Oocistos de Toxoplasmagondii , cistos de Giardia e Cryptosporidium oocistos em piscinas externas no Brasil 2

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''Oocistos de Toxoplasma gondii,
cistos de Giardia e oocistos de
Cryptosporidium em piscinas
externas no Brasil''
Alunas: Victória Dantas e Maria Thereza Lourenço 
Professora: Alexandra Paiva Araújo Vieira
Pineda et al., 2020. 
Introdução
Natação é a atividade favorita em estações mais quentes;
Exposição à diversos agentes infecciosos, que podem ser ingeridos
acidentalmente;
Estudos epidemiológicos comprovam: maior risco de doenças
gastrointestinais em banhistas do que não banhistas; 
 
EUA: surtos de infecções parasitárias Cryptosporidium spp., principal etiologia 
 em playgrounds aquáticos e piscinas;
Introdução
Sintomas: diarréia aquosa profusa e dolorosa, pode durar vários
dias até em indivíduos saudáveis. Sintomas extra-intestinais: dores
articulares, nos olhos, de cabeça recorrentes, tontura e fadiga;
Não existem ainda fármacos curativos efetivos contra o parasita,
usa-se então a Nitazoxanida - possui efeito em saudáveis e não em
imunossuprimidos e co-infectados com HIV; 
Surtos de Giardíase em águas tratadas ou não, com picos nos
meses mais quentes;
Sintomas: diarréia, perda de peso, inchaço e dor abdominal, além
de consequências a longo prazo, mas podem ser assintomáticos.
Introdução
Toxoplasmose de veiculação hídrica: contaminação por oocistos
documentada em vários países; doença zoonótica global, mas sem
informações sobre oocistos em piscinas; NEGLIGENCIADA
Registros de 647 casos de toxoplasmose no RS superou o último
maior caso que tinha acontecido no PR, passando a ser o maior surto
do mundo. No RS as possibilidades de causa eram: água ou vegetais
contaminados;
Os estágios resistentes de Giardia spp., T. gondii e Cryptosporidium
spp. são capazes de manter-se viáveis após a tratamentos físicos e
químicos (como cloro e ozônio) e o grande número de hospedeiros,
aumenta a contaminação. 
Introdução
Primeira avaliação de piscinas na cidade de Campinas, sudeste do Brasil, pela
detecção de Cryptosporidium spp., Giardia spp. e T. gondii por métodos
parasitológicos e moleculares.
Objetivo
Materiais e Métodos
Materiais e Métodos
Sites de amostragem: 21 piscinas; 4 macrorregiões de Campinas, geridas
pela Secretaria de Esporte e Lazer da prefeitura, oferece à população diversas
atividades esportivas gratuitas, todas ao ar livre e usam cloro para
desinfecção;
02 piscinas da FEF também foram inclusas;
Amostragem d’água: 57 amostras; 14 meses (nov 15 - dez 16);
armazenadas em frascos de polipropileno, previamente lavados com Solução
Tween 80 (0,1%) buscando reduzir possíveis parasitas fixados à garrafa;
amostras direto da piscina (PW) e amostras do filtro\máquina (FBW),
processadas no laboratório em 72h.
 O número médio semanal de usuários da piscina varia no verão e no inverno,
a fonte de água da piscina, o tipo de usuários de natação (crianças, adultos
ou ambos), o uso de cloro, algicida ou flocos culantes, a frequência de troca
do filtro de areia, o número de filtros em operação, a presença de animais
domésticos/selvagens ou roedores, a frequência de retrolavagem do filtro, a
ocorrência de acidentes fecais, o uso da piscina pelos moradores locais
durante a noite, e a presença de lixo na água da piscina foi registrado para
cada evento de amostragem. 
A turbidez e o pH das amostras de água foram medidos imediatamente após a
amostragem usando um Turbidímetro Portátil HACH® 2100P e Thermo
Scientific Orion Star-™ Medidor de pH Orion 3 Star, respectivamente. 
