificação, na qual os tecidos são imersos em solventes como xilol. É importante ressaltar que, nessa etapa, faz-se necessário o tratamento da amostra com uma substância crioprotetora, como o etilenoglicol, pois liga-se à água intracelular e evita a cristalização intra e extracelular.
FIXAÇÃO QUÍMICA
A fixação química é o processo mais utilizado. Ela consiste na utilização de substâncias químicas (sozinha ou uma mistura de substâncias) que realizam ligações químicas com sítios das biomoléculas. Antigamente, a fixação química era dividida em duas categorias, os fixadores não coagulantes e os fixadores coagulantes.
Os fixadores não coagulantes são categorizados dessa forma porque possuem a capacidade de ligar-se às proteínas do tecido precipitando-as, formando um gel transparente e evitando, assim, a sua desnaturação. Os fixadores formam uma amarração sobre as macromoléculas tissulares ao ligar-se às proteínas (ocorrendo ligações cruzadas entre os componentes estruturais). Os fixadores capazes de manter estas ligações são denominados de aditivos. As substância mais utilizadas como fixadores não coagulantes são o formaldeído (conhecido como fixador universal), teróxido de ósmio, acroleína e o glutaraldeído.
Os fixadores coagulantes têm a capazes de desnaturar as proteínas em graus variáveis, alterando a estrutura da proteína conforme a estrutura molecular do agente fixador. Como esses agentes não se ligam a proteínas, eles são chamados de não aditivos. São exemplos desse tipo de fixador o etanol, o cloreto de mercúrio e o ácido pícrino.
XILOL
Solvente intermediário entre o álcool e o meio de selagem, capaz de dissolver os lipídeos.
SAIBA MAIS
O mecanismo de ação dos fixadores químicos não é bem elucidado, mas sabe-se que formaldeído e glutaraldeído são fixadores não coagulantes, pois reagem com os grupos aminas (NH2) das proteínas. No caso do glutaraldeído, sua ação fixadora é reforçada por ser um aldeído com duas carbonilas (dialdeido), o que possibilita uma ligação cruzada entre as proteínas da célula e da matriz extracelular, tornando-as insolúveis e formando um gel.
EXEMPLO
Para a fixação de materiais que serão analisados na microscopia eletrônica, em que são necessárias uma fixação que melhor define as estruturas celulares e a matriz, pode ser utilizada uma solução de glutaraldeído tamponado seguida por uma segunda fixação em tetróxido de ósmio. O tetróxido de ósmio atua na proteção das lipoproteínas naturais dos tecidos, evitando sua ruptura e coagulação.
Existe uma variabilidade de moléculas que podem atuar como fixadores. Atualmente, elas são classificadas segundo Leong (1996).
	Classificação segundo Leong
	Tipo de fixador
	Fixadores aldeídos
	Formaldeído, glutaraldeído e paraformaldeído comercial.
	Agentes oxidantes
	Teróxido de ósmio, dicromato de potássio, permanganato de potássio e ácido crômico.
	Agentes desnaturantes ou coagulantes de proteínas
	Metanol, etanol, aceton e ácido acético.
	Mecanismo desconhecido
	Cloreto de mercúrio, ácido pícrico e sais de zinco.
	Combinação de reagentes
	Retróxido de ósmio e glutaraldeído; tetróxido de ósmio e iodeto de zinco; glutaraldeído e carbodiamida; formaldeído e glutaraldeído.
	Fixação a seco
	Carbowax 6000 (20% de polivinil, álcool ou 20% de polietileno glicol) ou fixação no vapor.
	Micro-ondas
	Fixação pelas ondas eletromagnéticas com ou sem a utilização de agentes fixadores.
Quadro 1: Classificação dos fixadores segundo Leong.
Os fixadores químicos mais empregados na rotina dos laboratórios de histopatologia são os fixadores aldeídos, com destaque para o formaldeído (solução de formaldeído a 10%, chamada de formalina), pelo baixo custo e de rápido preparo. A exposição do formaldeído à luz oxida essa molécula e origina o ácido fórmico. Esse ácido pode se precipitar nos tecidos sob forma de pigmento marrom (artefato de coloração). Para evitar isso, deve-se usar soluções tamponadas dos fixadores ou utilizar carbonato de cálcio (giz) para neutralizar o pH da solução, mas o carbonato de cálcio só deve ser utilizado em último caso, pois poderá deixar áreas de pseudocalcificação tecidual. O paraformaldeído é isento de metanol e é a opção de fixador para os tecidos que serão analisados na microscopia eletrônica.
ATENÇÃO
O preparo de soluções fixadoras deve ser feito em capela de exaustão. A manipulação do formaldeído ou de soluções contendo essa substância deve ser feita com auxílio de luvas, máscara com filtro próprio para vapores orgânicos, em local arejado e com exaustão. Além disso, por serem muito voláteis e sensíveis à luz, as soluções contendo formaldeído devem ser guardadas ao abrigo da luz em vidro âmbar firmemente fechado. A inalação deste composto pode causar irritação nos olhos, nas mucosas e no trato respiratório superior. Em altas concentrações, pode causar bronquite, pneumonia ou laringite. Este composto é classificado como carcinogênico e teratogênico. O formaldeído é tóxico quando ingerido, inalado ou em contato com a pele.
As características dos principais fixadores aldeídos estão descritos no Quadro 2.
	Fixadores
	Características
	Formalina 10%
	Solução hipotônica (células intumescidas).
Fixa bem proteínas.
Tem baixo custo.
Pode levar à deposição de pigmento fórmico.
	Formol- salino
	Solução isotônica.
Indicado para algumas reações histoquímicas.
Pode levar à deposição de pigmento formalínico.
	Formalina tamponada de Carson ou Formalina em tampão Millong
	Indicado para a microscopia eletrônica e óptica.
Não interfere na maioria das colorações.
Fixa muito bem a maioria dos tecidos.
Preserva a imunorreatividade de hormônios gastrintestinais (quando preparado com formaldeído).
Tecidos muito vascularizados têm a microtomia prejudicada.
	Formalina – alcoólica
	Utilizada para observação de minerais (cobre, magnésio, cálcio e ferro).
Indicada para tecido nervoso, visualizar parasitas, glicogênio, amiloide e mucopolissacarídeo.
	Formalina neutra tamponada 10%
	Solução hipotônica (células intumescidas).
Indicada para células pancreáticas, bactérias, alguns tipos de carboidratos, célulasdo tecido conjuntivo, fungos, minerais, tecido nervoso, pigmentos e glândulas.
	AFA ou FAA (álcool - formalina – ácido acético)
	Fixador de rápida penetração.
Preserva relativamente bem a morfologia, ácidos nucleicos e carboidratos.
Lipídeos não são preservados.
Muito utilizado para fixar helmintos.
Quadro 02: Principais fixadores aldeídos utilizados nas técnicas histológicas e suas características.
Será que existem fatores que afetam a fixação, ou apenas o tempo decorrido entre a coleta e a fixação? Diversos fatores afetam a fixação, esses fatores podem ser observados no quadro a seguir (Quadro 3).
	Fatores que afetam a fixação
	Temperatura
	Espessura do tecido
	Grau de penetração do fixador
	Relação volume do fixador e tamanho do espécime
	Estocagem apropriada
	pH do fixador
	Osmolaridade da solução fixadora. A osmolaridade é o número de partículas de um soluto contidas em um determinado volume de solvente, quanto maior a osmolaridade maior a pressão osmótica sobre o solvente. Soluções fixadoras com alta osmolaridade desidrata o tecido.
	Adição de sais na mistura
	Concentração dos fixadores
	Tipo de tecido analisado
Quadro 3: Fatores que afetam a fixação.
A fixação de órgãos metabolicamente ativos deve ser realizada antes do que de outros, pois eles são os primeiros a sofrer autólise. Quanto mais delgado o fragmento, mais rápida será a penetração do fixador. O ideal é que a clivagem ocorra antes da fixação, mas nem sempre isso é possível e, dependendo do tipo de fixador, pode ocorrer até três horas depois do início da fixação. Para os fragmentos que forem encapsulados antes da fixação, a capa deve ser retirada.
SAIBA MAIS
A clivagem do material visa à diminuição da espessura do tecido. O ideal é formar tecidos com espessura entre 3 e 5mm. No momento do corte, os fragmentos devem ser orientados e colocados em cassetes, o que facilita a orientação na hora da leitura dos fragmentos no microscópio. No caso de peças sólidas, o corte deve ser feito no maior diâmetro e suas faces devem ser paralelas e planas. Nas peças ocas, deve ser seccionado de forma perpendicular às superfícies e o tecido muscular deve acompanhar as fibras.
