Alterações genéticas

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TUTORIAL 2 - GENÉTICA
● Fluxo da informação genética e Transcrição do DNA:
Alguns pesquisadores criaram a hipótese de que o DNA serve como molde para sintetizar o
RNA, e após esse processo as moléculas do RNA vão para o citoplasma e determinam
como os aminoácidos irão se arranjar para formar as proteínas. Essa teoria é chamada de
Dogma central da biologia. Ao serem descobertas enzimas virais (transcriptase reversa)
capazes de usar o RNA como molde para produzir o DNA foi possível entender que essa
não era a única forma de passagem dos genes.
Esse processo ocorre da seguinte forma: o DNA é duplicado e usado como fita molde, o
RNA é transcrito e forma um RNA de fita simples que tem a sequência de bases
nitrogenadas iguais a uma das fitas do DNA. Em seguida ocorre a tradução, que converte a
sequência de bases do DNA numa sequência de aminoácidos, gerando a proteína.
As polimerases do RNA são enzimas que catalisam a síntese do RNA utilizando o DNA
como molde na transcrição. Essas enzimas são responsáveis por transcrever um conjunto
específico de genes, elas são chamadas de polimerase I, II e III do RNA e não precisam
de primer (iniciadores) para dar início a nova cadeia de RNA, diferente das polimerases do
DNA. Nos eucariontes existem 3 tipos dessas enzimas, já nos procariontes só 1 tipo. Essas
enzimas utilizam os fatores gerais de transcrição (GTFs) previamente ligadas ao promotor
para auxiliar o processo de transcrição que atraem as polimerases ao local de ativação
correto, já que essas enzimas não se ligam diretamente ao DNA e sim a essas proteínas.
Polimerase I do RNA: sintetiza a molécula precursora de três tipos de RNA ribossômico
(28S, 18S e 5,8S);
Polimerase II do RNA: transcreve os genes do RNA mensageiro, precursores de
microRNA e RNA longos não codificadores (RNAInc);
Polimerase III do RNA: sintetiza o RNA ribossômico 5S, o RNA transportador e pequenos
RNA nucleares (snRNA).
1. A transcrição começa dentro da bolha de transcrição (que é a região “aberta” do DNA) e
começa quando as pontes de hidrogênio do DNA são temporariamente rompidas, tendo 18
de seus pares separados da dupla hélice para que uma fita seja usada como molde. A
polimerase do RNA se liga numa sequência especial de DNA chamada promotor. Na
sequência de bases presentes nessa região fica o sítio de iniciação, que contém a primeira
base do DNA a ser transcrita (chamada de +1). A partir desse ponto a polimerase se move
ao longo do molde, sintetizando o RNA até alcançar a região terminalizadora, depois que a
polimerase passa a fita molde
do DNA volta se emparelhar.
Um exemplo de promotor é o
TATA box, rico em A e T e fica
na posição -30, ele permite
que fatores de transcrição e a RNA polimerase se liguem nele. Nucleotídeos que vem antes
do sítio de iniciação recebem números negativos estão a montante. Nucleotídeos que vem
depois do sítio de iniciação são marcados com números positivos e estão a jusante.
2. Após ligada a RNA polimerase ao promotor inicia-se a fase de alongamento, basicamente
a fita de RNA fica mais longa a medida que são adicionados novos nucleotídeos. Durante o
alongamento, a RNA polimerase "caminha" ao longo de uma fita molde de DNA, da 3' para
5'. Para cada nucleotídeo no molde, a RNA polimerase adiciona um nucleotídeo de RNA
correspondente (complementar) à extremidade 3' da fita do RNA. As polimerases próximas
ao início do gene têm caudas de RNA curtas que ficam cada vez maiores à medida que a
polimerase transcreve mais do gene.
Exemplo: existem 2 cadeias e 3 genes, para cada gene só 1 cadeia será usada como molde
para transcrição. O sentido da transcrição é sempre o mesmo, começa na extremidade 3’
da cadeia molde (5’ do RNA transcrito) e termina na ponta 5’ do DNA molde (3’ do RNA
transcrito). A sequência de bases do RNA é complementar à cadeia molde do DNA,
apresentando uracila no lugar de timina.
3. A RNA polimerase vai continuar transcrevendo até encontrar sinais para parar. O
processo de término da transcrição é chamado terminação e isso acontece uma vez que a
polimerase transcreve uma sequência de DNA conhecida como terminador. A terminação
tem início quando um sinal de poliadenilação aparece no transcrito de RNA. Essa é uma
sequência de nucleotídeos que marca onde o RNA deve terminar. O sinal é reconhecido por
uma enzima que corta o transcrito de RNA nas proximidades, liberando-o da RNA
polimerase. A RNA polimerase continua sintetizando RNA desnecessário, mas por não ser
protegido pelo encapamento esse pedaço é degradado. Todo esse processo ocorre no
núcleo da célula e antecede a tradução.
