'RELATÓRIO TOXICOLOGIAfim' 2022

Prévia do material em texto

UNIVERSIDADE PAULISTA - UNIP 
RELATÓRIO DE AULAS PRÁTICAS 
 
 
 
 
 
 
 
 
CURSO: FARMACIA 
DISCIPLINA: Toxicologia e Análises toxicológicas 
NOME DO ALUNO: Selma de Cassia Correa leal R.A: 2053396 
POLO: Macedo 
 
 
 
 
SÃO PAULO 
2022 
 
TÍTULO DA AULA: Padronização de Fármacos por Cromatografia em Camada 
Delgada (CCD) 
1.INTRODUÇÃO 
Apesar da existência de metodologias de análise modernas com alta 
especificidade e elevada sensibilidade, grande parte dos laboratórios de 
toxicologia analítica ainda utilizam métodos clássicos, como a cromatografia 
em camada delgada (CCD) (Linden et al., 2007). A técnica de CCD é 
considerada como método de escolha para a triagem de substâncias 
desconhecidas devido a sua velocidade, confiabilidade, simplicidade, baixo 
custo e habilidade de gerar parâmetros como cor e fator de retenção (Rf), 
frequentemente expresso multiplicado por 100 (hRf), em um curto intervalo de 
tempo, sendo considerada uma técnica de triagem mais abrangente que os 
imunoensaios (Moreau & Siqueira, 2008). 
2.OBJETIVO: Padronizar o comportamento do fármaco na realização de testes 
rápidos utilizados como triagem da exposição do organismo a fármacos ou 
drogas. 
 
AMOSTRA 
Padrões 
1. Ácido Salicílico 
 
REAGENTES E SOLUÇÕES 
Agentes cromogênicos: 
1. Solução de cloreto férrico (FeCl3)5% 
 
SISTEMA SOLVENTE: 
Cuba ácida: clorofórmio: acetona (9:1) 
 
3.MATERIAIS E MÉTODOS 
TÉCNICA 
1. Aplicar de 5 a 10 μL (5 a 10 μg) da solução padrão em uma placa 
cromatográfica, por meio de tubos capilares ou micropipetas. 
 
Deve-se atentar que o diâmetro do solvente não deve ultrapassar 5 mm, 
uma vez que manchas muito grandes podem descaracterizar a 
identificação da substância. Um secador de cabelo a frio pode ser 
utilizado para evaporar o solvente mais rapidamente e aplicar a 2,0 cm 
da borda inferior da placa. 
2. Colocar a cromatoplaca em uma cuba de desenvolvimento previamente 
saturada contendo o sistema solvente clorofórmio: acetona (9:1). 
 
Após o desenvolvimento das placas (10 cm, a partir do ponto de 
aplicação), retirá-las das cubas e deixá-las a temperatura ambiente para 
a completa evaporação do solvente, sob capela. 
 
3. A seguir, revelar a cromatoplaca com FeCl3 e avaliar o comportamento 
da mancha. 
 
4. Expressar os resultados segundo a forma da mancha, cor da mancha e 
Rf, em que: 
Rf = distância percorrida pelo analito 
 distância percorrida pela fase móvel 
 
hRf = Rf x 100; utiliza-se o hRf para evitar o uso de decimais. 
 
 
 
 
 
RESULTADOS E DISCUSSÕES 
A análise não pode ser concluída, pois acetona colocada na cuba não 
era PA, mas sim acetona diluída em água, o que dificultou o processo na 
cromatoplaca impedindo que agente conclui-se totalmente o ensaio. 
 
 
 
 
Foto 1 – Placas cromatográficas na cuba 
 
FONTE: do autor, 2022 
Foto 2 – Utilização do sistema cromatográfico 
 
FONTE: do autor, 2022 
 
 
Observamos na figura 1 que o ensaio não foi concluído devidamente, e 
o roteiro 1 pede para expressar os resultados de Rf, onde a distância 
percorrida pelo analito é dividida pela distância percorrida pela fase móvel, e 
em seguida ver o valor de hRf, que consiste em multiplicar o valor obtido de Rf 
por 100. Fomos orientados pelo professor a realizar os cálculos com o 
resultado do ensaio do roteiro 2. 
Foto 3 - Ensaio roteiro 2 
 
