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abrir Influência da glicose alta na 
composição, secreção e comunicação 
celular de exossomos derivados de 
células mesangiaisRecebido: 24 de abril de 2018 Aceito: 12 de novembro de 2018 
Publicado: xx xx xxxx Antônio da Silva Novaes1, Fernanda Teixeira Borges1, Edgar Maquigussa1, 
Vanessa Araújo Varela1, Marcos Vinícios Salles Dias2& Mirian Aparecida Boim1
As células mesangiais estimuladas com alta glicose (HG) exibem aumento da síntese intracelular de angiotensina II (AngII) 
que está correlacionada com a regulação positiva de genes alvo de AngII, como citocinas profibróticas. Os efeitos 
intracrinos da AngII podem ser mediados por várias moléculas transferidas para outras células via exossomos (Exos), que 
desempenham um papel fundamental na comunicação celular em muitas condições fisiológicas e patológicas. O objetivo 
deste estudo foi investigar os efeitos de exossomos derivados de células mesangiais humanas estimuladas por HG (HG-
HMCs) em HMCs normais não estimuladas. Exossomos de HMCs (C-Exos) e HG-HMCs (HG-Exos) foram obtidos a partir de 
sobrenadantes de cultura de células. Os HMCs foram incubados com C-Exos ou HG-Exos. O estímulo HG induziu uma 
mudança na quantidade, mas não no tamanho dos Exos. Ambos C-Exos e HG-Exos continham angiotensinogênio e renina, 
mas nenhuma enzima conversora de angiotensina foi detectada. Em comparação com os HMCs tratados com C-Exos, os 
HMCs tratados com HG-Exos apresentaram níveis mais elevados de fibronectina, angiotensinogênio, renina, AT1e AT2
receptores, indicando que HG-Exos modificou a função de HMCs normais. Esses resultados sugerem que a comunicação 
intercelular por meio de Exos pode ter implicações fisiopatológicas no rim diabético.
A comunicação intercelular desempenha um papel fundamental na regulação de processos fisiológicos e fisiopatológicos. Os 
exossomos, que são liberados pela maioria das células, constituem uma importante via na comunicação celular.1,2. Exossomos 
podem ser captados e entregar muitas moléculas sinalizadoras para células vizinhas ou distantes3–8.
O conteúdo molecular dos exossomos é determinado pelas células secretoras e é regulado pela fisiologia celular; no entanto, 
pode ser alterada em condições fisiopatológicas9. Assim, exossomos podem ser produzidos e secretados com conteúdo alterado 
em resposta a diversos estímulos, como mudanças na tensão de oxigênio, modificações no suprimento de glicose e drogas 
citotóxicas.7,10.
O envolvimento dos exossomos na comunicação celular tem sido demonstrado em diversas patologias, como crescimento 
tumoral e formação de metástases.11–13, bem como outras patologias, incluindo hepática6, neurodegenerativo14
e renal6doenças.
O diabetes mellitus e suas manifestações secundárias estão diretamente envolvidos no aparecimento do dano renal, 
representando uma das principais causas de doença renal crônica15–17. A ativação das células mesangiais em resposta à 
hiperglicemia resulta no aumento da síntese da matriz mesangial e na expansão mesangial, contribuindo para o dano glomerular 
progressivo. Além disso,em vitroestudos utilizando células mesangiais (MC) em cultura mostraram que o excesso de glicose é um 
potente estímulo para a síntese intracelular e a liberação de AngII18,19, contribuindo para a superprodução de AngII intrarrenal, 
uma característica da nefropatia diabética (ND)20. A AngII desempenha um papel local central na progressão da doença renal por 
seus efeitos pró-inflamatórios e pró-fibróticos20–24.
A doença renal crônica tem natureza progressiva, e a comunicação celular desempenha um papel crucial nesse processo20,25–28
; entretanto, a participação dos exossomos nesse processo não foi totalmente explorada. Nós levantamos a hipótese de que os 
MCs ativados com alto teor de glicose poderiam influenciar as células saudáveis vizinhas através da comunicação célula a célula 
via exossomos. Assim, o presente estudo avaliou a biologia e o conteúdo dos exossomos secretados por MCs humanos ativados 
por glicose (HMCs) e examinou seu papel potencial na transferência de informações para controle
1Divisão Renal, Departamento de Medicina, Universidade Federal de São Paulo, São Paulo, Brasil.2Centro Internacional de 
Pesquisas, Ac camargo Cancer Center, São Paulo, Brasil. correspondências e solicitações de materiais devem ser 
endereçadas ao MAB (e-mail:maboim@unifesp.br)
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http://orcid.org/0000-0002-8418-2504
http://orcid.org/0000-0001-7500-8371
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Figura 1.HMCs tratados com HG segregaram mais exossomas do que HMCs normais. A quantificação de exossomos foi normalizada para o 
número de células usando o método Condessa®Contador de Células Automatizado. O número de exossomos foi quantificado usando a 
Análise de Rastreamento de Nanopartículas. Seis frascos separados foram usados e o número de exossomos foi quantificado a partir de três 
gravações de vídeo. As barras de erro são plotadas como sem *p<0,05 versus o grupo HG-Exos 4 h,
#p<0,05 versus C-Exos. Grupo C-Exos: exossomos derivados de HMCs normais tratados com glicose (Student'st-teste); 
Grupo HG-Exos: exossomas derivados de HMCs tratados com HG.
células. A carga exossomal foi analisada em termos de moléculas fibróticas e dos componentes do sistema renina 
angiotensina (RAS). O conteúdo dos exossomos liberados por HMCs estimulados por glicose alta também foi avaliado e 
foi determinado se esses exossomos seriam capazes de alterar a função de células-alvo não estimuladas. Os resultados 
obtidos são consistentes com a hipótese de que HMCs ativados por glicose podem influenciar células saudáveis vizinhas 
através da comunicação célula a célula via exossomos.
Resultados
Caracterização de exossomos de HMCs cultivados sob condições de controle e de alta glicose.