Materiais e Métodos
Detecção de Cryptosporidium e Giardia por
métodos parasitológicos e moleculares 
Detecção de Cryptosporidium e Giardia por métodos
parasitológicos e moleculares 
Amostras PW e FBW concentradas por uma membrana por protocolo de
filtração;
Para amostras de alto grau de turbidez foi feita uma etapa de pré-filtragem em
papel de filtro;
Alíquotas de 0,5 ml de amostras peletizadas foram purificadas através da
técnica de separação imunomagnética através de esferas magnéticas
revestidas com anticorpos específicos para os patógenos;
Depois do processo de purificação os cistos e oocistos foram corados em
lâminas de poços por isotiocianato de fluoresceína.
 
Detecção de Cryptosporidium e Giardia por métodos
parasitológicos e moleculares 
Lâminas examinadas com microscópio de epifluorescência -> as superfícies das
lâminas foram examinadas em 200x e 400x com filtro de fluorescência FITC;
Cistos e oocistos foram identificados e enumerados de acordo com os seguintes
aspectos: tamanho, morfologia e fluorescência de maçã-verde brilhante;
Confirmação morfológica: realizada com Filtro Diferencial de Contraste de
Interferência;
Resultados expressos: contagem por litro;
As lâminas positivadas também foram submetidas à análise molecular.
Detecção de Cryptosporidium e Giardia por métodos
parasitológicos e moleculares 
A extração de DNA foi realizada a partir de amostras positivas por microscopia,
utilizando PowerSoil® DNA Isolation Kit;
Protocolo de reação em cadeia da polimerase aninhado foi usado para
amplificação do DNA de Cryptosporidium do fragmento do gene 18S rRNA
(RNA ribossômico), negativos e positivos controle foram usados em cada
reação;
Amplificação do DNA de Giardia usaram marcadores moleculares da triose
fosfato isomerase e beta-giardina; Fragmentos de 530 pb de glutamato gene da
desidrogenase também foram obtidos; SSU-rRNA foi amplificado usando o
protocolo descrito por Appelbee, Frederick, Heitman e Olson.
Detecção de Cryptosporidium e Giardia por métodos
parasitológicos e moleculares 
Todas as reações de PCR foram realizadas em um Mastercycler Thermal
ciclador de Eppendorf, os produtos amplificados envolvidos em gel de agarose
2% por eletroforese e visualizado sob luz UV (tempo de execução: 90 min;
100 volts);
Para o sequenciamento das amostras positivas os produtos PCR foram
purificados diretamente usando ExoSAP-IT e todas as amostras foram
sequenciadas com os mesmos primers usados na segunda reação de PCR.
Análise filogenética de Giardia
spp. 
Análise filogenética de Giardia spp. 
Sequências de consenso obtidas a partir do sequenciamento de Sanger de
SSU rRNA e bg loci usando o algoritmo de alinhamento múltiplo
implementado no MAFFT;
Método de refinamento G-INS-i para sequências com homologia global, foram
alinhados;
Sequências contendo extremidades com baixa qualidade de alinhamento foram
aparadas manualmente;
Para o conjunto de sequências obtidas, o modelo de substituição de
cleotídeos que melhor se ajustou aos dados foi inferido, usando o Critério de
Informação Bayesiano no software jModelTest2.
Análise filogenética de Giardia spp. 
Os modelos de substituição com melhor ajuste foram HKY + I para SSU rRNA
e TN + G para bg; 
Dois métodos foram usados para reconstruir as filogenias, permitindo a
comparação entre ambas as inferências;
As filogenias de máxima verossimilhança (ML) foram estimadas usando
RAxML v8 (Stamatakis, 2014) com 1.000 lotes de bootstrap para suporte da
filial. Inferências Bayesianas foram realizadas em MrBayes, com seis cadeias
de Markov independentes, executadas em 10 milhões de etapas cada.
Detecção de Toxoplasma gondii por
técnicas parasitológicas e
moleculares
Detecção de Toxoplasma gondii por técnicas
parasitológicas e moleculares
Protocolo modificado: Aubert e Villena (2009), Ruecker (2013) e Verant et al.
