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ACESSE AQUI O SEU LIVRO NA VERSÃO DIGITAL! PROFESSORA Dra. Ana Luisa Monezi Lucena Biologia Molecular e Forense https://apigame.unicesumar.edu.br/qrcode/12661 FICHA CATALOGRÁFICA C397 CENTRO UNIVERSITÁRIO DE MARINGÁ. Núcleo de Educação a Distância. LUCENA, Ana Luisa Monezi. Biologia Molecular e Forense. Ana Luisa Monezi Lucena. Maringá - PR.: Unicesumar, 2021. 224 p. ISBN: 978-65-5615-710-8 “Graduação - EaD”. 1. Forense 2. Biologia 3. Molecular. EaD. I. Título. Impresso por: Bibliotecário: João Vivaldo de Souza CRB- 9-1679 Pró Reitoria de Ensino EAD Unicesumar Diretoria de Design Educacional NEAD - Núcleo de Educação a Distância Av. Guedner, 1610, Bloco 4 - Jd. Aclimação - Cep 87050-900 | Maringá - Paraná www.unicesumar.edu.br | 0800 600 6360 PRODUÇÃO DE MATERIAIS DIREÇÃO UNICESUMAR NEAD - NÚCLEO DE EDUCAÇÃO A DISTÂNCIA Reitor Wilson de Matos Silva Vice-Reitor Wilson de Matos Silva Filho Pró-Reitor de Administração Wilson de Matos Silva Filho Pró-Reitor Executivo de EAD William Victor Kendrick de Matos Silva Pró-Reitor de Ensino de EAD Janes Fidélis Tomelin Presidente da Mantenedora Cláudio Ferdinandi Diretoria Executiva Chrystiano Mincoff, James Prestes, Tiago Stachon Diretoria de Graduação e Pós-graduação Kátia Coelho Diretoria de Cursos Híbridos Fabricio Ricardo Lazilha Diretoria de Permanência Leonardo Spaine Diretoria de Design Educacional Paula Renata dos Santos Ferreira Head de Graduação Marcia de Souza Head de Metodologias Ativas Thuinie Medeiros Vilela Daros Head de Tecnologia e Planejamento Educacional Tania C. Yoshie Fukushima Gerência de Planejamento e Design Educacional Jislaine Cristina da Silva Gerência de Tecnologia Educacional Marcio Alexandre Wecker Gerência de Produção Digital Diogo Ribeiro Garcia Gerência de Projetos Especiais Edison Rodrigo Valim Supervisora de Produção Digital Daniele Correia Coordenador de Conteúdo Sidney Edson Mella Junior Designer Educacional Vanessa Graciele Tiburcio Curadoria Gisele da Silva Porto Revisão Textual Cindy Mayumi Okamoto Luca Editoração Juliana Duenha; Lucas Pinna Silveira Lima Ilustração André Azevedo Realidade Aumentada Maicon Douglas Curriel Fotos Shutterstock. CDD - 22 ed. 574.8 Tudo isso para honrarmos a nossa missão, que é promover a educação de qualidade nas diferentes áreas do conhecimento, formando profissionais cidadãos que contribuam para o desenvolvimento de uma sociedade justa e solidária. Reitor Wilson de Matos Silva A UniCesumar celebra os seus 30 anos de história avançando a cada dia. Agora, enquanto Universidade, ampliamos a nossa autonomia e trabalhamos diariamente para que nossa educação à distância continue como uma das melhores do Brasil. Atuamos sobre quatro pilares que consolidam a visão abrangente do que é o conhecimento para nós: o intelectual, o profissional, o emocional e o espiritual. A nossa missão é a de “Promover a educação de qualidade nas diferentes áreas do conhecimento, formando profissionais cidadãos que contribuam para o desenvolvimento de uma sociedade justa e solidária”. Neste sentido, a UniCesumar tem um gênio importante para o cumprimento integral desta missão: o coletivo. São os nossos professores e equipe que produzem a cada dia uma inovação, uma transformação na forma de pensar e de aprender. É assim que fazemos juntos um novo conhecimento diariamente. São mais de 800 títulos de livros didáticos como este produzidos anualmente, com a distribuição de mais de 2 milhões de exemplares gratuitamente para nossos acadêmicos. Estamos presentes em mais de 700 polos EAD e cinco campi: Maringá, Curitiba, Londrina, Ponta Grossa e Corumbá, o que nos posiciona entre os 10 maiores grupos educacionais do país. Aprendemos e escrevemos juntos esta belíssima história da jornada do conhecimento. Mário Quintana diz que “Livros não mudam o mundo, quem muda o mundo são as pessoas. Os livros só mudam as pessoas”. Seja bem-vindo à oportunidade de fazer a sua mudança! Aqui você pode conhecer um pouco mais sobre mim, além das informações do meu currículo. Profa. Dra. Ana Luisa Monezi Lucena Meu nome é Ana Luísa e sou bióloga. Despertei o meu interesse pela área quando iniciei o Ensino Médio. Quando uma profes- sora de Biologia trazia à sala de aula materiais ilustrativos do conteúdo, eu achava fantástico. O ingresso na graduação e a participação em projetos de pesquisa me trouxeram indepen- dência, pois comecei a me organizar em relação aos estudos e à aplicabilidade financeira do pouco que ganhava com as bolsas de estudo. O mestrado e o doutorado foram ainda mais moti- vadores. A pesquisa era como uma busca de descobertas para o bem da humanidade. As oportunidades de estudo que a vida me deu têm trazido muitos privilégios. No entanto, às vezes, acredito que não dou o real valor, pois penso ser um pouco insignificante diante dos sonhos que ainda não alcancei. Por outro lado, orgulho-me, visto que aqueles que buscam chegar até aqui refletem admiração por mim. Além da profissional da educação que me tornei, tenho planos que fogem um pouco desse contexto. Adoro fazer exercícios. Se o tempo me permitir, serei uma atleta amadora de triathlon, já que eu adoro nadar, correr e andar de bicicleta. Não sou competitiva: diria que sou resisten- te. Essa resistência me apoia em muitas situações. Sou aquelas que, quando começa alguma coisa, não pára até que seja fina- lizada. Entretanto, a resistência me abandona em momentos de emoção. Sou emotiva e vivo o momento do outro, seja de tristeza, seja de alegria. Adoro conversar com os idosos. Co- munico-me com os olhos verdadeiros de um cão e me fascina aprender novas tecnologias. Sou muito eclética quanto aos gostos musicais, mas a pre- ferência é dada ao pagode e ao pop rock. Acreditava que tinha talento à área musical durante a minha adolescência, quando gravei algumas músicas com meu irmão e meu primo no es- túdio do meu tio. Acredito que a minha maior habilidade é ser professora. Às vezes, vejo-me como policial e perita. Talvez, tenha sido a maior motivação de escrever este livro, um modo de mostrar a área da biologia na investigação forense. Meu currículo: http://lattes.cnpq.br/0115131128803059 https://apigame.unicesumar.edu.br/qrcode/11724 https://apigame.unicesumar.edu.br/qrcode/9070 Quando identificar o ícone de QR-CODE, utilize o aplicativo Unicesumar Experience para ter acesso aos conteúdos on-line. O download do aplicativo está disponível nas plataformas: Google Play App Store Ao longo do livro, você será convidado(a) a refletir, questionar e transformar. Aproveite este momento. PENSANDO JUNTOS EU INDICO Enquanto estuda, você pode acessar conteúdos online que ampliaram a discussão sobre os assuntos de maneira interativa usando a tecnologia a seu favor. Sempre que encontrar esse ícone, esteja conectado à internet e inicie o aplicativo Unicesumar Experience. Aproxime seu dispositivo móvel da página indicada e veja os recursos em Realidade Aumentada. Explore as ferramentas do App para saber das possibilidades de interação de cada objeto. REALIDADE AUMENTADA Uma dose extra de conhecimento é sempre bem-vinda. Posicionando seu leitor de QRCode sobre o código, você terá acesso aos vídeos que complementam o assunto discutido PÍLULA DE APRENDIZAGEM Professores especialistas e convidados, ampliando as discussões sobre os temas. RODA DE CONVERSA EXPLORANDO IDEIAS Com este elemento, você terá a oportunidade de explorar termos e palavras-chave do assunto discutido, de forma mais objetiva. https://apigame.unicesumar.edu.br/qrcode/3881 BIOLOGIA MOLECULAR E FORENSE A biologia molecular, área de extensão da biologia, aproxima você do entendimento específico das ações feitas pelo detentor da informação genética, o DNA, e das estratégias usadas para manipular essa e outras moléculas biológicas. Você já pensou na importância do papel do estudo da biologia molecular para o seu aprimoramento profissional, futuro(a)profissional de saúde? Qual seria a aplicabilidade desse estudo para sua carreira? Com certeza, você já se deparou com casos envolvendo a aplicabilidade dos conhecimentos da biologia molecular e não refletiu sobre o fato. O que acha de começar agora? Imagine um caso em que uma mulher, a Maria, teve um relacionamento com João. Desse relacionamento, nasceu José, que, aos três anos de idade, começou a apresentar alguns sintomas preocupantes e que dificulta- va o dia a dia dele: ao respirar, apresentava cansaço constante. Foi detectado que ele tinha uma doença genética grave que demandava cuidados diários da mãe e transfusões sanguíneas a cada 20 dias. No entanto, há três semanas, Maria adoeceu e estava com dificuldades de cuidar de José. Sem notícias de João por, pelo menos, 10 anos, Maria foi em busca do paradeiro dele. Com a ajuda de algumas pessoas, Maria entrou em contato com João, que não aceitou a ideia de ser o pai de José. Em busca da justiça, Maria foi aconselhada a levar o filho para fazer alguns exames que ajudassem a comprovar a paternidade de José. Certamente, você já deve ter ouvido alguém falar sobre o teste de paternidade. Você sabia que exames de DNA envolvem a compreensão dos estudos da biologia molecular? Sabia que as meto- dologias utilizadas para fazer testes como esse provêm dos estudos desta disciplina? Por que seria importante o entendimento dos conceitos desta disciplina? Apesar de os testes de paternidade utilizando o DNA começarem a ser divulgados no Brasil apenas no final do século XX, principalmente a partir de programas populares de televisão que o ofereciam a camadas sociais de baixa renda, o exame já era utilizado no meio científico desde meados do século passado. A popularização do teste de DNA resultou no aumento da demanda do exame. A utilização do teste de DNA constitui uma forma de provar, por intermédio de métodos confiá- veis, a legitimidade do parentesco entre pessoas. A utilização dele é importante como um meio de produção de