Inicialmente, verificamos se os HMCs poderiam liberar exossomos e examinamos o papel da alta glicose nesse processo. 
Exossomos liberados por HMCs foram coletados e avaliados em 4, 8, 16 e 24 horas. Os resultados mostraram que HMCs 
estimuladas por HG liberaram um número maior de exossomos em comparação com células não estimuladas com significância 
após incubação por 16 e 24 horas (Fig.1).
Os exossomos foram caracterizados de acordo com suas formas e tamanhos por microscopia eletrônica de transmissão (TEM). 
Como mostrado na Fig.2A, as vesículas esféricas apresentaram exossomos típicos em forma de taça (Fig.2B). Não houve diferenças 
morfológicas entre os grupos C-Exos e HG-Exos. Figuras2C,Dmostram vesículas de tamanhos variáveis. A presença dos marcadores 
exossomais CD63 e CD81 tetraspaninas foi evidenciada por Western blotting (Fig.2E). Finalmente, o tamanho da partícula foi 
analisado por triagem de nanopartículas e, como mostrado na Fig.2º andar, ambos os grupos apresentaram perfis semelhantes 
para tamanho de partícula, com média de 135 nm, compatível com o tamanho do exossomo. No entanto, um número maior de 
partículas foi identificado no grupo HG-Exos em comparação com o grupo C-Exos, como também mostrado na Fig.1.
Esses resultados indicaram que o HMC produziu e liberou vesículas extracelulares de tamanhos e formas compatíveis com 
exossomos. A estimulação celular com alta concentração de glicose não alterou as formas e tamanhos dos exossomos, mas 
influenciou significativamente o número de partículas liberadas.
Exossomos foram internalizados por HMCs.Para avaliar a capacidade de HMCs normais de absorver exossomos, 
rotulamos HG-Exos com PKH26 (marcador lipídico fluorescente vermelho). A captação celular de HG-Exos foi observada sob 
microscopia confocal a laser (Fig.3A). Após o período de incubação de 3 horas, HG-Exos marcadoscom PKH26 foram localizados no 
citoplasma de HMCs, indicando que os exossomos foram internalizados pelas células.
Captação de C-Exos (Fig.3B) e HG-Exos (Fig.3C) por HMCs de controle também foi verificado por microscopia eletrônica. A 
incorporação da vesícula na célula pode ser observada (setas pretas), mostradas em detalhes com um tamanho maior. A 
intensidade de fluorescência das imagens de HG-Exos marcados com PKH26 (vermelho) em diferentes profundidades (z) é 
demonstrada na Fig. 3A suplementar. A adição do corante sozinho não produziu marcação intracelular, o que indica que a 
marcação intracelular observada na Fig.3Aé devido à internalização de exossomos na célula. (Complementar Fig. 3B).
Conteúdo de Exossomos.Como as células mesangiais são uma importante fonte intrarrenal dos componentes do sistema 
renina angiotensina (RAS), a presença de angiotensinogênio (AGT), renina e enzima conversora de angiotensina (ECA) nos C-Exos e 
HG-Exos foi avaliada por Western blotting . Os resultados mostraram que o extrato de proteína C-Exos continha constitutivamente 
proteínas renina e angiotensinogênio (Fig.4A), mas nenhum ACE foi detectado, como mostrado na Fig.4D. O controle positivo para 
expressão de ACE foi obtido em extrato de pulmão de camundongo. Análise densitométrica das bandas (Fig.4B,C) mostraram que 
as proteínas renina e angiotensinogênio estavam aumentadas em HG-Exos em comparação com C-Exos.
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Figura 2.Caracterização de exossomos. (UMA) C-Exos. (B) HG-Exos. (C) C-Exos e (D) Clusters HG-Exos com tamanhos variáveis. As 
imagens foram obtidas por microscopia eletrônica de transmissão. Estruturas em forma de taça de 30-150 nm de tamanho foram 
identificadas como exossomos. Ampliação:×150.000. (E) Análise de Western blot para marcadores de exossomos CD63 e CD81. (n
=3 para cada índice). (F) Histograma representando o perfil de tamanho de nanopartículas por Análise de Rastreamento de 
Nanopartículas. Os valores representam as médias±SEM, e todos os valores são representativos de pelo menos três experimentos 
independentes.
Examinar a capacidade de exossomos derivados de HMC para induzir ade novosíntese de AngII intracelular, usamos 
células CHO-K1 uma vez que esta linhagem celular não expressa componentes RAS29. Considerando que os exossomos 
derivados de HMCs não continham ACE, outro grupo de células CHO foi transfectado com ACE (ACE-CHO). As células CHO-
K1 e ACE-CHO foram incubadas com C-Exos ou HG-Exos na presença ou ausência do inibidor de ACE captopril. Como 
esperado, ACE-CHO expresso ACE (Fig.5A). Após incubação por 24 horas, a presença de AngII em ACE-CHO foi analisada 
por imunofluorescência sob um microscópio confocal a laser. As células CHO-K1 e ACE-CHO sozinhas não expressaram 
AngII (Fig.5B, painel superior). Em contraste, as células ACE-CHO expostas a C-Exos ou HG-Exos mostraram coloração 
AngII, indicando que AngII foi sintetizada a partir do conteúdo liberado pelos exossomos (Fig.5B, painéis do meio). A 
marcação de AngII não foi observada na presença de captopril (Fig.5B, painéis inferiores). A mesma experiência foi 
realizada com CHO-K1 (células não transfectadas). Como esperado, a presença de ACE não foi observada nestas células 
(Suplementar Fig. 4A). Além disso, nenhuma coloração de AngII foi observada em CHO-K1 tratado com C-Exos ou HG-Exos 
(Suplementar 4B). Estes resultados indicam que C-Exos e HG-Exos podem contribuir para a síntese de AngII em células 
alvo.
