Baixe o app para aproveitar ainda mais
Prévia do material em texto
1 MIP00072 Carga Horária: 80 horas. Segundas e Terças-feiras, das 14 às 16 horas BACTERIOLOGIA III Walter Lilenbaum Bruno de Araújo Penna 06/04 Aula Prática 11/05 Prova Teórica I 23/06 Prova Teórica II 29/06 Prova Prática 2 09 de Março de 2015 – Walter Lilenbaum. TAXONOMIA BACTERIANA Taxonomia é a classificação e a identificação de bactérias pré-existentes ou novas, usando-se como critério, provas fenotípicas e genotípicas. A uniformização da nomenclatura tornou-se necessária a partir de necessidades comerciais impostas pelo mercantilismo no século XVIII. Carl Von Linné (Lineu) utilizou o latim para nomear cientificamente a história natural, pois latim é a língua dos sábios. BACTÉRIAS São seres unicelulares, procarióticos, de reprodução sexuada e que pode assumir formas esféricas, bastonetes ou espiralada. Em 1683, Lewwenhoek observou o que viriam a ser os protozoários, seres que se moviam microscopicamente e que, por possuir vida, foram denominados animáculos. No século XIX a microbiologia moderna se iniciou com Pasteur e Koch, que descobriram leveduras da fermentação do vinho e bactérias do campo, respectivamente. Ambos comprovaram que bactérias são agentes de doenças, e estas até então tinham suas explicações baseadas em religião ou cultura. ♦ Bactérias são seres que viveram sozinhas na Terra por mais de 2 bilhões de ano, e iniciaram a fotossíntese, podendo assim gerar oxigênio para ser consumido pelas posteriores formas de vida que se desenvolveram. ♦ Produzem maior quantidade de oxigênio e de nitrogênio fixado na atmosfera. O nitrogênio é fonte de aminoácidos ou de proteína, porém somente as bactérias de raízes de plantas são capazes de utilizar esse nitrogênio e transformá-lo em nitrato e nitrito para serem usados no ciclo orgânico por outros seres. ♦ Existem em qualquer ambiente, e até mesmo bactérias levadas por ação humano a superfície da Lua sobreviveram por cerca de 2 anos. ♦ Bactérias congeladas por 3 milhões de anos puderam ser reativadas. ♦ Adultos humanos possuem cerca de 1 trilhão de bactérias somente na superfície de sua pele. No sistema digestivo são cerca de 100 trilhões de micro- organismos. Ao todo, há no corpo humano 100 quatrilhões deles, contabilizando 10 vezes mais do que o número de células. ♦ Apenas 1% das bactérias conhecidas se desenvolve bem em culturas. 3 SISTEMÁTICA Inventaria e descreve a biodiversidade. A taxonomia dá nomes e encaixa o organismo em Reino, Filo, Classe, Ordem, Família, Gênero e Espécie. A Filogenia estuda as relações evolutivas entre os organismos, relacionando seus graus de proximidade, por exemplo. A classificação soma métodos fenotípicos e genotípicos. Archaea é um reino recém- separado do Reino Das Bactérias. Formado por organismos procariotas, geralmente quimiotróficos, muitos dos quais sobrevivem em lugares extremos (extremófilo) como fontes de água quente, lagos ou mares muito salinos, pântanos (onde produzem metano) e ambientes ricos em gás sulfídrico e com altas temperaturas. MÉTODOS FENOTÍPICOS DE CLASSIFICAÇÃO DAS BACTÉRIAS As provas fenotípicas são mais baratas, mais rápidas, possuem certa confiabilidade, mas não são 100% precisas. As classificações fenotípicas incluem a morfologia da bactéria, as propriedades tintoriais, culturais e bioquímicas, presença de certas enzimas extracelulares e a identificação sorológica. 1. Morfologia bacteriana: as bactérias possuem certas formas características, podendo ser COCOS (forma de esfera - Staphylococcus), BACILOS ou bastonetes (forma de bastonete – Bacillus, agente do Cólera), ESPIROQUETAS (formato de espiral – Leptospira) ou VIBRIÃO (formato de vírgula – gênero Vibrio). http://pt.wikipedia.org/wiki/Procariota http://pt.wikipedia.org/wiki/Quimiotr%C3%B3fico http://pt.wikipedia.org/wiki/Extrem%C3%B3filo http://pt.wikipedia.org/wiki/Fonte http://pt.wikipedia.org/wiki/%C3%81gua http://pt.wikipedia.org/wiki/P%C3%A2ntano http://pt.wikipedia.org/wiki/Metano http://pt.wikipedia.org/wiki/Sulfeto_de_hidrog%C3%AAnio http://pt.wikipedia.org/wiki/Temperatura 4 2. Propriedades tintoriais: as bactérias apresentam certas propriedades em sua parede celular que as fazem reagir diferentemente a vários corantes usados em bacteriologia. O método mais usado para a coloração de bactérias atualmente é o método de gram. Podem ser GRAM-POSITIVAS (possuem camada externa de peptideoglicanos – não é celulose, embora seja similar – que “encapsula” a bactéria e mantém o corante, corando-se de roxo), GRAM-NEGATIVAS (camada externa formada de lipopolissacarídeo, que descora com o álcool e ficam róseas por não”segurar” o corante. Há fina camada de peptideoglicanos), BACILOS ÁLCOOL ÁCIDO RESISTENTES – BAAR (micobactérias, como as agentes da tuberculose humana e bovina, que possuem parede celular espessa e resistente que não se descora pelo álcool acido. O exame que as detecta é a “pesquisa de BAAR”) e NÃO SE CORAM PELO GRAM (pois não possuem parede celular, como as micoplasmas). 3. Exigências nutricionais: é a exigência de uma bactéria em relação ao meio de cultura necessário para o seu crescimento in vitro, ou seja, o que ela precisa para viver. Podem ser classificadas em: AUTOTRÓFICAS: usam fontes inorgânicas para gerar moléculas orgânicas. São elas: fotoautotróficas (fazem fotossíntese e sua fonte nutricional é a luz), cianobactérias, sulfobactérias e quimioautotróficas (enxofre é fonte nutricional). HETEROTRÓFICAS: minoria importante para a clínica veterinária, utilizam moléculas orgânicas diretamente, precisando de nutrientes de outro ser vivo para se alimentar, estando ele morto (são bactérias saprofágicas) ou vivo (sendo parasitos). 4. Tipagem enzimática: estudo das enzimas do metabolismo e outras substâncias bioquímicas que a bactéria possui e utiliza. São testes bioquímicos que definem o tipo de metabolismo das bactérias. Por exemplo, se a bactéria utiliza lactose, tem lactase e, portanto, o gene que a produz. Podem ser estudadas: ENZIMAS RESPIRATÓRIAS: pesquisa de catalase, pesquisa de oxidase, metabolismo glicídico (usando carboidratos: glicose, manitol, manose) e hidrólise de hidratos de carbono até formar ácido e alterar o pH do meio e gerar gases. METABOLISMO PROTEICO: hidrólise de gelatina, produção de indol e uso de ureia (amônia liberada na urina é tóxica e fede, e ureia e bactérias da microbiota são liberadas também na urina. Essas bactérias usam a ureia, produzem amônia volátil e o uso de gelo em mictórios reduz o metabolismo bacteriano e inibe a produção de amônia). METABOLISMO LIPÍDICO: pesquisa de lípase e lecitinase. 5 5. Enzimas extracelulares e toxinas: é a pesquisa pela liberação de exotoxinas pelas bactérias e os fatores extracelulares dela (enzimas que os micro- organismos produzem e enviam para fora do organismo). Normalmente essas enzimas são um mecanismo de agressão bacteriano ao hospedeiro. COAGULASE: Staphylococcus produz e libera essa enzima que na presença de plasma desencadeia mecanismos de coagulação do soro. Gera acne, furúnculos, abscessos e no teste de coagulase o plasma é coletado. ENZIMAS HEMOLÍTICAS: Streptococcus produz e libera hemolisina, gerando lise de hemática. O teste/pesquisa dessas enzimas caracteriza as espécies desse gênero. 6. Identificação sorológica/Sorotipagem: uma prova usada em estágios mais avançados da identificação de uma bactéria, feita quando as bactérias são difíceis de identificar, visa distinguir biótipos e sorotipos. Biótipos são sub- populações de bactérias, mas que por algum motivo possuem uma característica bioquímica diferente; já sorotipos são sub-populações bacterianas que estimulam de modo diferente o sistema imune do hospedeiro (por possuírem antígenos de superfície modificados). A sorotipagem dá entendimento de qual é a doençados indivíduos, principalmente quando há sorotipos de aspecto epidemiológico, por exemplo. MICRO-ORGANISMOS INERTES A PROVAS BIOQUÍMICAS: bactérias com poucas enzimas, que não reagem nos outros testes. MICRO-ORGANISMOS DE CULTIVO DIFÍCIL: crescem mal nos meio de cultura. MICRO-ORGANISMOS ASSOCIADOS A SÍNDROMES ESPECÍFICAS: E. coli, virulenta, sepa associada a coliformes. FINS EPIDEMIOLÓGICOS: Leptospira interrogans. 7. Outros testes fenotípicos: menos usados, envolvem: BIOTIPAGEM: o que diferencia e caracteriza cada bactéria quando elas são muito parecidas. PADRÕES DE SUSCEPTIBILIDADE ÀS DROGAS: quando duas espécies são muito parecidas em parâmetros bioquímicos, esse método usa a novobiocina para determinar cada uma. FAGOTIPAGEM: o fago, ou bacteriófago (vírus que infecta bactérias), é usado para determinar a bactéria após contato e possível lise. ANÁLISE DE CONSTITUINTES DE PAREDE PELA CROMATOGRAFIA 6 MÉTODOS GENOTÍPICOS DE CLASSIFICAÇÃO DAS BACTÉRIAS As provas genotípicas são os métodos de biologia molecular aplicados a bacteriologia. Pode-se analisar uma bactéria quanto ao peso molecular de seu DNA e o seu ponto de congelamento, o índice C-D e a homologia do DNA da bactéria analisada. São métodos utilizados principalmente na pesquisa científica, pois são métodos custosos atualmente, mas conferem 100% de veracidade na resposta. Os métodos fenotípicos, por outro lado, são sujeitos a resultados falsos, pois o gene pode não se expressar mas ainda assim estar presente e esperando a oportunidade de se ativar. Logo, um resultado negativo não garante que o material genético está ausente e um resultado positivo pode estar errado pois há varias vias bioquímicas alternativas àquela que resulta determinado produto final. 1. Tamanho do DNA: avalia o peso molecular/tamanho do genoma (medido em kilodaltons ou números de pares de base) após extração para confirmar o gênero da bactéria. 