 Fonte: do autor, 2022 
Podemos observar a direita o padrão (P) de referencia, e a esquerda a amostra 
(A) analisada. RfP: 17mm/100mm: 0,17 x100: 17 hRfP RfA: 82mm/100mm: 
0,82x100: 82 hRfA 
 
 
 
TITULO DA AULA: Triagem em Urina por Cromatografia em Camada Delgada 
(CCD) Extração Líquido/Líquido e Identificação de Fármacos por CCD 
 
1.INTRODUÇÃO 
As áreas que têm interesse em análises de compostos encontrados em 
fluidos biológicos são muitas: ambiental, farmacêutica, análises clínicas, 
medicina legal, etc. A análise cromatográfica de substâncias presentes nestes 
tipos de matrizes (soro, plasma, urina, etc), em geral, requer um pré-tratamento 
da amostra. As razões para isso são inúmeras, destacando-se a complexidade 
das matrizes biológicas, das quais os compostos são obtidos, a existência de 
proteínas que são incompatíveis com as colunas cromatográficas3 e a 
concentração das substâncias a serem analisadas, a nivel de traço. 
 2.OBJETIVO: Teste rápido como triagem da exposição do organismo a 
fármacos ou drogas de abuso e extração de substâncias em material biológico. 
 
3.MATERIAIS E MÉTODOS 
Amostra 
Padrões 
1. ácido salicílico 
 
REAGENTES E SOLUÇÕES 
Agentes cromogênicos: 
Solução de cloreto férrico (FeCl3) 5% 
 
Sistema solvente: 
Cuba ácida: clorofórmio: acetona (9:1) 
 
 
TÉCNICA EXTRAÇÃO 
Extração de substâncias de caráter ácido e neutro 
1. Colocar 10 mL da amostra (urina com ácido salicílico) em funil de 
separação (125 mL) e ler o pH; 
2. Ajustar o pH entre 4,0 e 5,0 por meio de solução de H2SO4 1%; 
3. Extrair com 20 mL da mistura clorofórmio: éter (3:1), agitando 
vigorosamente o funil por 1 minuto; 
4. Deixar o funil em repouso por 5 minutos para a separação das fases; 
5. Filtrar a camada orgânica sobre Na2SO4 1% anidro, previamente 
umedecido com a mistura clorofórmio: éter. Recolher o extrato em 
béquer; 
6. Repetir os itens 3 e 4 recolhendo o filtrado no mesmo béquer; 
7. Evaporar o solvente à secura e reservar o resíduo (Ra= ácido); 
8. Desprezar o remanescente aquoso, que ficou no funil de separação. 
 
TÉCNICA DE IDENTIFICAÇÃO 
Após a volatilização dos solventes, proceder a análise do resíduo por 
cromatografia em camada delgada (CCD) nas condições previamente 
padronizadas. 
 
 
 
3.RESULTADOS E DISCUSSÃO 
Foto 4 – Fase aquosa e fase orgânica 
 
Fonte: Do autor, 2022 
3.RESULTADOS E DISCUSSÃO 
O Objetivo deste ensaio era a identificação do ácido salicílico na urina 
previamente contaminada, e após a extração liquido/liquido a comparação com 
o padrão conhecido de ácido salicílico. A foto 3 apresenta o resultado final da 
 
análise, a direita temos o padrão de ácido salicílico e a esquerda o analito 
extraído da urina. Podemos então a partir do resultado apresentado do método 
realizado, que na amostra não possui ácido salicílico, pois seu tempo de 
retenção não corresponde com a do padrão conhecido, ou seja pode ter 
acontecido erros no preparo da amostra ou do padrão conhecido de ácido 
salicílico. 
TITULO DA AULA: Identificação de Aflatoxina por Cromatografia em Camada 
Delgada (CCD) 
1.INTRODUÇÃO 
Aflatoxinas são um grupo de micotoxinas estruturalmente semelhantes, 
altamente mutagênicas, que contaminam produtos agrícolas e se desenvolvem 
principalmente em ambientes com temperatura e umidade elevadas. São 
produzidas por fungos do gênero Aspergillus, sobretudo por A. flavus e A. 
parasiticus As técnicas mais usadas para a quantificação de micotoxinas são 
as cromatográficas, incluindo Cromatografia em Camada Delgada (CCD), 
Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (CLAE) e Cromatografia Gasosa 
acoplada a Espectometria de Massa (CG/MS). A mais simples é a CCD, porém 
os outros métodos têm maior sensibilidade e precisão (KAWASHIMA, 2004). ( 
 