CONHEÇA OUTRAS ESPECIFICIDADES DA FIXAÇÃO
O tempo de fixação depende do tamanho do tecido. Fragmentos mais espessos (aproximadamente 4mm) devem ser fixados por mais tempo, de 6 a 24 horas. Após a fixação, caso seja necessário armazenar por mais tempo o tecido, eles devem ser transferidos para o álcool 70%. Ademais, o tempo também da depende da temperatura de cada agente fixador. Uma temperatura muito elevada gera uma penetração mais rápida. Em alguns tecidos, em que é necessária uma penetração mais lenta, os fixadores são utilizados refrigerados (temperatura entre 0 e 6°C). É importante ressaltar que o tempo de fixação insuficiente pode gerar artefatos com retração nuclear e perda de detalhes. A fixação por aldeídos durante um longo período pode levar à inativação enzimática e, por agentes oxidativos, à clivagem oxidativa de proteínas.
O volume de fixador deve ser de 10 a 20 vezes o volume do material coletado e o recipiente para ser estocado deve ser largo, pois facilita o acesso aos fragmentos. Além disso, os fragmentos costumam aumentar de volume após a fixação.
Assista ao vídeo e conheça duas técnicas de descalcificação, assim como a importância dos cuidados a serem tomados.
DESIDRATAÇÃO, CLARIFICAÇÃO, INCLUSÃO E USO DO MICRÓTOMO
Fonte: Caputo, Gitirana, Manso (2010)Figura 3: Esquema mostrando as etapas de desidratação, clarificação e impregnação.
Com o material devidamente fixado como ele pode ser transformado em pequenas fatias que possibilitem sua observação no microscópio?
A preparação do tecido histológico para observação microscópica corresponde a várias etapas. A primeira, chamada de processamento histológico, é dividida nas etapas de desidratação, clarificação e impregnação. Elas visam a preparação das peças para inclusão na parafina (ou similares), ou seja, para a formação de blocos que serão cortados em lâminas finas (Figura 3). Essa preparação pode ser feita de forma manual ou automatizada. Vamos agora conhecer um pouco mais sobre elas.
PROCESSAMENTO HISTOLÓGICO
DESIDRATAÇÃO
Após a fixação, o material biológico ainda contém 85% de água. A água é imiscível nas substâncias utilizadas para a inclusão, ou seja, formação dos blocos para posterior corte no micrótomo. Dessa forma, uma grande quantidade de água não permitiria a penetração dessa substância no tecido, sendo necessário a desidratação. A desidratação permite a retirada de água dos tecidos e do fixador de forma gradual. Para isso, os cortes são colocados em concentrações crescentes de etanol (70%, 80%, 95% e álcool absoluto). Durante essa etapa, a peça recupera sua cor natural e diminui de tamanho, mas a estrutura tecidual ainda é preservada. É importante que o volume de solução desidratante seja vinte vezes o volume do material coletado e que a desidratação seja feita em um recipiente largo, com agitação e renovação do álcool.
CLARIFICAÇÃO
Etapa também conhecida como diafanização. Essa etapa consiste na substituição do líquido desidratante nos tecidos por uma solução que tenha afinidade pela substância utilizada nas próximas etapas, pois as substâncias usadas para a formação do bloco (como a parafina), além de imiscíveis em água também são insolúveis em álcool. Para isso, o xilol é o solvente mais empregado, mas também pode ser utilizado toluol, benzeno, óleo de cedro e os solventes universais: acetato butílico, dióxido dietileno e benzoato metílico. À medida que temos a substituição do desidratante pelo xilol, a peça vai ficando mais clara.
IMPREGNAÇÃO
Consiste na infiltração dos espaços internos do tecido com a mesma substância que será utilizada para a formação do bloco. A substância utilizada deve ter afinidade pelo solvente usado na clarificação; ser capaz de solidificar de maneira controlada; ser fluida para penetrar nos espaços internos do tecido e depois endurecer para formar o bloco; e oferecer a rigidez necessária para realização dos cortes. As substâncias mais usadas nessa etapa são a parafina e a resina, mas também pode ser usado ágar, gelatina, parafina plástica, goma arábica, polietilenoglicol, parafina esterificada e celoidina (altamente inflamável). A impregnação com a parafina deve ser realizada em estufa a 60°C, pois, nessa temperatura, a parafina é liquida. Os fragmentos serão transportados de uma parafina a outra em intervalos de tempo predeterminados.
ETANOL
Podem ser utilizadas outras substâncias como álcoois butílico, isopropílico e metílico, a acetona, o éter, o clorofórmio e o óxido propileno.
XILOL
Cuidado, o xilol é altamente tóxico e cancerígeno deve ser manipulado com os equipamentos de proteção individual e dentro de uma capela de exaustão.
60°C
A temperatura da parafina pode afetar depois as próximas etapas. Uma temperatura alta leva a um aumento da rigidez do tecido e dificuldade na secção e uma temperatura mais baixa impede a impregnação da peça.
PREPARAÇÃO DOS BLOCOS E CORTES HISTOLÓGICOS
INCLUSÃO
Fonte: LOPES & MALHÃO, 2016; BRASIL, 2012bFigura 4: Inclusão das amostras nos blocos de parafina. (A) orientação dos seguimentos no molde. (B) Fragmento orientado no molde embebido em parafina líquida. (C e D) Fotos de blocos de parafina contendo fragmentos de pele, a epiderme (setas) orienta a inclusão de forma paralela.
Essa etapa consiste em formar um bloco rígido e maleável que permita a secção do tecido sem a sua destruição. Para isso, após o processamento histológico, as amostras devem ser imediatamente incluídas em uma substância líquida (a mesma utilizada na fase de impregnação) e ser solidificadas. As amostras que foram impregnadas com parafina devem ser colocadas em um molde (normalmente metálico), com auxílio de uma pinça aquecida, com parafina líquida. O tecido deve ser colocado na parte central do molde com a parte a ser seccionada para baixo. Para evitar a formação de bolhas, as amostras devem ser colocadas durante o aquecimento do líquido. Após oresfriamento, os blocos são obtidos (Figura 4). A orientação é essencial para a demonstração correta da morfologia do tecido a ser analisado e para evitar a destruição tecidual no momento do corte. Órgãos tubulares devem ser incluídos no plano transversal, enquanto fragmentos de tecidos longos devem ser dispostos longitudinalmente. Depois da inclusão, se as etapas de processamento não forem realizadas de forma correta, os blocos ficam opacos e esbranquiçados. Se houver demora entre a impregnação e a inclusão, os blocos ficam quebradiços e retraídos, pela variação de temperatura.
IMPORTANTE: Caso os blocos fiquem opacos ou quebradiços é possível retroceder, refazendo as etapas de forma inversa e iniciando o processamento novamente.
MICROTOMIA
Figura 5: Microtomia das amostras. (A) Foto de um micrótomo para corte tecidos, mostrando suas partes. (B) Esquema ilustrando as fitas formadas durante o corte dos blocos. (C) Esquema ilustrando as fitas sendo colocadas no banho maria com auxílio de uma pinça. (D) As fitas sendo pescadas “capturadas” no banho maria com auxílio de uma lâmina.
Com as amostras incluídas em blocos, esses são acondicionados em banhos de gelo, para ficar bem rígidos. Em seguida, eles são seccionados em um aparelho específico, chamado de micrótomo, para originar fatias finas, delgadas, uniformes, sequenciais e com espessura entre 4 a 6 µm que possibilitam a passagem de luz e visualização das estruturas no microscópio.
Os blocos prontos são colocados no aparelho e os cortes devem ser realizados de acordo micrótomo utilizado. À medida que o bloco é cortado, vão sendo produzidas fitas que devem ser colocadas delicadamente, com auxílio de uma pinça, em um banho-maria (temperatura de 40°C), para que elas se distendam na água e não formem bordas. Com os cortes prontos, as fitas são pescadas com lâminas limpas e desengorduradas e colocadas na estufa a 60 °C (Figura 5 B, C e D).
MICRÓTOMO
O micrótomo é composto de corpo, porta bloco, porta objeto e navalha (Figura 5 A). Há vários tipos de micrótomo, como o criostato, o micrótomo de congelação, o ultramicrótomo, o do tipo serra, rotatório e o vibratório e diferentes tipos de navalhas. O micrótomo mais utilizado em rotina de laboratório são os rotatórios (Tipo Minot). Fonte: JUNQUEIRA & CARNEIRO, 2015
SAIBA MAIS
Após a preparação das lâminas, podem-se utilizar adesivos, sendo os mais utilizados a albumina de Mayer, a gelatina e celoidina para evitar que o material seja perdido na próxima etapa (como a coloração). Problemas durante essa etapa podem ocorrer em decorrência de processamento errado ou de problemas na navalha. Uma navalha não muito bem afiada pode gerar cortes pregueados. Cortes fragmentados podem ser resultado da inclusão com a parafina muito quente, não remoção do líquido clarificante e do álcool e muita exposição ao clarificante.
PRINCIPAIS TÉCNICAS DE COLORAÇÃO
Após a preparação das lâminas, elas são coradas para análise no microscópio óptico. A coloração é realizada em uma série de etapas que visam preparar o tecido aderido às lâminas para receber os corantes.
Existem vários métodos de coloração que possibilitam a visualização de determinada estrutura ou componente tecidual. A partir de colorações específicas, pode-se observar a presença de íons (que ao realizarem uma reação química com o corante, precipitam-se e formam pigmentos insolúveis ou escuros) e o DNA pelo corante de Feulgen, que gera uma cor vermelha.