● Leitura do DNA:
Antes da tradução ocorrer o RNAm sofre algumas reações. Ao ser sintetizado pela RNA
polimerase II o RNA é considerado um transcrito primário, que tem um tamanho longo e
ainda não é capaz de codificar uma proteína, e esse tamanho deve-se a longas cadeias
nucleotídicas chamadas de íntrons, porque estão intercalados nas sequências codificadoras
a qual será expressa, formando blocos chamados éxons.
1. Splicing durante esse processo o pré-RNAm perderá os íntrons para que seu tamanho e
sequência de nucleotídeos seja favorável a produção de proteínas, ou seja, o RNAm se
tornará maduro. Isso ocorre porque os íntrons não parecem ter uma sequência de
nucleotídeos úteis para as células, então as proteínas snurps (snRNPs) vão removê-los. As
snurps carregam moléculas de snRNA, que possuem 5 tipos funcionais no splicing (U1, U2,
U3, U4, U5 e U6), a U1 e U2 interagem entre si, com o pré-RNAm e várias proteínas para
definir os limites do íntron, e as outras 3 formam um complexo e interagem com a U1 e U2 e
com o pré-RNAm para mudar sua configuração, esse complexo é chamado spliceossomo.
O spliceossomo cliva cada extremidade do íntron e o libera como um laço, o papel do
snRNA é reconhecer e, por complementaridade de bases, se emparelhar com a sequência
de nucleotídeos que marcam o início e o ponto de ramificação de cada íntron, assim as
snurps aproximam as duas pontas do íntron que não foram retiradas. Existem vários tipos
de splicing, por isso existem formas tão variadas de genes.
2. Encapamento é um dos procedimentos que torna o RNAm maduro, nesse processo a
extremidade 5’ do RNA é encapado pela adição de um nucleotídeo contendo Guanina
metilado. O encapamento ocorre no início da transcrição, quando o transcrito é pequeno, a
molécula 7-metilguanosina se liga a ponta 5’ do transcrito tornando-se 5’ cap, cuja função é
proteger o RNA recém formado da degradação, além de agir no início da tradução.
3. Poliadenilação ocorre na extremidade 3’ do transcrito, logo após ser transcrita uma
sequência específica da molécula (sinal de poliadenilação) o RNA transcrito é clivado.
Depois a enzima polimerase poli-A adiciona de 100 a 200 resíduos de nucleotídeos
contendo adenina, na extremidade 3’ da cadeia, completando o pré-RNAm. A cauda de
poli-A tem função de exportar o RNAm maduro para o citoplasma, afeta sua estabilidade no
citoplasma e faz parte de um sistema que será reconhecido pelo ribossomo durante a
tradução.
A tradução ocorre no citosol dentro dos ribossomos, nela os códons do RNAm são lidos por
ordem (da extremidade 5’ para a 3’) por meio das moléculas RNAt (transferência), cada um
desses RNAs possui um anticódon, que é um conjunto de 3 nucleotídeos que se liga ao
códon correspondente no RNAm pelo pareamento de bases (5’AUG-UAC3’ por exemplo), e
a outra extremidade do RNAt traz o aminoácido
especificado pelo códon, esses aminoácidos são
adicionados na cadeia polipeptídica até formar uma
proteína.
1. Iniciação para a tradução ocorrer é preciso de um
ribossomo (com subunidades pequena e grande), um
RNAm trazendo a informação genética e um RNAt
carregando o primeiro aminoácido da proteína (geralmente é a metionina), e eles devem
estar unidos para formar o complexo de iniciação que irá produzir uma nova proteína.
Algumas proteínas especializadas auxiliam esse processo, elas movimentam o RNAm e o
RNAt para que se encontrem de forma ordenada e previsível, esse processo tem gasto
energético de GTP. Primeiro o RNAtcarregando a metionina se liga à subunidade
ribossômica pequena. Juntos, eles se ligam à extremidade 5' do RNAm através do
reconhecimento do cap 5' GTP. Em seguida, eles "caminham" ao longo do RNAm na
direção 3' e param quando alcançam o códon de iniciação (com frequência, mas nem
sempre, o primeiro AUG).