prova no processo civil, especificamente em relação ao Direito de Família. Além disso, esse tipo de exame, para ser validado, precisa ser feito por laboratórios autorizados e assinado por profissional especializado, que tem competência e respaldo legal para a realização. A prática é a melhor maneira de compreender os conceitos de um tema. Dessa forma, para melhor entendimento da biologia molecular, pesquise em sites confiáveis e em artigos científicos, dados a respeito da busca da paternidade a partir do exame de DNA no Brasil: será que temos uma faixa etária determinante dos pais que procuram pela confirmação da paternidade? Existe uma predo- minância dessa busca em relação a alguma classe social específica? Como pode ser comprovada a confiabilidade dessa técnica? Em casos de supostos pais não encontrados ou que tenham falecido, como pode ser procedido o processo de reconhecimento? Agora que você colocou a “mão na massa”, quais foram os resultados de sua pesquisa? Será que a técnica é 100% confiável? Quais foram as suas conclusões? Em relação à situação hipotética apresentada inicialmente, comprovar a paternidade da criança poderia contribuir como um modo de investigação da doença de José. Pense no quanto é importante a sua atuação profissional na vida de José e de tantos outros. Para iniciar a nossa narrativa sobre a biologia molecular e forense, realizaremos uma revi- são geral sobre a estrutura e as bases das informações moleculares. Também exporemos o controle de qualidade necessário em laboratórios de biologia molecular. Posteriormente, serão apresentadas as tecnologias de estudo dos ácidos nucleicos e das proteínas responsáveis pela manutenção do material genético e/ou atividades celulares, sendo elas: identificação, manipu- lação, amplificação e análise dos funcionamentos utilizados hoje. Além disso, serão explicadas as combinações das técnicas com a biotecnologia de DNA recombinantes para produção de produtos comerciais na área da saúde. Para finalizar, você aplicará todos os conhecimentos aprendidos sobre a biologia molecular no uso da chamada “ciências forenses”. São muitas curiosidades! Você não vai perder, né? Antes que eu me esqueça, mais um spoiler para você: ao longo de cada unidade de aprendizagem, há podcasts interessantes e que complementam o conteúdo de cada ciclo, ao trazerem curiosidades envolventes. Depois de finalizar esta disciplina, você perceberá que são muitas as esferas em que poderá atuar. Quem sabe em um laboratório onde você seja responsável por fazer exames e interpretar os resultados de análises clínicas? Em um laboratório que tenha a ação de diagnosticar doenças? Fazer análises bromatológicas para verificar contaminações em alimentos? Pesquisar e desen- volver produtos obtidos por biotecnologias, tais como medicamentos e vacinas? Você poderá, ainda, elucidar crimes por meio da análise de vestígios na Polícia Federal ou Civil. Mergulhe nesta jornada e não perca tempo! E você? O que espera com este estudo? Já pensou a respeito de qual área você mais gosta e como poderá aplicar todo o conhecimento? Convido você a mergulhar nesta busca. Venha conhecer uma das fascinantes áreas da biologia, a biologia molecular e forense. 3 1 2 4 5 6 APRENDIZAGEM CAMINHOS DE 11 53 37 81 REVISÃO GERAL DA ESTRUTURA E DAS BASES DAS INFORMAÇÕES MOLECULARES 125 MARCADORES MOLECULARES QUE DETERMINAM E ANALISAM O DNA E AS APLICAÇÕES DELE NA PESQUISA NA ÁREA BIOMÉDICA FERRAMENTAS DE MANIPULAÇÃO DO MATERIAL GENÉTICO CONTROLE DE QUALIDADE EM LABORATÓRIOS DE BIOLOGIA MOLECULAR REAÇÃO EM CADEIA DA POLIMERASE E SUAS APLICAÇÕES MÉTODOS DE SEQUENCIAMENTO DE DNA 103 7 8 9 149 167 A BIOINFORMÁTICA APLICADA AOS ESTUDOS DA PESQUISA E AO DIAGNÓSTICO MOLECULAR BIOTECNOLOGIAS PARA A PRODUÇÃO DE VACINAS, FÁRMACOS, TESTES GENÉTICOS E TERAPIA GÊNICA 185 BIOLOGIA FORENSE E AS APLICABILIDADES NA ÁREA DA SAÚDE 1 Nesta unidade, você relembrará a composição, a estrutura e a fun- ção do DNA (ácido desoxirribonucleico). Também compreenderá como as informações moleculares do DNA são passadas entre as gerações e transformadas em características extremamente com- pletas e diversas. Por fim, conhecerá os ajudantes do DNA nessa jornada, incluindo as enzimas e as proteínas de ação. Revisão geral da estrutura e das bases das informações moleculares Dra. Ana Luisa Monezi Lucena 12 UNICESUMAR Nós já sabemos que somos gerados por células reprodutoras: espermatozoide e óvulo. Todavia, você já pensou naquilo que essas células contêm e que nos tornam tão completos? Temos, por exemplo, órgãos sexuais que nos diferenciam em relação às aparências e às funções reprodutoras. Temos um cérebro que capta e emite informações e ideias. Também há um corpo que nos permite efetuar as nossas vontades. Talvez, a sua resposta seria o DNA. Contudo, você já imaginou como células tão pequenas e únicas, como as reprodutoras, armazenam as informações do DNA e são capazes de desenvolver estruturas e habilidades corporais tão complexas? Em que aspecto diferencia o DNA de cada um de nós, visto que somos tão diversos e, ao mesmo tempo, iguais em outros aspectos? Nós compreenderemos, primeiramente, a jornada das etapas que ocorrem no interior das células reprodutoras dos pais, com o intuito de entendermos como a molécula de DNA que é proveniente deles emite informações que a desenvolvem. Você compreenderá que existem diferenças na expressão do DNA. Por exemplo, pense em um irmão: como ele é diferente do outro irmão, se o DNA é proveniente dos mesmos pais? Essas e outras respostas você recordará e responderá nesta unidade. Entender que a informação necessária para nos formar é proveniente dos conhecimentos relativos à composição, à estrutura e à função da molécula de DNA, é reconhecer que as células iniciais carre- gam essas informações. Os gametas passam por etapas ordenadas de eventos, pois, logo após a união das células gaméticas masculinas e femininas,há a formação de uma nova e única célula a qual está condicionada ao desenvolvimento de inúmeras células por divisões sucessivas, formando os tecidos e os órgãos do corpo. Todos os comandos para efetuar essas ações são dados pelas informações contidas no DNA, os genes, que são multiplicados a cada nova célula que se forma. Esses genes são regulados de modo a estimular ou a inibir a ação de acordo com a localização corporal e as vias biológicas existentes. Na ambientação dessas etapas que chegam a traduzir a informação genética contida no DNA, podem ocorrer raras alterações que refletem em variações no funcionamento ou em características do corpo. Alguns exemplos incluem o nascimento de: • Um diabético, o qual não produz insulina. • Uma criança com fissura labial. • Um indivíduo albino. • Um sujeito com problemas no fígado. Dessa forma, há diversas razões para que os profissionais da saúde compreendam o magnetismo que abrange a molécula de DNA, uma vez que ele fornece a base para a compreensão dos fundamentos biológicos que levam a formação do indivíduo. Isso gera, consequentemente, o melhor entendimento do processo de doenças, o qual, em alguns casos, pode promover a prevenção e encontrar tratamentos. Em meio à compreensão das particularidades da molécula de DNA, muitas pesquisas surgiram para tentar entender as doenças e impedir o progresso delas. Para algumas situações, foram desen- volvidos fármacos. Para outras, foram feitas vacinas e técnicas laboratoriais, tais como a radioterapia e a quimioterapia. Diante disso, pesquise em bancos de dados confiáveis três descobertas feitas pela biologia molecular para a criação de soluções, ações, tratamento e prevenção de doenças, o que se deu 13 UNIDADE 1 a partir do conhecimento da composição, da estrutura e do funcionamento do DNA. Verifique quais foram os procedimentos adotados nas descobertas dos pesquisadores. Os avanços científicos da biologia molecular se perpetuam seguramente desde os anos 50, após determinação da estrutura da DNA por James Watson e Francis Crick. A partir disso, progressos grandiosos aconteceram nessa área. Diante do exposto, você concorda que há melhorias trazidas com o estudo da molécula de DNA? Por que a variação dos genes da molécula de DNA pode modificar a funcionalidade e as características do nosso corpo? Você reconhece que entender as particularidades da estrutura da molécula de DNA foi o primeiro passo para diversas ações? Quais são os outros procedimentos que deveriam ser adotados para con- cretizar as ações benéficas destinadas ao tratamento de doenças? Já sabemos que nascemos a partir do encontro de duas células reprodutoras e que elas são os veículos de transporte das nossas características genéticas, armazenadas em forma de DNA. Agora, pensemos microscopicamente no DNA no interior dessas células. Considere que, dentro do espermatozoide de seu pai e no óvulo de sua mãe, há uma estrutura chamada “núcleo”, que será o local de endereço do DNA. Quando ocorre a junção das células gaméticas, os DNAs de ambas as células se encontram para gerar o seu próprio DNA, que te acompanhará ao longo da vida. Entre 1952 e 1953, os pesquisadores James Watson e Francis Crick decifraram a estrutura da molécula de DNA contida no interior das nossas células. A partir de então, deu-se como marco o nascimento da biologia molecular, ao decifrar e ao desvendar as habilidades e as competências do carregador das informações genéticas. De acordo com os pesquisadores, a estrutura do DNA seria uma dupla fita DIÁRIO DE BORDO 14 UNICESUMAR disposta na forma de uma hélice. Essa conclusão foi conseguida com base na análise de padrões de um raio X realizado por duas pesquisadoras, Rosalind Franklin e Maurice Wilkins, além da contribuição de Erwin Chargaff no que diz respeito à análise dos constituintes dessas fitas (LODISH et al., 2014). Se fôssemos retirar o DNA do interior do núcleo da célula gerada após a fecundação dos gametas, observaríamos, com a utilização da técnica de difração