Fonte: Kostafly/Shutterstock
A coloração mais utilizada em laboratórios de histologia e histopatologia é a coloração pela hematoxilina-eosina (HE). Nessa coloração, assim como acontece na citopatologia, a hematoxilina, de caráter básico, cora o núcleo (rica em ácidos nucléicos) em roxo-azulado. Essa substância isoladamente não apresenta a capacidade de corar os tecidos, fazendo-se necessário a utilização de um mordente. A eosina, de caráter ácido, cora os citoplasmas e as fibras de colágeno em alaranjado.
MORDENTE
Elemento, metal ou íons de metal, que se liga covalentemente ao corante e facilita a ligação do corante ao tecido, normalmente o ferro ou alumínio.
SAIBA MAIS
A hematoxilina um corante natural (extraído de uma planta Haemotoxylon campechianum), que também pode ser sintetizado. Na verdade, esse corante não é capaz de corar os tecidos isoladamente, o que cora é sua forma oxidada, a hemateína, que tem pouca afinidade pelos tecidos, sendo necessária a utilização de um mordente. “Existem diferentes tipos de hematoxilina, mas a mais usada são as de hemalúnem, cujo mordente é o alumínio (exemplos: hematoxilina de Mayer, Harris e Gill). Elas podem ser utilizadas de forma regressiva (primeiro faz a hipercoloração para depois retirar o excesso de corante) ou progressiva (coloração feita progressivamente, sem necessidade de tirar o excesso de corante)¹
HEMATOXILINA
Existem diferentes tipos de hematoxilina, mas as mais usadas são as de hemalúnem, cujo mordente é o alumínio (exemplos: hematoxilina de Mayer, Harris e Gill). Elas podem ser utilizadas de forma regressiva (primeiro faz a hipercoloração para depois retirar o excesso de corante) ou progressiva (coloração feita progressivamente, sem necessidade de tirar o excesso de corante).
No quadro 4, estão descritos alguns exemplos dessas colorações e quando utilizar cada uma.
	Tipos de corante
	Estrutura evidenciada
	Tipos de corante
	Estrutura evidenciada
	Tipos de corante
	Estrutura evidenciada
	HE, Feulgen, Papanicolau, Shorr, Giemsa, azul de toluidina, metil green-pironina
	Núcleo e citoplasma as células
	PAS (Periodic Acid Shiff)
	Glicoproteínas neutras
	Tricomática de Masson, tricomática de Gomori, Goldner, picrossirius red, reticulina de Gomori
	Tecido conjuntivo
	Fontana-Masson
	Melanócitos
	PAS - alcian blue em pH 1,0 ou pH2,5
	Proteoglicanos
	Giemsa, reticulina de Gomori
	Tecido linfoide e mieloide
	Violeta cresil, azul de toluidina, Golgi (Prata)
	Células do sistema nervoso
	PAS, Reticulina
	Glicoproteínas não coagulantes
	Sudan black
	Tecido adiposo
	PAS, PAS alcian blue pH 1,0 ou 2,5
	Secreções celulares
	Tricomática de Masson, tricom de Gomori, picrossirius red
	Elementos fibrosos à base de colágenos
	Colorações tricromáticas, azul de toluidina
	Tecido muscular
	AB-safranina, Geimsa, azul de toluidina, sirius red em pH 10,2
	Mastócitos e eosinófilos
	Fibras do sistema elástico
	Resorcina fucsina de Weirgert
	Colorações tricromáticas, PAS - alcian blue em pH 1,0 ou pH 2,5
	Tecido cartilaginoso
	HE
	Inclusões virais, Helmintos
	Grocott e PAS
	Fungos de forma geral
	Warthin-Starry, Giemsa
	Treponema pallidun, Leptospira, Helicobacter pylori
Quadro 4: Tipos de coloração especiais dos testes Histopatológicos.
Independentemente da técnica escolhida, antes de iniciar a coloração, faz-se necessário uma série de etapas que visam retirar a parafina da lâmina (ou a substância utilizada para a inclusão), uma vez que a maioria dos corantes são soluções aquosas.
As lâminas são imersas em xilol seguida de uma hidratação, com banhos em concentrações decrescentes em álcool, ou seja 100%, 95%, 80%, 70%.
No fim, usa-se água destilada, deixando o material preparado para receber o corante em soluções aquosas.
Em seguida, as amostras devem ser coradas, desidratadas (com concentrações crescentes de álcool) e clarificadas com xilol e, em seguida, as lâminas devem ser preparadas para a leitura no microscópio (montagem ou selagem da lâmina).
ÁGUA DESTILADA
Se o corante estiver diluído em solução alcóolica, a hidratação deve ser interrompida no banho com álcool 70%.
SELAGEM
A selagem é a preparação da lâmina para a leitura, com a colocação de uma lamínula de vidro e uma substância para fixar a lamínula à lâmina, normalmente são usadas resinas, como bálsamo do Canadá ou Enttelan. No momento da selagem, deve-se evitar a entrada de ar, o que causaria bolhas.
Eventualmente, as técnicas histoquímicas tradicionais não conseguem verificar a localização de uma determinada proteína ou enzima. Nestes casos, podem ser aplicados métodos histoquímicos para detecção de enzimas ou proteínas,hibridização in situ ou imunohistoquimica, que vamos conhecer melhor a seguir.
No método histoquímico para detecção de enzimas ou proteínas (histoenzimáticos), a detecção pode ser feita de forma indireta, utilizando o substrato dessa enzima em investigação. Para isso, o material coletado é posto em contato com o substrato da enzima. Se ela estiver presente, pode haver uma interação substrato-enzima, o que gera um produto. Em seguida, é colocada uma substância marcadora que reage com o produto da reação enzimática. Esse produto precipita e se deposita no local da reação, possibilitando a visualização microscópica. Ao examinar um desses cortes ao microscópio, é possível observar as células (ou organelas) cobertas com um material colorido ou elétron-denso.
Fonte: Adaptado de LOPES, 2016Figura 6: Método Histoquímico para detecção de enzimas ou proteínas (histoenziáticos).
Exemplos de enzimas que podem ser detectadas por esse método:
	FOSFATASE
	PEROXIDASE
	DESIDROGENASES
FOSFATASE
localiza lisossomos e organelas citoplasmáticas.
PEROXIDASE
a atividade dessa enzima no sangue é característica da leucemia.
DESIDROGENASES
localiza mitocôndrias.
A imuno-histoquímica é técnica que combina Imunologia, Histologia e Química, permitindo o reconhecimento com alta especificidade de determinadas proteínas que, durante as técnicas histológicas normais, não são detectadas. Essa técnica é muito empregada no diagnóstico de doenças inflamatórias, infecciosas e neoplasias, além de ser utilizada para determinar fatores preditivos e prognósticos no câncer.
SAIBA MAIS
Essa técnica utiliza anticorpos para a identificação de um determinado antígeno. A coleta e os passos seguintes do material a ser estudado obedecem aos mesmos etapas do material colhido para diagnóstico de rotina hematoxilina & eosina (HE), mas, após a confecção das lâminas, essas devem ser secas em ar ambiente.
O reconhecimento de antígeno e de anticorpo tem alta afinidade, mas não gera cor. Assim, para a detecção do complexo antígeno e anticorpo, os anticorpos devem estar complexados com marcadores (substâncias que emitem luz), normalmente substâncias cromógenas, a fluoróforos, radioisótopos ou ouro coloidal. Existem dois tipos de métodos de reconhecimento, o direto e o indireto.
SUBSTÂNCIAS CROMÓGENAS
Substâncias que não apresentam cor, mas, depois de uma reação química (oxidação), produzem uma cor. Elas são formadas pela associação de um anel aromático com cromóforos (substâncias capazes de absorver energia ou luz visível e emitir uma luz em determinado comprimento de onda).
FLUORÓFOROS
São moléculas capazes de absorver um fóton em determinado comprimento de onda, excitar um elétron para um estado de energia mais alto e retornar ao estado original. Quando retorna ao estado de energia original, a molécula emite a energia absorvida com um fóton fluorescente.
RADIOISÓTOPOS
Radioisótopos ou isótopos radioativos. Isótopos são elementos que apresentam o mesmo número de prótons, mas com números de massa e nêutrons diferentes. Os átomos de isótopos radioativos são muito instáveis, seus núcleos liberam radiação e partículas eletromagnéticas de alta energia para a forma mais estável do átomo, em um fenômeno conhecido como decaimento radioativo. A capacidade de emissão de radiação dos isótopos radioativos é amplamente explorada na área médica.
Fonte: LOPES, 2016Figura 7: Métodos imuno-histoquímicos. Em (A) método direto, em (B) método indireto pela utilização do complexo biotina-estreptavidina-peroxidase.
No método direto, os anticorpos (chamados de anticorpos primários) estão marcados, e apenas o reconhecimento com o antígeno investigado gera uma cor. Esse método apresenta como principais desvantagens a baixa sensibilidade e a pouca amplificação de sinal (Figura 7 A).