(2014);
O sobrenadante descartado mantido no imã durante a etapa de purificação
IMS, durante o processamento de amostras destinadas a oocistos de
Cryptosporidium spp. e cistos de Giardia spp. foi usado após balançar a
amostra inserida no imã;
O líquido foi centrado por centrifugação a 1,500g por 20 minutos a 4ºC e
então submetido a uma etapa de flotação de sacarose 1,220 g\ml;
Após a centrifugação 1.250g por 10 minutos, o sobrenadante foi recuperado =
2ml e filtrado em sistema de funil contendo membrana de 25 mm de diâmetro
e porosidade de 5um.
Detecção de Toxoplasma gondii por técnicas
parasitológicas e moleculares
Após a filtração, a membrana foi colocada em uma lâmina e coberta comum
meio contendo glicerol e lamínulas;
A membrana de nitrato de celulose foi examinada com filtros para luz UV em
um microscópio de epifluorescência, estruturas semelhantes a oocistos de
T. gondii foram identificados, com base na morfologia e autofluorescência na
cor azul neon vista nas paredes dos oocistos e esporocistos, membranas
positivas foram submetidas a estudos moleculares para confirmação;
A membrana foi lavada com PBS aquecido a 37ºC e raspada, o líquido
resultante foi recuperado para extração de DNA e análise molecular para
confirmar a presença de T. gondii.
Detecção de Toxoplasma gondii por técnicas
parasitológicas e moleculares
Amostras com formas semelhantes a oocistos de T. gondii foram
submetidos à extração de DNA utilizando o kit NucleoSpin® Food;
Em seguida, as reações de nested-PCR foram realizadas utilizando primers,
com o fragmento de repetição 529 pb como alvo, o DNA de uma cepa de T.
gondii foi usado como controle positivo e reações de PCR, para cada amostra
incluída no estudo molecular, a PCR foi executada 3x;
Um nested-PCR - é uma otimização da técnica de REAÇÃO EM CADEIA DE
POLIMERASE (PCR), é realizado um segundo ciclo de amplificação sendo o
produto da primeira amplificação utilizado como alvo. 
Foi direcionado na repetição de 35x gene B1 ativo de T. gondii, usando primers
descritos anteriormente para amplificação de um 155-bp fragmento de DNA.
Detecção de Toxoplasma gondii por técnicas
parasitológicas e moleculares
O DNA da cepa RH foi usado como controle positivo;
As reações de sequenciamento para amostras positivas foram feitos com o
kit ciclador Big Dye terminador, depois as amostras foram processados no
analisador de DNA ABI 3730;
As sequências de DNA obtidas foram montadas e editadas manualmente
usando DNA STAR seqMan e comparados com os dados de sequência
disponíveis no banco de dados GenBank usando a pesquisa BLAST;
Para genotipagem dos isolados DNA de T. gondii positivo foi analisada com
PCR-RFLP usando marcadores.
 
Ensaios de controle de
qualidade
Ensaios de controle de qualidade
2 amostras de FBW, coletadas de uma piscina pública e privada foram
analisadas para determinar a recuperação de cistos e oocistos; 
Uma amostra de 1L foi contaminada artificialmente com suspensões de Easy-
Seed contendo 100 (margem de erro: +- 2,1) oocistos de Cryptosporidium e
99 (margem de erro: +- 1,9) cistos de Giardia spp;
Outro 1L DE FBW foi contaminado com oocistos de T. gondii (100) de uma
suspensão purificada de T. gondii positivo de fezes de gato que foram
mantidas refrigeradas até o uso; 
Por ensaio de SPIKE os oocistos foram previamente inativados pelo calor.
Ensaios de controle de qualidade
Após o enriquecimento as amostras foram agitadas por 10 minutos e depois
processadas;
Para cada ensaio controle outras duas amostras de FBW não enriquecidas
foram processadas para determinar o número eventual de cistos e oocistos
presentes naturalmente; 
Uma amostra de controle negativo também foi analisada para avaliar o
desempenho da detecção de Cryptosporidium e Giardia;
 Foi realizado um teste contínuo de precisão e recuperação usando água ultra
pura como amostra. 