de raio X (determina a estrutura atômica tri- dimensional de uma molécula), a molécula de DNA na forma de duas fitas enroladas em hélice, assim como pode ser observado na Figura 1. Você também perceberia que cada uma dessas fitas é constituída por várias unidades específicas chamadas “nucleotídeos” e que se diferenciam em quatro tipos. Eles se associam para constituir as duas fitas de polinucleotídeos. Os nucleotídeos podem ser comparados a tijolos para construir a fita de DNA, enquanto o cimento seria representado pelas ligações entre um nucleotídeo e outro, as quais são chamadas de “fosfodiéster”. É importante ressaltar que é apenas nas células eucariontes que o DNA está no interior do núcleo. Essas células carregam outros diferenciais, como a presença de organelas. Observe, a seguir, na Realidade Aumentada, a representação de uma célula eucarionte com núcleo e organelas. Veja a animação a seguir, a qual mostra como é a estrutura do DNA. Para acessar, use seu leitor de QR Code. REALIDADE AUMENTADA Citoplasma de uma célula eucarionte https://apigame.unicesumar.edu.br/qrcode/9071 15 UNIDADE 1 A B C D Descrição da Imagem: figura evidencia, em (A), os nucleotídeos, que são compostos por um açúcar-fosfato ligado covalentemente a uma base guanina (G), formando um nucleotídeo. Em (B), é representada parte da fita 5´- 3´ de DNA, com as bases G ligadas à C, que está vinculada à A, que está ligada à T. Em (C), mostra-se a fita dupla de DNA completa de forma filamentar. Nela, as bases nitrogenadas estão associadas por ligações de hidrogênio. G faz três ligações de hidrogênio com C, enquanto T faz duas ligações de hidrogênio com A. No total, a dupla fica representada com 10 pares de bases de cada lado. Na imagem (D), a molécula de DNA está representada em forma de hélice, com as mesmas 10 bases mostradas em C. Figura 1 - Representação da composição do DNA / Fonte: Alberts et al. (2017, p. 173). 16 UNICESUMAR O diferencial dos nucleotídeos está nos elementos constituintes. Cada um é composto por uma base nitrogenada, um grupo fosfato e um carboidrato (do tipo desoxirribose, constituído por seis átomos de carbono, sendo que um deles apresenta um hidrogênio na posição 2). A principal distinção está nas bases nitrogenadas, que são de quatro tipos: Adenina (A), Guanina (G), Citosina (C) e a Timina (T). As duas primeiras são quimicamente constituídas por dois anéis e chamadas de “bases purinas”, enquanto as duas últimas apresentam apenas um anel e são designadas como “bases pirimidinas” (Figura 2). Em cada nucleotídeo, uma das quatro bases diferentes estará ligada ao carbono 1 do carboidrato, en- quanto o grupo fosfato estará no carbono 5 (Figura 3). TIMINA ADENINA GUANINA CITOSINA Descrição da Imagem: a figura mostra as quatro bases nitrogenadas usualmente encontradas no DNA. As purinas A (adenina) e G (guanina) são representadas com a constituição de dois anéis. As pirimídicas C (citocina) e T (timina) carregam apenas um anel. Também é demonstrada a complementaridade (A - T e C - G). Figura 2 - Bases nitrogenadas usualmente encontradas no DNA 17 UNIDADE 1 O importante é imaginar as duas fitas de DNA construídas por nucleotídeos e ligadas entre si por meio de ligações fosfodiéster. As ligações entre os nucleotídeos da fita acontecem entre o carbono 3 do carboidrato (desoxirribose) e o grupo fosfato do outro nucleotídeo, localizado no carbono 5. Dessa maneira, duas fitas ficam dispostas de forma antiparalela, identificadas como 5´- 3´ou 3´- 5´, de acordo com as extremidades que ficam livres, ou seja, sem ligação química no início ou no final de cada fita (Figura 4) (ALBERTS et al., 2017). CITOSINA ÁCIDO FOSFÓRICO BASE FOSFATO AÇÚCAR DESOXIRRIBOSE AÇÚCAR E FOSFATO VOLTADO AO LADO DE FORA NUCLEOTÍDEO Descrição da Imagem: a figura mostra a estrutura do nucleotídeo. Indicados por setas, estão o ácido fosfórico, a base (exemplificada como a citosina) e o carboidrato desoxirribose.A união desses componentes é observada na parte inferior, visto que o carboidrato, localizado no centro, associa, na posição 5, o ácido fosfórico e, na posição 1, a base nitrogenada (não mostrando os números 1 e 5 das posições do carbono). Figura 3 - Nucleotídeo de DNA 18 UNICESUMAR Para finalizarmos a construção da fita de DNA, é preciso ligar as duas fitas e realizar uma torção voltada ao lado direito, a fim de formar a hélice observada na Figura 1. Para isso, é preciso ligar as fitas entre si. Nesse caso, as bases dos nucleotídeos de cada uma das fitas se associam por intermédio de uma ligação denominada “ligação de hidrogênio”. No entanto, a combinação delas entre as fitas é específica: a adenina sempre se pareia com a timina, enquanto a guanina sempre se pareia com a citosina (ALBERTS et al., 2017). NUCLEOTÍDEO NUCLEOSÍDEO PENTOSE RESÍDUO DE ÁCIDO FOSFATO L LIGAÇÃO DE HIDROGÊNIO BASE NITROGENADA Descrição da Imagem: na figura, é mostrada uma dupla fita de DNA antiparalela. Assim, do lado esquerdo, há a fita 5´- 3´, enquanto, do lado direito, há a fita 3´- 5´. A união das fitas antiparalelas é observada a partir da associação complementar das bases nitrogenadas de cada nucleotídeo na parte central (A-T e C-G). Figura 4 - Dupla fita de DNA antiparalela Você já se perguntou: qual é o tamanho do DNA em nossas células? 19 UNIDADE 1 Segundo Naoum (2010), em cada célula do organismo, o filamento estendido de DNA chega a ter cerca de dois metros. Nesse sentido, se pensarmos que, em nosso corpo, há cerca de 10 trilhões de células, teríamos uma ideia da enormidade de DNA que temos. Você seria nada mais que um proprietário de 20 milhões de quilômetros de DNA. Já entendemos como é a constituição e a forma do DNA que está no interior das células. Agora, é preciso compreender como essa molécula expressa as características comentadas no início da unidade. O principal aspecto é a leitura das sequências de nucleotídeos da fita de DNA, o que servirá de código para determinar cada característica. Essas sequências são chamadas de genes e carregam as instruções para a produção de proteínas. Pode surgir a seguinte dúvida: qual é a relação entre as proteínas e as características? As proteínas representam as macromoléculas biológicas mais abundantes no corpo, ocorrendo em todas as célu- las e em todas as partes dela. Estruturalmente e metabolicamente, elas te acompanham e efetuam o funcionamento eficaz do seu corpo. Por exemplo, a insulina é uma proteína responsável por regular a taxa de glicose no sangue. No fígado, há uma variedade de enzimas e hormônios, que são proteínas que participam de várias funções específicas, tais como a conversão de gorduras, carboidratos e de proteínas em nutrientes e em energia (NELSON; COX, 2014). Agora, você entenderá como o DNA exerce ações para expressar a informação genética em forma de proteínas. Após a descoberta da estrutura do DNA, revelou-se que ele era capaz de formar uma molécula intermediária, o RNA (ácido ribonucleico). Também foi descoberto que, a partir dela, ocorria a tradução das informações contidas no DNA em aminoácidos, formando as proteínas. Acontecimentos como esses marcaram a biologia molecular, consagrando como o dogma central da biologia molecular (Figura 5) (ALBERTS et al., 2017). 20 UNICESUMAR O dogma central corresponde aos passos que o DNA procede, a fim de transmitir a informação final, que é a produção de RNAs e proteínas. No entanto, para que esses eventos aconteçam, é preciso entender como é o RNA, em que local ele é encontrado e quais são os ajudantes do DNA para efetuar essas ações. A molécula de RNA, assim como o DNA, é denominada “ácidos nucleicos”. Ambos são encontrados no núcleo da célula formada após a fecundação dos gametas e em todas as células que surgirem por multiplica- ções sucessivas. Contudo, além de ser encontrado no núcleo, o RNA está no citoplasma das células, local que intermedeia o núcleo e processa a formação das proteínas mediante as instruções trazidas pelos RNAs. Faço uso do plural (os RNAs), porque, para desencadear essa ação, são formados três tipos principais de RNAs: o RNAm (RNA mensageiro), o RNAt (RNA transportador) e o RNAr (RNA ribossômico) (ALBERTS et al., 2017). DNA DNA RNA PROTEÍNA Aminoácidos Síntese de DNA REPLICAÇÃO Nucleotídeos Síntese de RNA TRANSCRIÇÃO Síntese de proteína TRADUÇÃO Descrição da Imagem: trata-se de um esquema que representa o dogma central da biologia molecular. Assim, são expressos o pro- cesso de replicação da molécula de DNA, a transcrição, em que o DNA forma o RNA, e a tradução, momento em que o RNA expressa a informação genética e forma a proteína com os aminoácidos. Figura 5 - Dogma central da biologia molecular / Fonte: Alberts et al. (2017, p. 3). 