No método indireto, utiliza-se um anticorpo primário (que se liga ao antígeno em investigação) e um anticorpo secundário, que reconhece o anticorpo primário. O anticorpo secundário está ligado a um fluoróforo e, a partir do reconhecimento antígeno + anticorpo primário + anticorpo secundário, é gerada uma cor. O método indireto mais usual na rotina laboratorial usa o anticorpo secundário complexado à biotina (uma vitamina). Ao meio reacional, é adicionada a estreptavidina ligada a uma peroxidase. A estreptavidina tem afinidade com a biotina que está ligada ao anticorpo secundário. Se houver ligação antígeno + anticorpo primário + anticorpo secundário-biotina, a estreptavidina-peroxidase irá ligar-se à biotina. Em seguida, é adicionado ao meio reacional a 3,3-diaminobenzina (DAB), que reage com a peroxidase, reduzindo o DAB que se precipita no local de reação e gera uma cor castanha (Figura 7B).
As técnicas de hibridização possibilitam a identificação de sequencias específicas das moléculas de DNA e RNA. As técnicas de hibridização são altamente específicas e habitualmente utilizadas em pesquisa, diagnóstico clínico (diagnóstico do HPV) e medicina forense.
Fonte: adaptado de NEVES, S.,M.,N.; GUEDES, R. Hibridização in situ fluorescente: Princípios básicos e perspectivas para o diagnóstico de doenças infecciosas em medicina veterinária. Arquivo Instituto de Biologia. v.79, n.4. p: 627-632, 2012. EMPRAPA, 2009.]Figura 08: Esquema ilustrando a hibridização in situ.
Uma técnica bastante difundida é a hibridização in situ, que consiste na técnica de hibridização aplicada diretamente nos cortes de tecido e células, esfregaços ou cromossomos de células mitótica. Essa técnica permite verificar a localização de um cromossoma, se a célula tem a presença de determinada molécula de DNA ou se determinado gene está sendo transcrito.
As lâminas que contêm os cortes de tecido, células ou cromossomos são inicialmente aquecidas para separar as cadeias duplas de seu DNA.
Em seguida, uma solução contendo a sonda (um segmento de cadeia simples de DNA ou a um segmento de RNA que sejam complementares à sequência que desejamos analisar marcado) é colocado sobre a amostra em um tempo suficiente para realizar a hibridização.
Depois de lavar a lâmina, a localização da sonda ligada à sua sequência complementar é revelada pelo marcador utilizado identificado por imunocitoquímica, pois, normalmente, a sonda é marcada por um isótopo radioativo (que pode ser localizado por radioautografia) ou um nucleotídio modificado (digoxigenina) (Figura 08).
RADIOAUTOGRAFIA
A radioautografia é a técnica que permite a localização de substâncias radioativas nos tecidos. Essa técnica baseia-se no efeito da radiação sobre uma emulsão fotográfica. Após a lavagem da lâmina, ela é posta em contato com a película fotográfica e, depois de um tempo, a película é revelada. Os pontos negros correspondem aos locais em que houve a hibridização, ou seja, a sonda ligada à sequência que está sendo investigada.
VERIFICANDO O APRENDIZADO
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1. A COLETA DE MATERIAL, ESSENCIAL PARA NORTEAR O TIPO DE AGENTE FIXADOR UTILIZADO, É UMA DAS ETAPAS MAIS IMPORTANTES NOS EXAMES HISTOPATOLÓGICOS. SOBRE A ETAPA DE FIXAÇÃO ASSINALE A ALTERNATIVA INCORRETA.
Fixadores não coagulantes são aquelas substâncias que se ligam a proteínas do tecido, por ligações cruzadas e formam um gel. Um exemplo desse fixador é a solução de formaldeído.
Fixadores coagulantes são aquelas substâncias que desnaturam as proteínas, alterando a sua estrutura, como o etanol.
A fixação do material pode ser realizada após 24 horas da coleta sem nenhum dano à arquitetura do tecido.
A fixação consiste na utilização de procedimentos químicos ou físicos para bloquear o sistema enzimático capaz de destruir o tecido (autólise) e, assim, manter a constituição tecidual mais próxima do que encontrado no paciente.
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2. SOBRE A PREPARAÇÃO DOS TECIDOS PARA OS EXAMES HISTOPATOLÓGICOS, CONHECEMOS AS ETAPAS DO PROCESSAMENTO HISTOLÓGICO, INCLUSÃO, DA SECÇÃO DOS TECIDOS E OS INÚMEROS TIPOS DE COLORAÇÃO QUE PODEM SER UTILIZADOS PAR ANALISAR AS ESTRUTURAS E CONSTITUINTES CELULARES. SOBRE ESSAS ETAPAS, MARQUE A ALTERNATIVA CORRETA.
A desidrataçãoconsiste apenas na retirada de excesso de fixador. Os fixadores atrapalham diretamente na preparação das estruturas para a coloração de HE. Os corantes de hematoxilina e eosina são soluções alcoólicas que, na maioria das vezes, são imiscíveis com os fixadores.
Após a inclusão do tecido em blocos, eles serão seccionados em um aparelho específico, chamado de micrótomo, para originar fatias finas, delgadas, uniformes, sequenciais e com espessura entre 4 a 6µm, que possibilitam a passagem de luz e visualização das estruturas no microscópio.
A clarificação consiste na etapa de lavagem das lâminas com água destilada. Essa etapa é importante para retirada do excesso de sangue de alguns tecidos.
A inclusão consiste em formar um bloco maleável e rígido com o tecido após todo o processamento histológico para ser seccionado no micrótomo. Para isso, podemos usar uma substância diferente da utilizada na etapa de impregnação.
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GABARITO
1. A coleta de material, essencial para nortear o tipo de agente fixador utilizado, é uma das etapas mais importantes nos exames histopatológicos. Sobre a etapa de fixação assinale a alternativa INCORRETA.
A alternativa "C " está correta.
A fixação é uma das etapas mais importantes da preparação dos tecidos para análise histopatológica. Essa etapa deve ser realizada imediatamente após a coleta para bloquear o sistema enzimático que induziria a autólise do tecido e alteraria a constituição tecidual.
2. Sobre a preparação dos tecidos para os exames histopatológicos, conhecemos as etapas do processamento histológico, inclusão, da secção dos tecidos e os inúmeros tipos de coloração que podem ser utilizados par analisar as estruturas e constituintes celulares. Sobre essas etapas, marque a alternativa correta.
A alternativa "B " está correta.
O processamento histológico consiste na etapa de desidratação, clarificação e impregnação. A desidratação é a retirada de água e do excesso de fixador no tecido. Após a fixação, o tecido ainda apresenta uma grande concentração de água. A água é imiscível com as substâncias usadas na impregnação e inclusão, sendo necessário retirar o seu excesso para permitir que essas substâncias presentes penetrem. A clarificação consiste em trocar o álcool usado na desidratação por xilol, uma substância mais solúvel à parafina (material mais utilizado na inclusão). A impregnação, como o nome diz, consiste em impregnar as estruturas celulares com o mesmo líquido que será utilizado na inclusão. Após a impregnação, o tecido estará pronto para ser emblocado.
MÓDULO 2
Descrever os padrões de atividade celular
ATIVIDADE GERAL DAS CÉLULAS
Durante a análise e a leitura da morfologia celular, problemas no processamento das amostras (confecção, fixação e coloração), o estado hormonal e a função e atividade celular mudam as características nucleares e citoplasmáticas das células. A análise das modificações estruturais (citoplasma e núcleo) que ocorrem nas células são essenciais para entendimento e diagnóstico dos processos patológicos.
A atividade geral das células pode ser classificada em quatro categorias: euplasia, retroplasia, proplasia e neoplasia maligna. Vamos conhecer cada uma dessas categorias.
Fonte: GiovanniCancemi/Freepik
EUPLASIA
O estado normal ou saudável de determinado tipo celular ou tecido é chamado de euplasia. Nessas células, as características citoplasmáticas e nucleares são bem estabelecidas. O citoplasma remete ao grau de diferenciação celular. Geralmente, o citoplasma é abundante e está disperso de forma uniforme, com o núcleo em uma posição central. Nas colorações utilizadas, tanto nas técnicas histopatológicas como nas citopatológicas de rotina, não é possível verificar as organelas citoplasmáticas, sendo necessário usar algumas colorações especiais. À medida que a célula sofre maturação, é possível observar a diferenciação funcional das células, ou seja, presença de cílios, produção de muco e de queratina. Além disso, a basófila diminui, pois a síntese de proteínas e a concentração de RNA no citoplasma regridem.
COLORAÇÕES UTILIZADAS
Corantes básicos:
São corantes catiônicos (carga elétrica positiva) e apresentam afinidade por constituintes celulares ácidos (carga elétrica negativa), como RNA e DNA. As estruturas coradas por esse tipo de corante são chamadas de basófilas. Exemplo de corante: hematoxilina.
Corante ácidos:
São corantes aniônicos (carga elétrica negativa) e apresentam afinidade por constituintes celulares básicos (carga elétrica positiva), como citoplasma e matriz extracelular. As estruturas coradas por esse tipo de corante são chamadas de acidófilas. Exemplo de corante: eosina.
