PCR-Real-Time

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Protocolo para PCR Real Time
1- Ligar o fluxo e UV. Limpar o fluxo e micropipetas com álcool e aguardar 30 min. Utilizar somente
ponteiras e Eppendorfs estéreis, e luva sem talco.
2- Enquanto aguarda o tempo do UV, ligar o computador do equipamento de PCR, montar a placa no
software (fazer uma cópia impressa ou anotada para distribuir as amostras na placa), abrir o protocolo
padrão de termociclagem*, ligar o equipamento de PCR e aguardar até que seja reconhecido pelo
computador.
3- Diluição das amostras de cDNA para curva padrão (para o teste de eficiência dos primers) - Retirar
sempre 3 µl da concentração inicial e adicionar 27 µl de água MilliQ para fazer a amostra diluída 10
vezes, em tubo de 200 µl.
Exemplo:
4- Diluição dos primers –
Para o ESTOQUE a 100 µM: Sempre diluir o equivalente à quantidade em nmol, multiplicando por 10
vezes, em microlitros de água MilliQ. Para o uso: diluir o estoque 10 vezes
Exemplo: Primer em quantidade de 10 nmol adicionar 100 µl de água MilliQ ESTOQUE a 100 µM
Para o USO a 10 µM: 10 ul de primer estoque a 100 µM + 90 µl de água MilliQ
5- Preparo do Master Mix para PCR -
Calcular a quantidade de poços que serão utilizados (n):
n = (amostras x diluições x réplicas) + controle negativo (NTC) + 1 (segurança p/viés de pipetagem)
Exemplo: n = [1 amostra (fígado F1) x 3 diluições (cDNA de F1 1:1, 1:10 e 1:100) x 3 (triplicatas) ] + 3
(controle negativo em triplicata) + 1 (limite da pipetagem) = 13
REAGENTE QUANTIDADE (x n)
SYBR Green 10 µl
Primer Left 0,4 µl
Primer Right 0,4 µl
Água Milli-Q 7,2 µl
 Pipetar 18 µl do Master Mix por poço, e depois acrescentar 2 µl de cada amostra.
6- Selar a placa e centrifugar rapidamente (dar um spin). Colocar a placa no equipamento de PCR e
iniciar o protocolo de termociclagem*.
*OBS: Protocolo Padrão de Termociclagem:
1- 50° C - 2 min
2- 95° C - 2 min (Hot start para ativação da enzima Taq polimerase)
3- 95° C - 15 sec
4- 60° C - 1 min  Plate Read
5- “GO TO 3” , “44 more times” (para 44 ciclos)
6- Melt curve: 50° C – 95° C; increment 0,5° C for 10 sec Plate Read
7- END
cDNA 1:1
(sem diluir) cDNA 1:10 cDNA 1:100
3 µl cDNA 1:1 +
27 µl MilliQ
RESSUSPENDER
3 µl cDNA 1:10 +
27 µl MilliQ
RESSUSPENDER