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Figura 3.Exossomos derivados de HMC estimulados com alta glicose podem ser internalizados por HMCs normais. Exossomos 
isolados dos sobrenadantes de cultura de HMCs tratados com HG foram marcados com corante fluorescente PHK26 e 
incubados com HMCs normais por 3 h. (UMA) Imagem de intensidade de fluorescência imediatamente e 3 horas após a adição 
de GF-Exos marcado com PKH26 (vermelho). (B) A microscopia eletrônica de transmissão ilustra o C-Exos incorporado por um 
HMC normal (seta). Bi e Bii: Expansão de exossomos endocitados (seta). (C) A microscopia eletrônica de transmissão mostrou 
HG-Exos incorporado por HMC normal. CEU: HG-Exos sendo incorporado por um HMC saudável. CII: Expansão da endocitose de 
HG-Exos.
HG e HG-Exos aumentaram a expressão de AT1e AT2receptores.Para avaliar se HG-Exos
induziria o HMC a aumentar a expressão de AT1e AT2receptores em HMC inteiro e nos núcleos isolados, 
incubamos HMCs com HG, C-Exos ou HG-Exos por 24 horas. A presença dos receptores em células inteiras foi 
avaliada por imunofluorescência sob microscopia confocal (Fig.6A,B), enquanto a presença de receptores em 
núcleos isolados foi avaliada por western blotting (Fig.6C,D). Rotulagem fraca para ambos AT1(FIG.6A) e AT2(FIG.
6B) foi observado; no entanto, na presença de HG ou HG-Exos, a marcação para ambos os receptores foi mais 
forte. O mesmo perfil foi observado em núcleos isolados de HMCs expostos a HG ou HG-Exos (Fig.6C,D). Figura6E
mostrou bandas representativas de AT1e AT2. A expressão da proteína nuclear histona e a ausência de α-actina de 
músculo liso (α-SMA) e proteínas S100A10 da membrana citoplasmática confirmaram a pureza das amostras.
Ativação de HMC por HG-Exos.Para determinar se os exossomos estão envolvidos na comunicação celular 
contribuindo para a perpetuação da ativação de células mesangiais no meio diabético, adicionamos exossomos 
derivados de HMCs estimulados por HG ao meio de cultura de HMCs saudáveis. A produção de componentes RAS 
(AGT, renina e AT1e AT2receptores), proliferação celular e produção de matriz mesangial foram estimadas em 24 
horas após a exposição de HMC a C-Exos ou HG-Exos.
A expressão gênica de AGT (Fig.7A) e fibronectina (Fig.7B) foi significativamente aumentado em HMCs 
estimulados por HG e HMCs expostos a HG-Exos. Como controle osmótico, foi adicionado manitol 30 mM em 
HMC em vez de glicose por 24 h (grupo Manitol). A partir do meio de cultura de HMC estimulado com manitol, os 
exossomos (Manitol-exos) foram coletados e adicionados em HMCs normais e a expressão gênica de AGT e 
fibronectina foi avaliada. As células expostas ao manitol também apresentaram aumento de AGT e fibronectina, 
mas o valor médio obtido não diferiu significativamente das células controle (Fig. 5 Suplementar). AGT (7C), 
renina (7D), AT1(7E) e AT2(7F) apresentaram o mesmo perfil. Figura7Gmostraram bandas representativas de AGT, 
renina, AT1e AT2. O tratamento com C-Exos não induziu alterações na expressão de mRNA ou proteína. A 
proliferação celular foi aumentada em HMCs incubadas com HG ou com HG-Exos em todos os períodos em 0, 24, 
48 e 72 horas (Fig.7H).
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Figura 4.Componentes RAS presentes nos exossomos. Extratos proteicos foram obtidos de C-Exos e HG-Exos. A imagem 
mostrada em A é representativa de três experimentos independentes. Expressão de proteínas exossomais para 
angiotensinogênio (B), renina (C) e ACE (D) foi determinado por Western blotting. A ECA não foi detectada na proteína do 
extrato exossomal (D). Os resultados são expressos como as médias±erro padrão. p≤0,05: * vs C-Exos.
Discussão
No diabetes, ainda não está claro se os exossomos podem mediar a comunicação entre as células mesangiais e participar da 
patogênese da ND. Para definir melhor o papel dos exossomos derivados de HMC, usamos umem vitro modelo para testar a 
hipótese de que a sinalização exossomal é responsiva ao aumento da concentração de glicose extracelular em HMCs. Os principais 
achados do presente estudo foram os seguintes: (1) HMCs provavelmenteutilizam mecanismos de comunicação intercelular 
envolvendo vesículas extracelulares, incluindo exossomos; (2) este mecanismo é preservado em HMCs mantidos sobem vitro
condições; (3) exossomos purificados a partir de HMCs estimulados com glicose elevada apresentaram maiores quantidades de 
componentes do RAS; e 4) HG-Exos transmitem a informação da célula fonte para células de controle não estimuladas que, por sua 
vez, respondem com alterações semelhantes às induzidas por HG.
HMCs secretaram constitutivamente exossomos, e o estímulo de alta glicose induziu um aumento no número de exossomos. 
Um efeito semelhante também foi observado em células trofoblásticas7, sugerindo que altos níveis de glicose podem interferir na 
bioatividade dos exossomos. Esse fenômeno pode contribuir para a amplificação do sinal induzida pelo meio hiperglicêmico, onde 
as células que reagem ao estímulo do HG podem ativar células não responsivas, perpetuando a sinalização da lesão.
Os resultados mostraram que Exos secretados por HMCs cultivadas em condições padrão continham constitutivamente os 
componentes do RAS, exceto ACE. Embora certas proteínas de superfície celular sejam encontradas na membrana dos exossomos, 
não encontramos a ECA nos exossomos. A ECA é uma enzima típica de membrana extracelular, explicando assim a ausência de 
ECA, uma vez que os exossomos são estruturas cuja biossíntese ocorre a partir do compartimento intracelular30,31, ao contrário das 
microvesículas liberadas da membrana plasmática. Além disso, este resultado está de acordo com o tamanho médio das partículas 
observadas, que foi compatível com exossomos32. Esses resultados sugerem que as informações sobre a atividade do RAS 
intracelular podem ser trocadas entre as células por meio da sinalização dos exossomos, mesmo sob condições fisiológicas.