Na análise morfológica do núcleo de células euplásicas, só é possível observar a intensidade da coloração nuclear e as características da membrana nuclear.
MEMBRANA NUCLEAR
Na microscopia óptica não é possível visualizar a membrana nuclear, o que é observado é a membrana cromatínica. A membrana cromatínica consiste nos depósitos de cromatina aderidas ao folheto interno da membrana nuclear. Assim a quantidade de cromatina determina a sua espessura.
Fonte: BRASIL, 2012aFigura 9: Fotos de células euplásicas de esfregaços cervicovaginais (coloração de Papanicolau, aumento 400x).
Nas células euplásicas, a membrana cromatínica é espessa e uniforme. A cromatina apresenta grânulos arredondados regularmente distribuída. O nucléolo, quando presente, cora-se em rosa (eosinofílico) e, normamalmente, aparece em apenas um núcleo. A multinucleação (presença de mais de um núcleo) ocorre apenas sob situações e condições especificas. Quando há mais de um núcleo, esses são similares entre si. Mulheres na menopausa podem apresentar histiócitos multinucelados no epitélio atrófico sem causa aparente.
CROMATINA
A cromatina é um conjunto de fios, cada um deles formado por uma longa molécula de DNA associado a proteínas (histonas) e ao RNA. Essa forma fica presente na célula quando não há divisão celular. Quando a célula entra em processo de divisão celular, no lugar da cromatina aparecem corpúsculos condensados facilmente observáveis no microscópio, chamados de cromossomos. Antes das células se dividirem, o cromossomo se duplica, aparecendo dois filamentos compactos (cromátides) ligados por uma região chamada centrômero.
NUCLÉOLO
A presença de nucléolos indica a atividade de síntese proteica na célula. O número de nucléolos por núcleo varia de acordo com o tipo de célula, mas geralmente permanece constante para um mesmo tipo de célula.
RETROPLASIA
A retroplasia representa um estado de diminuição de atividade de uma célula ou tecido que geralmente está relacionado ao próprio envelhecimento fisiológico ou resultados de uma agressão, como traumas, substâncias tóxicas, diminuição ou interrupção da irrigação sanguínea, agentes patogênicos e agentes físicos (calor ou irradiação). A morfologia das células retroplásicas depende do tipo, intensidade ou duração de um estímulo.
Fonte: BRASIL, 2012aFigura 10: Fotos de células retroplásicas com algumas modificações citoplasmáticas e nucleares.
Na figura (Figura 10), podemos ver algumas características nucleares e citoplasmáticas das células retroplásicas.
No citoplasma dessas células, são observadas diferentes alterações, como a desnaturação de proteínas, acúmulo de lipídeos, o que torna o citoplasma granular, turvo, espumoso ou vacuolizado, e o acúmulo de água, que torna o citoplasma opaco (condição observada quando há problemas no transporte de água pela membrana plasmática). O citoplasma degenerado pode aparecer condensado difusamente ou focalmente em forma de um anel periférico com uma coloração diferente na área mais interna (perinuclear). Além disso, a membrana plasmática pode-se romper e ter o extravasamento do conteúdo citoplasmático.
O núcleo apresenta cromatina granular com os limites borrados (mal definidos), cariopicnose, edema nuclear, cariorrexe, cariólise, núcleos desnudos e vacuolização nuclear.
Vamos agora entender um pouco mais sobre essas alterações:
Retração do núcleo. O núcleo torna-seescuro, não podendo distinguir os grânulos de cromatina. Na degeneração aguda, o contorno nuclear é borrado. Na regeneração crônica, o núcleo é bem limitado. Exemplo: Células escamosas superficiais da ectocérvie que, devido ao envelhecimento normal da célula, apresentam picnose nuclear (intensa coloração da cromatina tornando o núcleo intensamente escuro).
Acúmulo de água no núcleo (tumefação turva). O núcleo fica com o conteúdo diluído e com o aspecto de pouco corado (hipocromasia).
Corresponde à fragmentação e dispersão do núcleo no citoplasma. Em um primeiro momento, o núcleo se condensa e depois se fragmenta em massas redondas, de tamanhos variados, espalhados no citoplasma íntegro. Essa alteração é associada a uma degeneração rápida. Exemplo: Padrão nuclear de células após a radioterapia.
Alteração em que o núcleo quase desaparece. Nesse caso, ocorre digestão da cromatina, ficando quase imperceptível. Às vezes, ficando apenas uma sombra (núcleo fantasmas). Exemplo: Essa alteração pode ser resultado da tumefação turva (entrada de água no núcleo) ou na hiperqueratose (acúmulo de grânulos de queratina nas células escamosas superficiais).
Numerosos núcleos sem a membrana plasmática, que conservam a sua estrutura finamente granular da cromatina e a membrana nuclear bem definida e regular. Exemplo: Durante a confecção dos esfregaços, algumas células mais delicadas podem romper a membrana citoplasmática. Na atrofia pós-menopausa, esse padrão também é comum.
Quando presentes, os vacúolos são pequenos e redondos e estão agrupados ou isolados. A presença de vacúolos no núcleo é observada em uma regeneração rápida como acontece na radioterapia.
PROPLASIA
A proplasia representa um estado de aumento da atividade de uma célula ou tecido. Esse aumento da atividade biológica é devido a uma resposta a estímulos externos, reparação, aumento da atividade secretória e preparação da célula para a divisão celular.
Fonte: Brasil, 2012aFigura 11: Fotos de células com aumento da atividade celular (proplasia) com algumas modificações nucleares.
As células com aumento da atividade biológica apresentam um aumento do tamanho do núcleo (cariomegalia), núcleos com formato arredondado e vesicular, multinucleação (com núcleos similares entre si), presença de nucléolos redondos característicos na protoplasia (indicativo de síntese proteica aumentada), membrana cromatínica com espessura uniforme, podendo ser ondulada e hipercromasia (maior coloração, tornando esse mais escuro) da cromatina difundida uniformemente sobre uma região mais clara (menor afinidade com o corante). A cromatina pode aparecer de forma proeminente, com os limites bem marcados, aumento do tamanho dos grânulos, diferentemente da euplasia, em que a cromatina apresenta um aspecto borrado.
NEOPLASIA
Antes de vermos propriamente em neoplasia maligna, vamos entender o que é neoplasia e diferenciar seus tipos.
Neoplasia significa um novo crescimento. Ela é definida como uma massa anormal de tecido com o crescimento celular descontrolado capaz de persistir mesmo após a interrupção dos estímulos.
SAIBA MAIS
Nos dias atuais, o termo tumor também significa neoplasia. Antigamente o termo “tumor” foi utilizado para indicar o processo de tumefação que ocorria durante a inflamação e um traumatismo, mas, atualmente, esse termo tem sido utilizado apenas como sinônimo da neoplasia.
O processo neoplásico é resultante de alterações nos processos celulares de proliferação (aumento de células por divisão mitótica) e diferenciação (quando as células se tornam cada vez mais especializadas, formando células adultas, que tem um conjunto de características estruturais, funcionais e tempo de vida específico), importantes para a renovação e reparação celular.
Fonte: Grossman; Porth (2019)Figura 12: Ilustração mostrando o ciclo celular. O ciclo celular apresenta 4 fases (G1, S, G2 e M).
Em uma célula normal, o ciclo celular corresponde a uma sequência de eventos ordenados que permitem a duplicação de uma célula (Figura 12). O ciclo celular é altamente controlado por um grupo de proteínas chamadas de ciclinas, em pontos específicos do ciclo, que visam a identificação de defeitos e reparos, garantindo que cada célula-filha receba um conjunto completo de informação genética, idêntico ao da célula-mãe (Figura 12). Quando não for possível o reparo do dano, as ciclinas destravam uma série de sinalizações celulares com ativação de várias enzimas que levam a célula à apoptose (morte celular programada).
CICLO CELULAR
A fase G1 representa a fase pós-mitótica, quando ocorre o crescimento celular, com alta síntese proteica, duplicação das organelas e preparação da célula para duplicação do DNA. A fase S é a fase de duplicação do DNA. A fase G2 é a fase pré-mitótica com crescimento celular, aumento da síntese proteica e preparação para a mitose. Fase M é a fase de mitose, em que, a partir de uma célula, irão surgir duas idênticas. Além dessas quatro fases, a célula (quando for altamente especializada, como neurônios, ou não apresentar todos os fatores para a sua renovação) entra na fase G0, um estado de repouso ou “latência”. Em qualquer momento, caso haja nutrientes necessários e estímulos (fatores de crescimento), a célula pode sair do estado de repouso G0 e entrar novamente no ciclo celular. Quando a célula for altamente especializada, como os neurônios, o retorno ao ciclo celular não acontece, não havendo renovação celular no caso de morte. Normalmente, quanto mais diferenciada a célula, menor será a capacidade proliferativa. Na figura 12, estão demostrados também os pontos de controle do ciclo.
Como você acha que acontecem as neoplasias?
