Apresentação Artigo Infecção Pelo Vírus Sincicial Respiratório Bovino

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Orientanda: Ana Thays dos Santos da Silva
Orientadora: Diana Célia Sousa Nunes Pinheiro
Ciclo de Seminários - LIBA
Neutrófilos
Introdução
NETs
Armadilhas extracelulares
neutrophil extracellular traps
Capturar e matar patógenos
NETosis
Bactérias, fungos, protozoários e VÍRUS
Alta concentração local de proteínas antimicrobianas 
Fatores de Virulência
As redes são compostas por um complexo de cromatina processada ligada a proteínas granulares e citoplasmáticas expelidas da célula para patógenos onde se ligam, desarmam e matam patógenos extracelularmente.
As NETs são compostas basicamente por cromatina nuclear descondensada juntamente com proteínas, onde a maioria delas vem dos grânulos dos neutrófilos e as outras proteínas são citoplasmáticas e nucleares (histonas).
NETs fornecem uma alta concentração local de proteínas antimicrobianas, incluindo proteases como elastase de neutrófilos, mieloperoxidases e αdefensinas que degradam fatores de virulência 
Introdução
Estímulo de NETosis
Fungos, bactérias, protozoários e vírus
Citocinas proinflamatórias
Diversos autoanticorpos
Vírus Sincicial Respiratório
EXCESSO DE NETs
Aumento da resposta inflamatória
Patogênese de doenças autoimunes
Introdução
O papel dos NETs nas infecções virais varia muito entre os vírus.
Captura de vírions - HIV
Inibição da disseminação viral - varíola murina
Benéficos
Obstrução das vias aéreas - RSV
Inflamação alérgica das vias aéreas - Rinovírus
Prejudiciais
Efeitos da terapêutica nos NETs no manejo das infecções virais são amplamente desconhecidos.
(Funchal et al., 2015; Cortjens et al., 2016a,2016b; Schönrich e Raftery, 2016; Toussaint et al., 2017; Shao et al., 2019)
Introdução
Infecção por BRSV em bovinos
Doenças respiratórias graves
Infecções secundárias
Perdas econômicas significativas
HRSV e BRSV: semelhanças - histopatológicas e imune 
A infecção por BRSV em bovinos continua a ser uma doença problemática que causa doenças respiratórias graves que predispõem os bovinos à infecção secundária, resultando em perdas econômicas significativas devido à mortalidade, diminuição da produtividade e aumento dos custos de tratamento
Introdução
Tratamento BRSV 
Inibidor da proteína de fusão (FPI)
Eficácia - tratamento de BRSV em bezerros
GS-5806
(Jordan et al., 2015;Walsh et al., 2020)
(Jordan et al., 2015)
Eficácia - tratamento de RSV em Humanos
Ibuprofeno: anti-inflamatório - tratamento de BRSV 
Minimizou o efeito inflamatório
Não conseguiu diminuir a infecção viral.
(Walsh et al., 2016)
Avaliação de NETs nos pulmões de bezerros infectados experimentalmente com BRSV; 
Tratamento com ibuprofeno e FPI, influencia na NETose nos pulmões desses bezerros?;
Monoterapia ou uma combinação dos dois iniciados em momentos diferentes; 
Possíveis papéis do ibuprofeno e outros anti-inflamatórios contra a formação de NETs
Nova compreensão das respostas imunes do hospedeiro durante infecções por RSV e possíveis opções terapêuticas
Objetivos
Metodologia
02.
Cinco a seis semanas
3 repetições – 12 bezerros cada
6 grupos
Ibuprofeno
Placeblo
Ibuprofeno + FPI
Dia 10 pós-infecção
2 bezerros – eutanásia precoce
36 bezerros
Tratamento
Eutanásia 
PCR 
Confirmação da Infecção
Metodologia
Tratamento BRSV 
Infecção
Sistema de nebulizador/compressor
5 mL aerossolizado - 15 min.