2. Índice citosina-guanina (C+G): avalia as bases nitrogenadas que compõem o DNA, m percentuais. Há tabelas que classificam o gênero da bactéria de acordo com o índice C-G. Quebra-se o DNA, e se extrai suas bases citosina-guanina. Por exemplo, um DNA apresentando 63% de C-G (ou seja, esse DNA possui 37% de A-T). Essa porcentagem pode ser igual em diferentes espécies, mas isso não significa que o DNA seja igual, visto que a ordem desses pares de base pode ser diferente. 3. Hibridização ou Homologia de DNA: no caso do tamanho do DNA e do índica C+G forem iguais entre as espécies, avalia-se a localização das bases (o que codifica genes distintos de acordo com o arranjo). A hibridização de DNA avalia se elas irão se alinhar – o processo envolve aumento de temperatura, que abre a dupla fita de DNA. Então diminui-se a temperatura para analisar se há estabilidade nos híbridos de DNA formados (junção das duas fitas de DNA de duas espécies diferentes). Quanto mais estável a molécula for, maior é o grau de homologia entre as duas fitas (homólogas, e não idênticas, pois as fitas se pareiam). Avalia-se o percentual de pares de bases que acoplaram, e, se foram 100%, a espécie é a mesma. A homologia de DNA testa o quanto o DNA da bactéria estudada é homologa de outra bactéria. Pode ser feito usando-se o DNA total, ou somente um trecho do DNA. Separa-se a dupla fita de ambas as bactérias e após suas fitas parearem, observa-se o nível de homologenidade das bases das fitas. Já com somente um trecho do DNA, o esquema é o mesmo, sendo que ao invés de se usar o DNA inteiro da bactéria estudada, se usa uma sonda (um trecho de seu DNA marcado). Se essa sonda parear com uma fita de outra bactéria, então esse DNA é da espécie testada. Se não parear, ou não é a bactéria testada ou pode se tratar de uma nova bactéria. 4. Sondas moleculares – 50-100 pares de base (pb): região do genoma é variável e possui determinada composição somente em uma espécie, sendo específica a ela. A sonda é jogada no DNA extraído e vê-se homologia. 7 5. Sequenciamento de DNA: sequencia uma parte do DNA que é variável ao invés do genoma inteiro, e cria-se um banco de dados. Mostra as variações sutis de uma determinada espécie, como é feito no caso da Leptospira. 6. Ribotipagem RNAr 165: sequenciamento do RNAribossomal, que é estável e invariável. O 165 determina com certeza a espécie ou o gênero da bactéria. 7. Análise Plasmidial: envolve todos os processos listados acima, e utiliza no Plasmídeo. É pouco estudado, mas importante nos estudos de resistência bacteriana. A maioria das bactérias trocam plasmídeos e por isso a análise plasmidial não é uma categoria estável de taxonomia. X. Ponto de congelamento: avaliação do ponto de quebra da dupla fita (ponto em que ela abre). Dependendo da composição química desse DNA, ele possuirá uma diferente resistência ao frio. PCR – POLYMERASE CHAIN REACTION Amplifica determinado pedaço do DNA, que é selecionado a partir de seus prímers para dermacar o tamanho a ser aumentado e resultar em várias cópias. Aumenta a temperatura, abre a dupla fita, diminui a temperatura, adiciona a Polimera, prímers, exons e bases, as duplas fitas se multiplicam, aumenta-se o número de cópias de determinado pedaço de DNA e, refazendo o processo, resulta em milhares de moléculas formadas a partir de uma molécula de DNA. “Ocorrendo a fragmentação das moléculas de DNA, com o uso das enzimas de restrição, e o seu reconhecimento pela técnica de eletroforese em gel, o próximo passo é multiplicar (clonar) o fragmento obtido e submetê-los à tecnologia do DNA recombinante. A técnica de multiplicação da fita de DNA é chamada de PCR (reação em cadeia da polimerase). Essa técnica é usada em tubos de ensaio contendo o DNA e mais alguns compostos necessários, como prímers (DNAs iniciadores) e a enzima DNA polimerase (enzima que faz a replicação do DNA). Os prímers são fitas de DNA, com mais ou menos 20 bases (A, T, C, G) complementares, isto é se ligam por complementaridade ao início da sequência de DNA que se quer multiplicar. Quando uma molécula de DNA vai ser multiplicada deve-se separar a dupla fita, formando assim duas fitas diferentes mas complementares entre si. Cada fita servirá de molde para a duplicação, por isso, precisamos de dois tipos de prímers diferentes. 1. Obtém-se uma amostra mínima de DNA de uma célula. 2. A amostra de DNA, a enzima que faz a replicação (DNA polimerase), os nucleotídeos de DNA e os prímers complementares a sequência de DNA são colocados em um tubo de ensaio. 3. Coloca-se o tubo de ensaio em uma máquina de PCR (máquina que aumenta e diminui a temperatura de acordo com um programa). Os passos seguintes, de aquecimento e resfriamento, acontecem dentro da máquina controlados pelo programa. 4. Aquece-se o tubo a 94ºC para desnaturar (separar a dupla fita) o DNA. 5. Cada fita simples do DNA que foi desnaturado serve de molde para a síntese de novas cadeias complementares. Para isso resfria-se a 54ºC onde os prímers se anelam ao início das duas fitas simples, servindo de iniciadores para a enzima polimerase. 8 6. Aquece-se novamente o tubo a 72ºC (temperatura ideal de funcionamento da DNA polimerase) para a duplicação da fita. A DNA polimerase inicia, após o final do prímer, a colocar os nucleotídeos livres na fita de DNA ligando-os por complementaridade, formando assim uma nova fita dupla.” EXEMPLOS DE GRUPOS BACTERIANOS: ♦ Cocos gram positivos: Staphylococcus aureus, Streptococcus pneumoniae ♦ Bacilos gram negativos: Escherichia coli, Proteus mirabillis, Pseudomonas aeruginosa ♦ Espiroquetas: Leptospira interrogans, Treponema pallidum (agente da sífilis, não acomete animais) ♦ Micobactérias: Mycobacterium bovis (agente da tuberculose) ♦ Bactérias que não se coram pelo método de gram: Micoplasma agalactiae. Essas bactérias não se coram pelo método de gram, pois não possuem parece celular. As espiroquetas tambémnão se coram por este método apesar de possuírem parede celular. 9 10 de Março de 2015 – Bruno Penna. CITOLOGIA BACTERIANA A célula bacteriana possui várias diferenças em relação à célula animal. Não possui núcleo, ou seja, seu material genético encontra-se solto no citoplasma, junto aos ribossomos, suas únicas organelas. Seu genoma é composto apenas por um cromossomo (com exceção de algumas bactérias que possuem dois), e é este cromossomo que possui todas as informações necessárias a vida da bactéria. Esta célula, de tamanho reduzido, variando entre 0,2 e 10 micrometros, apresenta capacidade reprodutiva, através de mitose. Geralmente sua morfologia é monomórfica, ou seja, não mudam com o passar das gerações mas algumas mutações podem alterar sua forma temporariamente ou definitivamente. Algumas, como micoplasmas, são pleomórficas. ESTRUTURAS DA CÉLULA BACTERIANA ♦ Procarionte Material genético livre no citoplasma, na região central denominada “nucleóide”. ♦ Parede celular Estrutura externa a membrana plasmática. Confere rigidez e forma a bactéria, protege contra lise osmótica (mantendo a pressão interna entre 15 e 20 atm) e serve de suporte aos agentes somáticos bacterianos (flagelos, importantes para bactérias gram-negativas; fímbrias e proteínas de superfície). A célula bacteriana é um meio muito concentrado, principalmente por proteínas, e assim tem tendência a absorver muita água e poder gerar sua lise. Alguns tipos diferentes de parede celular geram doenças diferentes. A parede celular possui diversidade entre bactérias gram-positivas ou gram- negativas, micobacterias (BAAR) e micoplasma e ureaplasma, que são bactérias que não se coram pelo método de GRAM e domínio archeae (não costumam ser patogênicas). Composta de peptideoglicano (ou mureína), dissacarídeo que é a junção de três compostos: N-acetilglicosamina (NAG), ácido n-acetilmurâmico (NAM) e pentapeptídeo precursor (ligado covalentemente ao NAM). A cadeia lateral é de composição diferente entre bactérias gram-positivas e gram-negativas. Os antibióticos β-lactâmicos agem sobre o peptídeoglicano de forma a impedir sua síntese. BIOSSÍNTESE DO PEPTÍDEO: construção dos precursores no interior da célula, para serem exteriorizados. Para que haja o transporte, há composto que se liga a fração básica do peptídeo e a parede celular. No meio extracelular há a 10 montagem do peptideoglicano por ação enzimática e os precursores são ligados em uma linha via transglicolidação (ligação do NAM e do NAG) e via transpeptidação (ligação das cadeias laterais, que pode ocorrer diretamente ou através de uma nova cadeia). Se as bactérias são gram-negativas, as cadeias laterais são ligadas diretamente (4º com 5º aminoácido) e há uma camada fina de peptideoglicanos com membrana externa de composição diferente. Entre essas membranas há o Espaço Periplasmático, onde há enzimas – lípases, proteases, etc. – que auxiliam na digestão bacteriana, inibição da ação de fármacos, entre outras atividades. Se as bactérias são gram-positivas há uma nova cadeia entre uma cadeia e outra, havendo maior proximidade e tamanho das cadeias e a parede de peptideoglicanos é mais espessa. Resumo da Biossíntese: 1º - formação da parede celular 2º - ligação dos glicosídeos por transglicosidases 3º - ligação dos peptídeos pelas transpeptidases A parede bacteriana está sempre em formação para se dividir em dado momento. A bactéria visa obter energia o suficiente para se dividir em duas. Outras enzimas medeiam a sua divisão/quebra de parede celular, e elas são as autolisinas. Estas enzimas quebram ligações entre NAM e NAG para inserir novas frações básicas que estão sendo produzidas no interior da bactéria. Esses produtos são