No entanto, muitos estímulos, como a exposição ao álcool33, choque térmico34, estresse oxidativo35, hipóxia4,36e pH 
ácido37, podem modificar os teores de Exos e, no presente estudo, HMCs expostos a altas concentrações de glicose 
secretaram Exos enriquecidos com níveis mais elevados de renina e AGT do que os teores de Exos liberados por HMCs de 
controle. Este achado é de particular importância, uma vez que o aumento da atividade intrarrenal do EAR tem sido 
implicado na patogênese da nefropatia diabética.38,39. As células mesangiais são uma fonte potencial de componentes do 
RAS no rim e o HG estimula a síntese intracelular de AngII nessas células18,19. Além disso, um aumento nos níveis locais de 
AngII tem sido implicado nas manifestações iniciais da nefropatia diabética caracterizada por expansão mesangial e 
produção de moléculas pró-fibróticas como a fibronectina. Aqui, demonstramos que a ativação do RAS induzida pela 
glicose em HMCs pode ser transmitida a outras células por exossomos. Na verdade, normais
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Figura 5.Síntese de AngII induzida por C-Exos e HG-Exos em ACE-CHO. Células de ovário de hamster chinês transfectadas 
com enzima conversora de angiotensina (ACE-CHO) foram incubadas com C-Exos ou HG-Exos. Após 24 horas, a coloração 
de AngII foi avaliada por imunofluorescência sob microscopia confocal. Para cada 1 milhão de células ACE-CHO, 2×108
partículas/mL de C-Exos ou HG-Exos foi adicionado na presença e ausência de captopril (inibidor de ACE). A coloração 
para AngII (verde) não foi observada em células ACE-CHO que não foram tratadas com exossomos (controle). A coloração 
para AngII (verde) foi observada em ACE-CHO exposto a C-Exos ou HG-Exos. A coloração de AngII não foi observada na 
presença de captopril. As imagens são representativas de três experimentos independentes. Ampliação de 630x. Os 
núcleos foram corados com DAPI (azul).
HMCs não estimulados expostos a HG-Exos apresentaram a mesma resposta observada em HMCs inteiros expostos a HG. 
Esta transmissão de informação via exossomas foi confirmada em células CHO que não expressam o componente RAS 
transfectadas com ACE. As células ACE-CHO exibiram marcação AngII apenas quando expostas aos Exos de HMCs,
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Figura 6.Efeito de glicose alta, C-Exos ou HG-Exos na expressão de AT1e AT2receptores em HMC intactos e em núcleos 
isolados. Os HMCs foram incubados com HG (30 mM), C-Exos ou HG-Exos. Após 24 horas, as células intactas foram 
marcadas com anticorpos anti-AT1(UMA) ou anti-AT2(C), e a coloração foi detectada por imunofluorescência sob 
microscopia confocal. A expressão de proteínas para AT1(B) e AT2(D) no extrato nuclear foi determinado por western blot. 
A imagem é representativa de três experimentos independentes. Bandas representativas de AT nuclear1(E) e AT2(F) 
expressão. A expressão da proteína nuclear histona e a ausência de α-actina de músculo liso (α-SMA) e proteínas S100A10 
da membrana citoplasmática confirmaram a pureza das amostras. Os resultados foram expressos como a média±erro 
padrão da média (SEM). P<0,05: * vs Controle; # vs C-Exos.
indicando que a AngII foi produzida a partir do conteúdo liberado pelos exossomos. Embora Exos não contenha ACE, 
HMCs expressam mRNA de ACE18e exibir atividade ACE40, permitindo que os HMCs aumentem a síntese de AngII a partir 
de AGT e renina exossomal.
A hiperglicemia tem um efeito citotóxico nas células mesangiais41–44. Neste estudo, demonstramos que Exos 
derivados de HMCs estimulados pela concentração de HG influenciaram o fenótipo de HMCs não estimulados. Os HMCs 
de controle estimulados pelo HG-Exos mostraram aumento nos teores de AGT e renina, indicando que a carga de HG-
Exos foi eficientemente entregue às células de controle e contribuiu para aumentar os componentes do RAS em células-
alvo não estimuladas. Como resposta do fenótipo, observou-se uma superprodução de fibronectina em HMCs expostos a 
HG-Exos, um aumento da proliferação celular em células alvo, e um efeito semelhante foi observado em HMCs inteiros 
estimulados com HG45,46.
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Figura 7.Ativação de HMC normal por glicose alta e HG-Exos. HMCs normais foram incubadas com glicose alta, 
C-Exos ou HG-Exos. Após 24 h, a expressão gênica para angiotensinogênio (AGT) (UMA) e fibronectina (B) foi 
avaliado. Expressão proteica de AGT (C), renina (D), NO1(E) e AT2(F) no extrato celular foi determinado por 
Western blotting. A imagem é representativa de três experimentos independentes e é mostrada no painel 
inferior, enquanto a análise densitométrica é mostrada no gráfico. (G) Bandas representativas da AGT, Renin, AT1
e AT2expressão. A β-actina foi usada como controle de carga. (H) HMCs foram estimulados com glicose alta ou 
tratados com C-Exos ou HG-Exos. Após 0, 24, 48, 72 ou 96 h, a proliferação celular foi avaliada por Brometo de 3-
(4,5-Dimetiltiazol-2-il)-2,5-Difeniltetrazólio (MTT) (n=3). Os resultados são expressos como as médias±erro padrão 
da média (SEM). p<0,05: * vs controle **p<0,01 vs grupo controle. ***p<0,001 vs grupo controle; # vs C-Exos.
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Nós observamos anteriormente47que os receptores de AngII AT1e AT2estão presentes no citoplasma e na membrana 
nuclear das HMCs, e esses receptores intracelulares podem estar envolvidos em algumas das respostas intracelulares da 
AngII, incluindo a ativação gênica. Essas respostas são definidas como as ações intracrinas da AngII48–50. No presente 
estudo, observamos que o HG induziu a superexpressãotanto de AT1e AT2receptores nas membranas nucleares de HMCs 
e, curiosamente, os exossomos derivados de HMCs estimulados por HG induziram o mesmo efeito nas células alvo. A 
relevância fisiopatológica do efeito intracrino da AngII não é completamente compreendida, mas especulamos que os 
efeitos biológicos observados nas HMCs estimuladas com HG-Exos foram desencadeados, pelo menos em parte, pela 
ação intracelular da AngII.
