Tese_Daniel

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INSTITUTO NACIONAL DE PESQUISAS DA AMAZÔNIA 
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM BIODIVERSIDADE E 
BIOTECNOLOGIA DA REDE BIONORTE 
 
 
 
 
 
 
 
 
PROPAGAÇÃO IN VITRO E BIOPROSPECÇÃO DE EXTRATOS DE 
PLÂNTULAS DE Libidibia ferrea (FABACEAE) 
 
 
 
 
 
 
 
 
DANIEL DA SILVA 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
MANAUS-AMAZONAS 
Fevereiro/2019
 
 
DANIEL DA SILVA 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
PROPAGAÇÃO IN VITRO E BIOPROSPECÇÃO DE EXTRATOS DE 
PLÂNTULAS DE Libidibia ferrea (FABACEAE) 
 
 
 
 
Tese apresentada ao Curso de Doutorado do 
Programa de Pós-Graduação em Biodiversidade e 
Biotecnologia da Rede BIONORTE, no Instituto 
Nacional de Pesquisas da Amazônia, como requisito 
parcial para a obtenção do título de Doutor em 
Biotecnologia e Biodiversidade. 
 
Orientador: Prof. Dr. Paulo de Tarso Barbosa 
Sampaio 
 
 
 
 
 
MANAUS-AMAZONAS 
Fevereiro/2019 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
FICHA CATALOGRÁFICA 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Dedicatória. 
 
 
 
“Maxime” Dedico este trabalho à minha avó “In 
memorian” Palmira Nonata da Silva Pereira e a 
minha mãe Maria das Dores Nonata da Silva, que 
através de suas orientações sempre me exigiram um 
pouco mais, fazendo-me crescer intelectualmente e 
moralmente, e por ter me ensinado a importância da 
educação. Aos meus queridos irmãos Danilo e 
Adonias, vocês dois sãos os melhores irmãos que a 
vida me proporcionou! 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
“Epígrafe”. 
 
 
 
“Não existe felicidade maior na Terra do que aquela 
que um espírito belo e produtivo encontra em si 
mesmo nos momentos felizes”. 
 
Arthur Schopenhauer 
 
 
“Os grandes feitos são conseguidos não pela força, 
mas pela perseverança”. 
 
 Samuel Johnson 
 
 
AGRADECIMENTOS 
 
Esta tese é o resultado de um esforço conjunto, e sua produção seria impossível sem a 
generosidade de Deus, por sempre estar ao meu lado, ter me dado esperança, força de vontade 
e acima de tudo a sabedoria para a conquista de mais uma vitória pessoal e profissional. Minha 
gratidão ao Dr. Paulo de Tarso de Barbosa Sampaio, meu orientador e amigo, pela orientação 
e estímulo ao meu desenvolvimento acadêmico, profissional e pessoal. Agradeço à Dra. Angela 
Maria Imakawa que ajudou a desenvolver o plano de revisão desde o 1º até o 3º capítulo deste 
trabalho, fez muitas sugestões úteis, cujas contribuições foram significativas e evidentes no 
texto. Nosso técnico do Laboratório de Silvicultura e Tecnologias Digitais do Instituto Nacional 
de Pesquisas da Amazônia (LASTED-INPA), Eng. Florestal, Flávio Mauro Souza Bruno, de 
todas as formas manteve o funcionamento do laboratório e nos forneceu opiniões extremamente 
úteis sobre diferentes capítulos. Agradeço à Dra. Suely de Souza Costa pelo seu talento 
estatístico e na interpretação das análises de dados. Minha gratidão vai também para Dr. Luiz 
Augusto Gomes de Souza pela identificação da espécie vegetal e fornecimentos das sementes. 
Um agradecimento muito especial vai para Dra. Cecília Verônica Nunez, que me supervisionou 
no seu Laboratório de Biotecnologia e Bioprospecção do INPA e contribuiu muito para a 
realização deste projeto. 
Também estou profundamente agradecido à Fundaçao de Amparo à Pesquisa do Estado 
do Amazonas (FAPEAM) e a Coordenação de Pesquisas de Nível Superior (CAPES) pelo apoio 
financeiro da bolsa de estudo junto ao Programa de Pós-Graduação em Biodiversidade e 
Biotecnologia – Rede Bionorte. 
Agradeço ao reitor da Universidade do Estado do Amazonas, Dr. Cleinado de Almeida 
Costa, meu amigo, por sua extraordinária ajuda na aquisição de passagens aéreas e diárias para 
participação em diversos eventos científicos nacionais e internacionais, assim como para 
custeio da taxa de publicação dos artigos, frutos desta tese. Sinto-me muito feliz por ter tido Dr. 
Spartaco Astolfi Filho, como Coordenador Geral da Rede Bionorte, o qual aprendi bastante 
durante a Representação Estudantil (2015-2016) e, sobretudo, foi um importante “interlecutor” 
nos bastidores durante a realização do doutorado sanduíche no exterior – uma mão amiga. 
Agradeço ao Coordenador Estadual do PPG-Bionorte/Amazonas, Dr. Jair Maia por sua ajuda e 
por fornecer assistência administrativa em muitas ocasiões. 
 Em Leeds, Dra. Christine H. Foyer foi minha supervisora e crítica de primeira linha 
durante o meu estágio de doutoramento-sanduíche na Universidade de Leeds, Reino Unido. 
Dra. Barbara Kampiska contribuiu bastante para o ensino de técnicas biotecnológicas, 
 