21 UNIDADE 1 Estruturalmente, o RNA, na forma primária, assemelha-se ao DNA, com duas diferenças: o carboi- drato que compõe o RNA, a ribose, tem um grupo hidroxila na posição 2, e a base dos nucleotídeos de timina do DNA é substituída pela uracila (U). Quanto à forma, a maioria dos RNAs celulares é de fita simples e exibe uma variedade de conformações (LODISH et al., 2014). Ácido Desoxirribonucleico Ácido Ribonucleico Fita dupla- açúcar fosfato desoxirribose Pares de bases Nucleobases Bases únicas Fita única- açúcar, fosfato ribose Timina Citosina Adenina UracilaGuanine Descrição da Imagem: na figura, o RNA apresenta uma fita simples e o DNA contém uma fita dupla. Paralelo a cada ácido nucleico, no DNA, o carboidrato contém um átomo de hidrogênio (H) no carbono 2, enquanto, no RNA, é mostrado o grupo hidroxila (OH) na mesma posição. Na parte inferior da imagem, estão as bases nitrogenadas comuns entre colchetes (C, G, A). Já as específicas estão isoladas: timina do DNA e uracila- do RNA. Figura 6 - Diferenças entre as moléculas de DNA e RNA 22 UNICESUMAR Voltando à célula-ovo que se formou depois da fecundação dos gametas, imagine o DNA no interior e como se prossegue a transmissão da informação genética. A princípio, é necessário que se formem os RNAs, processo chamado de “transcrição”, uma vez que transcreve parte das informações que estão no DNA para o RNA. Você se lembra que as sequências de nucleotídeos seriam códigos denominados “genes” e corresponderiam a uma característica? Desse modo, cada gene será uma unidade do DNA que conterá as informações, com o intuito de sintetizar um dos RNAs funcionais. As cópias de RNAs são os codificadores de proteínas, mais precisamente o RNAm (LODISH et al., 2014). Durante a transcrição, uma sequência de nucleotídeos de uma das fitas de DNA servirá como modelo para formar o RNA. A sequência específica da linguagem das quatro bases dos nucleotídeos do DNA é copiada na linguagem das quatro bases do RNA, modificando a timina por uracila. No entanto, você pode estar se perguntando: em que local esses nucleotídeos estão para formar o RNA? Eles estão dispersos no núcleo celular e são capturados por uma enzima específica, responsável por fazer a transcrição: o RNA polimerase (ALBERTS et al., 2017). Observe a Figura 7: para realizar a transcrição, o RNA polimerase reconhece, no DNA, um sítio de ligação específico, chamado de “promotor”. Em seguida, inicia-se a separação das fitas. O RNA polime- rase pareia os nucleotídeos complementares ao DNA, de modo que a associação e a construção da fita de RNA seguem o que está descrito no DNA, mais precisamente, na fita 3´- 5´ do DNA. O pareamento ocorrerá de modo que, quando houver um nucleotídeo de base A (adenina), o RNA polimerase ligará uma U (uracila). Quando for T (timina), ligará A (adenina) e, quando for G (guanina), ligará C (citosina). As combinações seguem até finalizar o gene correspondente ao RNA. Além disso, o RNA polimerase realizará as ligações fosfodiéster entre os nucleotídeos do RNA formador e, depois, reconhecerá um local de parada em que o RNA recém-formado, de fita simples 5´- 3´, dissociará do DNA e liberará o RNA polimerase(LODISH et al., 2014). 23 UNIDADE 1 INICIAÇÃO 1 A polimerase liga-se à sequencia promotora no dúplex de DNA. "Complexo fechado" 2 3 A polimerase dissocia o dúplex de DNA próximo ao sítio de início da transcrição, formando uma bolha de transcrição. "Complexo aberto" A polimerase catalisa a ligação fosfodiéster de dois rNTPs iniciais. 4 5 ALONGAMENTO A polimerase avança na direção 3' ->5' da �ta-molde, dissociando o dúplex de DNA e adicionando rNTPs ao RNA crescente. TERMINAÇÃO No sítio de parada da transcrição, a polimerase libera o RNA completo e dissocia-se do DNA. RNA-polimerase Sítio de início na �ta-molde Sítio de parada na �ta-molde Promotor Bolha de transcrição RNA nascente Região híbrida de DNA-RNA Fita de RNA completa 5' 3' 5' 3' 5' 3' 5' 3' 5' 3' 5' 3' 5' 3' 5' 3' 5' 3' 5' 3' 5' 5' 3' Descrição da Imagem: trata-se de um esquema que mostra o processo de transcrição. Nele, o RNA polimerase, representado pela cor amarela, adiciona os nucleotídeos que são complementares ao DNA, formando a fita de RNAm em progresso. Além disso, é mostrado o processo de transcrição em três etapas. Iniciação: acontece no reconhecimento do sítio promotor pelo RNA polimerase e na adição dos primeiros ribonucleotídeos. Alongamento: crescimento da fita de RNA. Terminação: ocorre quando o RNA polimerase identifica o sítio de parada da transcrição, dissociando-se e completando a formação do RNA. Figura 7 - Processo de transcrição / Fonte: Lodish et al. (2014, p. 126). 24 UNICESUMAR Já sabemos que o processo de transcrição forma diferentes tipos de RNA. Três deles são os principais participantes da expressão da informação genética do DNA. O RNAm codifica as informações do gene que dirigirá a síntese de uma proteína, o RNAr forma o núcleo estrutural e o catalítico dos ribossomos que traduz os RNAm em proteínas, enquanto os RNAt atuam como adaptadores que selecionam os aminoácidos específicos e os posiciona adequadamente sobre os ribossomos, com o objetivo de que eles sejam incorporados em uma proteína (ALBERTS et al., 2017). Partindo do imaginário do interior da célula, você sabe que, no núcleo, há a transcrição do DNA para RNA. Neste momento, acredito que você pen- se que o RNA já está pronto para traduzir a informação do DNA e produzir a tão esperada característica na forma de proteínas. Pelo contrário, esses RNAs ainda passarão por modificações, fato que foi reconhecido porque pesquisadores compararam as sequências de nucleotídeos do RNAm com o do DNA utili- zado como modelo. Eles admiraram que as sequências de nucleotídeos que estabeleciam os aminoácidos da proteína do RNA não correspondiam às sequências do DNA codificador (LODISH et al., 2014). Dessa maneira, é preciso compreender mais uma etapa antes de finalizar a expressão das informações do DNA. As sequências não encontradas no RNAm pelos pesquisadores foram chamadas de “introns”. Eles detectaram que essas sequên- cias eram removidas, ficando apenas as sequências codificadoras, chamadas de “éxons”. Coincidentemente, elas correspondiam aos nucleotídeos, que conferem os aminoácidos da proteína compa- rada ao RNA analisado. A partir dessa modificação, observaram mais duas alterações: uma na extremidade 5 ' do RNAm, em que é adicionado um grupo 7- metilguanilato, denominado cap 5´, o qual, funcionalmente, está envolvido na proteção do RNAm da degradação enzimática e auxilia na exporta- ção ao citoplasma. A segunda alteração está na extremi- dade 3 ', na qual se adiciona uma fita de resíduos de ácido adenílico em torno de 100 a 250 bases (A) pela enzima poli (A) polimerase (LODISH et al., 2014). 25 UNIDADE 1 As modificações ocorridas com a transcrição foram somente para o RNAm, visto que há mais detalhes. No entanto, é sabido que ocorrem outros modos de processamento em RNAt e RNAr, os quais não são muito relatados em livros. Para finalizar a expressão da informação do DNA, você compreenderá como uma sequência de nucleotídeos do RNA formará os aminoácidos de uma proteína, processo chamado de “tradução”. Considerando a célula-ovo formada no começo da nossa discussão, podemos afirmar que o processo de tradução, no início do desenvolvimento, é bem frequente, uma vez que é necessário produzir uma grande quantidade de proteínas e enzimas que influenciam no crescimento do indivíduo. Desse modo, é importante entender que a transcrição de um gene e a consequente tradução só ocorrerão se for preciso. CITOPLASMA Núcleo DNA Íntrons Éxons Unidade de transcrição "Transcrito primário de RNA" TRANSCRIÇÃO CAPEAMENTO 5' SPLICING DO RNA POLIADENILAÇÃO 3' PROCESSAMENTO DO RNA Quepe do RNA mRNA AAAA 5' 3' EXPORTAÇÃO AAAAmRNA TRADUÇÃO Proteína Descrição da Imagem: na figura, é exposto, no interior do núcleo, o DNA com os éxons e os introns. Em seguida, o RNAm transcrito, em conjunto com os éxons e os introns, passa pelo processo de modificação, em que são retirados os introns e feita a junção dos éxons. Ao mesmo tempo, são modificadas as extremidades 5 ́, com a introdução da CAP5 ́, e a 3´, com a introdução das poliadeninas. Figura 8 - Mecanismos de modificação do RNAm / Fonte: Alberts et al. (2017, p. 238). 26 UNICESUMAR A tradução em células eucariontes, como a célula-ovo, ocorre no interior do citoplasma. Assim, após a transcrição e o processamento dos RNAs, eles passam pelo poro nuclear e chegam até o citoplasma para iniciar a tradução. Esse processo inclui a participação dos três RNAs (ALBERTS et al., 2017). O RNAm terá a sequência dos nucleotídeos de um gene específico do DNA, a fim de produzir a proteína. Uma proteína será formada a partir da combinação de até 20 tipos diferentes de aminoácidos. Talvez, possa surgir a seguinte dúvida: qual é a relação entre os nucleotídeos e os aminoácidos? Depois de vários experimentos, foi detectado que a sequência de cada três nucleotídeos do RNAm, também chamada de “códons”, corresponderia a um aminoácido. Os vários tripletes que podem ser formados na combinação dos quatro tipos de nucleotídeos do RNAm foram determinados como “código genético”. Dos 64 códons possíveis no código genético, 61 especificam aminoácidos individuais, sendo três desses códigos de finalização. Como temos apenas 20 tipos de aminoácidos, consideramos que existem mais códons que especificam um mesmo aminoácido. Se você observar a Figura 9, perceberá que apenas dois, a metionina (met) e o triptofano (trp), têm um único códon (LODISH et al., 2014). SEQUENCIA DOS CÓDIGOS DE AMINOÁCIDOS Segunda letra Pr im ei ra L et ra Terceira letra Parada Parada Parada Descrição da Imagem: a figura mostra os 64 códons possíveis. Assim, podem ser observados vários códons que identificam o mesmo aminoácido. Um exemplo é a Arg (arginina), que pode ter até seis codons que identificam ela (CGU, CGC, CGA, CGG, AGA e AGG), além dos códons de iniciação met (metionina) AUG e dos códons de finalização (UAA, UAG, UGA). Figura 9 - Código genético 27 UNIDADE 1 Para que ocorra a tradução, é necessário fazer a leitura de três em três nucleotídeos do RNAm. Contu- do, o primeiro código a ser lido enquanto início da construção da expressão gênica é o triplete AUG, independentemente se tiverem outros que não sejam eles. O códon AUG especifica o aminoácido metionina e quem levará esse aminoácido até o RNAm será o RNAt. O RNAt apresenta uma confir- mação que permite associar exatamente com o códon do RNAm, pois a estrutura dele apresenta duas extremidades, uma que se complementa ao códon, denominada “anticódon”, e outra que carrega o aminoácido específico ao códon que se associará (ALBERTS et al., 2017). Os aminoácidos são encontrados livres no citoplasma. Para que eles façam parte da proteína, eles precisam ser carregados pelo RNAt até o mensageiro. Todavia, para que o aminoácido seja associa- do ao RNAt, é necessária a presença de uma enzima denominada “aminoacil-tRNA- sintetase”. Ela é específica para cada aminoácido ligado ao RNAt,ou seja, há 20 tipos dessa enzima. Depois de ativados, os RNAt estão prontos para estabelecer