inseridos na membrana, que aumenta até que se divida. A Parede Celular de bactérias gram-positivas possui camada espessa de peptideoglicanos sobrepostos devido a cadeia de peptídeos que ligam as laterais. Logo, a espessura resulta em maior rigidez de membrana celular. São bactérias sensíveis a penincilina. A Parede Celular de bactérias gram-negativas possui fina camada de peptideoglicanos e membrana externa de composição parecida com a normal, porém com particularidades: LPS (lipopolissacarídeo, composto de lipídeo e sacarídeo, possui o antígeno 0 “zero” e função de adesão e de endotoxina, ou seja, toxina da parte estrutural da célula, liberada após morte da bactéria) e ESPAÇO PERIPLASMÁTICO (local de armazenamento de metabolismo). COLORAÇÕES: na GRAM, o corante cristal violeta é adicionado e se liga igualmente as duas. Adiciona-se então lugol, outro corante que cria ligação estável entre o cristal violeta e o peptideoglicano das bactérias gram-positivas. Ele fixa pouco nas gram-negativas pois sua camada de peptideoglicanos é fina e 11 ainda há uma membrana externa sobre. Álcool é adicionado, lavando o cristal violeta, principalmente das bactérias gram-negativas (que não formam complexo estável). O contra corante é adicionado, e as bactérias gram- negativas perdem a coloração. Um contra corante – fucsina – é adicionado e deixa as bactérias gram-negativas rosas. COMPONENTES DA PAREDE CELULAR DE BACTÉRIAS GRAM-NEGATIVAS: Fina camada de proteoglicanos Membrana externa exclusiva das bactérias gram-negativas ancorada a proteoglicanos pelas lipoproteínas: barreira, defesa contra antibióticos, enzimas de células de defesa. Camada Interna fosfolipídica Camada Externa: lipídio A (porção mais interna e tóxica, endotoxina), região central polissacarídica com açucares exclusivos da bactéria e região externa de polissacarídeo (antígeno 0, antígeno de superfície que confere especificidade). Logo, a camada externa é lipopolissacarídeo. Porinas: permitem passagem de compostos hidrofílicos de baixo peso molecular OMPs: transporte de solutos, receptores de Pili (podem interagir e agregar bactérias formando colônias) e Fagos. Espaço Periplasmático: armazena enzimas hidrolíticas (para obtenção de aminoácidos), β-lactamases (medeiam a resistência a antibióticos) e proteínas transportadoras. Está entre o peptideoglicano e a membrana plasmática da bactéria. Lipoproteína: estabiliza e fixa a membrana externa. COMPONENTES DA PAREDE CELULAR DE BACTÉRIAS GRAM-POSITIVAS: Espessa camada de proteoglicanos (três aminoácidos e dois açucares) Ácidos teicóicos e lipoteicóicos (LTA): auxiliam no transporte de íons, estabilização a parede, controlam autolisinas para parar divisão celular, são fatores de virulência quando funcionam como adesinas, são receptores de bacteriófagos, são endotoxinas menos potentes e armazenam fósforo. O LTA tem porção livre ancorada na membrana celular Proteínas: MSCRAMMs, nos estafilococos. Função de adesinas e proteína de superfície que medeia ligação. 12 COMPONENTES DA PAREDE CELULAR DE BACTÉRIAS BAAR (agente da Tuberculose): Espessa camada lipídica externa: é fator de virulência, dá resistência a bactéria e aumenta sua patogenia. Possui ácidos micólicos (lipídico) na parte externa da parede celular, e eles não permitem que o método de gram core os peptideoglicanos abaixo. O tratamento com álcool ácido é um contra corante roxo. Arabinogalactâmico Peptideoglicano Membrana Plasmática COMPONENTES DA PAREDE CELULAR DE MYCOPLASMAS E UREAPLASMA: Não possuem parede celular, e a membrana citoplasmática é a estrutura externa com lipídeos denominados ESTERÓIS. Paredes celulares atípicas podem ser pelomórficas (não formam paredes típicas), com esteróis ou aeróbias/anaeróbias. ♦ Membrana Citoplasmática Composta fluida dupla de fosfolipídeos e proteínas, normalmente sem esteróis (exceto em mycoplasmas e ureaplasmas). É uma bicamada fosfolipídica externa ao citoplasma e interna a parede celular. Possui proteínas periféricas ou integrais inseridas. Modelo mosaico fluido. Possuicátions com magnésio (Mg) ou Cálcio (Ca). Suas funções são: transporte de solutos selecionando moléculas, processo mediado pelas proteínas de transporte (uniporte: transporta um íon por vez; simporte: dois íons são transportados na mesma direção por 1 transportador; antiporte: dois íons são transportados em sentidos contrários) por difusão 13 passiva/facilitada (proteína media o transporte a favor do gradiente de concentração), transporte ativo ou translocação de grupo (metabolismo vetorial: captação de determinados açucares com fosforilação do substrato durante o transporte. É um sistema de fosfotransferase. A bactéria pega carboidrato para seu interior, mas sua captação só é permitida se antes de entrar na célula a glicose adquirir fosfato). Também é função da bactéria: produção de energia/respiração celular (transporte de elétrons), fosforilação oxidativa, enzimas do citocromo associadas a membrana, enzimas da cadeira de transporte de elétrons (presentes no mesossoma – invaginação da membrana que acumula enzimas), excreção de exoenzimas hidrolíticas (proteínas do metabolismo para o processo de digestão é extracelular, e, por isso, a bactéria libera proteínas como lipases, proteases e amilases e fatores de virulência, como IgA/proteases – que destroem IgA – e toxinas), divisão celular (através dos mesossomas, invaginações de membrana que formam o septo) e biossíntese da parede. ♦ Citoplasma Envolto pela membrana citoplasmática e sem citoesqueleto, o citoplasma é um fluido com organelas da bactéria, incluindo material genético. Composto 80% de água e 20% de lipídeos, proteínas, polissacarídeos, moléculas de baixo peso molecular e nucleotídeos. Possui o nucleóide (DNA Cromossomial), Plasmídeos (DNA extracromossomial, acessório a bactéria), ribossomos, mesossomos e inclusões citoplasmáticas. ♦ Cromossoma (nucleóide) Informação genética essencial, é o DNA. É um único cromossomo circular em dupla hélice, superenovelado exceto em Bovulia (linear) e Rhodobacter sphaeroides (2 cromossomas). Não é delimitado por membrana. ♦ Plasmídeo Informação genética adicional, como virulência e resistência a antibióticos. São moléculas pequenas de DNA circular que não codificam características essenciais, mas podem conferir características especiais as bactérias. São capazes de se auto-replicar independentemente. ♦ Ribossomos Responsável pela síntese de proteínas, o ribossomo está presente em grande número no citoplasma conferindo aparência granular a ele. Compostos 60% de RNAr e 40% de proteínas acessórias. Ribossomos bacterianos são de 14 composição diferente dos mamíferos, pois possuem duas subunidades onde os antibióticos se ligam, com proteína e RNAribossomal que formam o ribossomo 70s (taxa de sedimentação sob força centrífuga). Os nossos são 80s, e os antibióticos interferem só na síntese proteica bacteriana. Algumas mitocôndrias nossas tem ribossomos com 70s (?). ♦ Grânulos/Inclusões Estruturas facultativas, número e tipo variam com o meio e o estado funcional da célula. É substância reserva de nutrientes (amido, glicogênio nas enterobactérias, polifosfatos) e subunidades de macromoléculas que servirão de matéria prima para a formação de estruturas. as reservas são feitas na forma de polímeros insolúveis. Mesossomas são invaginações das membranas citoplasmáticas. Os profundos se relacionam com a replicação do DNA e a divisão celular e os periféricos podem estar envolvidos com a secreção enzimática. ♦ Flagelos Apêndices longos e finos, com origem na membrana celular. São facultativos. Compostos de proteínas (flagelina), é um órgão de locomoção altamente antigênico (H). Geralmente são observados em bactérias gram-negativas, mas há alguns cocos e bacilos gram-positivos que possuem. Também funcionam como sensores, onde por quimiotaxia a bactéria percebe o ambiente ao seu redor. Os flagelos também são reconhecidos como antígenos pelo hospedeiro (antígeno H). Os flagelos se classificam se acordo com o arranjo na membrana celular: MONOTRÍQUIO (um flagelo em um polo), LOFOTRÍQUIO (várias flagelos em um polo), ANFITRÍQUIO (dois flagelos, um em cada polo), ANFILOTRÍQUIO (tufos de flagelos em cada polo) e PERITRÍQUIO (Escherichia coli, com flagelos em toda extensão de parede celular). Os flagelos periplasmáticos são flagelos do espaço periplasmático que conferem a bactéria (Leptospira, por exemplo) alta motilidade helicoidal típica em locais viscosos. A estrutura flagelar envolve base (fixa o flagelo na parede celular), gancho (liga a base ao filamento) e filamento (flagelo propriamente dito). A estrutura basal tem anéis de número variável. Alguns deles fixam-na na parede celular. Há um motor basal que irá fazer os movimentos circulares e de rotação do flagelo para que a bactéria possa fazer propulsão. 