2. Alongamento o primeiro RNAt carregando a metionina começa no meio no ribossomo,
chamado de sítio P. Ao lado, um novo códon é exposto em outro compartimento, chamado
de sítio A. O sítio A será o "desembarque" para o próximo RNAt, aquele cujo anticódon é o
correspondente perfeito (complementar) do códon em exposição. Uma vez que o RNAt
correspondente desembarca no sítio A é formada uma ligação peptídica que conecta um
aminoácido a outro. Esta etapa transfere a metionina do primeiro RNAt para o aminoácido
do segundo RNAt no sítio A. A metionina forma o N-terminal (grupo amina) do polipeptídeo,
e o outro aminoácido é o C-terminal (grupo carboxila). Depois que a ligação peptídica é
formada, o RNAm é puxado para frente no ribossomo por um códon. Esse deslocamento
permite que o primeiro RNAt, agora vazio, saia através do sítio E (do inglês “exit”). Isso
também faz com que um novo códon fique exposto no sítio A, para que todo ciclo se repita.
A proteína titina, que é encontrada nos músculos e é o mais longo polipeptídeo conhecido.
3. Terminação ele acontece quando um códon de parada no RNAm (UAA, UAG ou UGA)
entra no sítio A. Os códons de parada são reconhecidos por proteínas chamadas de fatores
de liberação, os quais se adaptam perfeitamente no sítio P (embora não sejam RNAt).
Fatores de liberação confundem a enzima que normalmente forma as ligações peptídicas:
fazem-na adicionar uma molécula de água ao último aminoácido da cadeia. Essa reação
separa a cadeia do RNAt, assim a proteína recém-produzida é liberada. E depois esses
elementos podem voltar a um novo ciclo de tradução.
Os Polipeptídeos muitas vezes precisam de algumas "edições". Durante e após a tradução,
aminoácidos podem ser quimicamente alterados ou removidos. O novo polipeptídeo
também vai se dobrar em uma estrutura em 3D distinta e podem se associar a outros
polipeptídeos para formar uma proteína com múltiplas partes. Muitas proteínas são boas em
se dobrarem sozinhas, mas algumas precisam de auxiliares ("chaperonas") para evitar que
se unam incorretamente durante o processo complexo que é o dobramento.
● Função do DNA lixo:
Antes acreditava-se que 98% do DNA não era funcional, e só 2% era utilizado para síntese
de proteínas. As pesquisas hoje relatam 80% de funcionalidade do DNA, uma grande parte
disso atua apenas em um tipo específico de célula. Embora não seja capaz de codificar a
produção de proteínas, o “DNA lixo” tem influência direta sobre o modo como elas atuam no
organismo. Isso porque age como controlador, ligando ou desligando os genes. E é ainda
capaz de fazer o mesmo gene produzir proteínas diferentes. Por exemplo, apesar de todas
as células do corpo terem o gene que codifica a produção de insulina (o hormônio que abre
a porta das células para a entrada da glicose que está no sangue) sua ativação se dá
apenas no pâncreas. O moderador desse processo, acredita-se agora, está nessa outra
parte do DNA.
● Tipos de Rna e sua função:
O RNA é um polímero composto por 4 tipos de nucleotídeos, seu açúcar é a ribose, possui
um grupo hidroxila (OH) adicional no carbono 2’, possui a uracila como base nitrogenada ao
invés da timina e sua fita é simples, com os nucleotídeos ligados entre si a partir de ligações
covalentes. Apesar de ter uma fita simples quando comparado a dupla hélice do DNA, o
RNA tem uma arquitetura tridimensional bem complexa e definida, e isso permite que ele
realize dobramentos sobre si mesmo, por isso a molécula do RNA forma regiões de dupla
hélice em locais com sequência de bases complementares. É por essas regiões
dupla-hélice que a estrutura do RNA o permite realizar diversas funções, como a
transportadora e ribossômica.
O RNAs se dividem em duas classes, os funcionais atuam agindo como DNA em diversas
atividades biológicas e a outra contém a informação genética para sintetizar proteínas.
RNAm participa da tradução que é o processo anterior a síntese de proteínas, o RNAm tem
as informações para a síntese de proteínas na forma de 3 nucleotídeos chamados de
códons, existem 61 códons diferentes para cada
aminoácido e eles originam todas as proteínas existentes.
O códon AUG marca o início da tradução e outros 3 códons
marcam o polipeptídeo como terminado.
RNAt eles variam entre si e isso permite a distinção entre
os diferentes tipos de moléculas, todos eles interagem com
sítios específicos dos ribossomos durante a síntese de
proteínas. Além disso, em uma de suas extremidades eles se associam ao RNAm (por
complementaridade de bases) e na outra eles transportam aminoácidos. Os RNAt tem
bases não usuais, diferentes de A, G, C e U, e essas bases se originam por modificações
das bases usuais após serem incorporados na molécula de RNAt.
RNAr nos ribossomos existem duas subunidades, uma grande e outra pequena, e elas se
encaixam uma na outra formando um complexo, mais da metade desse complexo contém
RNA ribossômico com função catalítica. Durante a síntese de proteínas esse RNA interage
com o RNAm e o RNAt durante as 3 fases da tradução, sendo auxiliado por algumas
proteínas a se manter na estrutura adequada para exercer sua atividade catalítica.