Embora os resultados obtidos neste estudo sugiram fortemente que a informação sobre a atividade do RAS possa ser 
transmitida de célula para célula por sinalização de exossomos em HMCs, esses resultados não excluem a transmissão de outras 
proteínas, mRNAs ou microRNAs presentes nos Exos a partir de HMCs estimuladas por HMCs. a concentração de HG, que também 
pode desempenhar um papel importante na comunicação intercelular e na modificação do fenótipo celular. Em conjunto, esses 
resultados indicam que os Exos de células estimuladas por glicose elevada alteram o fenótipo das células normais, sugerindo que 
esse mecanismo de comunicação celular pode ser importante na transmissão e disseminação de alterações para células e tecidos 
que não são diretamente afetados.
Em resumo, os principais resultados obtidos no presente estudo sugerem que (1) HMCs em condições padrão de 
cultura liberam Exos; (2) a glicose é um fator que pode regular a liberação e interferir no conteúdo dos Exos secretados 
pelos HMCs; e (3) Exos isolados de HMCs estimulados por glicose induziram a produção de substâncias profibróticas e 
biologicamente ativas com HMCs normais.
A comunicação de exossomos é ativa em HMCs e pode ter implicações na fisiopatologia da nefropatia 
diabética.
Procedimentos experimentais
Cultura de células mesangiais.Células mesangiais humanas imortalizadas (HMC) foram fornecidas pelo Dr. Bernhard 
Banas (Centro de Nefrologia, Universidade de Munique, Alemanha)51. As células foram cultivadas a 37°C em frascos 
plásticos em meio Dulbecco's Modified Eagle's (DMEM, Invitrogen Corporation, Gaithersburg, MD, EUA) contendo 10% de 
soro fetal bovino (FBS), penicilina (50 U/ml) e 2,6 g de HEPES. Os frascos de cultura foram mantidos a 95% de ar e 5% de 
CO2ambiente umidificado. Na confluência, os HMCs foram expostos a meio de cultura sem FBS por 24 horas de acordo 
com os seguintes grupos experimentais: o grupo controle, cultivado em DMEM contendo uma concentração padrão de 5 
mM de D-glicose, e o grupo High Glucose (HG), cultivado durante 48 horas em DMEM contendo D-glicose 30 mM. 
Posteriormente, os meios de cultura foram coletados e os exossomos foram isolados de ambos os grupos. Em seguida, 
os HMCs foram expostos a exossomos de células de controle (grupo Controle-Exos) ou de células estimuladas por HG 
(grupo HG-Exos). Após incubação por 24 h, os meios de cultura foram aspirados e as células analisadas.
Extração de exossomos.A centrifugação diferencial foi usada para extrair exossomos dos sobrenadantes de cultura de HMC 
sem soro, conforme descrito anteriormente8. Em resumo, os sobrenadantes da cultura de HMC foram coletados e centrifugados 
sequencialmente a 300×gpor 10 minutos, 2.000×gpor 20 minutos e 10.000×gpor 30 min para remover células levantadas, detritos 
celulares e vesículas grandes. As amostras limpas foram então submetidas a ultracentrifugação a 100.000×g por 120 min duas 
vezes a 4 ° C para peletizar os exossomos (Exos). Os exos resultantes foram ressuspensos em uma pequena quantidade de PBS 
para uso direto em estudos subsequentes.
Exos foram obtidos do sobrenadante após 2 h de ultracentrifugação. Como as metodologias publicadas anteriormente 
divergem no tempo de ultracentrifugação, foi realizado um experimento preliminar para padronizar o tempo para 1 ou 2 h de 
ultracentrifugação. Conforme mostrado na Fig. 1A suplementar, em comparação com a ultracentrifugação por 1 h, a 
ultracentrifugação por 2 h resultou em um número maior de partículas. O tamanho dos Exos não foi alterado pelo tempo de 
ultracentrifugação (Fig. 1B suplementar). Esses achados confirmam a presença de Exos derivados de HMCs em nossas preparações 
e indicam que HG estimulou uma maior liberação de Exos por HMCs.
Quantificação de partículas de exossoma.O tamanho e a concentração de exossomos de HMCs estimulados ou não com alta 
glicose foram determinados por análise de rastreamento de nanopartículas (NTA) para medir a taxa de movimento browniano 
para tamanho de partícula usando um sistema Malvern NanoSight (NS300) (Worcestershire, Reino Unido) que rastreia indivíduos 
partículas e a equação de Stokes-Einstein para calcular seus diâmetros. Três réplicas de alíquotas diluídas de frações de vesículas 
(1mL em PBS) foram injetadas na câmara de amostras da máquina e as vesículas foram rastreadas e medidas por 30 segundos, 
três vezes para cada amostra, a uma taxa de fluxo constante.
Microscopia eletrônica de transmissão.Células. As HMCs cultivadas foram fixadas em formaldeído a 4% (PFA; 
Polysciences Inc., 18814) e glutaraldeído a 2% (Sigma-Aldrich, 340855) em tampão fosfato 0,1 M, pH 7,4. Após a fixação, as 
amostras foram lavadas várias vezes com PBS, seguidas de pós-fixação em tetróxido de ósmio a 1% (EMS, 19150) em 
tampão fosfato por 1 h. As amostras foram enxaguadas com PBS por 15min e desidratadas através de uma série de 
lavagens graduadas com etanol variando de 70% a 100%. As amostras foram posteriormente imersas em uma mistura de 
óxido de propileno: epon (1:1) e polimerizadas em epon puro (Polysciences, Inc. 02334-500) a 60°C por 48 h. Seções 
ultrafinas foram coradas com acetato de uranila e citrato de chumbo e fotografadas a 80 kV em um microscópio 
eletrônico de transmissão JEOL 1200 EX II (JEOL, EUA). As imagens foram adquiridas com uma câmera GATAN 781 (EUA).