15 ♦ Pilis Projeções finas, curtas e numerosas da superfície. São compostas de proteínas e são agentes de adesão que fazem o reconhecimento de membrana a hospedeiro. Auxiliam na troca de material durante a conjugação bacteriana. Classificam-se como FÍMBRIAS (estruturas proteicas expostas para fora da célula, promove reconhecimento entre bactérias e células hospedeiras) e PILI SEXUAIS (fixação entre células bacterianas para conjugação e troca de material genético – plasmídeo – não tem teor reprodutivo, visto que a reprodução bacteriana é assexuada). ♦ Cápsula Estrutura opcional encontrada ao redor da célula bacteriana, formada de polissacarídeos, polipeptídeos ou ambos. É agente bacteriano em bactérias gram-negativas (?). É uma camada condensada e bem definida que circunda a célula, protegendo-a de fagocitose (inibindo as células imunitárias de reconhecerem proteínas de superfície das bactérias e assim estão relacionadas com a virulência das bactérias) e de dessecação (perda de líquidos) ou outras condições externas desfavoráveis. Promove aderência a superfície da célula hospedeira. A Cápsula classifica-se em CÁPSULA NÃO IMUNO-GÊNICA (anti- fagocítica, pode ter polissacarídeo – S. pneumoniae –, ácido hialurônico – rico na matriz extracelular, S. pyogenes – ou ácido siálico – N. meningitis). Protege a célula bacteriana porque camufla a estrutura que a célula de defesa do hospedeiro reconheceria. ♦ Endosporo Estrutura rara, mais encontradas em bactérias em situação desfavorável. Confere resistência a processos biológicos, como temperatura, inanição, desinfetantes e etc. O Bacilus antrax possui. A bactéria em situação adversa vira endósporo até encontrar um hospedeiro ou meio favorável e voltar a sua forma vegetativa. O endósporo possui parede celular mais espessa, logo, resistente. FORMAÇÃO DO ENDOSPORO (forma basal ou de latência da bactéria): a bactéria se divide em proporções desiguais, porém o material genético é igualmente dividido e condensado em alguma extremidade da célula. A célula filha maior invagina a menor, que receberá cálcio entre a membrana dela e da invaginação. A menor é então ressecada e entrará em estado de latência, enquanto que a maior morre e libera o Endosporo ao meio adverso. Os endósporos tem pouca atividade metabólica. 16 17 16 de Março de 2015 – Bruno Penna. FISIOLOGIA BACTERIANA O crescimento e a divisão celular bacteriana necessitam de um ambiente propício com todos os constituintes químicos e físicos necessários para o seu metabolismo. Cada espécie inclusive possui necessidades específicas – de nutrição, crescimento e multiplicação. NUTRIÇÃO BACTERIANA As estruturas bacterianas são formadas por macromoléculas (proteínas, lipídeos, ácidos nucleicos, etc.), e os precursores dessas macromoléculas são encontrados no ambiente ou sintetizados pela bactéria a partir de compostos mais simples. As proteínas, por exemplo, são exportadasao meio extracelular, onde são quebradas e seus produtos (os aminoácidos ou pequenos peptídeos) são importados para a bactéria de forma que ela possa fazer outras proteínas necessárias. Nutrientes, substâncias ou elementos são retirados do ambiente e usados para fazer novos componentes celulares ou obter energia. São eles: ♦ Macronutrientes (necessários e essenciais em grandes quantidades para as bactérias) ♦ Micronutrientes (necessários, porém em frações menores e variadas, sempre na forma inorgânica) ♦ Fatores de crescimento A receita do crescimento bacteriano é o equilíbrio entre FONTE DE ENERGIA + SUBSTRATOS (para produzir novas organelas) + FATORES AMBIENTAIS (temperatura, pH, disponibilidade de água e tudo exógeno que irá influenciar no crescimento). As células bacterianas obtém energia pela 1. FERMENTAÇÃO (lática, alcoólica, acética, propiônica. Gera pouco saldo energético e energia sob a forma de 2 ATPs a partir de açucares, não requer oxigênio e não usa o Ciclo de Krebs), 2. RESPIRAÇÃO AERÓBICA (faz fosforilação oxidativa, onde oxigênio é aceptor de elétrons e há alto ganho de ATP) e 3. RESPIRAÇÃO ANAERÓBICA (outro composto é aceptor de elétrons e o débito é alto, logo a eficiência é baixa). (ver via de degradação de nutrientes no próximo assunto). 18 CLASSIFICAÇÃO DAS BACTÉRIAS QUANTO À FONTE DE ENERGIA ♦ Fototróficas: obtém energia de energia luminosa (bactérias fotossintetizantes). “clorofila a” presente em algumas bactérias, irá produzir oxigênio no final da cadeia energética Bacterioclorofila presente em algumas bactérias geralmente irá produzir enxofre no final da cadeia energética. ♦ Quimiotróficas: maioria das bactérias. Obtém energia das reações de oxirredução na cascata metabólica. São as Litotróficas (comedoras de terra, como o Thiobacillus) e as Organotróficas (bactérias que utilizam carboidratos e compostos orgânicos como fonte de energia). CLASSIFICAÇÃO DAS BACTÉRIAS QUANTO À FONTE DE CARBONO ♦ Autotrófica: utilizam compostos inorgânicos como fonte de carbono – CO2, CO3 -2. ♦ Heterotrófica: utiliza compostos orgânicos como fonte de carbono – carboidratos, principalmente. CLASSIFICAÇÃO DAS BACTÉRIAS QUANTO À FONTE DE NITROGÊNIO ♦ Fixadoras de Nitrogênio: simbiose com leguminosas para fixar nitrogênio atmosférico (Azotobacter e Rhizobium) ♦ Compostos inorgânicos: sais de amônio e nitratos como fonte de energia, gerando nitritos. ♦ Compostos orgânicos: alguns aminoácidos que contenham nitrogênio na composição. CLASSIFICAÇÃO DAS BACTÉRIAS QUANTO À FONTES DE ENERGIA E DE CARBONO CLASSIFICAÇÃO FONTE DE ENERGIA FONTE DE CARBONO EXEMPLO Fotoautotróficas Luz CO2 Cianobactérias Fotoheterotróficas Luz Compostos Orgânicos Bactérias verdes e púrpuras Quimioautotróficas Compostos Inorgânicos CO2 Archaea Quimioheterotróficas Compostos Orgânicos Compostos Orgânicos (principalmente carboidratos) Maioria das bactérias patogênicas 19 MACRONUTRIENTES Carbono (principal constituinte celular da bactéria, presente na composição de todas as moléculas orgânicas), Oxigênio (receptor final dos elétrons no ciclo de Krebs – bactérias que seguem a cadeia respiratória tem esta realizada pelas suas enzimas do citocromo. Essencial as bactérias aeróbias, funcionam como aceptores de elétrons ao final da cadeia respiratória), Nitrogênio (constituinte proteico e de ácidos nucleicos, também funciona como cofator enzimático), Hidrogênio (mantém pH, está em todo o material celular e promove equilíbrio osmorregulador), Fósforo (constitui fosfolipídeos, lipopolissacarídeo, ácido teicóico das bactérias gram-positivas, fosforila glicose para que ela entre na célula), Potássio (cofator de enzimas), Sódio (realiza transporte de moléculas pela membrana por participar principalmente no simporte) e Magnésio (cofator de enzimas). MICRONUTRIENTES Encontrados sempre na forma inorgânica, nas bactérias são elementos estruturais e cofatores de enzimas. Também são osmorreguladores. FATORES DE CRESCIMENTO São moléculas orgânicas indispensáveis ao crescimento bacteriano, visto que ela é incapaz de sintetizá-las. Nessas moléculas, estão os aminoácidos, as purinas e pirimidinas e as vitaminas. Essa última por sinal é o grupo que as bactérias precisam em menor quantidade, sendo que certas espécies bacteriana são capazes de sintetizar certas vitaminas (como algumas do complexo B pela Escherichia coli). Para as bactérias que não produzem vitaminas, é necessário que esse seja ofertado no meio de cultura, ou seja, um meio de cultura enriquecido. Compostos orgânicos indispensáveis, mas que não são sintetizados pela bactéria. Fatores de crescimento são o fator limitante: sem eles, a bactéria é incapaz de crescer, mas sua presença não é requerida em grandes quantidades, e sim pequenas. As bactérias não precisam ter todos os fatores de crescimento existentes, e por isso eles não são micronutrientes. Cada bactéria necessita de um ou outro em determinadas quantidades para que possa crescer: ♦ Purinas e pirimidinas – necessárias para síntese de DNA/RNA ♦ Aminoácidos – necessários para a síntese proteica ♦ Vitaminas – coenzimas de algumas reações enzimáticas As bactérias obtém os fatores de crescimento In vivo do organismo que estão parasitando (fluidos corporais, tecidos) ou In vitro (fornecidos ao meio de cultura – extrato de levedura, sangue e derivados). 20 FATORES AMBIENTAIS (FÍSICOS) QUE INFLUENCIAM TOMADA DE NUTRIENTES E O METABOLISMO BACTERIANO ♦ Temperatura ótima de crescimento bacteriano: Psicrófilas: -5 a 25°C. Contaminam alimentos mesmo nas geladeiras, onde era suposto que houvesse conservação do crescimento bacteriano. Ex.: Listeria. Psicotróficas: DEPENDE DO AUTOR: bactérias de 0 a 30°C. Mesófilas: 26 a 45°C. Maioria é patogênica e se desenvolve em temperatura ambiente. Ex.: Leptospira. Termófilas: 46 a 70°C. Hipertermófilas ou Termófilas Extremas: 71 a 110°C. Desenvolvem-se em ambientes inóspitos. A temperatura influência na velocidade das reações metabólicas. Na temperatura ótima (TOT) o tempo de geração (tempo que leva para ocorrer um ciclo de fissão binária) é o menor o possível. Em gráficos temos que a parábola não é perfeita pois temperaturas abaixo da TOT o metabolismo é reduzido e a bactéria pode se romper mas se acima da TOT há desnaturação proteica e queda rápida no crescimento bacteriano. A resistência das bactérias a modificações de temperatura ocorre devido à composição da sua membrana celular: ◊Presença de ácidos graxos insaturados – dão maior permeabilidade as membranas (psicrófilos) ◊Presença de ácidos graxos saturados e maior concentração de G+C no DNA – devido ao meio apresentar muita agitação molecular, o que permite a troca de solutos, a membrana de AGS conferem menor permeabilidade de membrana (termófilos). G+C são pares de bases ligados por três pontes de hidrogênio ao invés de duas, como a A+T, logo, a ligação é mais forte e por ter maior concentração desses pares de base o DNA sobrevive em maiores temperaturas. ◊Isoprenóides ao invés de ácidos graxos: Archaea. ♦ pH ótimo: Acidófilas: pH < 5,5. Bactérias que se mantém em pH ácido. Os exemplos são as bactérias fermentadoras, as lácticas e e as propiônicas (do rúmem). Neutrófilas: pH entre 5,5 e 8,5. Bactérias que se mantém em pH neutro. São de maioria patogênicas. Alcalófilas: pH > 8,5. Bactérias que se mantém em pH alcalino. 