2.OBJETIVO: Identificação de micotoxinas (aflatoxinas B1, B2, G1 e G2) 
presentes em alimentos, sementes, grãos ou rações, com extração por 
solventes orgânicos e Cromatografia em Camada Delgada (CCD). 
3.MATERIAIS E MÉTODOS 
Preparação da amostra – Triture ou moa, de acordo com a natureza da 
amostra, a fim de que se obtenha massa homogênea, podendo utilizar 
liquidificador, moinho ou moedor de carne. Passe a amostra pela peneira de 20 
mesh. Homogeneize novamente e retire uma subamostra de 30 g. 
Extração e purificação – Pese 30 g da amostra previamente homogeneizada e 
transfira para um frasco Erlenmeyer. Adicione cerca de 10 mL de água 
 
aquecida a 60 ºC para facilitar a penetração do solventeorgânico nos tecidos 
hidrofílicos. Homogeneize com bastão de vidro. Adicione 100 mL de 
clorofórmio, tampe o frasco com algodão e agite manualmente por 30 
segundos. Prossiga esta operação com agitador mecânico por mais 30 
minutos. Filtre o extrato clorofórmico em funil de vidro com papel de filtro 
qualitativo. 
No caso de amostra de amendoim ou derivados, adicione pequena quantidade 
de celite* ao funil para acelerar a filtração. Colete 50 mL do extrato em outro 
frasco Erlenmeyer e evapore em banho-maria a 80 ºC até que todo o 
clorofórmio tenha sido eliminado. Ressuspender o resíduo com 50 mL de 
metanol, transfira quantitativamente para o funil de separação, adicione 50 mL 
da solução de NaCl a 4% e agite lentamente. Extraia as gorduras e os demais 
interferentes com três porções de 50 mL de hexano. Descarte a fração com 
hexano (superior). Recolha o extrato metanólico em béquer ou frasco 
Erlenmeyer. 
 
Transfira quantitativamente o extrato metanólico para um funil de separação 
limpo e extraia as aflatoxinas com 50 mL de clorofórmio, agitando o funil de 
separação suavemente por três minutos. Deixe as fases se separarem e 
recolha a inferior (clorofórmio) em frasco Erlenmeyer de 250 mL. Repita a 
operação com mais 50 mL de clorofórmio. Recolha o total de clorofórmio 
juntamente com o extrato da primeira partição e evapore em banho-maria a 80 
ºC ou rotavapor a 50 °C a 60 °C. O resíduo deve ser transferido 
quantitativamente com clorofórmio para um frasco Erlenmeyer de 25 ou 50 mL 
e evaporado sob corrente de nitrogênio**. Para efetuar a cromatografia em 
camada delgada, dissolva o resíduo em clorofórmio em quantidade adequada, 
normalmente entre 200 a 500 µL e utilize banho de ultrassom por cerca de 30 
segundos para assegurar total dissolução das aflatoxinas. Triagem das 
micotoxinas por cromatografia em camada delgada – Aplique em placa de 
sílica gel, 5 a 10 µL da amostra e alguns pontos de cada padrão, 
separadamente, fazendo sobrepor no segundo ponto do padrão 5 µL da 
 
amostra. Desenvolva o cromatograma em cuba previamente preparada para 
garantir a saturação com tolueno-acetato de etila-ácido fórmico (50:40:10). 
Remova a placa depois de 12 cm de desenvolvimento do solvente e seque. 
Observe o cromatograma sob lâmpada de luz UV de comprimento de onda 
longo. 
Excepcionalmente, na ausência do ácido fórmico, utilizar clorofórmio-acetona 
(90:10). 
* Na ausência da celite, preceder a filtração mesmo sem a utilização da 
substância. 
** O fluxo de nitrogênio é sugerido, mas não obrigatório. A volatilização do 
solvente orgânico pode ocorrer por chapa de aquecimento. 
 