Vírus
Isolado de BRSV (CA-1) cultivado em células de conchas bovinas
Sinais Clínicos
Pontuações 0-10
Metodologia
Infecção por BRSV 
Frequência respiratória
Quantidade e características das secreções nasais
Tosse
Sons pulmonares
Atitude/ Comportamento
Padrão respiratório
Temperatura
Metodologia
Amostras
Lavado broncoalveolar e tecido pulmonar fresco para análise histopatológica
Áreas de atelectasia e consolidação - estimadas semiquantitativamente - porcentagem do pulmão
Exame histológico: traqueia, brônquio principal direito e lobo pulmonar cranial, médio e caudal direito e esquerdo
Tecido pulmonar - imunohistoquímica para detectar NETs
Excreção viral - swabs nasais em dias alternados e realização de PCR
Metodologia
Protocolo in vitro
Neutrófilos isolados do sangue periférico (dois bezerros saudáveis)
PMA
BRSV
NETs - Detecção de NE e citH3
Detecção de NETs
Tecido pulmonar (lobos cranial, médio e caudal) 
Quantificados como a área média em μm de NE e CitH3
Estudos mostraram que os neutrófilos liberam NETs após a exposição ao RSV in vitro. Para confirmar que os neutrófilos respondem ao BRSV, examinamos neutrófilos bovinos isolados expostos a PMA, BRSV ou ambos in vitro
A) Desenho de pulmão bovino indicando áreas onde amostras de tecido foram coletadas e criopreservadas usando nitrogênio líquido. Coletamos pelo menos três amostras de cada lobo.
Resultados
03.
Todos os bezerros desenvolveram doença clínica e excreção viral
Todos os bezerros tiveram pontuações clínicas mais altas a partir do dia 3
Grupo 3 (placebo) - pontuações clínicas altas - doença mais grave
Grupo 6 (terapia combinada a partir do dia 3) teve a pontuação clínica mais baixa
Ibuprofeno aumentou a excreção viral e FPI diminuiu a excreção viral
Resultados
Escores clínicos e patológicos
Escores histopatológicos mais altos - placebo em todo o tratamento e ibuprofeno a partir do dia 5
Escores mais reduzidos - terapia de combinação com ibuprofeno e FPI iniciada no dia 3
Escores clínicos e patológicos
Resultados
observamos redes semelhantes a teias de DNA extracelular em torno de neutrófilos bovinos desnaturantes desafiados com BRSV e PMA
Redes semelhantes a teias de DNA extracelular em torno de neutrófilos
Análise de NETs in vitro
Resultados
NETs mais abundantes em neutrófilos estimulados por PMA
Revestidas com elastase e citH3 - formação de NETs 
Imagens imunofluorescentes representativas de amostras de citologia de bezerros saudáveis. As células foram fixadas, permeabilizadas e coradas para histona citrulinada H3 (citH3, vermelho), elastase de neutrófilos (NE, verde) e DNA (azul). NETs foram identificados por co-localização de citH3 e NE. As células foram identificadas como neutrófilos com base em núcleos lobulados
Pulmões - apresentavam lesões macroscópicas com distribuição cranioventral médio e caudal
Patologia e NETs induzidas por BRSV em neutrófilos bovinos in vivo 
Resultados
Pneumonia bronco-intersticial, bronquiolite necrosante, formação de sincícios, hiperplasia de pneumócitos tipo II e alveolite exsudativa ou proliferativa
NETose generalizada e deposição de NETs - coloração positiva de CitH3 e NE
Deposição de NETs em áreas intraluminais e intersticiais
As amostras do grupo placebo continham significativamente mais coloração de citH3 e NE
C) e D): distribuição de NETs nos lobos pulmonares cranial, médio e caudal com alta Netose visualizada no lobo cranial para histonas citrulinadas e elastase de neutrófilos. Dados representados como uma porcentagem do total de três repetições. n = 6 por grupo, Vermelho – lobo craniano, Amarelo – lobo médio, Azul – lobo caudal.
B) Uma imagem imunofluorescente representativa de tecido pulmonar bovino congelado. Os tecidos foram fixados, permeabilizados e corados para histona citrulinada H3 (citH3-verde) e elastase de neutrófilos (NE-red). O DNA foi corado com DAPI-blue. Observe a expressão intracelular de citH3 (cabeças de seta) e NE (setas) em neutrófilos, e liberação de NETs decorados com NE e citH3 (circulado).