 
especialmente a microscopia confocal. Muitos colegas tiveram um papel especial em momentos 
importantes durante o meu estágio e por suas intervenções oportunas. Destaco: o maravilhoso 
casal Jonas Alvim e Fernanda Alvim, e aos colegas de laboratório: Philipa Siclair, Hayati 
Razak, Sarah Alomran, Yousef Hajaya todos fizeram muitos comentários incisivos e 
principalmente ao estímulo do network que foi fundamental durante a minha experiência nesta 
Universidade. 
 Muitos outros colegas e amigos, que me auxiliaram a dar forma a este trabaho com seus 
comentários, sugestões e críticas. Sou profundamente grato a todos eles: 
MSc. Messe Elmer Torres da Silva, Universidade do Estado do Amazonas 
MSc. Weison Lima da Silva, Universidade Federal do Amazonas 
MSc. Maria Teresa Fachin Espinar, Universidade Federa do Amazonas 
MSc. Maria Izabel Correia Osorio, Instituto Nacional de Pesquisas da Amazônia 
MSc. Adrian Arturo Arispe, Instituto Nacional de Pesquisas da Amazônia 
Aos velhos amigos, por compreenderem as infinitas horas de minha ausência e que, 
mesmo tão longe, continuam tão perto. Não tenho espaço espaço aqui para agradecer a todas as 
pessoas cujos esforços contribuíram para o desenvolvimento deste projeto. Ofereço meu sincero 
agradecimento – e a tese pronta que eles ajudaram a finalizar. Assumo, é claro, total 
responsabilidade por eventuais incorreções. 
 Quero agradecer, de modo especial, aos meus meus alunos de PIBIC e de TCC da 
Univesidade do Estado do Amazonas por suas inúmeras contribuições que me ajudaram a 
equilibrar as demandas com o tempo e o estudo. 
 Finalmente, expresso minha profunda gratidação à minha família, especialmente a 
minha querida mãe - Maria das Dores Nonato da Silva - e a minha querida companheira e 
mulher - Josilene Cavalcante Cunha - que tiveram extraordinária paciência e me apoiaram na 
realização deste sonho, e dando-me força para ser um vencedor. 
 
 
 Muito obrigado! 
 
 
 
 
 
 
vii 
 
DA SILVA, Daniel. Propagação in vitro e bioprospecção de extratos de plântulas de 
Libidibia ferrea (Fabaceae). 2019. 125 f. Tese (Doutorado em Biodiversidade e Biotecnologia) 
– Instituto Nacional de Pesquisas da Amazônia, Manaus, 2019. 
 