 
 
4.RESULTADOS E DISCUSSÕES 
Foto 5 – Identificação de aflatoxina 
 
Fonte: Do autor, 2022 
 
O ensaio de identificação de aflatoxina foi executado com sucesso, pois 
a amostra respondeu com o mesmo tempo do padrão conhecido usado no 
ensaio. Podemos observar a direita como P o padrão de aflatoxina e o R a 
amostra utilizada no ensaio. Como o resultado só é visível a luz UV, foi feito um 
ponto de marcação para a resposta de cada analito, assim conseguimos 
observar o resultado positivo do ensaio. 
 
TITULO DA AULA: Determinação da Carboxihemoglobinemia 
1.INTRODUÇÃO 
O monóxido de carbono tem sua ação tóxica pela forte ligação química 
por coordenação que ela estabelece com átomo de ferro da fração heme da 
hemoglobina formando a carboxiemoglobina, um pigmento anormal no sangue 
que dificulta a oxigenação dos tecidos do corpo, pois esse composto possui 
afinidade para se combinar com a hemoglobina 210 vezes superior do 
oxigênio. As altas concentrações de carboxiemoglobina provocam hipóxia 
tecidual, estimulando a ertropoiese e causando uma elevação do hematócrito. 
A meia vida da carboxiemoglobina no organismo,em condições de repouso é 
de cerca de 4 a 5 horas, dessa forma caso o indivíduo deixe de fumar por 24 
horas, o nível de carboxiemoglobina aproximar-se-á de zero. 
 
 
2.OBJETIVO: Determinar os níveis de carboxihemoglobina de amostras 
biológicas para verificar se estão dentro dos limites máximos permitidos. 
3.MATERIAIS E MÉTODOS 
 
AMOSTRA 
Sangue. Deve ser colhido no final da jornada de trabalho em vacutainer 
heparinizado e conservado a 4 oC por, no máximo, uma semana. Para os 
 
fumantes devem ser colhidas duas amostras, antes e após a jornada de 
trabalho. 
REAGENTES E SOLUÇÕES 
• Sol. Tampão pH = 6,85: KH2PO4 (fosfato monobásico de 
potássio)/K2HPO4 (fostato dibásico de potássio) 0,1 M. 
• Sol. Hemolisante: diluir o tampão com água de 1:10. Preparar 
semanalmente. 
• Sol Diluente: dissolver 25 mg de hidrossulfito de sódio em 20 mL de sol. 
Tampão. Preparar antes do uso. 
 
TÉCNICA 
1. Em tubo de ensaio com tampa, colocar 0,1 mL de sangue (amostra) e 12 
mL de solução hemolisante. Agitar, deixar em repouso por 10 minutos. 
2. Diluir0,2mL do hemolizado com 2,3mL de solução diluente. Tampar. 
3. Deixar a temperatura ambiente por 10 minutos. Ler a absorvânciasa 420 
e 432nm, usando como branco a solução diluente. 
CÁLCULO DA CARBOXIEMOGLOBINA 
 
% COHb = 1 – ( AR . F1) x 100 
 AR ( F2 – F1 ) – F3 + 1 
 
 SENDO: AR = Abs. 420 
 Abs. 432 
 
F1 = Abs. Hb 432 
 Abs. Hb 420 
 
F2 = Abs. HbCO 432 
 Abs.HbCO 420 
 
 
F3 = Abs. HbCO 420 
 Abs. Hb 420 
 
EM QUE: 
AR= A 420/ A 432 
F1= A Hb red 432 / A Hbred 420 (1,3330) F2= A HbCO 432 / A Hb red 420 
(0,4787) F3= A HbCO 420 / A Hb red 432 (1,9939) 
 
INTERPRETAÇÃO 
O Índice Biológico Permitido (IBMP) é de 3,5% e o Valor de Referência (VR) é 
< 1%, ambos para não fumantes. 
 
RESULTADOS E DISCUSSÕES 
 
 
AR = 0,406 = 1,241 
 0,327 
 
 
1 – (1,241 . 1,3330) 
1,241 . (0,4787 – (1,3330) – 1,9939 + 1 
 
- 1,060 – 0,654 
1,241 . (-0,8543) – 1,9939 + 1 
 
- 0,654 
- 2,0539 
0,3184 X 100 = 31,84% 
 
O resultado da porcentagem de carboxihemoglibinemia encontrado na 
amostra foi de 31,84%, um valor muito acima do considerado normal, esse 
valor pode ter como justificativa o preparo e armazenamento do sangue usando 
para o ensaio. 
 