contato com o RNAm. Entretanto, ainda temos um colaborador imprescindível para isso, o RNAr. Ele permite que a polimerização dos aminoácidos seja eficiente e rápida à medida que os códons são lidos pelos RNAt sucessivos (LODISH et al., 2014). Dos três RNAs participantes da tradução, o RNAr é aquele que inicia a síntese. Composto por de- zenas de proteínas e várias moléculas de RNA está estruturalmente modelado por duas unidades, uma menor e outra maior. A função dele é ajudar o RNAt a identificar o código de iniciação e deslizar sobre o RNAm, fazendo a leitura dos sucessivos códons e, consequentemente, a ligação dos aminoácidos trazidos por cada RNAt (ALBERTS et al., 2017). Para ordenar a síntese, o RNAr distribui os papéis às subunidades. No início do processo, as subu- nidades estão separadas: a menor será a responsável por capturar o RNAt com o aminoácido iniciador (metionina) e colocá-lo em um local específico, chamado de “sítio P”. Posteriormente, essa subunidade (menor) se liga à extremidade 5’ de um RNAm e se move para frente junto ao RNAt até identificar o primeiro códon AUG. Após identificá-lo, libera outros dois locais na estrutura, os chamados “sítio A” e “sítio E”, paralelos à P. O sítio A é o local de contato com o próximo RNAt correspondente ao códon de leitura do mensageiro. No entanto, antes de ligar, o próximo RNAt da subunidade maior do ribossomo se associa à menor e completa a estrutura dele (ALBERTS et al., 2017). O código genético, por muito tempo, foi considerado universal, ou seja, os códons seriam iguais para qualquer organismo vivo. Diante da leitura de que cada três nucleotídeos do RNAm correspondem a um aminoácido, os códons não mudariam entre as espécies. No entanto, em algumas espécies de fungos e protozoários, foram encontradas variações. Outras alterações também foram observadas no RNAm de mitocôndrias, mas foram consideradas mínimas, se comparadas ao código todo. Fonte: adaptado de Lodish et al. (2014). 28 UNICESUMAR O mecanismo da tradução, que, na nossa discussão, inicia-se pela primeira vez na célula-ovo, passa por um ciclo de quatro etapas, o qual é repetido até encontrar um dos códons finalizadores (UAA, UAG, UGA) (Figura 9). A primeira etapa inicia após a montagem completa do ribossomo mais a ligação do primeiro RNAt no sítio P. Dessa forma, seguirá com a entrada do próximo RNAt, que carrega o aminoácido correspondente ao códon do RNAm, o qual se associa ao sítio A. Esse aminoácido fará parte da cadeia da proteína a ser formada (AL- BERTS et al., 2017). A segunda etapa é marcada pela ligação entre os aminoácidos, a qual é catalisada na subunidade maior do RNAr. Os primeiros aminoácidos a se associar serão aqueles acoplados ao RNAt locali- zado no sítio A com o aminoácido metionina do RNAt iniciador. Desse modo, o RNAt do sítio A ficará com dois aminoácidos e o do sítio P ficará vazio. Já a terceira etapa consiste no deslizamen- to da subunidade maior do RNAr. Nesse sentido, ocorre a troca das localizações dos RNAts: aquele que estava no sítio A vai para o P e o que estava no sítio P vai para o E. Na quarta etapa, a subunidade menor do ribos- somo acompanha a maior, move-se e faz a leitura de mais três nucleotídeos, agora, localizados no sítio A. Por conseguinte, reinicia-se todo o ciclo de ligação. Mais um RNAt se combina com o aminoá- cido específico, faz a ligação com os aminoácidos do RNAt presentes no sítio P e, por consequência, ocorre mais um movimento do RNAr, liberando o RNAt vazio localizado no sítio E ao citoplasma da célula (Figura 10) (ALBERTS et al., 2017). H2N Segmento terminal do mRNA 5' 3' H2N 5' LIGAÇÃO DO FATOR DE LIBERAÇÃO AO SÍTIO A 3' Liberação da cadeia polipeptídica H2O COOH TERMINAÇÃO NH2 5' 3' 5' 3' DISSOCIAÇÃO DO RIBOSSOMO E A E UAG UAG A UAG UAG Descrição da Imagem: a figura mostra o momento em que o RNAt com a metionina se liga à subunidade menor do ri- bossomo. A subunidade menor se direciona ao RNAm, que se desloca até chegar no códon de iniciação AUG. É possível ver, ainda, a subunidade maior se conectando à menor. Depois que acontece a montagem completa do RNAr, dá-se início ao desenvolvimento da tradução, quando ocorre a dissociação do RNAr e a liberação da proteína formada. Figura 10 - Processo de tradução Fonte: Alberts et al. (2017, p. 247-248). 29 UNIDADE 1 A síntese da maior parte das moléculas proteicas leva entre 20 segundos e alguns minutos. No entanto, na mesma molécula de RNAm, podem ser associados vários ribossomos, os chamados polirribossomos. Isso possibilita a realização da tradução e da formação daquela proteína em grande escala. Quando a formação da proteína é finalizada, é possível concluir que a informação do DNA foi expressa. Contu- do, após a tradução, muitas proteínas ainda sofrem modificações, adquirindo formas tridimensionais definidas que lhe atribuíram funções específicas (ALBERTS et al., 2017). Agora que você já compreendeu como a informação genética codificada na sequência de nucleotídeos do DNA é traduzida em proteínas, pense novamente na célula-ovo, aquela gerada pela junção dos gametas. Depois de formada, essa célula já tem o próprio DNA, capaz de desencadear os processos citados. No entanto, você não é constituído por uma única célula. Após a fecundação, o DNA da célu- la-ovo produz enzimas capazes de induzir a reprodução, formando outras células, o que desencadeará a formação dos tecidos do corpo, os órgãos e os sistemas como um todo (ALBERTS et al., 2017). Considerando que uma célula nova se forma, devemos pressupor que uma nova molécula de DNA deve ser formada. Dentre os processos incluídos no dogma central feito pelos pesquisadores da biologia molecular, destaca-se a replicação, mecanismo pelo qual o DNA é capaz de fazer cópias de si mesmo toda vez que uma nova célula se formará. A replicação acontece no interior do núcleo da célula que sofrerá divisão e a própria molécula de DNA existente servirá de molde para formar uma nova. As duas fitas de DNA serão copiadas para formar, cada uma, uma nova. O processo é caracterizado como “semiconservativo”, uma vez que as fitas do DNA modelo se separam permanentemente e cada uma delas forma uma molécula dupla com a fita-filha (nova) pareada a ela (Figura 11) (LODISH et al., 2014). Certamente, em algum momento de sua vida, você já fez uso de an- tibióticos, talvez, por uma infecção na garganta ou um desconforto intestinal. Os antibióticos são utilizados para o tratamento de doen- ças causadas por invasão de bactérias. Os mecanismos de ação de alguns antibióticos estão relacionados à inibição da síntese proteica. Venha conferir os detalhes! https://apigame.unicesumar.edu.br/qrcode/9061 30 UNICESUMAR Para iniciar a replicação, uma série de enzimas e proteínas é necessária. Apresento a você a primeira delas, o DNA polimerase (DNApol), enzima essencial para adicionar os nucleotídeos complementares a cada uma das fitas. Para adicionar os nucleotídeos, o DNApol precisa que uma pequena sequência de nucleotídeos seja adicionada às fitas modelos, o que é feito pela primase. Essa segunda enzima é um tipo de RNA polimerase especializado em adicionar esses primers. Além dessa, temos outra enzima que será necessária para a separação das fitas, para que os nucleotídeos possam ser lidos. Quem faz essa separação é uma enzima chamada “helicase”. A helicase tem a função de quebrar, de forma gradual, as ligações de hidrogênio que ligam cada uma das fitas de DNA, à medida que o DNA polimerase acresce os nucleotídeos (Figura 12) (ALBERTS et al., 2017). O DNA polimerase tem a capacidade de adicionar nucleotídeos para formar a nova fita apenas na leitura dos complementares da direção 3´- 5´da fita modelo, uma vez que só consegue construir fitas comple- mentares 5´- 3´. Como ambas as fitas são moldes, para resolver a situação da fita modelo 5´ - 3´, é possívelutilizá-la como molde para a polimerase com a adição de vários primers, permitindo que seja feita a leitura de trás para frente, o que é citado por autores como modo de costurar para trás. Dessa forma, é dito que a síntese da molécula de DNA é feita de maneira contínua, sem interrupção em uma direção e, na outra, é descontínua, formando fragmentos, denominados “fragmentos de Okasaki” (LODISH et al., 2014). Os fragmentos separados na fita descontínua, no final da replicação, são unidos por uma proteína chamada de “DNA ligase”. Contudo, antes, são retirados os primers de RNA por uma nuclease e adi- cionado o DNA substituinte pela polimerase de reparo. Também temos outras enzimas que participam do processo de replicação, como a topoisomerase, que se posiciona na extremidade oposta da helicase. À medida que a helicase abre a fita em uma das extremidades, na oposta, a topoisomerase se associa, a fim de diminuir a tensão e impedir o superenrolamento do DNA. Há, ainda, as proteínas ligadoras, Descrição da Imagem: na figura, há um modelo de DNA que contém as fitas originais, as quais são representadas em azul. À medida que abrem, são construídas as fitas de cor laranja ligadas às originais (azul). No final do processo, são geradas duas moléculas de DNA, cada uma contendo uma fita nova e outra que serviu como modelo. Por isso o processo é chamado de semiconservativo. Figura 11 – Replicação: processo semiconservativo 31 UNIDADE 1 que impedem que a fita de DNA separada volte a se associar. Outras são as proteínas chamadas “gram- po deslizante”, que mantêm a DNA polimerase presa ao molde à medida que há a síntese da fita nova (Figura 12) (ALBERTS et al., 2017). A diversidade na aparência e, às vezes, nas fragilidades de ter algumas doenças ou de ser mais forte em outros aspectos está condicionada às alterações que podem ocorrer no DNA ou na molécula de RNA. No que diz respeito ao DNA, é mais preocupante, tendo em vista que, toda vez que se replicar, passará o erro à nova célula que se formar. Já em relação ao RNA, como ele é formado a partir do DNA, não