Exossomos.Exossomos isolados e congelados foram ressuspensos em formaldeído tamponado a 1%, adsorvidos em grades de 
microscopia eletrônica revestidas com formvar-carbono (EMS, FCF200H-Cu) e fixados com uma mistura de formaldeído a 2% por 20 
min. Um 50-µL gota de PBS foi colocada em uma folha de parafilme e as grades foram transferidas com o lado da amostra voltado 
para baixo na gota por 2min. As grades foram transferidas para um 50-µL gota de glutaraldeído a 1% por 5 min antes de transferir 
para um 100-µL gota de água destilada por 2 min. A coloração negativa foi realizada por
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colocando a grade sobre um 50-µL gota de solução de uranil-oxalato por 5 min (4% de acetato de uranil, EMS, 22400-4; ácido 
oxálico 0,15 M, Sigma-Aldrich, 75688 pH 7) antes de transferir para um 50-µL gota de metilcelulose-UA (4% de acetato de uranila e 
2% de metilcelulose por 10 min, Sigma-Aldrich, M6385, na proporção de 100µL:900µL) em um prato de vidro coberto com 
parafilme no gelo. As grades foram removidas e o excesso de fluido foi removido suavemente em papel de filtro Whatman nº 1. As 
grades foram secas, armazenadas em caixas de armazenamento de grade apropriadas e posteriormente observadas sob um 
microscópio eletrônico de transmissão JEOL 1200 EX II a 80 kV. As imagens foram adquiridas com uma câmera GATAN 781 (EUA).
Incorporação de exossomos.Primeiro, os HMCs estimulados com exossomos derivados de glicose alta foram marcados com 
corante fluorescente lipofílico vermelho PKH26 (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) de acordo com as instruções do fabricante. Após 
marcação, os exossomos foram incubados com células normais por aproximadamente 3 horas a 37°C e visualizados por um 
microscópio confocal.
Análise de Western blot.A proteína total foi purificada das células e dos extratos de núcleos isolados. As 
suspensões de células e núcleos foram homogeneizadas em tampão de lise gelado contendo 50 mM de 
Tris (pH 8,0), 150 mM de NaCl, 1% de Nonidet P-40, 0,5% de desoxicolato de sódio, 0,1% de dodecil sulfato 
de sódio (SDS), 2,5 mM de etilenodiaminotetraacéticoácido (EDTA), fluoreto de fenilmetilsulfonil (PMSF) 1 
mM e o-fenantrolina 44 mM (todos os reagentes da Sigma-Aldrich Chemical Co., EUA). A concentração de 
proteína foi determinada pelo método Lowry (DC Protein Assay; Bio-Rad Laboratories Inc., Richmond, CA, 
EUA). Quantidades iguais de proteínas totais extraídas (50μg) foram separadas por eletroforese em gel de 
SDS-poliacrilamida (SDS-PAGE) e depois transferidas para uma membrana de nitrocelulose (Amersham 
Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ, EUA).1(1:1000 ;) e AT2(1:1000) receptores (Immony, Brasil), a proteína 
nuclear histona (1:1000; Sigma, EUA), a proteína citosólica α-actina do músculo liso (α-SMA) (1:1000; Sigma-
Aldrich, EUA) e a proteína de membrana plasmática S100A-10 (1:1000; Sigma, EUA) para verificar a pureza 
da amostra.
Os blots de proteína celular foram submetidos a análises de immunoblot com os anticorpos policlonais primários 
contra Angiotensinogênio (1:1000; Sigma-Aldrich, EUA), Renina (1:1000; Sigma-Aldrich, EUA), AT1e AT2.
A expressão de proteínas exossomais foi verificada por anticorpos contra CD63 (1:100, Abcam), CD81 (1:1000 Santa 
Cruz), renina, angiotensinogênio e ECA (1:1000; Sigma-Aldrich, EUA).
A imunodetecção foi conseguida incubando as manchas em anticorpo secundário anti-coelho ou anti-rato 
conjugado com peroxidase de rábano (HRP) (diluição 1:30.000). As bandas de proteína foram visualizadas usando 
o substrato Immobilon Western HRP (Millipore). As bandas obtidas foram quantificadas utilizando o software 
Luminescent Image Analyzer-LAS 4000 e Image Gauge V3.1 (Fuji Photo Film Co, Tóquio, Japão).
Expressão de AT1e AT2nos núcleos do HMC.HMCs expressam AT1e AT2Receptores na membrana nuclear52, que medeiam 
os efeitos nucleares da AngII. Assim, investigamos se os exossomos derivados de HG-HMC poderiam modificar a 
distribuição e o número de receptores nucleares. Os núcleos intactos foram isolados de acordo com o protocolo de Ho YF
e outros.53. Resumidamente, após a confluência, os HMCs foram tripsinizados, transferidos para um tubo e centrifugados 
a 1200gpor 5 min. O sedimento celular foi ressuspenso em 4 mL de 0,25 M de sacarose/tampão TKM (50 mM Tris-HCl, 5 
mM MgCl, 25 mM KCl, pH 7,5). A suspensão foi centrifugada novamente a 600gpor 5min. A suspensão foi dividida em 
alíquotas e transferida para tubos separados de ultracentrífuga contendo 2 volumes de sacarose 2,3 M/TKM. Os 
conteúdos foram misturados por inversão. A mistura foi cuidadosamente coberta com 4 mL de sacarose 2,3 M/TKM e 
coberta com TKM para encher o tubo. Os tubos foram centrifugados a 25.000gpor 10min. O pellet no fundo do tubo 
continha os núcleos. O pellet nuclear foi lavado por ressuspensão em TKM, seguido de centrifugação a 900gpor 5 min a 
4°C, e o pellet resultante continha núcleos altamente purificados, que foram ressuspensos em tampão fosfato-tampão 
salino (PBS) e armazenados a -80°C para uso futuro. Para as análises de proteínas, o extrato de proteína nuclear foi 
purificado usando o kit Nuclei Isolation de acordo com as instruções do fabricante (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EUA). O 
extrato de proteína nuclear foi usado em Western blotting.