Resultados
Resultados
Revelaram eficiência de recuperação de 15% e 27% para os cistos de Giardia 
 e oocistos de Cryptosporidium, usando a técnica de filtração por membrana;
Para T. gondii foi alcançada uma recuperação de 14% com base na
visualização de oocistos auto fluorescentes após filtração da amostra no
sistema MicroFunnil®;
O teste OPR revelou recuperar 33% para oocistos de Cryptosporidium e 36%
para cistos de Giardia .
 Ensaios de controle de pico
Foram detectados cistos de Giardia: 19% (4\21); 
Oocistos de Cryptosporidium: 9,5% (2\21);
Giardia e Cryptosporidium: 4,7% (1\21);
Semelhantes à oocistos de T. gondii: 33,3% (7\21);
Cistos e estruturas de Giardia semelhantes à oocistos T. gondii: 9,5 (2\21);
Giardia > Cryptosporidium\L; 
1 Cryptosporidium positivo foi encontrado em uma piscina infantil; 
O número de estruturas que exibem morfologia compatível com oocistos de T.
gondii variou de 01 a 23 por lâmina;
Uma piscina foi positiva para cistos de Giardia e outra com estruturas
semelhantes a T. gondii em duas amostragens de diferentes ocasiões;
 Ensaios de imunofluorescência
Resultados
Presença de Giardia confirmada por amplificação de DNA em 3 piscinas e por
reação de imunofluorescência; 
Zero presença de Cryptosporidium confirmada por amplificação de DNA em
qualquer posição de imunofluorescência;
Presença de bandas de T. gondii relacionadas ao alvo REP529 foi confirmado
em 3 piscinas (amostras 11,12,21, 47,48);
Uma identidade de sequência de 98\99% com T. gondii foi encontrado (exceto
amostra 11).
 Análise molecular
Resultados
Genotipagem não foi possível com nenhum dos marcadores;
Nenhuma amostra foi positivada usando o 155-bp fragmento do gene B1;
PW (n=12) 1 positiva para T. gondii (8,3%);
FBW (n=45) 9 positivos para patogênicos (15,5%); 03 com Giardia e 06 com
T. gondii utilizando a meta REP529.
 Análise molecular
 
Resultados
Discussão
Discussão
Atividades em piscinas expõe as pessoas a infecções de parasitas
protozoários;
Giardia e Cryptosporidium são os protozoários mais encontrados em
veiculação hídrica na América do Sul;
O monitoramento não é realizado rotineiramente;
A detecção de oocistos de T. gondii é um desafio pois não existem métodos
padronizados para detecção e falta de de prática e métodos táticos e sensíveis
para recuperar e detectar números baixos de oocistos nas amostras;
Falta de um sistema confiável e um kit comercialmente disponível de
separação imunomagnética, ou de anticorpo monoclonal dirigido contra
epítopos da parede do oocisto de T. gondii torna o monitoramento do parasito
mais difícil.
 
Discussão
Existem métodos padronizados e validados pra Giardia e Cryptosporidium e
exigem qualidade dos testes controle;
O processo de filtração por membrana obteve recuperação de 15% para
Giardia e 27% para Cryptosporidium (as amostras continham grande
quantidade de suor, urina, resíduos de pele, cabelo, cosméticos e outros que
prejudicaram o método);
Adicionando Easy-Seed na amostra houve melhora dos resultados: 33% de
oocistos e 36% de cistos;
Os dados sofrem influência de certos fatores: pequeno número de amostras,
volume, concentração do inóculo, tornando difícil a comparação com os
critérios do controle de qualidade.
 
Discussão
T. gondii foi avaliado devido a presença de gatos e ausência de filtros em
alguns estabelecimentos (gatos são os únicos hospedeiros definitivos de T.
gondii e uma infecção primária pode resultar na excreção de milhões de
oocistos não esporulados no ambiente, tornando-se infectados em 1\2 dias);
A recuperação de oocistos de T. gondii de águas recreativas pode variar de
0% a 8,8% por floculação e densidade de sacarose centrifugação em
gradiente; 
Embora a grande quantidade de etapas, a metodologia proposta alcançou
uma taxa de recuperação ligeiramente superior (14%) e permitiu a detecção
simultânea de todos os 3 protozoários. 