serão traduzidos erros por muito tempo, visto que ele é degradado após fazer algumas sínteses. As alterações no DNA, quando permanentes, são chamadas de “mutações”, que ocorrem por equívocos no processo de replicação. A maioria dos danos no DNA é uma consequência não intencional do vasto número de reações químicas que ocorrem no interior da célula. A grande maioria dos danos ao DNA é temporária, uma vez que são imediatamente corrigidos pelos processos de reparo do DNA (LODISH et al., 2014). Os danos que podem ser encontrados no DNA incluem aqueles ocasionados espontaneamente, como os que podem ocorrer nos processos de replicação, em que o próprio DNA polimerase pode incluir um nucleotídeo incorreto, ou seja, não complementar a fita. Não só, mas também abrangem os danos influenciados por agentes ambientais, como a radiação ultravioleta e ionizante, que pode ocasionar a associação de bases incorretas (formação de dímeros de timina) ou a quebra da associação das fitas de DNA. De outro modo, também pode ocorrer a retirada de bases púricas e pirimídicas ou causar defeitos nos nucleotídeos, incluindo a desaminação (PIERCE, 2013). No entanto, cada uma das células apresenta um sistema de reparo que permite a correção da maioria das mutações e elas não se perpetuam. Um dos participantes na correção dos erros é o DNA polime- DNA polimerase DNA original Topoisomerase Fita descontínua Fita contínua Fragmento de Okazaki Primer de RNA Primase Helicase DNA parental Descrição da Imagem: na figura, é mostrado o processo de replicação do DNA, o qual foi parcialmente aberto pela enzima helicase. São mostrados, ainda, DNA polimerase, RNA primers e topoisomerase. Uma das fitas que formam os fragmentos de Okasaki também é evidenciada. Figura 12 - Replicação do DNA 32 UNICESUMAR rase, que tem a capacidade de fazer revisões e efetuar as correções. Outras, as glicosilases específicas, reparam os erros, fazendo as retiradas de pareamentos incorretos, como G-T. Após a retirada dos erros de pareamento, o DNA ligase será mais uma enzima que atuará ligando as fitas (LODISH et al., 2014). Apesar de raro, o processo de reparo pode ter falhas e as mutações podem permanecer. As mutações relacionadas às células germinativas (mutações que venham a ocorrer nas células dos gametas) são as mais preocupantes, uma vez que são transmitidas às gerações que a formam, como a célula-ovo. Já no caso das mutações em células do corpo, com exceção das gaméticas, em indivíduos completamente formados, os erros trazem prejuízos apenas individuais, e não aos filhos, como o câncer (LODISH et al., 2014). As mutações podem ser analisadas, ainda, a nível gênico (alteração de apenas um gene), quando as mudanças de nucleotídeos modificam as sequências de códons que passam pela transcrição, ou a nível cromossômico, quando alteram vários genes (PIERCE, 2013). Inicialmente, foi exposta a seguinte pergunta: em quais aspectos há uma diferenciação no DNA de cada um de nós que nos torna tão diversos entre si e, ao mesmo tempo, iguais em outras características? Essas diferenças podem ser supostas após as abordagens feitas nesta unidade. Pense nas variedades de mutações que podem ocorrer, seja em um único gene, seja em vários. Considere os gametas sendo formados em cada divisão celular. Durante esses processos, ocorre variabilidade genética. No entanto, nesta unidade, você entendeu que, independentemente das diferenças, somos muito parecidos quando levamos em consideração a forma de produzir essas características. Todos temos um DNA que forma um RNA, o qual se traduz em proteínas pelo processo chamado “dogma central da biologia”. Recentemente, os avanços no desenvolvimento de fármacos, vacinas e tratamentos de doenças são dependentes de achados sobre o conhecimento atribuído à maquinaria de enzimas, proteínas e distinções de funções de genes. Para você, futuro(a) profissional da saúde, esse domínio permitirá a compreensão das várias técnicas criadas pela biologia molecular em relação às múltiplas ações feitas com a manipulação da molécula de DNA. Um exemplo é o desenvolvimento de uma substância de valor econômico, como a produção de insulina. Atualmente, essa molécula já é produzida pelas técnicas de biologia molecular, em que são feitas manipulações de bactérias geneticamente modificadas. Dessa forma, entender que o DNA é uma herança das células gaméticas e que os processos básicos que sustentam essa molécula química contro- lam a expressão das diferentes características que governam o teu, o meu e o corpo de várias espécies de organismos é primordial para acompanhar e atuar nas várias aplicações que esses processos englobam. Você percebeu o quão a expressão da informação genética é importante? Ela não é relevante apenas à formação das proteínas para delimitar as características externas do corpo, como a textura da pele, cabelo ou cor. Ela também é essencial para todo o funcionamento celular, na formação dos seguintes elementos: enzimas que completam a replicação do DNA, enzimas envolvidas na transcrição e RNAs participantes da tradução. 33 Após uma breve revisão das características e das funcionalidades da molécula de DNA, convido você a fazer uma avaliação do seu desempenho. Você deverá preencher o mapa mental a seguir e, se necessário, poderá ampliá-lo. Complete os quadros que não estão preenchidos. Deixo, como dica, a seguinte afirmação: ao estudar e realizar a leitura do livro, grife as palavras-chave que você considera importantes. GAMETAS DNA Materno Nucleotídeos (A, T, C, G) Ligações de hidrogênio Estrutura e composição Várias enzimas: DNA polimerase, helicases, topoisomerases... Replicação do DNA Semiconservativo Reparo do DNA Transcrição RNA Ligações fosfodiéster RNA polimerase RNAm, RNAt e RNAr Aplicações na biotecnologia: vacinas, melhoramentos, prevenção de doenças. 34 1. Após uma das primeirasaulas de Biologia Molecular, a professora apresentou uma tarefa. Nela, os alunos deveriam construir uma fita de DNA fictícia. Portanto, deveriam levar em consideração as características básicas da constituição do DNA. De acordo com os conceitos aprendidos, como deveria ser constituída a fita de DNA? a) A molécula de DNA deveria ser representada por uma dupla fita, constituída por nu- cleotídeos ligados entre si por ligações fosfodiéster. As bases nitrogenadas estariam associando as duas fitas de forma complementar (A-T e C-G) por ligações de hidrogênio. b) A estrutura do DNA deveria ser representada por uma única fita, constituída por nu- cleotídeos ligados entre si por ligações fosfodiéster. As bases nitrogenadas estariam ligadas de forma complementar (A-T e C-G) por ligações de hidrogênio. c) A molécula de DNA representada pelo estudante deveria ser formada por uma dupla fita, constituída por nucleotídeos ligados entre si por ligações de hidrogênio. As bases nitrogenadas estariam associando as duas fitas de forma complementar (A-T e C-G) por ligações fosfodiéster. d) O DNA deveria ser representado por uma fita simples, constituída por nucleotídeos ligados entre si por ligações fosfodiéster. As bases nitrogenadas estariam associando as duas fitas de forma complementar (A-U e C-G) por ligações de hidrogênio. e) A molécula de DNA deveria ser representada por uma dupla fita, constituída por nu- cleotídeos ligados entre si por ligações fosfodiéster. As bases nitrogenadas estariam associando as duas fitas de forma não complementar (A-G e C-T) por ligações de hidrogênio. 2. O processo de transcrição da molécula de DNA abrange o momento em que são trans- mitidas as informações a partir da formação de uma molécula intermediária, o RNA. Sabe-se que, para que esse processo aconteça, muita energia é gasta. Justifique o motivo pelo qual o DNA não traduz a informação genética diretamente, ao contrário de produzir uma molécula intermediária. Explique a vantagem de transmitir a informação ao RNA. 35 3. A maioria dos produtos finais da informação genética provinda do DNA é finalizada com a tradução, produzindo proteínas. Em relação às características do processo de tradução, assinale a alternativa correta: a) Os RNAr participantes da tradução são específicos, ou seja, podem fazer apenas um tipo de proteína. b) As subunidades do RNAr sempre ficam unidas, independentemente de estarem pro- cessando a tradução. c) Um RNAm pode conter a sequência UTTACCGUCAT. d) Uma vez que as duas fitas de DNA são complementares, o RNAm de um dado gene pode ser sintetizado por meio de qualquer uma das duas fitas. e) O RNAm passa por processamentos durante a transcrição, tais como a retirada de introns, junção de éxons e modificação da extremidade 5´ com a cap e da 3´com a poliadenilação. 4. A capacidade de replicação do DNA é primordial. Toda vez que uma nova célula é formada, esse processo ocorre, uma vez que, individualmente, cada célula precisa da informação genética contida no DNA para efetuar as funções dela. Em relação ao processo de replicação, analise as afirmativas a seguir: I) O DNA polimerase é a enzima responsável pela construção da fita nova. Ele adiciona os nucleotídeos complementares em cada uma das fitas. II) A sequência das etapas da replicação consiste em: quebra das pontes de hidrogênio que unem as bases pela helicase; adição dos nucleotídeos complementares pelo DNA polimerase; e adição dos primers. III) Ao final da replicação, as fitas que serviram de molde se voltam a unir e as fitas novas se associam. IV) A replicação é o processo de formação de uma nova molécula de DNA. No caso das células eucariontes, ocorre no interior do núcleo celular. É correto o que se afirma em: a) I e II. b) I, II, III e IV. c) I e IV. d) I. e) III e IV. 36 5. As alterações no DNA, quando permanentes, são chamadas de “mutações”. A maio- ria dos danos do DNA é uma consequência não intencional, tendo em vista o grande número de reações químicas que ocorrem no interior da célula. Além do mais, esses danos, em grande parte, são temporários, uma vez que são imediatamente corrigidos pelos processos de reparo. Se fôssemos classificar a melhor etapa do dogma central para acontecer o sistema de reparo, qual você escolheria? Justifique. 