Ao contrário de processos adaptativos celulares normais, como a hiperplasia (aumento do número de células) e hipertrofia (aumento do tamanho da célula ou tecido), as neoplasias não obedecem às leis de crescimento celular, não apresentando mais o controle sobre o ciclo celular.
As neoplasias são classificadas como benignas e malignas. Porém, independentemente do tipo, todos os processos neoplásicos apresentam dois componentes básicos:
Células neoplásicas, que constituem o parênquima (componentes funcionais de um órgão)
Estroma (suporte), composto por vasos sanguíneos e tecido conjuntivo.
Fonte: Kumar, Abbas, Aster (2016)Figura 13: Ilustração mostrando a diferença entre uma neoplasia benigna e maligna no miométrio.
O que diferencia os tipos de neoplasia são as características celulares, taxa de crescimento, modo de crescimento, capacidade de invadir e formar metástases em outros órgãos e potencial para causar a morte. No Quadro 5 e na Figura 13, podemos ver as principais diferenças entre a neoplasia benigna e maligna.
	Característica
	Neoplasia benigna
	Neoplasia maligna
	Características celulares
	Células bem diferenciadas que são parecidas com o tecido de origem.
	Células indiferenciadas, com anaplasia (ausência de proliferação), com pouca semelhança com o tecido de origem. Apresentam a capacidade de liberar fatores de crescimento, hormônios e citocinas.
	Taxa de crescimento
	Lento e progressivo. Pode parar ou regredir. Figuras mitóticas normais e raras.
	Variável (inversamente proporcional ao grau de diferenciação). Figuras mitóticas numerosas a anormais
	Modo de crescimento
	Crescimento por expansão, sem invadir os tecidos vizinhos. Normalmente é encapsulado por tecido conjuntivo (cápsula fibrosa), o que facilita a sua remoção cirúrgica.
	Crescimento por invasão. Há invasão dos tecidos subsequentes por prolongamentos.
	Metástase
	Ausente.
	Presente. Mais provável com grandes tumores primários e indiferenciados.
	Invasão tecidual
	Normalmente uma massa coesa, expansiva e bem delimitada, que não invade ou se infiltra nos tecidos subsequentes.
	Localmente invasivo, infiltrando tecido circundante; às vezes, pode ser enganosamente coeso e expansivo.
	Desenvolvimento
	Motivos não conhecidos, mas, por algum motivo, perdem a capacidade de interromper a proliferação celular, mas não de diferenciação.
	Motivos não conhecidos, mas, por algum motivo, perdema capacidade de interromper a proliferação celular e a diferenciação.
	Ameaça à vida
	Normalmente não são uma ameaça à vida.
	Alta.
Quadro 5: Diferenças nas neoplasias malignas e benignas.
SAIBA MAIS
Papilomas: projeções digitiformes, benignas e de tamanho microscópico ou macroscópico, que crescem em qualquer superfície.
Pólipo: crescimento de tecido que se projeta a partir de uma superfície mucosa, como a do intestino, normalmente indica uma neoplasia benigna, mas os pólipos podem dar origem a neoplasias malignas. Pólipos adenomatosos são considerados precursores de adenocarcinomas do cólon” Fonte: (GROSSMAN, PORTH, 2019).
Agora, vamos juntos nos aprofundar em cada tipo de neoplasia?
BENIGNAS
Neoplasias benignas recebem o nome por adição do sufixo oma + nome do tecido do parênquima que deu origem ao crescimento. Exemplo: Osteoma: neoplasia benigna do tecido ósseo. Adenoma: neoplasia benigna do tecido epitelial glandular.
As neoplasias benignas apresentam células bem diferenciadas muito parecidas com as células do tecido de origem, ficando difícil a sua distinção. Apresentam o crescimento por expansão, sem invadir os tecidos vizinhos. Normalmente, são encapsulados por tecido conjuntivo (cápsula fibrosa), o que facilita a sua remoção cirúrgica. Esse tipo de neoplasia dificilmente ameaça a vida, apenas em alguns casos onde há alteração de funções vitais ou então compreensão de órgãos vitais. Durante a análise histopatológica dos tecidos, as neoplasias benignas podem se diferenciar das células do tecido normal pelo crescimento de células neoplásicas, como uma massa distinta (Figura 14).
Fonte: Kumar, Abbas, Aster, 2016Figura 14: Tumor benigno do miométrio (leiomioma). Esse tumor bem diferenciado apresenta fibras musculares esqueléticas entrelaçadas (setas) bem semelhantes a aparência das células musculares lisas normais.
MALIGNAS
Seguem a classificação parecida com a neoplasia benigna, mas com algumas expressões adicionais.
Carcinoma: neoplasia maligna do tecido epitelial em qualquer uma das três camadas germinativas, exemplo: adenocarcinoma: neoplasia maligna do tecido epitelial glandular.
Sarcoma: neoplasia maligna do tecido mesenquimal sólidos. Exemplo: osteossarcoma.
Linfoma: tumores de linfócitos ou seus precursores.
Na neoplasia maligna (chamadas também de câncer), as células apresentam uma rápida proliferação e são pouco diferenciadas. O termo anaplasia significa perda de diferenciação no tecido canceroso. As células altamente indiferenciadas perdem sua semelhança com as células normais, independentemente do seu tecido de origem. É importante ressaltar que o grau de anaplasia depende do tipo de câncer. Assim, nem toda neoplasia maligna será formada apenas por células indiferenciadas.
Fonte: Kumar, Abbas, Aster (2016); Crossman, Porth (2019)Figura 15: Fotos mostrando algumas alterações celulares nas neoplasias malignas.
As células de tumores malignos apresentam uma variedade de modificações celulares, com variação na forma e tamanho (pleomorfismo) celular. As células dentro do mesmo tumor não são uniformes, variando desde células pequenas com um aspecto indiferenciado até células tumorais gigantes, muitas vezes maiores do que as suas vizinhas. O núcleo apresenta um tamanho desproporcional para o tamanho da célula, com forma variável e irregular, cromatina grosseira e agregada, normalmente com maior coloração hipercromática (mais escura que o normal), os nucléolos são maiores do que os normais e o número de cromossomos é anormal (aneuploidia). Nas neoplasias com células indiferenciadas, há um aumento das mitoses, com o maior aparecimento de células em divisão celular, mas as mitoses são atípicas ou bizarras (com fusos mitóticos triplos, quadripolares ou multipolares) (Figura 15).
Fonte: Kumar, Abbas, Aster (2016)Figura 16: Esquema mostrando de metástase de células neoplásicas. Carcinoma in situ é uma lesão pré-invasiva localizada.
O crescimento das neoplasias malignas é acompanhado por infiltração progressiva, invasão e destruição do tecido adjacente, ficando pouco demarcado em relação ao tecido normal, sendo muito difícil a remoção cirúrgica dessas células. As células malignas são capazes de sintetizar fatores de crescimentos, moléculas de adesão, enzimas proteolíticas e hormônios que facilitam sua invasão nos tecidos adjacentes. A disseminação acontece por invasão direta e extensão, semeadura das células cancerígenas na cavidade (lançam as células nos espaços ocos do organismo, como cavidade peritoneal, pleural, pericárdica e espaços articulares) e metástases (através da disseminação de células sanguíneas no sistema sanguíneo e linfático) (Figura 16).
ENTENDA MAIS SOBRE AS NEOPLASIAS MALIGNAS
Em um primeiro momento, as células que constituem o carcinoma in situ adquirem a capacidade de aderir à matriz extracelular via moléculas de adesão. Após a adesão, há a liberação de enzimas proteolíticas e a subsequente degradação da membrana extracelular e invasão para outros tecidos. As células cancerosas conseguem atingir vasos sanguíneos e linfáticos, sendo disseminadas para outras partes do corpo.
O grau de diferenciação e o número de células em proliferação são importantes para a classificação histológica e citológica das neoplasias. A classificação é feita em uma escala de I a IV, onde I representa a neoplasias com células diferenciadas semelhantes aos tecidos normais, tanto na morfologia como na fisiologia, e IV, neoplasia, com células pouco diferenciadas.
Além dessa classificação, os tumores sólidos são classificados quanto ao tamanho e à extensão de sua disseminação para os linfonodos regionais e na presença ou ausência de metástase, pelo estadiamento.
O sistema de estadiamento mais utilizado é o preconizado pela União Internacional para o Controle do Câncer (UICC), denominado Sistema TNM de Classificação dos Tumores Malignos. Nessa classificação, o “T” indica tumor primário, que é categorizado de 0 a 4 de acordo com seu tamanho, T0 indica lesão in situ, T1 corresponde a tumor de até 2 cm na sua maior dimensão, T2 representa tumor de mais de 2 cm, não ultrapassando 5 cm de sua extensão.
Como é realizado o diagnostico laboratorial das neoplasias malignas?