RNAsn participam do splicing na maturação do RNAm, são chamados de pequenos RNA
nucleares. Sua função é reconhecer e aproximar os íntrons no pré-RNAm.
RNAsi são RNAs curtos de interferência, sua função é silenciar genes, são muito
promissores na genética reversa.
RNAinc são RNA longos não codificadores, sua função é regular a expressão gênica e
inibir a atividade de elementos de transposição.
● RNA de interferência no tratamento terapêutico:
A interferência por RNA (RNAi) é um mecanismo de silenciamento gênico
pós-transcricional. Esse mecanismo é mediado por pequenos RNAs capazes de reconhecer
especificamente uma sequência de RNAm e mediar sua clivagem ou reprimir sua tradução.
O emprego da RNAi tem sido muito estudado, especialmente em infecções virais, câncer,
desordens genéticas herdadas, doenças cardiovasculares e mesmo em doenças
reumáticas. As vias de quebra de tolerância e inflamação são alvos potenciais para terapia
com RNAi em doenças inflamatórias e autoimunes.
1. A interferência por RNA (RNAi) é um mecanismo celular responsável pelo silenciamento
gênico pós-transcricional (PTGS) atuando sobre o RNA mensageiro (mRNA). Seu de ação
consiste em uma molécula de fita dupla de RNA que ao ser ativada se liga numa sequência
de nucleotídeos complementar no mRNA, causando o silenciamento por inibição da
tradução e/ou degradação do mRNA.
A RNAi tem sido o método de escolha no silenciamento de genes em células de mamíferos
por sua seletividade e potência. O emprego de RNAi como abordagem terapêutica tem sido
considerado altamente promissor no combate a doenças em que a expressão anormal de
certos genes pode ser identificada como a causa ou o fator contribuinte. Entre essas
doenças está o câncer, doenças genéticas dominantes, doenças autoimunes e infecções
virais.
2. Há basicamente duas estratégias para se induzir RNAi. Na primeira, siRNAs
pré-sintetizados são introduzidos nas células-alvo. Mas esse processo é temporário. A
segunda estratégia se baseia na introdução de vetores que codificam o shRNA, o que
resulta em silenciamento estável de longa duração na célula. A transcrição do shRNA é
controlada por sequências promotoras para as RNA polimerases II ou III, dependendo do
tipo de expressão desejada.
3. Existem três atributos importantes que devem ser levados em consideração quando se
deseja projetar e selecionar um siRNA. São eles: potência, especificidade e estabilidade às
nucleases. Um dos fatores críticos para o sucesso no uso de RNAi é a capacidade do
siRNA em silenciar especificamente o mRNA-alvo. O silenciamento gênico mediado por
siRNAs pode ser altamente específico,como evidenciado pelo silenciamento seletivo de
alelos que divergem em um único nucleotídeo. No entanto, siRNAs também podem
reconhecer e interferir com a expressão de mRNAs que apresentam homologia parcial com
o mRNA-alvo, alterando os níveis de mRNA de genes que não são o alvo desejado (efeitos
fora do alvo) embora com menor intensidade.
4. O principal obstáculo ao uso de siRNAs como drogas terapêuticas é obter sua
penetração na célula através da membrana plasmática, de modo a ser incorporado na via
de RNAi e causar a degradação do mRNA-alvo no tecido de interesse. Na ausência de
agentes de transfecção ou alta pressão, a maioria das células não incorpora siRNA, por sua
carga negativa, logo não penetra com facilidade através das membranas celulares
hidrofóbicas. Entretanto, silenciamento in vivo tem sido relatado após administração direta
de siRNAs desprotegido (naked) a locais anatomicamente isolados (intravítreo, intranasal e
intratecal), demonstrando a possibilidade de entrega de siRNAs em olhos, pulmão e sistema
nervoso central. Entretanto, o emprego terapêutico de RNAi de modo mais amplo depende
da possibilidade de associar às moléculas de siRNA outras propriedades farmacológicas
como biodisponibilidade e seletividade para as células-alvo. Diversas estratégias empregam
injeção endovenosa de siRNAs quimicamente modificados, mediante conjugação ao
colesterol, ou protegidos dentro de lipossomas catiônicos. A conjugação ao colesterol tem
mostrado bons resultados, pois prolonga a meia-vida dos siRNA na circulação por meio de
ligação a lipoproteínas, que são resistentes à filtração pelos rins e oferecem também
proteção à ação das nucleases plasmáticas. Embora eficaz, a conjugação ao colesterol não
é um método seletivo, pois o complexo colesterol-siRNA-lipoproteína pode ser endocitado
por receptores de colesterol encontrados em todos os tipos celulares.