21 Para cada micro-organismo, teremos um pH mínimo, um máximo e um ótimo ao seu crescimento. Em um pH desfavorável, ocorre a lise celular devido ao desequilíbrio eletrostático. Nos meios de cultura, usa-se de tampões para manter o pH do meio sobre controle, próximo a neutralidade, favorecendo assim o crescimento bacteriano. O gráfico de pH ótimo segue uma parábola quase perfeita. O pH tem efeitosno crescimento. ♦ Oxigênio: Aeróbios restritos: só possuem metabolismo com a presença de oxigênio – Pseudomonas (gram-negativa não fermentadora, de metabolismo sempre oxidativo). São as mais eficientes em gerar energia. Microaeróbios: crescem em baixas concentrações de oxigênio, entre 5 e 10%. Se a concentração for menor, não há crescimento, se for maior é tóxico para a célula bacteriana. Cresce no meio da cultura, onde não há muito nem pouco oxigênio. Anaeróbios restritos: bactérias fermentadoras, apenas crescem na ausência de oxigênio. O oxigênio além de inibir o crescimento é tóxico a bactéria – Bacillus antrax (se houver oxigênio, assume a forma de Endosporo). Anaeróbias aerotolerantes: não utilizam oxigênio para promover crescimento mas sua presença não causa toxicidade nem interferência no seu metabolismo. O local de crescimento na cultura, de acordo com proximidade ou distância do oxigênio em nada irá interferir. A redução de oxigênio na respiração leva a formação de peróxidos e de superóxidos que são altamente tóxicos. Algumas bactérias são capazes de reduzir os superóxidos em peróxidos através da enzima superóxido desmutase e outras reduzem o peróxido em água e oxigênio através da catalase. A presença dessas enzimas leva a existência de bactérias aerotolerantes. Anaeróbias facultativas: bactérias que toleram as duas situações – aerobiose (se houver oxigênio, irá fazer metabolismo oxidativo, ciclo de Krebs e cadeia respiratória, gerando 32 ATPs) e anaerobiose (na ausência de oxigênio irá fazer metabolismo fermentativo e gerar 2 ATPs). Localizam-se por toda a cultura mas preferem as regiões próximas do oxigênio pois poderão fazer o metabolismo oxidativo e obter mais energia. 22 CULTIVOS MICROAERÓFILOS E ANAERÓBIOS simulam atmosfera para a bactéria crescer. O Jarro de Microaerofilia envolve o método da vela, que é acessa e hemeticamente fechada, fazendo com que haja combustão e assim depleção quase total do oxigênio. Há o Sistema Gas-Pak, o Saco e a Câmara de Anaerobiose (essa permite anaerobiose completa – zero oxigênio). ♦ Pressão osmótica/equilíbrio de osmolaridade: Bactérias geralmente são encontradas no meio isotônico/fisiotônico estão em equilíbrio. Bactérias em solução hipotônica podem ter muito influxo/absorção de líquidos e se romperem, e em solução hipertônica ela pode perder muitos líquidos, secar e não sobreviver. As bactérias são classificadas nas soluções de acordo com seu crescimento na presença de sal: Não tolerantes ou Não halofílicas: não crescem na presença de sais. Halotolerantes: toleram maiores quantidades de sal mas crescem melhor se a concentração for próxima a zero. Halofílicas toleram mais sal. Halofílicas extremas: toleram presença de muito sal. Quanto maior a quantidade de sal e açúcar, menor é o crescimento bacteriano. MEIOS DE CULTURA Servem para suprir a bactéria com elementos e fatores de crescimento ideais em condições de temperatura, pH e osmolaridade ideais. São usados para manutenção, isolamento, identificação e pesquisa de sensibilidade às drogas das bactérias. 23 CLASSIFICAÇÃO QUÍMICA DOS MEIOS DE CULTURA ♦ Definido/Sintético: sabe-se quais nutrientes estão presentes e a sua concentração. ♦ Complexo: não se conhece exatamente a composição do meio, tanto quais os nutrientes ofertados tanto sua concentração. Ex.: extrato de carne, extrato de levedura, etc. CLASSIFICAÇÃO FUNCIONAL DOS MEIOS DE CULTURA ♦ Básico: contém o mínimo de nutrientes necessários ao crescimento de uma determinada espécie bacteriana. ♦ Enriquecido: um meio com muitos nutrientes e enriquecimentos especiais para certas espécies bacterianas. Cultiva-se bactérias desconhecidas ou que requerem nutrientes complexos. É mais nutritivo e mais complexo. ♦ Seletivo: meio com componentes que inibem o crescimento de uma certa espécie de bactéria, e favorece o crescimento de outra. Ex.: Meio de Chapman, seletivo para Staphylococcus sp.; Manitol Salgado (aumenta a concentração de sal ofertado e só bactérias halotolerantes sobrevivem). Há expressão de indesejados em prol de outros de interesse. ♦ Diferencial ou Indicador: diferencia micro-organismos ou grupos bacterianos de acordo com a sua atividade metabólica. Desse modo, acaba sendo uma forma de cultura seletiva. Ex.: Manitol Salgado (quando o manitol é consumido) e Ágar Sangue (qualquer bactéria cresce, mas o tipo de hemólise é diferente entre as espécies e o Ágar sangue indica se essa bactéria é hemolítica ou não. Caso haja hemólise será visualizado um halo branco). CLASSIFICAÇÃO DOS MEIOS DE CULTURA QUANTO A CONSISTÊNCIA/SOLIDEZ Os meios podem ser classificados quanto a sua consistência, ou seja, podem ser líquidos, semi-sólidos ou totalmente sólidos. Estes meios são inseridos em um tubo de ensaio ou em uma placa de Agar. ♦ Meios líquidos: crescimento de culturas putas com maior massa celular. ♦ Meios sólidos: isolamento de culturas puras para estimar viabilidade da população bacteriana. Ex.: Ágar-Ágar, Rhodophyceas é um componente que as algas produzem mas que não é metabolizado por bactérias. Tem ponto de fusão alto (121 graus Celsius) e permitem esterilização em auto-clave. Posteriormente solidifica-se. ♦ Meios semi-sólidos: adição de quantidade reduzida de agente solidificante. Pouca quantidade de Agar: 0,3 a 0,5%. 24 16 de Março de 2015 – Bruno Penna. METABOLISMO BACTERIANO Metabolismo é o conjunto de reações químicas em um organismo. O CATABOLISMO envolve a quebra de macromoléculas em compostos menores e menos energéticos enquanto que o ANABOLISMO envolve a síntese de macromoléculas a partir de compostos menores. A bactéria importa catabólitos e promove anabolismo. O crescimento microbiano é sempre populacional, nunca individual. A energia celular é algo importante pois a célula viva necessita dela para realizar diversos trabalhos, como 1. Biossíntese de partes estruturais da célula; 2. Síntese de enzimas, ácidos nucleicos, polissacarídeos e etc.; 3. Reparos de danos e manutenção da célula sadia; 4. Crescimento e multiplicação; 5. Armazenamento de nutrientes, em pouquíssimas quantidades, e excreção de produtos e 6. Mobilidade. O ATP – adenosina trifosfato – é o estoque de energia que a célula possui para as reações, e é sintetizada por: fosforilação (luz), fosforilação a nível de substrato (fosfato é removido de compostos orgânicos e adicionado diretamente ao ADP) e fosforilação oxidativa. VIAS DE DEGRADAÇÃO DE NUTRIENTES ♦ Catabolismo – de carboidratos. Catabolismo é a quebra de grandes moléculas em moléculas pequenas para que energia seja liberada. ♦ Respiração celular: Aeróbia: Glicólise Ciclo de Krebs Fosforilação Oxidativa (o receptor final é o O2 e H2O é liberada) Anaeróbias: Glicólise Ciclo de Krebs PARCIAL Fosforilação Oxidativa (compostos inorgânicos são receptores e compostos inorgânicos são liberados). ♦ Fermentação: Glicólise e liberação de energia a partir de açúcares. 25 FISSÃO BINÁRIA O crescimento bacteriano (proliferação numérica das bactérias) se dá por fissão binária (assexuada). A célula primeiramente se alonga, o DNA é duplicado, e a célula começa a se dividir em duas. Um septo é formado entre as duas e por fim elas são separadas. A célula mãe dá origem a duas células filhas idênticas, num tempo de geração (tempo que leva para ocorrer um ciclo de fissão binária, varia conforme a espécie, onde as mais patogênicas normalmente possuem um tempo maior, e também conforme as condições do meio – nutricionais e físicas). No meio ideal e propício, o crescimento bacteriano é uma progressão com base 2: 1 - 2 - 4 - 8 - 16 20 - 21 - 22 - 23 - 24 CF = Ci X 2 TG , onde CF = concentração final das bactérias Ci = concentração inicial das bactériasTG = tempo de geração (1 intervalo). OU N = N0 X 2 t N = número de bactérias No = inóquo inicial t = número de divisões binárias (descobre a partir do TG) Exemplo: há uma população de 10 bactérias, com tempo de geração de 10 minutos. Qual será a concentração final da população após 30 minutos? CF = Ci X 2 TG Lembre-se que 30 minutos são 3 intervalos de 10 minutos! CF = 10 X 2 3 CF = 10 X 8 CF = 80 bactérias Exemplo 2: Há 10 bactérias iniciais que se dividem a cada 10 minutos, quantas bactérias terei em 40 minutos? N = N0 X 2 t 40/10 = 4 = t N = 10 X 24 N = 160 bactérias. Porém, se não houver o número, é possível avaliar o crescimento bacteriano através da turbidez do tubo. 26 CURVA DE CRESCIMENTO POPULACIONAL É dividida em quatro etapas: 1. Fase de adaptação ou fase lag: ao chegar em um novo ambiente, a bactéria precisa se adaptar as condições oferecidas por esse meio. Nesse estágio, não há crescimento bacteriano, ou se cresce é muito pouco. As bactérias estão em intensa atividade metabólica pois estão modificando sua maquinaria interna para poder posteriormente crescer nesse meio. Há biossíntese de moléculas para a divisão das células. A conta do CF não leva em conta essa fase, portanto, se essa fase durar 30 minutos, a bactéria só irá começar a gerar filhas após o 31º minuto. 2. Fase exponencial ou fase log: agora que a bactéria se encontra adaptada ao seu novo meio, ela começa a se reproduzir e o numero de indivíduos na população aumenta. A reprodução celular está ativa, há maior atividade metabólica entretanto é maior a sensibilidade ao ambiente. Essa fase se encerra pela falta de nutrientes e acumulo de tóxicos e excretas no meio. 3. Fase estacionária: a oferta de nutrientes do meio começa a diminuir, e algumas bactérias começam a morrer. Nessa fase, o numero de bactérias que morrem é próximo ao numero de novas bactérias “nascidas”. 