O BRSV pode induzir a formação de NETs tanto em vitro quanto in vivo. A formação de NETs foi observada nos pulmões, sugerindo que os NETs contribuem para a imunopatologia na doença do VSR. Ibuprofeno e FPI, em média diminuem a gravidade clínica da doença e NETosis, mas deve ser usado em conjunto e não como monoterapia. A combinação de ambas as drogas foi eficaz no 3 e 5 após a infecção com início precoce levando a melhores resultados. Este trabalho ressaltaa necessidade de mais estudos sobre compostos que influenciam NETs. Também especula-se que há necessidade de diagnóstico precoce de doenças exacerbadas por NETs para que a terapia seja eficaz, pois é u trabalho contra o tempo em competição com uma resposta inflamatória.
Conclusão
Obrigada!
A PICTURE IS WORTH A THOUSAND WORDS
TYPE B
CONCEPTS AND TYPOLOGY
TYPE A
Venus has a beautiful name, but also very high temperatures
Jupiter is a gas giant and the biggest planet in the Solar System
GESTATIONAL
Saturn is the sixth planet from the Sun and the second-largest
1
2
3
—Someone Famous
“This is a quote, words full of wisdom that someone important said and can make the reader get inspired.”
70%
Leishmaniasis in dogs
AWESOME WORDS
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Venus is the second planet from the Sun
DOGS
Despite being red, Mars is a cold place
CATS
Mercury is the closest planet to the Sun
RABBIT
Earth is the planet where we live on
HAMSTER
40%
23%
27%
10%
RISK FACTORS
KEY NUMBERS
250
10M
It’s the fifth planet from the Sun and the largest in the Solar System
Venus has a beautiful name, but also very high temperatures
You could enter a subtitle here if you need it
DIAGNOSIS
02
DIAGNOSIS
MERCURY
Mercury is the closest planet to the Sun
VENUS
Venus is the second planet from the Sun
MARS
Despite being red, Mars is actually a cold place
JUPITER
It’s the biggest planet in the Solar System
SATURN
Saturn is composed of hydrogen and helium
NEPTUNE
Neptune is the farthest
planet from the Sun
PREVENTION
MARS
Despite being red, Mars
is actually a cold place
VENUS
Venus is the second planet from the Sun
JUPITER
Jupiter is a gas giant and the biggest planet
NEPTUNE
Neptune is the farthest
planet from the Sun
01
03
02
04
DAY 2
TREATMENT DURATION
Despite being red, Mars is cold
Venus has a beautiful name
Jupiter is the biggest one
DAY 1
DAY 3
DAY 4
Neptune is the farthest one
MARS
JUPITER
VENUS
NEPTUNE
You can describe what the animal shouldn’t do here
You can describe what the animal shouldn’t do here
You can describe what the animal shouldn’t do here
You can describe what the animal should do here
You can describe what the animal should do here
You can describe what the animal should do here
WHAT TO AVOID
WHAT TO DO
RECOMMENDATIONS
		MONOVALENT	POLYVALENT	PENTAVALENT	ANTIRABIC
	6-8 WEEK				
	9-11 WEEK				
	12-14 WEEK				
	6 MONTHS				
	ANNUAL				
VACCINE SCHEDULE
2500
Saturn is the sixth planet from the Sun and the second-largest in the Solar System
VENUS
Venus has a beautiful
Name, but it’s hot
MERCURY
Mercury is the closest planet to the Sun
TREATMENT
MARS
NEPTUNE
Despite being red, Mars is actually a cold place
Neptune is the farthest planet from the Sun
PREVALENCE
DISEASE CASES
Venus has a beautiful name
Mercury is the smallest planet
Mars is actually a cold place
Neptune is the farthest planet 
50%
70%
80%
95%
MERCURY
VENUS
MARS
NEPTUNE
RESEARCH CONCLUSIONS
Mercury is the closest planet to the Sun and the smallest one in the Solar System—it’s larger than the Moon
CONCLUSIONS
OUR TEAM
ANGELINA DOE
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JAMES JONES
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JENNA MCKANE
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Pretty young woman petting her dog
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Diferenças entre os grupos
Valor de p igual ou inferior a 0,05
Estatisticamente significativos
1
2
3
Metodologia