6. Vários avanços na biologia molecular foram conquistados com o conhecimento da estrutura, composição e função do DNA. Hoje, muitos fármacos e vacinas foram de- senvolvidos devido ao entendimento da expressão de determinados genes e das várias enzimas envolvidas. Suponha que um pesquisador busque criar um remédio contra um vírus que ataca o sistema pulmonar humano. Considerando a situação apresentada no enunciado, assinale a alternativa que corres- ponde ao nível que o pesquisador poderia se amparar para destruir o vírus: a) Produzir um fármaco que atinge o processo de replicação do DNA viral. b) Criar uma ação que destrua as proteínas fabricadas pelo vírus. c) Desenvolver um fármaco que age de forma a impedir a transcrição dos genes dos órgãos dos hospedeiros, ou seja, das células pulmonares. d) Desenvolver uma ação que ative a replicação viral na célula. e) Produzir um fármaco de ação ativadora da transcrição da célula hospedeira, a fim de atingir o vírus. 2 Nesta unidade, compreenderemos a importância da atenção dada ao controle de qualidade em laboratórios de biologia molecular forense. Também conheceremos o fundamento deles e os proce- dimentos para alcançar resultados seguros e confiáveis. Entendere- mos que o manuseio de materiais das análises laboratoriais requer padrões a serem seguidos, a fim de aferir a condição de excelência e confiabilidade das pesquisas feitas. Compreenderemos as fases que exigem atenção durante a análise para alcançar a qualidade e assi- milaremos, de forma geral, as características necessárias para um laboratório ter um selo de excelência pelo processo de acreditação. Controle de qualidade em laboratórios de biologia molecular Dra. Ana Luisa Monezi Lucena 38 UNICESUMAR "Suspeito de matar Rachel Genofre é identificado quase 11 anos depois do crime". Esse é título de uma reportagem publicada no G1, em setembro de 2019. Talvez, você já tenha ouvido a história de uma menina que foi encontrada morta e enrolada entre lençóis dentro de uma mala localizada na rodoviária de Curitiba, no Paraná. Rachel tinha nove anos e foi vista pela última vez na frente da escola onde estudava no dia 3 de novembro de 2008. O suspeito de matar a menina foi identificado quase 11 anos depois do crime. A identificação do suspeito ocorreu após a coleta do DNA de diversos suspeitos. Foi feita a compara- ção do material genético encontrado nos lençóis e na Rachel. A princípio, os dados do DNA dos vários suspeitos foram armazenados em um Banco Nacional de Perfis Genéticos. Posteriormente, cruzaram os dados disponíveis com o material genético colhido no corpo de Rachel. Um dos suspeitos, o qual se encontrava preso, apresentou uma correlação positiva em 100% em relação ao material genético encontrado em Rachel. De acordo com o Ministério da Justiça, a coleta colaborou com o cruzamento de dados do Banco Nacional de Perfis Genéticos, que conta com 30 mil perfis de condenados cadas- trados (PADRONIZAÇÃO..., [2021]). Você já pensou no quão é importante a elaboração de metodologias adequadas para a identificação do DNA de suspeitos? Já refletiu sobre as consequências que podem ser acarretadas devido à existência de erros nos procedimentos adotados? Coloque-se no lugar do profissional do laboratório que analisou o DNA do suspeito de Rachel. Agora, imagine o quão será importante o seu entendimento sobre o tema “controle de qualidade na manipulação de materiais em laboratórios clínicos”. A utilização de tecnologias de análises forenses com o objetivo de identificar tem sido feita com con- siderável sucesso nos últimos anos. Isso acontece devido ao acelerado avanço das técnicas de biologia molecular e dosmétodos de tipagem de DNA. Atualmente, existem bancos de dados de DNA em diversos países. No entanto, para compartilhar informações com esses bancos, deve-se levar em consideração o conhecimento da manipulação da técnica, principalmente em relação às normas, à padronização, ao controle de qualidade e aos cuidados na coleta e na preservação das amostras biológicas, uma vez que consequências éticas e sociais podem vir à tona, impedindo o compartilhamento de informações. Se fôssemos associar os fundamentos éticos expressos com o caso abordado, imagine como seria constrangedor se fossem identificados resultados diferentes. Isso aconteceria se um laboratório testasse positivo e outro negativo, ambos utilizando a mesma amostra. Agora que você já tem algumas informações relevantes e que mostram a importância do uso das tecnologias forenses, proponho uma atividade. Em bancos de dados on-line confiáveis, pesquise os objetos de investigação da análise forense. Depois, identifique, pelo menos, três resultados alcançados pelos pesquisadores na utilização das técnicas forenses. Por fim, procure casos em que a técnica não foi satisfatória em detrimento da má adequação dos procedimentos metodológicos. Organize e anote todos os seus resultados no diário de bordo. Diante da pesquisa efetuada, o que você identificou como características semelhantes entre os ob- jetos de pesquisa da análise forense? Os resultados procurados com o auxílio das técnicas de biologia molecular estão voltados apenas às características de identificação? O quão é importante adotar um método de análise de qualidade para investigação? 39 UNIDADE 2 A aplicação da tecnologia do DNA em investigações forenses cresceu rapidamente nos últimos anos. As principais amostras utilizadas como objeto de estudo das aplicações forenses é o DNA cole- tado do sangue, o líquido seminal, a medula óssea, o cérebro, os músculos, a pele, a polpa dentária e as manchas secas de sangue em tecido ou em outra superfície (LEE; LADD, 2001). Contudo, muitas são as evidências de DNA que não são apropriadamente coletadas, documentadas, reconhecidas e preservadas, invalidando uma investigação. Pense nos aspectos principais da situação-problema proposta e anote as suas ideias, reflexões, dis- cussões e argumentos no diário de bordo: 1. Qual é a importância da coleta de materiais de qualidade para as análises forenses? 2. O quanto é relevante ter atenção na execução das técnicas em relação à adequação do labora- tório para efetivar um resultado de qualidade? 3. Quais são as consequências dos erros de um procedimento mal executado? Os exames de DNA adotados em várias situações registradas na literatura têm sido eficazes e confiáveis ao longo dos anos, uma vez que os sistemas de qualidade têm sido aprimorados cons- tantemente em todas as etapas de análise. Na área forense, a qualidade dos exames de DNA é DIÁRIO DE BORDO 40 UNICESUMAR importante para descrever os laudos periciais que suprem as necessidades das análises da justiça (GARRIDO; GIOVANELLI, 2011). Alec Jeffreys foi o primeiro pesquisador que utilizou a leitura do DNA em um laboratório forense com sucesso. Ele descreveu que certas regiões do DNA continham repetições de sequência, também conhecidas como Variable Number Of Tandem Repeats (V.N.T.R.), as quais variam em comprimento de indivíduo para indivíduo, o que foi designado como “D.N.A. fingerprint” (“impressão digital de DNA”, em português). Jeffreys percebeu que essa variação seria um diferencial para identificar a individuali- zação das pessoas, tornando uma arma extremamente poderosa para o domínio forense, o que, até o momento, revelava-se como o mais robusto mecanismo de individualização (DALE; BECKER, 2007). A investigação da morte de Rachel obteve elucidação pela justiça a partir do exame de DNA. Se posicio- ne como gerenciador da execução dos procedimentos adotados para fazer o exame de DNA dos suspeitos e do material encontrado em Raquel. A primeira atitude a ser compreendida é o reconhecimento de que, para ter um resultado satisfatório, é necessário um rigoroso controle de qualidade, o qual se estende desde a coleta do material, identificação e posterior processamento (OGA; CAMARGO; BATISTUZZO, 2014). A Academia Americana de Ciências Forense exige que sejam seguidas normas para a análise de mate- riais biológicos (OGA; CAMARGO; BATISTUZZO, 2014). No caso do sêmen encontrado em Rachel, o laboratório que estivesse sob responsabilidade deveria realizar a construção de uma documentação para rastrear todo o processo de análise do material biológico, incluindo coleta, transporte, análise, descarte ou estocagem, a fim de evitar erros na identificação do material do doador ou da vítima. Essa documentação é denominada “cadeia de custódia” (Figura 1). Nela, deverão conter informações relacionadas ao manu- seador da amostra, ao local onde foi obtida e ao momento em que foi realizado o manuseio. Costuma-se separar a cadeia de custódia em duas etapas: a cadeia de custódia externa e a interna. Descrição da Imagem: na Figura 1 (a), são expressas algumas evidências coletadas na cadeia de custódia. Assim, em um piso de madeira, estão dispostos os objetos deixados na cena de um crime, como drogas, dinheiro, carteira e pinça. Na Figura 1 (b), há duas placas amarelas com os números 5 e 6, e um documento com as digitais registradas. Sobre o documento, há uma munição dentro de um saco plástico e uma pinça. Figura 1 (a) – Evidências coletadas na cadeia de custódia; (b) – Outras evidências coletadas na cadeia de custódia A) B) 41 UNIDADE 2 A primeira etapa que você deve entender compreende o momento de coleta do material e o transporte até o laboratório, denominada de “cadeia de custódia externa”. Por outro lado, a cadeia de custódia interna será o momento em que a amostra chegará ao laboratório. Nele, são feitos os registros, os exa- mes, o armazenamento, o descarte ou a devolução. Assim, os laboratórios de análises forenses devem seguir normas e diretrizes que englobam a coleta, a cadeia de custódia, o processamento