 RESUMO 
 
 O estudo teve por objetivo estabelecer e avaliar métodos de propagação in vitro e 
bioprospecção de extratos de plântulas de Libidibia ferrea (Fabaceae), que possibilitará a 
multiplicação de genótipos superiores com potencial para uso medicinal. Os experimentos 
foram desenvolvidos no Laboratório de Silvicultura e Tecnologia Digitais (LASTED) e 
Laboratório de Bioprospecção e Biotecnologia (LABB), ambos, vinculados ao Instituto 
Nacional de Pesquisas da Amazônia (INPA, Manaus, AM), em parceria com o Laboratório de 
Cultura de Tecidos Vegetais (LCTV) da Universidade do Estado do Amazonas (UEA, Manaus, 
AM). A pesquisa contempla quatro capítulos. Capítulo I – Cultura in vitro de embriões zigóticos 
e sementes de L. ferrea e as respostas morfogenéticas dos explantes em relação a diferentes 
concentrações de reguladores de crescimento.Os resultados indicaram a viabilidade técnica da 
cultura de embriões zigóticos e germinação de sementes in vitro, tornando-se uma técnica 
alternativa para propagação in vitro desta espécie. No capítulo II - Foi avaliado o efeito de 
diferentes concentrações de 2,4-D e ANA isoladamente ou em combinação com BAP e TDZ 
para a indução de calos friáveis em explantes foliares e segmentos nodais. Os resultados 
demonstraram que ambos os tipos de explantes apresentaram diferenças significativas (p<0,05) 
na indução, morfologia e coloração dos calos. A indução máxima de calos friáveis (90%) foi 
obtida a partir de explantes de segmentos nodais cultivados em meio MS suplementado com 
1,0 mg L-1 de 2,4-D e 5,0 mg L-1 de TDZ. Em relação ao capítulo III – Foi avaliada a influência 
da luz de LED azul-vermelha e LED branca na calogênese e na regeneração de plântulas in 
vitro de L. ferrea. A luz LED azul-vermelha estimulou a maior formação de calos friáveis e a 
regeneração in vitro de plântulas em relação à luz LED branca. Os resultados confirmam a 
eficiência da utilização da luz de LED azul-vermelha e LED branca para calogênese e a 
regeneração in vitro de L. ferrea. No capítulo V – Foi realizado o estudo químico e biológico 
diferentes metabólitos secundários, e atividades antibacterianas, antioxidantes e tóxicos. A 
avaliação dos extratos mostrou a presença de diferentes metabólitos secundários, e atividades 
antibacterianas, antioxidantes e tóxicos. 
Palavras-chave: Biotecnologia, Multiplicação in vitro, Otimização de protocolo, Libidibia 
ferrea, Planta medicinal. 
viii 
 
DA SILVA, Daniel. In vitro propagation and bioprospecting of seedling extracts of 
Libidibia ferrea (Fabaceae). 2019. 125 f. Thesis (Doctorate in Biodiversity and 
Biotechnology) - National Institute of Amazonian Research, Manaus, 2019. 
 
 ABSTRACT 
 
 The objective of this study was to establish and evaluate methods of in vitro propagation 
and bioprospecting of seedlings extracts of Libidibia ferrea (Fabaceae), which will allow the 
multiplication of superior genotypes with potential for medicinal use. The experiments were 
developed at the Laboratory of Silviculture and Digital Technology (LASTED) and Laboratory 
of Bioprospecting and Biotechnology (LABB), both linked to the National Institute of 
Amazonian Research (INPA, Manaus, AM), in partnership with the Laboratory of Plant Tissue 
Culture (LCTV) of the Amazonas State University (UEA, Manaus, AM). The research includes 
four chapters. Chapter I - In vitro culture of zygotic embryos and seeds of L. ferrea and the 
morphogenetic responses of explants in relation to different concentrations of growth 
regulators. The results indicated the technical viability of zygotic embryo culture and seed 
germination in vitro, becoming as an alternative technique for in vitro propagation of this 
species. In Chapter II - The effect of different concentrations of 2,4-D and ANA alone or in 
combination with BAP and TDZ for the induction of friable calli from leaf explants and nodal 
segments was evaluated. The results showed that both types of explants presented significant 
differences (p <0.05) in callus induction, morphology and coloring. Maximum induction of 
friable calli (90%) was obtained from nodal segment explants cultured in MS medium 
supplemented with 1.0 mg L-1 of 2,4-D and 5,0 mg L-1 of TDZ. In relation to chapter III - The 
light influence from red-blue LED and white LED on the calogenesis and in vitro seedling 
regeneration of L. ferrea was evaluated. The red-blue LED light stimulated the greater 
formation of friable calli and the in vitro regeneration of seedlings in relation to the white LED 
light. The results confirm the efficiency of using red-blue LED and white LED light for 
calogenesis and the in vitro regeneration of L. ferrea. In chapter V - Chemical and biological 
study was carried out on hexane, methanolic and aqueous extracts obtained from the leaves, 
stems and roots of seedlings originated from the in vitro culture of L. ferrea. The evaluation of 
the extracts showed the presence of different secondary metabolites, and antibacterial, 
antioxidant and toxic activities. 
Keywords: Biotechnology, In vitro multiplication, Protocol optimization, Libidibia ferrea, 
Medicinal plant. 
ix 
 