A expressão de AT1e AT2os receptores foram avaliados por imunofluorescência em células inteiras e núcleos 
isolados de HMCs por Western blotting nas seguintes condições: I: Controle: células tratadas com meio padrão; II: 
células tratadas com meio hiperglicêmico; III: células expostas a C-Exos; e IV: células expostas a HG-Exos.
HMCs foram cultivados no LabTec®lamínulas em meio de cultura padrão e fixadas em formaldeído 3,5% por 15 min em 
temperatura ambiente. As células foram lavadas com PBS e subsequentemente permeabilizadas com 0,2% de Triton X-100 por 10 
min. Células de HMCs inteiras foram incubadas durante a noite com anticorpos primários contra AT1(1:100), AT2
(1:100) receptores (Immony, Brasil). O anticorpo primário foi lavado e as células foram incubadas com anticorpo 
secundário (anti-coelho de coelho diluído 1:50 em PBS) conjugado com isotiocianato de tetrametilrodamina (TRITC) ou 
isotiocianato de fluoresceína (FITC) por 40 minutos à temperatura ambiente (em uma câmara escura ) e depois 
enxaguado com PBS. Finalmente, as células foram incubadas com DAPI (4′,dicloridrato de 6-diamidino-2-fenilindol, 
Invitrogen Life Technologies Inc., Gaithersburg, MD, EUA) diluído 1:50 em PBS por 15 min para marcar o núcleo. Os 
reagentes foram lavados e as lamínulas e lâminas foram montadas com pH 9,0 glicerina/500mM Na2CO3
e NaHCO 500 mM3(MERK SA Indústrias Químicas, Rio de Janeiro, RJ, Brasil). As imagens foram obtidas em 
microscópio confocal (Zeiss LSM 510 META, Carl Zeiss Inc., Jena, Alemanha) e digitalizadas no software ZEN 
(Zeiss, Alemanha).
Expressão de mRNA por RT-PCR.Os níveis de expressão de mRNA de fibronectina, angiotensinogênio e β-actina foram 
estimados por RT-PCR quantitativo. O RNA total foi purificado a partir de HMCs usando um método comercial de fenol e 
isotiocianato de guanidina-cloreto de césio (TRIzol, Gibco BRL, Rockland, MD, EUA) de acordo com as instruções do 
fabricante. Um volume de 2 μg de RNA total foi tratado com DNase (RQ1 RNase-free DNase; Promega, Madison, WI, EUA) 
para evitar a contaminação do DNA genômico. O pellet de RNA foi ressuspenso em
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Água livre de RNase e transcrição reversa em cDNA pela adição de uma mistura contendo 0,5 mg/mL de 
oligodesoxitimidilato (oligo-d(T)), 10 mM ditiotreitol (DTT), 0,5 mM desoxinucleosídeo trifosfatos (Amersham Pharmacia 
Biotech, Uppsala, Suécia) e enzima transcriptase reversa 200 U (SuperScript RT; Gibco BRL). A amplificação por RT-PCR foi 
realizada utilizando o Sistema de Detecção de Sequências GeneAmp 5700 (Applied Biosystems, Foster City, CA, EUA), com 
primers específicos para cada molécula da seguinte forma (direto e reverso, respectivamente): fibronectina (5′
acccaattccttgctggtatca 3′e 5′gtatattcggttcccggttcca 3′);angiotensinogênio (5′tcaaaaccaggagaggaac 3′e 5′
agatggcgaacaggaaggg 3′);e β-actina (5′cctctatgccaacacagtgc 3′e 5′acatctgctggaaggtggac 3′).Os produtos amplificados 
foram monitorados usando o corante intercalante SYBR Green I (Molecular Probes, Eugene, OR, EUA), que apresenta alta 
fluorescência na ligação do DNA de fita dupla. A fluorescência para cada ciclo foi analisada quantitativamente usando o 
sistema Sequence Detection (Applied Biosystems). Ao final de cada corrida de PCR, uma curva de fusão foi produzida 
aumentando a temperatura de 60°C para 95°C a uma taxa de 2°C/min, e a fluorescência foi medida a cada 15 s. Esta 
técnica proporcionou a verificação da presença de um único produto de amplificação. A expressão gênica relativa foi 
calculada usando as condições de PCR anteriores sob as quais a curva de amplificação era logarítmica. Os níveis de 
expressão de mRNA foram normalizados para β-actina e os resultados foram expressos como unidades arbitrárias, com 
as células de controle como amostra de referência.
Proliferação celular usando o ensaio MTT.HMCs foram plaqueados em placas de 96 poços a uma densidade de 103células/poço. 
Após a fixação por 24 horas, o meio de cultura foi substituído de acordo com cada grupo e as células foram cultivadas por mais 24, 
48, 72 ou 96 horas. Os sobrenadantes foram descartados e 200 μL de meio de cultura contendo 0,5% de brometo de 3-(4,5-
dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazólio (MTT) foi adicionado a cada poço. Após um período de incubação de 4 horas, o meio de 
cultura foi cuidadosamente removido e 100 μL de dimetilsulfóxido (DMSO; Sigma-Aldrich) foi adicionado a cada poço. As células 
foram colocadas em uma incubadora e agitadas em vórtex em baixa velocidade por 2 minutos para dissolver completamente os 
cristais de formazan. A densidade óptica (DO) de cada poço foi medida a 490 nm usando o leitor de microplacas EON (BIOTEK, 
Winooski, Vermont, EUA).
CulturaCHO-K1 e CHO-ACE.Células de ovário de hamster chinês de tipo selvagem (CHO-K1) foram usadas como controle negativo 
para a síntese de AngII, pois essas células não expressam nenhum componente RAS29, incluindo AT1e AT2receptores. As células 
CHO-K1 foram fornecidas pelo Dr. Guacyara da Motta (Departamento de Bioquímica, Universidade Federal de São Paulo, Brasil). 