Discussão
não foram observadas alterações morfológicas nos oocistos de T. gondii
durante o teste de pico de matriz após a filtração da amostra concentrada na
membrana de 25mm e a amostra manteve a coloração azul sob excitação UV;
Para amostras de FBW várias estruturas com tamanho e morfologia similar a
T. gondii foram observadas nas lâminas (detritos prejudicaram a visualização
das estruturas autofluorescentes);
Esse tipo de amostra (FBW) fornece o melhor cenário para observação, pois
pode estar com maior concentração de protozoários, mesmo em amostras
túrbidas;
Discussão
Os métodos moleculares são muito úteis para avaçiação, devido a
similaridade entre as formas morfológicas das espécies (Hammondia e
Bernoitia ou Neospora caninum);
REP529 -> amplamente utilizado, + sensibilidade e especificidade (entretanto,
menor especificidade em amostras ambientais);
Diagnóstico molecular combinado com sequenciamento para confirmar a
identidade deT. gondii para 04 amostras, presença em 14,2% das piscinas;
Nenhum sucesso com nested-PCR do fragmento 155 pb do gene B1 devido a
baixa concentração de parasitos.
;
Discussão
Resultados mal sucedidos na genotipagem de T. gondii, a técnica foi
desenvolvida com uma única reação de PCR para isolados do parasita;
PCR-RFLP demonstrou baixa sensibilidade em amostras primárias;
A presença de oocistos de T. gondii em águas superficiais fonte da água
potável foi detectada com a técnica qPCR (das 39 amostras 3 foram +);
Considerando esses dados, a presença de gatos e água fonte para torneiras
e piscinas torna a contaminação por T. gondii viável reforçando a validade dos
dados aqui apresentados pelos testes moleculares;
Os resultados positivos para Giardia spp e Cryptosporidium spp. não é
surpreendente e já foram obtidos em outros países (Bélgica e EUA).
Discussão
Usando técnicas moleculares baseadas em SSU-IRNA e bq, a presença de
Giardia foi confirmada em três das quatro piscinas, consideradas positivas
pela IFA;
Essas sequências pertenciam à genética como semblage A, enquanto para o
gene gah houve a amplificação das bandas que revelaram a presença de
outro tipo de microrganismo (bactérias do gênero Pseudomonas);
Estudos futuros devem reavaliar a especificidade desses marcadores 
Cryptosporidium foi identificado em 2 piscinas apenas por imunofluorescência,
a falha na detectação por técnicas moleculares são atribuídas a baixa
quantidade de DNA, já que apenas 01 cisto foi visualizado;
Sabe-se que o número de ciclos de congelamento-descongelamento é
essencial pois um número maior pode degradar o DNA.
Discussão
Em uma piscina houve liberação acidental de fezes, a piscina não tinha filtros
mas a água era clorada;
Níveis de cloro mantidos de acordo com as recomendações: 1-3mg\L;
Oocistos de Cryptosporidium podem sobreviver de 3,5 a 10,6 dias na água
das piscinas, exibindo tolerância extrema;
Presença e manutenção dos filtros é essencial para mitigar os surtos;
Evitar uso desses espaços quando estiver com sintomas como diarréia
também é outra forma de evitar.
Discussão
O processo analítico de filtração por membrana modificada empregado neste
estudo permitiu a detecção de patógenos transmitidos pela água mesmo sob
dificil amostragem;
O procedimento é uma alternativa para o isolamento de cistos e oocistos de
amostras complexas. A recuperação do líquido sobrenadante descartado
durante a imunomagnética purificação por separação de oocistos de
Cryptosporidium e cistos de Giardia foi útil para a detecção de oocistos de T.
gondii em piscinas amostras de água;
A análise de oocistos de T. gondii deve ser incluída ao monitorar a qualidade
de água das piscinas, principalmente em locais abertos.
 "Toxoplasma gondii oocysts, Giardia cysts and Cryptosporidium oocysts in outdoor
swimming pools in Brazil", Pineda et al., 2020. 
Referência