Para o diagnóstico das neoplasias, diversas abordagens de amostragem existem, como a excisão, biópsia, aspiração por agulha fina e esfregaços citológicos. A partir dessas amostras, podem ser realizados estudos histoquímicos para avaliação das alterações da morfologia das células e tecidos e estudos imuno-histoquímicos, que ajudam na classificação dos tumores, pois o padrão de expressão de proteínas é bem diferente entre o tecido normal e o tecido neoplásico, ajudando o diagnóstico e a classificação dos tumores.
Assista ao vídeo para conhecer alguns casos clínicos de atividade normal e alterada.
VERIFICANDO O APRENDIZADO
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1. ESTUDAMOS SOBRE O PADRÃO DA ATIVIDADE CELULAR DAS CÉLULAS. VIMOS QUE A ATIVIDADE GERAL DAS CÉLULAS PODE SER CLASSIFICADA EM QUATRO CATEGORIAS (EUPLASIA, RETROPLASIA, PROPLASIA E NEOPLASIA MALIGNA). SOBRE ESSES PADRÕES DE ATIVIDADE CELULAR, MARQUE A ALTERNATIVA CORRETA.
Euplasia representa um aumento da atividade celular. Ocorre em resposta a estímulos externos, normalmente em situações de reparação. Nota-se aumento do tamanho do núcleo, presença de nucléolos característicos (arredondados), membrana nuclear com destaque.
Proplasia representa a atividade normal da célula. O citoplasma é abundante e está disperso de forma uniforme, com o núcleo em uma posição central. A membrana cromatínica é espessa e uniforme. A cromatina apresenta grânulos que são arredondados e estão regularmente distribuídos. O nucléolo, quando presente, cora-se em rosa (eosinofílico). Normalmente, estão presentes em apenas um núcleo.
A neoplasia maligna representa “um novo crescimento celular”. Nesse padrão, as células apresentam algumas alterações nucleares bem características, como cariopicnose, edema nuclear, cariorrexe e cariólise.
A retroplasia representa uma diminuição da atividade celular, com a presença de cromatinagranular com limites borrados, cariopicnose, edema nuclear, cariorrexe, cariólise, vacualização nucelar, núcleos desnudos, desnaturação de proteínas citoplasmáticas.
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2. A NEOPLASIA CONSISTE NA PROLIFERAÇÃO DESCONTROLADA E ANORMAL DAS CÉLULAS POR DIFERENTES FATORES. A NEOPLASIA BENIGNA TEM CRESCIMENTO LENTO, ORDENADO COM OS LIMITES DEFINIDOS. NA NEOPLASIA MALIGNA, AS CÉLULAS APRESENTAM UM CRESCIMENTO RÁPIDO DESORDENADO E COM GRANDE CAPACIDADE DE INVASÃO NOS TECIDOS ADJACENTES. SOBRE A NEOPLASIA MALIGNA, MARQUE A OPÇÃO INCORRETA.
Na neoplasia maligna, as células são pouco diferenciadas, independentemente da origem do câncer. Todas as neoplasias malignas são formadas por células indiferenciadas.
As células dentro de um mesmo tumor maligno são pleomórficas, variando desde células pequenas até células gigantes.
Nas neoplasias com alta taxa de crescimento celular, há um aumento das mitoses, com o maior aparecimento de células em divisão celular, mas as mitoses são atípicas ou bizarras.
Nas células de neoplasias malignas o núcleo apresenta um tamanho desproporcional para o tamanho da célula, com forma variável e irregular, cromatina grosseira e agregadas, normalmente com uma maior coloração hipercromática (mais escura que o normal) e nucléolos são maiores do que os normais.
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GABARITO
1. Estudamos sobre o padrão da atividade celular das células. Vimos que a atividade geral das células pode ser classificada em quatro categorias (euplasia, retroplasia, proplasia e neoplasia maligna). Sobre esses padrões de atividade celular, marque a alternativa correta.
A alternativa "D " está correta.
A proplasia representa um aumento da atividade celular, ocorre em resposta a estímulos externos e nota-se um aumento do tamanho do núcleo, presença de nucléolos característicos (arredondados), membrana nuclear com destaque. A euplasia representa a atividade normal da célula. O citoplasma é abundante e está disperso de forma uniforme e com o núcleo em uma posição central. A membrana cromatínica é espessa e uniforme. A cromatina apresenta grânulos arredondados e regularmente distribuídos. O nucléolo quando presente cora-se em rosa (eosinofílico). Normalmente, estão presentes apenas um núcleo. A neoplasia maligna representa um novo crescimento, com crescimento descontrolado do número de células. As células apresentam núcleos de vários formatos, aumentados em relação ao tamanho da célula e hipercromático, com nucléolos e em constante divisão celular e o aparecimento de mitoses atípicas. A cariopicnose, edema nuclear, cariorrexe, cariólise são características de uma célula com diminuição da atividade.
2. A neoplasia consiste na proliferação descontrolada e anormal das células por diferentes fatores. A neoplasia benigna tem crescimento lento, ordenado com os limites definidos. Na neoplasia maligna, as células apresentam um crescimento rápido desordenado e com grande capacidade de invasão nos tecidos adjacentes. Sobre a neoplasia maligna, marque a opção incorreta.
A alternativa "A " está correta.
Na neoplasia maligna, normalmente as células são pouco diferenciadas. No entanto, nem todo tumor maligno apresenta células indiferenciadas, há alguns tumores em que as células são diferenciadas, se assemelhando às células do tecido de origem. O grau de diferenciação e proliferação dos tumores malignos possibilita a sua classificação, sendo categorizado de grau I a IV, em que, no grau I, as células apresentam uma maior diferenciação, se assemelhando tanto na morfologia como na fisiologia às células do tecido de origem e, no grau IV, são as mais indiferenciadas.
MÓDULO 3
Exemplificar os tipos de necrose
TIPOS DE NECROSE
Nas células com padrão de atividade celular ou tecidual normal (euplasia), vários fatores são capazes de gerar uma alteração no metabolismo, proliferação, especialização das células e gerar uma variedade de alterações na morfologia e no padrão de atividade celular. Esses fatores alteram o equilíbrio fisiológico da célula (homeostase) e, como resposta, o organismo pode apresentar uma adaptação ou uma lesão celular reversível ou irreversível.
A adaptação consiste em uma resposta estrutural e funcional reversível a uma injuria ou condição fisiológica, como a gestação, que pode levar a um aumento do número de células (hipertrofia), diminuição do número de células (atrofia), aumento do tamanho da célula (hiperplasia), metaplasia e displasia. Quando o estímulo é eliminado, as células podem retornar ao seu estado normal.
METAPLASIA
Substituição de um tipo de tecido celular por outro. Está associado a processos de dado, reparo e regeneração tecidual. Exemplo: metaplasia escamosa que acontece no colo do útero.
DISPLASIA
Termo que indica um “crescimento desordenado”. Ela pode ser encontrada em epitélios. As células apresentam várias modificações estruturais, como pleomorfismo e núcleos hipercromáticos, com figuras mitóticas e com a estrutura tecidual desordenada, não ficando apenas restrito à camada basal. Nos epitélios, quando as alterações são marcantes em toda a estrutura (sem transpassar a membrana basal), é classificada como uma neoplasia pré-invasiva, chamada de carcinoma in situ. Quando rompe a membrana basal, ele passa a ser um tumor invasivo.
No entanto, quando as células sofrerem mutações prejudiciais ao seu funcionamento normal, não são supridas com os nutrientes essenciais, são expostas a agentes ou estímulos nocivos e têm os limites das respostas adaptativas excedidos, ocorre uma sequência de eventos que levam à lesão celular, que pode ser reversível ou irreversível. As lesões celulares irreversíveis levam à morte celular (Figuras 17 e 18).
Fonte: Kumar, Abbas, Aster (2016)Figura 17: Esquema dos tipos de respostas celulares ao estresse (privação de nutrientes e irrigação sanguínea) e estímulo lesivo.
Fonte: Kumar, Abbas, Aster (2016)Figura 18: Esquema da relação do miocárdio normal, hipertrófico (em resposta a uma adaptação celular) e com uma lesão irreversível (necrose).
As lesões celulares podem ocorrer por diferentes fatores, dentre eles, agentes biológicos, fatores nutricionais, radiação, agentes físicos (traumatismos, variação de temperatura, exposição ambiental e lesão por forças elétricas) e agentes químicos (exposição a substâncias químicas prejudiciais). O mecanismo pelo qual esses agentes causam danos é complexo, mas existem descritos pelo menos três mecanismos principais. São eles:
Que levam à oxidação de estruturas celulares, mitocôndrias e do DNA nuclear.
Gerando diminuição da síntese proteica, deposição de lipídeos, diminuição das reservas de glicogênio, aumento da permeabilidade da membrana celular e acúmulo de líquidos intracelulares (tumefação).
Que gera uma ativação enzimática inadequada danificando o citoesqueleto, membrana plasmática e organelas celulares, além de gerar a fragmentação da cromatina e provocar um aumento da depleção de ATP.