LISTA DE TABELAS 
 
REFERENCIAL TEÓRICO 
Tabela 1. Classificação taxonômica de Libidibia var. ferrea ................................................... 20 
Tabela 2. Alguns nomes populares de Libidibia ferrea conhecidos no Brasil ......................... 20 
Tabela 3. Aplicações terapêuticas de Libidibia ferrea na medicina popular............................ 22 
Tabela 4. Atividades biológicas de Libidibia ferrea. ............................................................... 24 
Tabela 5. Comparação entre o conteúdo energético de três comprimentos de ondas .............. 32 
Tabela 6. Exemplos de fármacos obtidos de matérias-primas vegetais ................................... 33 
 
CAPÍTULO I 
Tabela 1. Percentagem de germinação (GER) e plantas normais (PN), número de brotos (NB), 
número de gemas (NG) e número de folhas (NF), comprimento dos brotos (CB), número de 
raízes (NR) e taxa de multiplicação (TM) obtidos de embriões zigóticos e sementes de Libidibia 
ferrea após 30 dias de inoculação em meio de cultura MS. .................................................... 61 
 
CAPÍTULO II 
Tabea 1. Efeito de diferentes concentrações de auxinas e citocininas na indução de calos friáveis 
em explantes foliares e segmentos nodais de Libidibia ferrea ................................................. 73 
 
CAPÍTULO III 
Tabela 1. Produção de calos friáveis obtidos de segmentos nodais de Libidibia ferrea, em 
resposta a diferentes concentrações do meio MS e da auxina 2,4-D e cultivados na ausência e 
presença de luz (LED azul-vermelha 470 nm e LED branca 530 nm). .................................... 88 
Tabela 2. Produção de calos friáveis obtidos de explantes de segmentos nodais de Libidibia 
ferrea, em resposta a diferentes concentrações do meio B5 e da auxina 2,4-D e cultivados na 
ausência e presença de luz (LED azul-vermelha 470 nm e LED branca 530 nm). .................. 89 
 
CAPÍTULO IV 
Tabela 1. Resultado da atividade antibacteriana dos extratos de Libidibia ferrea obtido pelo 
método de microdiluição em caldo. ........................................................................................ 110 
Tabela 2. Escala para interpretação dos resultados da atividade antioxidante ...................... 111 
Tabela 3. Resultados da avaliação da capacidade antioxidante de extratos de Libidibia ferrea 
obtidos pelas metodologias de DPPH e Fe3+/Fenantrolina. .................................................... 112 
x 
 
LISTA DE FIGURAS 
 
REFERENCIAL TEÓRICO 
Figura 1. Libidibia ferrea (Mart. Ex Tul.) L.P. QUEIROZ. (A) Aspecto geral da floração; (B) 
Detalhe do caule; (C) Fruto maduro; (D) Aspecto geral da semente; (E) Distribuição e 
ocorrência. ................................................................................................................................ 21 
Figura 2. Substâncias isoladas de Libidibia ferrea ................................................................... 23 
Figura 3. Princípio geral da cultura de células e tecidos vegetais ........................................... 25 
Figura 4. Esquema geral das vias de biosíntese do metabolismo vegetal secundário (retângulos 
rosas) e suas conexões com o metabolismo primário (retângulos vermelhas), em detalhe os 
metabólitos primários (verde) e os secundários (azul). ............................................................ 34 
Figura 5. Esquema de processo de descoberta de produtos naturais. ....................................... 35 
Figura 6. Processo de partição com solventes de polaridade crescente.................................... 36 
Figura 7. Reação de estabilização do RadicalDPPH frente a um composto fenólico doador de 
hidrogênio. ................................................................................................................................ 40 
Figura 8. Reação da atividade redutora do íon Fe3+ a íon Fe2+ ................................................ 40 
 
CAPÍTULO I 
Figura 1. Plântulas germinadas in vitro oriundas de embriões zigóticos (a) e sementes (b) de 
Libidibia ferrea inoculados em meio MS após 30 dias de cultivo (b). .................................... 62 
Figura 2. Percentagem de regeneração (A), número de brotos (B), número de gemas (C), 
número de folhas (D), taxa de multiplicação (E), altura das brotações (F), número de raízes (G) 
e formação de calos (I) obtidos de embriões zigóticos de Libidibia ferrea após 30 dias de cultivo 
in vitro em meio MS suplementado com diferentes concentrações de BAP e ANA. Médias 
seguidas de mesma letra não diferem estatisticamente entre si pelo teste de Duncan 
(p<0,05)......... ........................................................................................................................... 63 
Figura 3. Fases de desenvolvimento de embrião zigótico e formação de plântula de Libidibia 
ferrea no meio MS suplementado com 0,9 mg L-1 de BAP: Cultivo inicial do embrião zigótico 
(A); Germinação do embrião zigótico aos 10 dias (B); Plântula com brotos, gemas e raíz 
primária aos 20 dias (C); e Plântula normal após 30 dias de cultivo in vitro (D). ................... 65 
 