 
TITULO DA AULA: Determinação de Nitrito em Alimento 
 
1. INTRODUÇÃO 
 
Alimentos industrializados apresentam maior durabilidade, devido à 
presença de aditivos alimentares com finalidade de conservação desse 
produto, como é o caso do nitrito de sódio que é adicionado em produtos 
cárneos para conferir a cor vermelha e sabor característico, além de prevenir 
alterações desagradáveis e atuar como conservante, principalmente contra o 
crescimento e a produção de toxina do Clostridium botulinum. O maior 
problema associado à ingestão do nitrito de sódio está relacionado com o seu 
potencial efeito tóxico em indivíduos expostos, o que depende tanto da 
quantidade ingerida quanto da susceptibilidade do organismo. O excesso 
desses íons causa danos à saúde humana, e é preocupante sob o ponto de 
 
vista toxicológico, uma vez que o nitrito é convertido em N-nitrosaminas, e 
possui ação carcinogênica após a digestão. 
 
2.OBJETIVO 
 Determinar os teores de nitrito como conservante em amostra de salsicha para 
verificar se estão dentro dos Limites Máximos Permitidos segundo a Legislação 
Brasileira preconizados pelo Ministério da Agricultura. 
 
3.MATERIAIS E MÉTODOS 
 
AMOSTRA 
Salsichas. 
 
REAGENTES E SOLUÇÕES 
Solução I 
Tetraborato de sódio decahidratado 
(Na2B4O7. 10 H2O).........................................................50 g 
Água destilada até completar 1 L 
 
Solução II 
Ferrocianeto de potássio trihidratado 
K4Fe(CN)6 . 3H2O.......................................................106 g Água destilada até 
completar 1L. 
 
Solução III 
Acetato de zinco dihidratado 
Zn(CH3COO)2..................................................................220 g 
Ácido acetico glacial........................................................30 mL 
Água destilada até completar1 L. 
 
Reagente Cromogênico. 
 
 
Solução de alfa-naftol: aquecer 360 mL de água destilada e 50 mL de ácido 
acético a 50 *C. Transferir esta solução para um frasco escuro contendo 0,25 g 
de ácido sulfanílico. Agitar até dissolver, adicionar 0,20 g de alfa-naftol agitando 
bem. Esfriar a temperatura ambiente e adicionar 90 mL de solução de NH4OH 
a 10%. O pH desta solução deverá ser 4,0 + 0,5. 
 
Solução tampão: em 500 mL de H2O destilada adicionar 20 mL de HCl 
concentrado. Agitar e adicionar 50 mL de NH4OH concentrado e diluir com 
água destilada até 1000 mL. O pH obtido é de 9,6 - 9,7. 
 
Solução padrão de nitrito: 0,25 g NaNO2 em 500 mL H2O. 
 
PROCEDIMENTO: 
Padronização 
 
1. Transferir alíquotas de 1, 2, 4, 8 e 16 mL da solução padrão de nitrito de 
sódio em 5 diferentes balões volumétricos de 100 mL; adicionar 5 mL do 
tampão e completar com H2O destilada, q.s.p. 100 mL, a cada um dos 
balões. 
 
2. Transferir 10 mL de cada alíquota da solução (1) para 5 diferentes 
balões volumétricos de 100 mL e completar com H2O destilada, q.s.p. 
100 mL, a cada um dos balões. 
 
3. Transferir 5 mL de cada uma das soluções (2) em tubos de vidro e 
acrescentar 10 mL de reagente cromogênico, 5 mL de água destilada e 
5 mL da solução tampão a cada um dos diferentes tubos. 
 
4. Deixar em banho de H2O a 30 oC por 30 minutos. 
 
5. Leitura espectrofotométrica em 474 nm, contra um branco. 
 
 
 
Obs.: O branco se constituirá de 10 mL do reagente cromogênico em 10 mL de 
água e 5 mL tampão (deixar em banho de água a 30 oC por 30 minutos). 
 