ATENÇÃO
Nos estágios iniciais ou nas lesões leves, as alterações morfológicas e funcionais das células são reversíveis se o estímulo for retirado. Nessa lesão, ocorre alterações no citoesqueleto e em algumas organelas, há alteração na membrana citoplasmática, alterando o influxo de íons (bomba de sódio e potássio) e água, o que gera tumefação celular (edema), degeneração gordurosa (acúmulo de lipídios em vacúolos) e uma redução da fosforilação oxidativa, com diminuição na concentração de ATP e energia (Figura 20). Quando os danos são persistentes, as lesões passam a ser irreversíveis, levando à morte celular, que pode ocorrer por dois mecanismos distintos: a apoptose ou necrose.
Você sabe as diferenças ente apoptose e necrose?
APOPTOSE
A apoptose representa a morte celular programada, um processo altamente regulado por várias vias genéticas que visa a eliminação de células danificadas.
É importante destacar que a apoptose não ocorre apenas nos casos de lesão celular, mas também em funções normais da célula como envelhecimento celular. Na apoptose, ocorre a dissolução do DNA,rápida remoção dos restos celulares pelos fagócitos, fragmentação da célula sem perda da integridade celular e extravasamento do conteúdo citoplasmático e não gera uma resposta inflamatória.
NECROSE
A necrose é o padrão de morte celular encontrada em diversos tipos de agressões, como trauma, infecções, exposição a substâncias tóxicas e isquemia.
É a morte celular desregulada ou acidental, com perda da integridade da membrana celular, ativação das enzimas lisossômicas com digestão da célula e extravasamento do conteúdo citoplasmático que ativam a resposta inflamatória.
Fonte: Kumar, Abbas, Aster (2016)Figura 19: Esquema demostrando as principais diferenças nas células que sofrem morte por necrose e apoptose.
As mortes celulares por necrose e apoptose apresentam várias diferenças que podem ser observadas no Quadro 06 e na Figura 19.
	Característica
	Necrose
	Apoptose
	Tamanho celular
	Aumentado (tumefação)
	Reduzido (retração)
	Núcleo
	Picnose → de cariorrexe → cariólise
	Fragmentação
	Membrana plasmática
	Rompida
	Intacta, mas com a estrutura alterada (orientação dos lipídeos de membrana)
	Conteúdo celular
	Ocorre digestão enzimática com extravasamento do conteúdo intracelular.
	Intacto. São liberados de forma controlada em corpos apoptóticos, que serão fagocitados pelos fagócitos.
	Inflamação
	Frequente
	Nenhuma
	Papel fisiológico ou patológico
	Sempre patológica, resultado da lesão celular irreversível.
	Eliminação de células danificadas ou envelhecidas. Pode ser patológica para alguns tipos de dano celular, como células com dano no DNA.
Quadro 6: Principais diferenças entre a necrose (morte celular “acidental”) e apoptose (morte celular programada).
E como são as são as alterações na morfologia do núcleo e citoplasma das células que sofreram necrose?
Fonte: Kumar, Abbas, Aster (2016)Figura 20: Alterações morfológicas nas lesões reversíveis (B) e na necrose (C). Foto de cortes histológicos de tubos renais, corado por HE. (A) O epitélio normal dos túbulos renais.
A célula que sofre necrose apresenta várias alterações na morfologia citoplasmática e nuclear. Nos tecidos corados por hematoxilina eosina, as células apresentam uma maior eosinofilia, atribuídas à perda de RNA citoplasmático (que se liga a hematoxilina) e à desnaturação de proteínas (que se coram com a eosina). O citoplasma torna-se vacuolado pela perda de organelas digeridas pelas enzimas lisossômicas e o DNA pode aparecer três alterações, a cariólise (que reflete a perda de DNA pela degradação enzimática via endonucleases), picnose (retração celular nuclear e aumento da basofilia) e cariorrexe (fragmentação do núcleo picnótico). Após dois dias, o núcleo pode desaparecer completamente (Figura 20). As células mortas por necrose podem ser substituídas por grandes massas de fosfolipídios, chamados de figuras de mielina (Figura 19).
SAIBA MAIS
As alterações celulares muitas vezes não são perceptíveis ao microscópio óptico durante horas depois da morte celular. Quando um número de células morre por necrose em um determinado tecido ou órgão, classificamos esse como tecido necrosado. Os tecidos necrosados sofrem diferentes padrões morfológicos e, de acordo com esses padrões, as necroses são classificadas em caseosa, coagulação, liquefação e fibrinóide. A análise histopatológica dos tecidos necrosados auxilia no diagnóstico das doenças.
Vamos conhecer cada um desse tipo de necrose e descobrir os diferentes padrões morfológicos que cada uma dessas necroses causa nos tecidos.
NECROSE DE COAGULAÇÃO
A necrose de coagulação é a forma de necrose ocasionada após a isquemia (diminuição total ou parcial da irrigação sanguínea) desencadeada por obstrução de um vaso, com o comprometimento das funções metabólicas celulares, pela hipóxia ou anoxia, falta de nutrientes e não eliminação de excretas. Esse tipo de necrose ocorre em todos os órgãos do tecido, menos no cérebro, onde ocorre a necrose liquefativa. A área do tecido com a necrose de coagulação recebe o nome de infarto. A obstrução dos vasos pode ocorrer através de um êmbolo, um trombo, uma doença da parede arterial ou uma pressão externa ao vaso.
Fonte: Kumar, Abbas, Aster (2016)
Fonte: Kumar, Abbas, Aster (2016)
Figura 21: Alterações macroscópicas e microscópicas característicos da necrose de coagulação.
Essa necrose é desencadeada em tecidos com uma diminuição na irrigação sanguínea, que não apresente outras rotas alternativas para suprir as necessidades das células, levando a uma acidose. A diminuição do pH provoca a desnaturação das enzimas e das proteínas estruturais da célula, originando a lesão hipóxica. Macroscopicamente, a área afetada fica esbranquiçada e cercada por uma auréola avermelhada, que consiste em uma região mais irrigada (hiperemia) como uma tentativa do organismo para compensar a falta de irrigação da área afetada (Figura 21).
A análise microscópica exibe a arquitetura do tecido morto intacta, mostrando uma aparência firme. Esse fato ocorre provavelmente pela desnaturação parcial das proteínas estruturais e das enzimas proteolíticas, evitando a lise das células mortas. Como resultado, aparecem citoplasma eosinófilico e núcleo com picnose pela degradação enzimática do DNA e condensação da cromatina, cariorrexe pela fragmentação nuclear ou cariólise pelo esmaecimento nuclear, devido à dissolução da cromatina pela ação das enzimas desoxirribonucleases e ribonucleases e pelo desaparecimento do núcleo. Depois de dias ou semanas, as células mortas são fagocitadas por leucócitos, que são os responsáveis pela remoção delas (via enzimas lisossômicas dos leucócitos), revelando também a presença de um infiltrado leucocitário na análise microscópica (Figura 21).
NECROSE CASEOSA
Fonte: Kumar, Abbas, Aster (2016)Figura 22: Alterações macroscópicas e microscópicas característicos da necrose Caseosa.
A necrose caseosa é um tipo de necrose de coagulação, em que as células mortas são mantidas por tempo indeterminado. Essa necrose é comum nos focos de infecção da tuberculose (infecção causada pela Mycobacterium tuberculosis), mas pode ser observada também na histoplasmose (infecção fúngica por Histoplasma capsulatum), na paracoccidioidomicose (infecção fúngica por Paracoccidioides brasiliensis) e na tularemia (infecção bacteriana por Francisella tularensis). Esses microrganismos causam processos inflamatórios crônicos no organismo denominados granulomas, que evoluem para a necrose do tecido (necrose caseosa). Os granulomas são um conjunto de macrófagos que tentam envolver o patógeno, evitando que esses agentes atinjam os tecidos subsequentes sadios e causem a sua disseminação. Os granulomas apresentam alterações em sua morfologia e são conhecidos como células gigantes e epitelióides.
A necrose caseosa macroscopicamente apresenta uma área amarelo-esbranquiçada com aspecto de queijo. Microscopicamente, a área necrosada é uma área homogênea ou finamente granular de cor rosa (eosinofílico) devido à variedade de restos celulares amorfos, normalmente delimitados pelo granuloma. Ao passar do tempo, a necrose geralmente calcifica ou são eliminadas para o exterior originando cavidades, conhecidos como cavernas (Figura 22).
NECROSE DE LIQUEFAÇÃO
Na necrose de liquefação, também denominada de liquefativa ou por coliquação ou coliquativa, ocorre a degradação total das células mortas pelas enzimas proteolíticas, tornando o tecido necrosado com uma consistência muito amolecida, semifluida ou líquida.
Fonte: Kumar, Abbas, Aster (2016)Figura 23: Alterações macroscópicas e microscópicas característicos da necrose liquefativa.
Essa necrose é característica de tecidos ricos em adipócitos, como o cérebro e suprarrenal, mas também pode ocorrer na mucosa gástrica. No tecido nervoso central após a hipóxia, de forma diferente ao infarto do miocárdio, não acontece a parada completa da irrigação, mas uma redução na circulação que é suficiente para matar o neurônio, mas sem impedir a chegada de fagócitos, monócitos do sangue e macrófagos presentes no tecido (provenientes da micróglia) que são os responsáveis