CITOMETRIA DE FLUXO

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CITOMETRIA DE FLUXO
 
FACS
(Flourescence-Activated Cell Sorting)
Princípios Básicos de Citometria de fluxo
CITO METRIA FLUXO
Célula Medida Movimento
Princípios Básicos de Citometria de fluxo
Pode ser definida como metodologia, tecnologia ou ferramenta direcionada ao estudo de células.
 Utilizada na: 
Identificação 
Avaliação 
Diferenciação 
 De diversas características celulares como:
Conteúdo de DNA E RNA 
Receptores de superfície 
Produção de citocinas 
Apoptose
Princípios Básicos de Citometria de fluxo
AA
A citometria de fluxo também é utilizada para:
Contar
Examinar
Classificar
Partículas microscópicas suspensas em meio liquido em fluxo.
 
 A técnica depende da utilização de um 
 Citômetro de Fluxo.
O que pode ser analisado? 
Princípios Básicos de Citometria de fluxo
Citometria de Fluxo 
Baseia-se na detecção de substâncias fluorescente ( flourocromos), geralmente, acoplados a anticorpos.
Purificação de uma solução heterogênea de células- Cell Sorting
Citometria de Fluxo 
Principio básico – emprego de uma radiação laser direcionada que excita os flourocromos;
Os flourocromos ao serem excitados pelo laser, emitem luz, que dependendo do comprimento de onda, possuem uma cor caracterizas;
Assim, pode-se pesquisar informações biológicas, moleculares e/ou bioquímicas das células em suspensão.
Citometria de Fluxo
CITOMETRIA DE FLUXO 
Sistema Fluido 
Sistema Eletrônico 
Sistema Ótico 
Introduz e alinha as partículas em um fluxo continuo.
Gera e coleta os sinais de luz.
Converte os sinais ópticos em sinais eletrônicos, disponibilizando-os para análise no computados.
Citometria de fluxo : Técnica 
Células para análise por citometria de fluxo são primeiramente marcadas com corantes fluorescentes;
As células são forçadas a passar por um bico em uma corrente unicelular que passa por um feixe de laser;
Tubos fotomultiplicadores (PMTs) detectam a dispersão de luz, o que é um sinal de tamanho celular e granulosidade, e emissões de diferentes corantes fluorescentes;
Essa informação é analisada pelo computador (CPU).
Os dados captados podem ser mostrados usando diferentes representações gráficas: 
Citometria de fluxo
Fluorocromos
Os fluorocromos são moléculas fluorescentes, que estão inicialmente em repouso, e que são excitados por uma determinada fonte luminosa (laser), emitindo uma luz de comprimento de onda (cor) característica.
A maioria dos fluorocromos é excitada por um laser argônio (comprimento de onda de 488 nm - azul), presente em todos os citômetros de fluxo. 
• Laser Ultravioleta – 355 nm 
• Laser Violeta-Azul – 405 nm 
• Laser Hélio-Neônio (HeNe) – 633 nm (vermelho) 
Os fluorocromos são geralmente acoplados a anticorpos com afinidade por determinada estrutura química das células e biologicamente significativas, as quais podem caracterizar um tipo celular, um evento bioquímico ou um tipo de resposta imunológica.
Cluster (agrupamento) de diferenciação (cluster de designação), abreviado como CD.
Citometria de fluxo
Citometria de fluxo
Para utilizar a citometria de fluxo como ferramenta de estudo, as amostras devem estar em uma suspensão e dois protocolos principais devem ser seguidos: 
 Protocolo de separação de células;
 
 protocolo de marcação citofluorimétrica.
Aplicação da citometria de fluxo
Imunofenotipagem
Usando anticorpos conjugados com fluorescência direcionados a uma proteína de interesse, as células que expressam essa(s) proteína(s) na superfície ou intracelularmente podem ser detectadas por citometria de fluxo. Tipos de células específicos podem ser distinguidos dentro de uma população mista usando múltiplos anticorpos conjugados com fluorescência.
Estado de saúde celular
Da viabilidade à apoptose em estágio avançado ou morte celular programada
Status do ciclo celular
Fornecendo uma ferramenta poderosa para avaliar as células na fase G0/G1 versus fase S, G2 ou poliploidia, incluindo análise de proliferação e ativação celular. A intensidade fluorescente é usada para determinar a quantidade de DNA celular presente em cada célula.
Vantagem
As duas maiores vantagens da citometria de fluxo são sua capacidade de medir um grande número de parâmetros (2 a 30 ou mais) em uma amostra e sua capacidade de coletar informações de milhões de células em questão de segundos.
Esta técnica analítica é uma ferramenta poderosa para aplicações que incluem um número significativo de análises celulares, desde a fenotipagem até a saúde e viabilidade celular.
Utilização da técnica 
A citometria de fluxo é frequentemente usada em:
• Onco-hematologia: contagem absoluta de células, diagnóstico/prognóstico e acompanhamento do tratamento de doenças hematológicas (leucemia e linfoma), análise da medula óssea, contagem de reticulócitos.
• Imunologia: Identificação e contagens absolutas de populações de células imunes, análise de
citocinas, tipagem de tecidos, estimulação de linfócitos.
• Microbiologia: diagnóstico bacteriano e viral, sensibilidade aos antibióticos.
• Genética: cariótipo, diagnóstico de portador, diagnóstico pré-natal.
• Farmacologia: estudos de cinética celular.
Desvantagem
É um equipamento de alto custo, ter uma baixa vazão celular, causar a morte de muitas células da amostra e também pela necessidade de células em suspensão, que em alguns materiais necessita de uma preparação mais difícil ou às vezes impossível. Mas também se tem a vantagem de ser automatizado e de disponibilizar os resultados no computador.
REFERÊNCIA 
CUNHA, Clarissa Ferreira; CÔRTES, Fernanda Heloise; FLORES, Geane Lopes Flores; ARCILA , Juan Camilo Sánchez. Citometria de Fluxo: Imunofenotipagem e Avaliação da Produção de Citocinas. 2013. 92 f. Monografia - Instituto Oswaldo Cruz/FIOCRUZ., [S. l.], 2013. Disponível em: http://www.ioc.fiocruz.br/picf/PROD_LITERAT/Apostilas/ApostilaCMFCurso_Ferias2012.pdf. Acesso em: 3 maio 2021.
Abbas, AK; Lichttman, AH. Imunologia Celular e Molecular . 5. ed. Rio de Janeiro: Elsevier, 2005. 
ROITT, I.M.; DELVES, P.J. Fundamentos de Imunologia. 12ᵃ Edição. Editora Guanabara Koogan, 2013.
CITOMETRIA de Fluxo. Direção: ImunoCanal. Youtube: [s. n.], 2020. Disponível em: https://www.youtube.com/watch?v=EMwas8hyi4M. Acesso em: 29 abr. 2021.
CITOMETRIA de fluxo e qual a sua aplicação. Disponivel em: http://bioemfoco.com.br/noticia/o-que-e-citometria-de-fluxo-e-qual-sua-aplicacao-para-a-saúde. Acesso em: 04 mai. 2021.