4. Fase de declínio ou fase de morte: a oferta de nutrientes é escassa no meio, e as bactérias começam a morrer. Há muitos produtos metabólicos acumulados no meio e o ambiente se torna inóspito à colônia. CRESCIMENTO BACTERIANO NO MEIO AMBIENTE – MICROBIOTA COMPETITIVA É a interação com comunidades mistas através da formação de biofilmes bacterianos. Os biofilmes são comunidades de micro-organismos incorporados a matriz orgânica (tártaro, por exemplo) ou inorgânica (Staphylococcus em produtos hospitalares) aderida a superfície viva ou inerte. As bactérias se aderem as estrututas, crescem dentro da matriz extracelular e formam pêndulos. Quando crescem muito, 27 destroem a matriz para que migrem em busca de novas fontes de energia. As bactérias são capazes de sinalizar a carência de nutrientes através do Quorum sensing: bactérias sinalizadoras da colônia produzem componentes que são liberados em grandes quantidades no meio, mas que só se ligam nos receptores bacterianos comunicando a falta de alimentos e a superpolução quando houver muitas bactérias no biofilme. Então todas as bactérias param de produzir algo (coagulase, por exemplo) para produzir outra coisa (quinase, para destruição do coágulo). A sinalização comanda, portanto, a mudança na rota metabólica (catabolismo ↔ anabolismo). Resumindo, o biofilme é a matriz orgânica aderida a uma superfície ou organismo que protege a bactéria e o Quorum sensing é o mecanismo de troca de sinais com o ambiente e micro-organismos através de autoindutores/metabólitos secundários, determinados pela densidade celular. ENDOSPOROS (ou ESPOROS) Células especializadas em repouso, resistentes a meios adversos. A produção é de uma célula vegetativa por esporo, que é formado por ESPORULAÇÃO (metabolismo basal dentro da célula mãe quando em ambiente adverso, através da formação de peptideoglicanos entre as suas membranas para que haja deposição de cálcio) e sai do estado de latência por GERMINAÇÃO (quando seu conteúdo e organelas aumentam). A localização do endósporo segue a formação dele dentro da célula e pode ser lateral, subterminal (Bacillus subtillis), terminal (Clostridium tetani) ou central (Bacillus cereus). 28 17 de Março de 2015 – Bruno Penna. GENÉTICA BACTERIANA Bactérias são seres unicelulares e procariotos (com todo o material genético solto no citoplasma e sendo ele uma fita dupla de DNA em grande maioria dos casos). Mesmo não possuindo membrana celular seu material genético – cromossomos e elementos genéticos móveis – tende a ficar na região central da célula, denominada “nucleóide”. Há único cromossoma circular nas bactérias, salvo em exceções. GENOMA BACTERIANO Cromossoma (nucleóide) DNA dupla fita, único e circular (superenovelado). Informação genética essencial, o cromossoma carrega genes que possuem o conjunto de informações essenciais à sobrevivência da bactéria. É composta de Ácido desoxirribonucléico (DNA), sendo um único cromossoma circular onde a fita gira em torno dela mesma em formato helicoidal, com exceções (Borrelia é linear e Vibrio cholerae tem mais de 1 comossoma). Não está separado dos demais materiais celulares por uma membrana nuclear, diferente da célula eucariótica. Elementos Genéticos Moveis (extra-cromossomiais) Não fazem parte do cromossoma e podem ser trocados entre bactérias. São eles os Plasmídeos, os Transposons e as Ilhas genômicas (pedaços de DNA acoplados no genoma ou no Plasmídeo que codificam coisas). ♦ Plasmídeos (DNA extra-cromossômico) Possuem material genético que codifica enzimas que permitem a sua replicação independentemente do cromossomo bacteriano. São, portanto, moléculas de DNA de fita dupla circulares que se replicam independente do cromossoma. Carregam informação genética adicional (ex. resistência antimicrobiana, virulência) e são característicos do indivíduo, não da espécie ou gênero. Há bactérias que não possuem. O tamanho e número de cópias são variáveis, pois o Plasmídeo pode ter um único gene ou vários. Como auto- induzem a própria replicação, a velocidade e o número de cópias formadas entre as bactérias é muito variável. Há Plasmídeos Promíscuos, que não são espécie-específicos, e, por não ter predileção por nenhuma espécie ou gênero bacteriano pode ser trocado entre diferentes espécies, promovendo resistência bacteriana. Os Plasmídeos estão no citoplasma ou integrados ao cromossoma (aí vira epissoma). É um elemento genético móvel por ser trocado entre bactérias, sendo esse seu mecanismo conservativo na natureza. A conjugação é o principal mecanismo de transferência de plasmídeos entre bactérias. 29 Características conferidas por plasmídeos: resistência antimicrobiana (plasmídeos R); fertilidade (plasmídeo F, E. coli – fertilidade é a capacidade de atrair outras células para que seja feita troca de material genético, mas só há essa troca se uma das células possuir o Plasmídeo F, que produz ferormônios e estimula a formação do Pilis Sexual); virulência (ex. toxinas, enzimas, proteínas de superfície); bacteriocinas (substância tóxica para outras bactérias que dá vantagem na competição entre grupos); e outros, como via metabólica de preferência e a capacidade de produzir cápsula. ♦ Transposons ou Elementos de transposição Pequenos segmentos de DNA que podem saltar ou autotransferir-se de uma molécula de DNA para outra. Nunca estão soltos na natureza e se encontram sempre inseridos em genomas (bacteriano ou do Plasmídeo). Não são auto- replicáveis – replicam-se junto com DNA receptor. A transposição (capacidade de saltar entre genomas garantindo que tenham seu DNA replicado) é o mecanismo replicativo ou conservativo dos Transposons. Eles possuem genes que são ladeados por duas sequências de inserção. O material genético produz enzimas denominadas Transposases que reconhecem os Transposonse o capacita a pular entre fitas. As regiões de inserção são partes do genoma que são homólogas ao genoma bacteriano e é nesse local que há a inserção do Transposons, onde a sequência das bases é AATTC. Portanto, o material genético codifica as Transposases, que pegam o genoma dos Transposons e tenta encaixar no genoma bacteriano, cortando AATT- e –TAAG do Transposon e encaixando na porção homóloga do genoma bacteriano. A inserção do Transposon nessa sequência específica evita que a inserção aleatória possa alterar a transcrição de genes fundamentais a vida bactéria. Os Transposons são lidos como genes de resistência pela bactéria. 1 gene entre duas sequências de iniciação/inserção. Tem um gene que codifica a enzima transposase, que tem três funções: 1. Reconhecer a sequência de inserção que tem o Transposon; 2. Reconhecer as outras sequências de inserção aleatórias e 3. Cortar nesse ponto as 2 partes e unir as pontas “soltas”. 30 ALTERAÇÕES NO GENOMA Envolvem mutações e transferência de genes (transformação, conjugação e transdução). ALTERAÇÕES NO GENOMA - MUTAÇÕES Alteração herdável na sequência de bases do DNA que gera variações no material genético das bactérias. Gera transferência vertical de genes. Pode ser: ♦ ESPONTÂNEA: houve erros na replicação do DNA, ocorre em baixa frequência pois é ao acaso e não um processo induzido. ♦ INDUZIDA: provocada por agentes mutagênicos químicos (ex. análagos de bases), físicos (ex. radiações) ou biológicos (ex. transposons, que podem pular até errar, carregando uma base a mais sem querer e alterando a leitura dos códons da bactéria – onde de 3 em 3 são lidos). ♦ MUTAÇÃO PONTUAL: ocorre em apenas um ponto do material genético. Mutações mais significativas envolvem deleção, substituição, inserção ou inversão de bases. O mutante tem o genótipo diferente da célula parenteral (selvagem). Lembre-se que genótipo é o conjunto de genes de um organismo e o fenótipo é o conjunto das características observáveis. Se mutante possui genótipo diferente da célula parenteral e o mesmo fenótipo a mutação é silenciosa, um códon pode ter sido trocado modificando o genótipo mas ainda assim a mesma proteína será sintetizada, porém, se genótipo e fenótipo são diferentes da célula parenteral, temos mutação sem sentido, e a produção da proteína pode parar no processo e ela ficar defeituosa e com menos aminoácidos. Cepa selvagem mutou no ponto onde a enzima DNAgirase é codificada, e a cepa mutante ficou resistente a quinolonas. 31 ALTERAÇÕES NO GENOMA - TRANSFORMAÇÃO DNA na forma livre é incorporado por uma célula receptor. Há troca de material genético entre bactéria morta (célula doadora de material genético) e viva. Foi feito um experimento por Ghriffts para saber porquê cepas lisas levavam a morte de camundongos mas cepas rugosas não. As Cepas Lisas provocavam morte pois produziam cápsula bacteriana. Cepas lisas foram então fervidas e lisadas, inoculadas e os indivíduos não morreram. Restos dessas cepas foram então misturadas com cepas rugosas (avirulentas) e os camundongos morreram, constantando que as cepas avirulentas adquiriam fragmentos de DNA das virulentas e assim capacidade de produzir cápsula. Ocorre em bactérias Gram-positivas e Gram-negativas (ex. S. pneumoniae, N. gonorrhoeae, H. influenzae). A competência envolve ter proteínas específicas para captação e processamento do DNA livre, ter o maquinário específico que permite aquela bactéria ler e aproveitar o DNA daquela que morreu. A célula doadora morre, deixando seus fragmentos de DNA livres no ambiente. A célula COMPETENTE prende esses fragmentos LIVRES em proteínas de sua superfície. Após essa ligação, nucleases associadas à parede celular processam a fita dupla que está enorme, possibilitando entrada no citoplasma bacteriano através da membrana celular. Uma vez dentro do citoplasma, a proteína recA se liga a fita simples e encontra região homologa no cromossomo bacteriano para haver recombinação (tira o pedaço homólogo e coloca o recebido). 