Desproteinização 
 
Pesar 10 g do alimento homogeneizado em um béquer de 150 mL. Adicionar 5 
mL da solução I (bórax) e cerca de 40 mL de água destilada, a temperatura 
acima de 70 C. Aquecer em banho de água fervente por 15 minutos, agitando 
frequentemente. Deixar esfriar a temperatura ambiente. Adicionar 2 mL da 
solução II (ferrocianeto de potássio) e 2 mL da solução III (acetato de zinco). 
Agitar vigorosamente após cada adição. 
 
Transferir a amostra para um balão volumétrico de 100 mL. Deixar o balão em 
repouso por 30 minutos a temperatura ambiente. 
 
Completar o volume com água destilada, q.s.p. 100 mL. Agitar o conteúdo do 
balão vigorosamente e filtrar em papel livre de nitritos. Determinar a 
concentração de nitrito 
presente nesta solução. 
 
Determinação de nitrito 
 
Pipetar 10 mL da solução desproteinizada da amostra de alimento para um 
tubo de ensaio. Adicionar 5 mL da solução tampão e 10 mL da solução de alfa-
naftol. 
 
Deixar em banho de água a 30 *C, durante 30 minutos, esfriar a temperatura 
ambiente: ler em 474 nm. 
 
Calcular o valor de nitrito presente na amostra, usando a curva padrão 
previamente estabelecida. 
 
 
 INTERPRETAÇÃO 
 
Segundo a Portaria no 1.004 de 11 de dezembro de 1998 da Secretaria de 
Vigilância Sanitária do Ministério da Saúde, a quantidade residual máxima de 
nitritos e nitratos em produtos cárneos, excetuando-se o charque brasileiro, é 
de 150 mg/Kg e 300 mg/Kg, respectivamente, expressos como sal de sódio. 
 
 
 
3.RESULTADOS E DISCUSSÕES 
O resultado da absorbância dos cinco pontos da curva de nitrito foi 
colocado neste gráfico de dispersão para a avaliação de sua linearidade 
através de seu r2, quanto mais próximo de 1 for o r2, maior a linearidade da 
curva quantitativa do método, e nesta curva tivemos o r2 de 0,9723. 
A Amostra da salsicha de frango foi preparada e sua absorbância foi lida 
em 474 nm, o resultado da leitura foi de – 0,046. 
Com o resultado da leitura obtido, iremos então calcular a concentração 
de nitrito na amostra da salsicha através de uma fórmula baseada na curva 
analítica anteriormente preparada. 8 A formula é Y:31,183X -0,2219 onde X é o 
valor da absorbância da leitura da salsicha. 
Cálculo: 
 Y:31,183 . -0,046 – 0,2219 Y: -1,6563 
Após o cálculo podemos observar que o valor da concentração de 
acordo com a fórmula, resulta em um valor negativo, oque pode significar que 
não havia nitrito na amostra ou houve alguma falha na preparação dos 
padrões, na execução da curva analítica, nos equipamentos de leitura, ou no 
próprio analista do ensaio. 
 
 
 
 
 
 
 
REFERÊNCIAS 
 
LINDEN, R., SARTORI, S., KELLERMANN, E., SOUTO, A. A. Identificação de 
substâncias em análise toxicológica sistemática utilizando um sistema 
informatizado para cálculo de parâmetros cromatográficos e busca em 
base de dados. Quím. Nova, 30: 468-475, 2007. 
MOREAU, R.L.M., SIQUEIRA, M.E.P.B. Toxicologia Analítica. 1ª edição. Rio 
de Janeiro: Editora Guanabara Koogan S.A., 2008. 
QUEIROZ, S. C N.COLLINSISABEL, C. H., JARDIM, C. S. F. Métodos de 
extração e/ou concentração de compostos encontrados em fluidos biológicos 
para posterior determinação cromatográfica. Quím. Nova, 24(1). Fev. 2001. 
KAWASHIMA, L.M. Micotoxinas em Alimentos e bebidas nacionais 
produzidos e comercializados em diferentes regiões do Brasil. Tese 
(Doutorado em Ciência de Alimentos) – Faculdade de Engenharia de 
Alimentos, Universidade Estadual de Campinas, Campinas, São Paulo. 110p. 
2004. Legislação sobre micotoxinas.