Esta linha celular foi cultivada em meio de mistura de nutrientes F-12 de Ham (Invitrogen Corporation, Gaithersburg, MD, EUA).
As células CHO-K1 foram transfectadas com o gene da enzima conversora de angiotensina (ECA) e foram gentilmente cedidas 
pela Dra. Dulce Casarini (Departamento de Medicina da Universidade Federal de São Paulo). Células CHO-K1 transfectadas com 
ACE (ACE-CHOs) foram cultivadas a 37°C em placas de cultura com DMEM, contendo 10% de FBS, penicilina (50 U/ML) e 2,6 g de 
HEPES. Ambas as linhagens celulares foram cultivadas em placas plásticas em uma incubadora umidificada contendo 5% de CO2a 
37ºC. Os meios de cultura foram suplementados com 10% (v/v) de soro fetal bovino (FBS) e penicilina (50U/mL).
Análise estatística.Os resultados são expressos como as médias±erro padrão da média (SEM). A significância estatística foi 
determinada por meio de análise de variância unidirecional (ANOVA), seguida pelo teste de Newman–Keuls ou teste de Tukey. 
Valores de p inferiores a 0,05 foram considerados estatisticamente significativos. A análise estatística e a construção dos gráficos 
foram realizadas usando o software GraphPad Prism versão 5.00 para Windows (GraphPad Software, San Diego, CA, EUA).
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www.nature.com/scientificreports/ www.nature.com/scientificreports
Reconhecimentos
Os autores agradecem que este trabalho foi financiado por bolsas da Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São 
Paulo (FAPESP), Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq), Coordenação de 
Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) e Fundação Oswaldo Ramos e Laboratório Multiusuário 6 – Infar/
Unifesp para análises em Microscopia Confocal. Os autores também gostariam de agradecer à Dra. Dulce Casarini e ao 
Dr. Niels Câmara pelos conselhos e sugestões sobre este trabalho.Este trabalho foi financiado por bolsas da Fundação de 
Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP). Número do processo: 2017/00250-8 e 2015/23345-9.
Contribuições do autor
Antonio da Silva Novaes, Mirian Aparecida Boim. Análise formal: Antonio da Silva Novaes, Mirian Aparecida Boim. 
Aquisição do financiamento: Mirian Aparecida Boim. Investigação: Antonio da Silva Novaes, Fernanda Teixeira 
Borges. Metodologia: Antonio da Silva Novaes, Marcos Vinicios Salles Dias, Fernanda Teixeira Borges, Edgar 
Maquigussa, Vanessa Varela. Administração do projeto: Antonio da Silva Novaes, Mirian Aparecida Boim. 
Recursos: Antonio da Silva Novaes, Mirian Aparecida Boim. Orientação: Mirian Aparecida Boim. Validação: Mirian 
Aparecida Boim. Visualização: Antonio da Silva Novaes, Mirian Aparecida Boim. Redação – rascunho original: 
Antonio da Silva Novaes, Mirian Aparecida Boim. Redação – revisão e edição: Antonio da Silva Novaes, Mirian 
Aparecida Boim.
informação adicional
Informação suplementaracompanha este artigo emhttps://doi.org/10.1038/s41598-019-42746-1. Interesses 
competitivos:Os autores declaram não haver interesses conflitantes.
Nota do editor:A Springer Nature permanece neutra em relação a reivindicações jurisdicionais em mapas publicados e 
afiliações institucionais.
Acesso livreEste artigo está licenciado sob uma Licença Creative Commons Atribuição 4.0 Internacional, 
que permite o uso, compartilhamento, adaptação, distribuição e reprodução em qualquer meio ou
formato, desde que você dê os devidos créditos ao(s) autor(es) original(is) e à fonte, forneça um link para a licença 
Creative Commons e indique se foram feitas alterações. As imagens ou outros materiais de terceiros neste artigo estão 
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material. Se o material não estiver incluído na licença Creative Commons do artigo e seu uso pretendido não for 
permitido por regulamentação legal ou exceder o uso permitido, você precisará obter permissão diretamente do 
detentor dos direitos autorais. Para ver uma cópia desta licença, visitehttp://creativecommons.org/licenses/by/4.0/.
© O(s) Autor(es) 2019
CientíficoRelatórios| (2019) 9:6270|https://doi.org/10.1038/s41598-019-42746-1 13
https://doi.org/10.1038/s41598-019-42746-1
https://doi.org/10.1038/s41598-019-42746-1
http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/
	Influence of high glucose on mesangial cell-derived exosome composition, secretion and cell communication
	Results
	Characterization of exosomes from HMCs cultured under control and high-glucose conditions. 
	Exosomes were internalized by HMCs. 
	Content of Exosomes. 
	HG and HG-Exos increased the expression of AT1 and AT2 receptors. 
	Activation of HMC by HG-Exos. 
	Discussion
	Experimental Procedures
	Mesangial cell culture. 
	Exosome extraction. 
	Quantification of exosome particles. 
	Transmission electron microscopy. 
	Cells. 
	Exosomes. 
	Incorporation of exosomes. 
	Western blot analysis. 
	Expression of AT1 and AT2 in nuclei of HMC. 
	mRNA expression by RT-PCR. 
	Cell proliferation using MTT assay. 
	CHO-K1 and CHO-ACE culture. 
	Statistical analysis. 
	Acknowledgements
	Figure 1 HG-treated HMCs secreted more exosomes than normal HMCs.
	Figure 2 Exosomes characterization.
	Figure 3 High glucose-stimulated HMC-derived exosomes can be internalized by normal HMCs.
	Figure 4 RAS components present in the exosomes.
	Figure 5 Synthesis of AngII induced by C-Exos and HG-Exos in ACE-CHO.
	Figure 6 Effect of high glucose, C-Exos or HG-Exos on the expression of AT1 and AT2 receptors in intact HMC and in isolated nuclei.
	Figure 7 Activation of normal HMC by high glucose and HG-Exos.