32 ALTERAÇÕES NO GENOMA - CONJUGAÇÃO É a transferência de genes (plasmídeos) que envolve o contato entre 2 células. Ledenberg juntou dois tipos bacterianos, negativos e positivos, e viu que depois da interação havia um grupo positivo com todas as 6 características (3 provenientes de cada grupo), logo, havia ocorrido troca de informações. Ele então gerou tubo em U com uma membrana de filtro fina o suficiente para impedir passagem de bactérias, e dividiu os grupos por ela. Mesmo assim, sem o contato direto entre as bactérias, houve troca de material genético, pois ferormônios bacterianos agrupou bactérias e permitiu a passagem de uma estrutura muito menor que elas que trocasse informações: o pili sexual. Plasmídeos Conjugativos são os que possuem o Fator F e assim são capazes de estimular a produção de ferormônios e do pili sexual, que irá agir como comunicação entre os citoplasmas bacterianos para permitir a passagem dos Plasmídeos. A célula doadora somente deve possuir os Plasmídeos Conjugativos para transferir os genes a célula receptora. Na conjugação de bactérias Gram-negativas: bactéria com o Plasmídeo Conjugativo (por exemplo o Fator F das E. coli) produz ferormônios e atrai célula receptora. Há formação do pili sexual, que é o canalículo de comunicação entre citoplasmas. Os Plasmídeos enviam uma fita enquanto que a que sobra na bactéria doadora se replica. A fita enviada a receptora também é replicada. Outros Plasmídeos não Conjugativos (de resistência) também podem ser trocados, mas não são capazes de induzir o processo de conjugação bacteriana. Os envolvidos são na situação acima são: o Plasmídeo F (E. coli), F+ (célula doadora, positiva para o Plasmídeo) e F- (célula receptora). Quando o Plasmídeo está inserido no cromossoma, formando o Epissoma (integração ao cromossoma do hospedeiro por meio de transferência de regiões do cromossoma) a leitura do Plasmídeo ocorrerá em frequência maior tal como a troca de material genético, e a célula doadora é a Hfr (alta frequência de recombinação). 33 A conjugação ocorre entre diferentes espécies e gêneros, principalmente entre bactérias Gram-negativas (enterobactérias, por exemplo). Não é espécie-específica. Em bactérias Gram-Positivas a Conjugação não envolve pili sexual; feromônios são produzidos pela célula receptora e a troca de material genético ocorrerá pela agregação de células, onde paredes celulares irão se fundir. ALTERAÇÕES NO GENOMA - TRANSDUÇÃO Transferência de DNA de uma célula para outra por meio de um vírus (fago ou bacteriófago). Ocorre em bactérias Gram-negativas mas nem em todas as Gram- positivas, onde o ácido teicóico da parede celular são receptores para bacteriófagos. A transdução pode ser: ♦ Transdução especializada: Vírus temperados (bactérias com o vírus latente em seu genoma, com capacidade em se ligar em um setor específico do genoma bacteriano) sofrem divisões e em algum momento a bactéria morre, deixando livres o corpo e o DNA viral e bacteriano. Quando infecta o DNA da nova bactéria o DNA da célula receptora irá receber DNA bacteriano. O DNA de uma região específica do cromossoma integra-se ao DNA viral. A partícula transdutora é o vírus defectivo e a transferência é de baixa eficiência. O vírus defectivo não possui todas as características necessárias para ele causar morte da bactéria. O vírus possui ciclos de vida, podendo este ser LÍTICO (infectam bactérias, material genético é replicado, seu maquinário é sintetizado, aumenta a concentração de partículas virais e isso gera lise da célula com extravasamento das partículas) ou LISOGÊNICO (infectam bactérias mas não se replicam, e sim se inserem em região do genoma bacteriano. Assim, quando houver divisão celular bacteriana o vírusou PRÓ-FAGO será replicado). Radiação UV induz a saída do vírus do estágio lisogênico ao lítico. Pró-fagos se internalizam em região específica do genoma bacteriano, mas ao se desligar dele podem carregar material genético da bactéria consigo. Assim, seu material genético não será somente viral, e ele replica no citoplasma formando Capsídeos além de sair da célula bacteriana em questão para infectar outras, onde irá achar região homóloga no genoma e se aderir, para haver recombinação (troca de informação que leva à bactéria nova característica). Na prática: vacinas recombinantes, que usam DNA/gene ao invés do organismo morto ou atenuado e tem toxicidade reduzida são importantes. No laboratório pode-se pegar fagos e inserir um gene nele para que o fago seja posteriormente inserido na E. coli para que ela produza muitas proteínas a partir desse gene. 34 ♦ Transdução generalizada: DNA derivado de qualquer região do cromossoma substitui o genoma viral dentro da partícula viral. A partícula transdutora é o vírus defectivo (“corpo de vírus, recheio de bactéria”) e a transferência é de baixa frequência por ocorrer ao acaso. A estrutura viral destrói a célula bacteriana mas por acaso o Capsídeo Viral internaliza material genético bacteriano ao invés do seu próprio, deixando de ser vírus e se tornando PARTÍCULA TRANSDUTORA. Essa Partícula Transdutora irá infectar bactérias, internalizar seu material genético bacteriano e: 1. repassá-lo a bactéria, quando encontra região homologa no seu genoma, há recombinação e uma nova característica é conferida a bactéria; 2. Não ter o material genético aproveitado e a transdução se tornar abortiva e 3. Ter seu material genético destruído e a transdução não obter sucesso. ALTERAÇÕES NO GENOMA – CONVERSÃO FÁGICA Alteração fenotípica decorrente de uma lisogenização por fago temperado normal, ou seja, quando o DNA da bactéria com vírus é aproveitado pela bactéria receptora gerando alterações fenotípicas. O DNA viral é convertido a um pró-fago e há alterações fenotípicas (imunidade a novas infecções e produção de toxinas (ex. C. diphteriae), por exemplo). A Conversão Fágica ocorre se o resultado da transdução especializada gerar alteração de fenótipo. 35 23 de Março de 2015 – Bruno Penna. MECANISMOS DE PATOGENICIDADE ♦ Patogenicidade: capacidade de um organismo causar uma doença. ♦ Virulência: agressividade da bactéria em tornar-se patogênica. Os fatores de virulência envolvem estruturas, produtos (enzimas ou toxinas no meio extracelular) ou estratégias (biofilme) que contribuem para a patogenicidade de um micro-organismo. Os tipos de fatores de virulência de uma bactéria são: ADESÃO e INVASÃO, EVASÃO e DANOS AO HOSPEDEIRO. Todos esses processos ocorrem simultaneamente e se interligam. INFECÇÃO Pode ocorrer através de diversos mecanismos: ingestão (fecal-oral), inalação (respiratória), trauma (queimaduras, traumas que abrem portas de entrada e muitas vezes carrega o micro-organismo para dentro do hospedeiro), picada de artrópodes (zoonoses, mosquitos, pulgas, carrapatos), transmissão sexual, picada de agulhas e cateteres e infecção maternal-neonatal. FATORES QUE PROMOVEM ADESÃO E INVASÃO Ancoramento com o hospedeiro via estruturas chamadas adesinas. 1. ADESINAS Reconhecimento e fixação de micro-organismos em células ou tecidos do organismo. No 1º ESTÁGIO a associação das fimbrias bacterianas com o hospedeiro é fraca, reversível, inespecífica e representada por interações eletrostáticas (adesinas fimbriais). Se o hospedeiro possui as suas defesas funcionais elas desligam essas ligações. No 2º ESTÁGIO, onde há a adesão propriamente dita, há o contato de moléculas da parede bacteriana (como o pilis de bactérias GN) com a membrana da célula hospedeira (adesinas afimbriais). É uma ligação de difícil reversibilidade. Os tipos de adesinas são: ♦ GN: quatro tipos diferentes de adesinas fimbriais que variam o tipo de produção ♦ GP: proteína de superfície (MSCRAMM) ♦ Outros: ácido lipoteicóico e LPS. 36 2. BIOFILME (forma de adesina) Microcolônias ou agregados bacterianos envolvidos em uma película de POLISSACARÍDEOS produzida pelas bactérias e que se forma na superfície de dispositivos plásticos (sondas, cateteres e próteses) quando estão introduzidos no organismo. O biofilme defende as bactérias das células de defesa e é um mecanismo de adesão e de evasão. As bactérias crescem, há processo de maturação, digestão da matriz extracelular e liberação das bactérias, em um processo contínuo. O quorum sensing traduz bactérias com autoindutores. Conforme o crescimento bacteriano do biofilme aumenta e há maturação, um gene é “desligado” e outro gene é “ligado” para produzir fatores que virulência que propiciam a liberação das bactérias. 3. SIDERÓFOROS (metabolismo do Ferro) Estruturas que a bactéria possui para captação de ferro. No hospedeiro há ferro na hemácia, na transferrina e na lactoferrina. A bactéria tem afinidade maior com o Ferro, e o rouba das proteínas do hospedeiro. Bactéria pode fagocitar proteína + Ferro e pegar o Ferro. 