da amostra e os testes confirmatórios, por exemplo (CASTELARI et al., 2018). Na fase de custódia externa, que inclui a coleta de material, estão disponíveis recursos que ajudarão a identificar os vestígios deixados. Caso haja um perito, ele colherá o material na cena do crime. Em relação à coleta do sêmen encontrado junto a Rachel, provavelmente, ele estava com coloração ama- relada e consistência seca, uma vez que foi encontrado dois dias depois. Nessa fase, inicialmente, é feita a identificação. Os peritos detectarão se a mancha que contém sêmen tem a probabilidade ou certeza de ser um material suspeito. Uma das provas de probabilidade muito usada pelos profissionais é a luz ultravioleta (lâmpada de Wood), com a finalidade de detectar a fluoresceína (tem tom branco-azulado e, com o passar do tempo, tende a ter uma cor amarela), que se encontra presente no espermatozoide. Todavia, não está presente somente nele, mas em outros fluidos biológicos, tais como urina, muco vaginal e nasal. Por esse motivo, é considerado teste de orientação, e não de certeza (Figura 2). Os cristais de florence ou cristais de picrato de espermina também são elementos que indicam a presença de esperma. Esses cristais podem ser encontrados em diversas secreções, o que o tornam um teste de probabilidade (DEL-CAMPO, 2008). A prova de certeza conseguida no caso de Rachel certamente aconteceu quando os peritos coletaram os espermatozoides presentes na secreção vaginal e, então, foram feitas a recuperação pela coloração e o procedimento do esfregaço cérvico-vaginal mais conhecido como “papanicolau” (TÁMARA, 2013). Descrição da Imagem: na Figura 2 (a), há um perito abaixado. Ele usa luvas e um traje descartável e branco dos pés à cabeça. Em uma das mãos, está a luz ultravioleta (luz negra), enquanto a outra coleta, com o swab, os vestígios deixados no piso. Na Figura 2 (b), um equipamento de emissão deluz ultravioleta é colocado próximo a uma superfície que contém digitais. Na Figura 2 (c), é utilizada uma lanterna de emissão de luz ultravioleta, a fim de identificar, no chão, uma pegada, que é demarcada por uma placa com o número 3. Figura 2 (a) – Perito fazendo uso de luz ultravioleta; (b) – Equipamento de emissão de luz ultravioleta; (c) – Luz ultravioleta demarcando uma pegada A. B. C. 42 UNICESUMAR Neste momento, você pode estar se perguntando: como são feitas a coleta e a preservação do ma- terial até a chegada ao laboratório? Como a amostra de espermatozoide foi buscada nas secreções vaginais? O procedimento adotado para essa coleta é o uso de swab, um cotonete estéril utilizado para apanhar e transportar múltiplos tipos de materiais biológicos. Na Figura 2 (a), é possível ob- servá-lo em uma das mãos do perito. De maneira geral, a sobrevida dos espermatozoides na cavidade vaginal é de poucas horas, variando em função das hostilidades químicas ambientais. No entanto, quando colhidos a tempo, ainda podem ser vistos, a fresco, com movimentos. No caso de Rachel, como haviam passado dias, a possibilidade era de encontrá-los mortos, mas ainda era possível aplicar uma técnica de coloração. Com ela, eles podem ser identificados até cerca de quatro dias após a deposição (INTERPOL, 2009; TAMAI, 2015). As Figura 2 (a) e 3 mostram que, para efetuar as coletas, é necessário o uso de equipamentos indi- viduais de proteção, os chamados EPIs, de modo que se assegure a preservação da amostra e evite a contaminação do manipulador durante a coleta. Por isso, é fundamental o uso de luvas descartáveis, máscara e sapato fechado. Não é permitido beber ou comer no local da coleta. Além disso, o material descartável utilizado deve ser colocado em sacos de resíduos biológicos e, posteriormente, devem ser descartados em locais adequados (BEZERRA, 2004; SILVEIRA, 2009). Descrição da Imagem: na figura, é representada uma pessoa utilizando os equipamentos de proteção individual (EPIs). Ela está posi- cionada com as mãos paralelas ao rosto, a fim de evidenciar as luvas brancas, que prendem as mangas de um jaleco azul feito de TNT. A pessoa também usa óculos de proteção transparentes, viseira de proteção facial, touca e máscara. Figura 3 - Representação dos equipamentos de proteção individual 43 UNIDADE 2 Clique no QR Code e conheça a importância do uso de EPIs de forma adequada em laboratórios de biologia molecular. Tendo os recipientes com as amostras, a abertura acontecerá quando for iniciada a análise. Cada recipiente deve ser identificado por meio de autoadesivos, que devem ser invioláveis, a fim de segurar a cadeia de custódia. Na identificação, são incluídos: o número identificador institucional do caso ou o número do pedido; o nome da vítima ou algum tipo de identificação; a data e a hora da coleta; o tipo de amostra biológica; e assinatura do responsável pela coleta. Findada a etapa de coleta, em seguida, as amostras devem ser encaminhadas ao laboratório (LISBOA, 2016). REALIDADE AUMENTADA Principais EPI usados em laboratórios de biologia molecular e sua importância A recolha dos vestígios é fundamental para a averiguação de um crime. Outro método utilizado para melhorar não só a qualidade do trabalho no local do crime, mas também a interligação com a investigação criminal, é a utilização da lofoscopia, método de análise de digitais. De modo geral, a lofoscopia é a ciência forense que estuda os desenhos dermopapilares que existem na ponta dos dedos, nas palmas das mãos e nas plantas dos pés. Esse desenho digital é visível desde o sexto mês de gestação e só desaparece com a putrefação. O uso desse vestígio é interessante, porque não existem duas impressões digitais iguais no mundo, mesmo em gêmeos homozigotos. Para a detecção das digitais, é feita a utilização de produtos químicos em forma em pó. São empregados o carbonato de chumbo (pó branco de extrema leveza e ótima aderência ao suor e à gordura), o dragon blood (pó avermelhado usado em quase todas as superfícies, mas especialmente em veículos, ferro, plásticos e celofane), o caput mortuum (pó de óxido preto aplicável em cartões, madeira, vidro e plásticos) e pós magnéticos e fluorescentes. No caso dos reagentes líquidos, há a ninidrina, substância que se apresenta sob a forma de cristais brancos/esverdeados e reage com o componente do aminoácido da impressão digi- tal. Além da ninidrina, componentes de violeta de genciana e negro de amido são utilizados. Detectadas as impressões com o uso desses materiais, elas são direcionadas a uma base de dados em que são introduzidas imagens de impressões digitais e os respectivos pontos carac- terísticos. Então, é feita uma comparação para encontrar uma possível presença dos suspeitos. Fonte: adaptado de Pinheiro (2008) e Duarte (2009). 44 UNICESUMAR Agora, são iniciados os preparativos para a etapa de custódia interna, momento em que a amostra chega no laboratório. Primeiramente, é necessário entender o objetivo proposto, ou seja, estar consciente da situação ocorrida. Posteriormente, deve-se verificar se a metodolo- gia (equipamentos, reagentes e insumos) estão disponíveis e em prazo de validade. Outro requisito é detectar se será possível atender à demanda e realizá-la no tempo oportuno. Também é preciso averiguar se o material encaminhado é adequado e se o laboratório dispõe de recursos para o correto acautelamento (GARRIDO; ARAUJO, 2014). Em laboratórios forenses, muitas vezes, as amostras necessitam passar por um preparo prévio. Para um processo de limpeza, no caso da análise de tecidos, pode ter a necessidade de fazer cortes no tecido biológico, como ossos e músculos, e separação de swab. Em re- lação ao crime que você acompanha nesta unidade, na amostra, quando recém-chegada, foi utilizado o swab com a necessidade de separar o material. Nessa fase, é necessário fazer as escolhas quantitativa e qualitativa das amostras, incluindo o modo de realizar a limpeza, homogeneização e retirada das alíquotas. Para executar os procedimentos relacionados ao manuseio de equipamentos e as técnicas do ensaio, é preciso seguir os procedimentos operacionais padronizados pelo laboratório e controlados por profissionais competentes. Esses procedimentos não são imutáveis e precisam sofrer revisões sempre que for conveniente ou necessário. Eles também precisam ter os respectivos registros. De acordo com o Ministério da Justiça, as demandas da padronização de exames de DNA em perícias criminais devem utilizar um mínimo de marcadores moleculares e fazer a análise estatística dos resultados (PA- DRONIZAÇÃO..., [2021], GARRIDO; ARAUJO, 2014). Em exames interlaboratoriais e bancos de dados, a padronização dos exames de DNA deve usar, no mínimo, treze marcadores moleculares definidos pelo CODIS (TPOX, D3S1358, D5S818, FGA, CSF1PO, D7S820, D8S1179, TH01, vWA, D13S317, D16S539, D18S51 e D21S1) e a amelogenina. Normalmente, esses marcadores são disponibiliza- dos em kits comerciais multiplex ou, quando não comerciais, devem ser kits validados. Os laboratórios, em relação aos exames rotineiros, podem estabelecer os marcadores necessários para a execução dos laudos periciais. No entanto, recomenda-se a utilização dos treze marcadores mínimos (PADRONIZAÇÃO..., [2021]). Após a passagem da análise do material no laboratório, outra grande preocupação é se a certificação e a publicação dos resultados estão dispostos de forma clara e objetiva. Além disso, é importante disponibilizar meios para dirimir eventuais dúvidas e proceder os exames de contraprova. Além dos aspectos analíticos citados, dentro da cadeia de custódia, é de grande valia dar atenção à etapa pós-analítica, na qual são considerados os resíduos produzidos. O mínimo possível e a realização correta da disposição final são essenciais. Nessa etapa, é preciso realizar um perfeito gerenciamento dos documentos e garantir a adequabilidade e a segurança do sistema de informação, em especial,
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