4. MOBILIDADE (flagelar e não flagelar) FATORES QUE PROMOVEM A INVASÃO A invasão celular é a segunda etapa no processo infeccioso, mas pode ou não existir. Quando ocorre FAGOCITOSE NATURAL pelas células de defesa é objetivada a preservação do hospedeiro. Quando ocorre a FAGOCITOSE INDUZIDA por células epiteliais da pele e do intestino essa fagocitose é induzida pela bactéria. INVASINAS são proteínas de superfície ou estruturas que induzem a fagocitose e assim a invasão da bactéria. Pode ela ser: ♦ MACROPINOCITOSE (ondulação ou ruffles, como ocorre na Salmonella), onde bactérias aderidas à parede estimulam a célula a fazer ondulações que vão se fechar na bactéria, que fica dentro de um vacúolo. Um estímulo enzimático que altera a estrutura da membrana e faz ela ondular. Através de receptores específicos a bactéria induz rearranjo dos filamentos de actina do seu citoesqueleto, levando a ondulações que levam a célula do hospedeiro a internalizá-la dentro de um vacúolo (abrigando da resposta imune, até que a bactéria reproduza e cause lise na célula hospedeira). No caso da Shigella, por razões desconhecidas ela invade as Células M da Cripta Intestinal, migra até chegar nas células de defesa associadas (neutrófilos e macrófagos) e, por fagocitose, nestas se reproduz e destrói. Posteriormente invade o organismo via membrana basal dos enterócitos (possivelmente não haja receptores para ela no polo apical dessas células). Tanto a Listeria quanto a Shigella uma vez dentro do enterócito e livres em seu citoplasma, formam redes de actina sobre 37 elas que permite que se propulsionem de uma célula a outra como um foguete. Neutrófilos e macrófagos podem também fagocitar essas bactérias diretamente, sem que elas precisem passar pelas Células M. ♦ FAGOCITOSE INDUZIDA (ou zíper, feita pela Listeria) há uma primeira ligação e a membrana da célula vai abraçando a bactéria até incorporá-la – se liga completamente. Há bactérias incapazes de induzir fagocitose e nunca fazem invasão no hospedeiro. Toda a sua agressão ocorre na superfície celular. Alguns tipos de E. coli são assim. FATORES QUE PROMOVEM A EVASÃO DO SISTEMA IMUNE DO HOSPEDEIRO São as EVASINAS, estruturas e estratégias para contornar ou vencer células e mecanismos de defesa do hospedeiro. Pode ocorrer: ESCAPE DOS MACRÓFAGOS, por meio de evitar contato com essas células fagocíticas. Somente bactérias com cápsula fazem isso. Podem escapar dos macrófagos também acessando células menos hostis, como as epiteliais intestinais ou intestinais. A bactéria invade a célula para não ser reconhecida pelos anticorpos e fica escondida nelas, que não são agressivas. O macrófago reconhece a estrutura da parede bacteriana, NÃO DA CÁPSULA(outras células sim são capazes de reconhecer cápsula, mas não o macrófago!). Streptococcus possuem cápsula com ácido hialurônico, um componente abundante na matriz extracelular, e por isso não são reconhecidos como antígenos. SOBREVIVÊNCIA DENTRO DO MACRÓFAGO: ocorre de 3 maneiras: ♦ Escapando do fagossoma: a bactéria lisa a membrana do fagossoma e assim não haverá posterior destruição bacteriana por conta das enzimas da célula. ♦ Evitando a formação do fagolisossoma (Salmonella e Mycobacterium) e das enzimas por ele produzidas. ♦ Produzindo substâncias que anulam os efeitos defensivos celulares: como a catalase, que altera o pH e desnatura enzimas lisossômicas. A catalase destrói H2O2 em H2O e O. Essa enzima está presente nas células sanguíneas, e altera o pH no fagolisossoma, desnaturando enzimas. EVASÃO A IMUNIDADE ADQUIRIDA, por meio da PROTEÍNA A (impede a opsonização do antígeno, devido a possuir alta afinidade pela porção FC do anticorpo e se ligar a ela, impedindo ligação e reconhecimento pelos macrófagos e opsonização da bactéria. O anticorpo reconhece o antígeno pela FAB e apresenta sua porção FC para célula de defesa reconhecer e destruir o hospedeiro. A proteína A tem alta afinidade por FC e isso impede a apresentação do antígeno, visto que as células de defesa não reconhecem a FC), da VARIAÇÃO ANTIGÊNICA (varia a composição das fimbrias, mudando a antigenicidade e necessidade de um anticorpo diferente. A composição do 38 pilis é alterada durante o curso da infecção e o anticorpo para de funcionar na variação de fase do pili. Essas bactérias usam pili como adesinas, mas por poderem ter o pili alterado os mecanismos de defesa são alterados) e de DIFERENTES CEPAS DA MESMA ESPÉCIE (Streptococcus possuem proteína M, mas pode variar a composição entre elas. Cápsulas antigênicas e antígeno O (do LPS das bactérias GN, como E. coli 157). FATORES QUE CAUSAM DANOS AO HOSPEDEIRO – MECANISMOS DE AGRESSÃO As AGRESSINAS são fatores ou produtos que contribuem para a virulência da bactéria e envolvem toxinas e enzimas celulares. A bactéria busca equilíbrio com o hospedeiro, pois ter que realizar todos os mecanismos variando de hospedeiro em hospedeiro é um processo custoso. Na INVASÃO TECIDUAL há disseminação do agente infeccioso, dano tecidual e produção de ENZIMAS: hialuronidase (destrói ácido hialurônico, componente abundante na matriz extracelular, deixando-a fluida e permitindo a invasão bacteriana), colagenase (destrói colágeno, alcançando camadas mais profundas do tecido. O colágeno destruído também pode ter seus produtos internalizados como matéria-prima para a bactéria), sistema coagulase/quinase (coagula o sangue, e catabólitos da bactéria causam danos direto ao tecido hospedeiro. A Stafilococcus quinase é uma enzima extracelular que a bactéria produz porque não consegue quebrar proteína para obter aminoácidos em seu interior. Há invasão tecidual, onde as bactérias usam coagulase para estimular o coágulo a se formar em seu entorno, criando defesa contra o hospedeiro e estabilizando suas condições para crescimento. Em algum momento a quinase é produzida para que o coágulo seja destruído. O aumento da concentração de substâncias produzidas pelas bactérias indica o super crescimento populacional, e o quorum sensing muda as rotas metabólicas da bactéria para que elas se liberem e caiam na corrente sanguínea, podendo colonizar outros locais), neuraminidase e fibronolisina. São enzimas do metabolismo bacteriano, mas que agridem os tecidos quando estão no meio extracelular, gerando lise da célula hospedeira, alterações no metabolismo e alterações na resposta imune. O metabolismo bacteriano é praticamente todo extracelular – as proteínas são digeridas fora da bactéria através de proteases, onde há redução a aminoácidos ou pequenos compostos. As TOXINAS são divididas em: ♦ EXOTOXINAS: produzidas pela bactéria e secretadas ao meio, onde tem efeito. Maior parte das bactérias GP e GN produzem. Os toxóides (toxina inativada) não são antigênicos, mas estimulam imunoglobulinas (são usados para soros e vacinas por induzir resposta imune sem ter toxicidade). Causa efeito deletério ao hospedeiro. Podem adquirir capacidade de síntese por plasmídeos ou transposons. 39 ♦ ENDOTOXINAS: composto tóxico da célula bacteriana liberado quando a bactéria é lisada. Um exemplo é o LPS, e também um pouco do ácido teicóico. Se fossem altamente antigênicas (estimulantes da produção de anticorpos) elas seriam rapidamente reconhecidas devido a ser componentes estruturais e seriam facilmente eliminadas do hospedeiro. EXOTOXINAS ENDOTOXINAS Compostos produzidos e excretados pelas bactérias vivas Partes da bactéria que são liberadas quando ela morre. É parte integrante da parede celular. Bactérias GP e GN Bactérias GN predominantemente Relativamente Instáveis (são proteínas e enzimas, mudam com pH e temperatura) Relativamente estáveis (são componentes estruturais) Altamente Antigênicas (estimulam a resposta imune e podem ser neutralizadas por anticorpos) Pouco antigênicas, não é sempre neutralizada por anticorpos. Não gera febre Gera febre ao hospedeiro Genes plasmidiais (extracromossomiais) dirigem síntese (podem mudar) Genes cromossomiais dirigem síntese (geralmente não mudam) Altamente tóxicas Moderamente tóxicas As toxinas também podem ser classificadas em: TIPO I ou SUPERANTÍGENOS (LPS e TSST – Toxina da Síndrome do Choque Tóxico): proteínas que ligam-se diretamente as moléculas de MHC da superfície de macrófagos e a receptores de linfócitos T, gerando uma resposta imune exacerbada – produção de muita citocina e anticorpos policlonais – e choque. Staphylococcus produzem TSST. Em condições fisiológicas, a célula apresentadora de antígenos possui molécula de MHC de classe II em sua superfície, e essa se liga ao antígeno e o apresenta ao TCR, estimulando uma resposta imune específica envolvendo anticorpos e citocinas para destruir o agente. Nesse caso, o MHC é ligado indiferentemente ao TCR, gerando a resposta imune inespecífica e alta produção de citocinas que irão inclusive agir contra as células do hospedeiro. Um soro que se tem é a base de toxóides que se ligam as toxinas, cessando o estímulo. Exemplos: enterotoxinas estafilocócicas e toxina eritrogênica A e C. São toxinas termoestáveis, o que é importante na produção animal visto que mesmo cozidas elas resistem. TIPO II ou TOXINAS DESTRUIDORAS DE MEMBRANA: se polimeriza, agindo em membranas eucarióticas, formando poros que tiram a integridade da membrana celular e promovem extravasamento de conteúdo, levando a célula a apoptose – hemolisina e α-toxina. TIPO III ou TIPO A-B: compreende 90% das toxinas bacterianas. A toxina apresenta duas subunidades: A e B (geralmente são 1ª:5B). Subunidade A tem função tóxica para o hospedeiro. A Subunidade B protege a subunidade A e também se liga a célula e permite a sua entrada. A toxina se liga na membrana celular (pela Subunidade B) e se polimeriza na membrana, abrindo canal e permitindo a liberação da subunidade A na 40 célula. A toxina irá inibir a síntese proteica nos ribossomos, realizar extravasamento de solutos, ativar AMPc (aumentando secreção de cloro e sódio) e interferir na sinapse neuromuscular (inibindo reabsorção de acetilcolina, que continua ligada ao receptor e gera paralisia muscular – tétano, botulismo e cólera). ♦ A – B: PORÇÃO B (binding): reconhecer receptor na membrana celular levar porção A a ser internalizada proteção da toxina PORÇÃO A internalizada: interfere na síntese proteica apoptose inibe equilíbrio hidroeletrostático agindo a nível de ativar AMPc ou GMPc altera transporte de solutos apoptose 41 24 de Março de 2015 – Gabriel Martins. MICROBIOTA NORMAL
Compartilhar