 
 
 
 
xi 
 
CAPÍTULO II 
Figura 1. Plântula de Libidibia ferrea cultivada in vitro como fonte de explantes utilizadas para 
a indução de calos friáveis (A). Segmentos nodais com formação de calos cultivados em meio 
MS suplementado com 2,4 D (B), ANA (C), 2,4-D e BAP (D), 2,4-D e TDZ (E), ANA e BAP 
(F) e ANA e TDZ (G), mantidos a 25°C±2°C sob fotoperíodo de 16 horas por 30 dias. ........ 74 
 
CAPÍTULO III 
Figura 1. Aspectos da morfologia e coloração de calos friáveis de Libidibia ferrea obtidos de 
segmentos nodais cultivados em diferentes concentrações de meio MS e suplementado com 
2,4-D, na ausência e presença de luz, após 30 dias de cultivo. (A) MS, (B) MS/2 e MS/4 (C) 
cultivados no escuro; (D) MS, (E) MS/2 e MS/4 (F) cultivados sob LED azul-vermelha 470 
nm; (G) MS, (H) MS/2 e MS/4 (I) cultivados sob LED branca 530 nm. Barras = 3 cm. ........ 86 
Figura 2. Aspectos da morfologia e coloração de calos friáveis de Libidibia ferrea obtidos de 
segmentos nodais cultivados em diferentes concentrações de meio B5 e suplementado com 
2,4-D, na ausência e presença de luz, após 30 dias de cultivo. (A) B5, (B) B5/2 e B5/4 (C) 
cultivados no escuro; (D) B5, (E) B5/2 e B5/4 (F) cultivados sob LED azul-vermelha 470 nm; 
(G) B5, (H) B5/2 e B5/4 (I) cultivados sob LED branca 530 nm. Barras = 3 cm. ................... 87 
Figura 3. Eletromicrografia de varredura de células de calos friáveis de Libidibia ferrea. Calos 
do tipo globular originados de explantes de segmentos nodais, inoculados em meios MS (A) e 
B5 (B), suplementado com 2,4-D e mantidos sob LED azul-vermelha; Aspectos de calos 
embriogênicos vistos de cima (C) e ligados por segmentos semelhantes a suspensores (seta 
branca) (D). ............................................................................................................................... 91 
Figura 4. Eletromicrografia de transmissão da caracterização de estruturas e organelas das 
células meristemáticas em diferenciação após 60 dias de cultivo in vitro originados de calos 
friáveis de Libidibia ferrea. (A) Núcleo (seta preta) e parede celular (seta verde); Células com 
elevada relação núcleo citoplasmática (círculo preto) com diferenciação celular (B); Núcleos 
proeminentes com início da divisão celular (seta preta) formados da diferenciação do sistema 
vascular (C); Aspectos em vista longitudinal dos elementos vasculares das mitocôndrias (seta 
preta), núcleo (seta vermelha) e cloroplastos (seta verde) (D). ................................................ 92 
Figura 5. Valores médios de números de brotos (A), número de gemas (B), taxa de 
multiplicação (C) e comprimento das brotações (D) por explante, em resposta a diferentes 
concentrações de 6-benzilaminopurina (BAP) e cultivadas sob diferentes fontes de luz (LED 
azul-vermelha 470 nm e LED branca 530 nm) na multiplicação in vitro de Libidibia ferrea, 30 
xii 
 
dias após a inoculação. Médias seguidas de mesma letra não diferem estatisticamente, entre si, 
ao nível de 5% de probabilidade pelo teste de Tukey. ............................................................. 94 
Figura 6. Plântula de Libidibia ferrea cultivada in vitro como fonte de explantes utilizadas para 
a regeneração in vitro (A). Aspectos das brotações cultivadas em meio de cultura MS 
suplementado com 0,05 mg L-1 de BAP mantidos sob LED azul-vermelha 470 nm (B-C) e LED 
branca 530 nm (D-E). ............................................................................................................... 95 
 
CAPÍTULO IV 
Figura 1. Extratos metanólicos de folhas (Fo), Caules (Ca) e Raízes (Ra) de plantas 
microprapagadas de Libidibia ferrea, eluídos com hexano/acetona 9:1 (v/v) analisadas por 
Cromatografia em Camada Delgada Comparativa (CCDC) sob luz vísivel (A), UV 254 nm (B) 
e UV 365 nm (C) e reveladas com diferentes reagentes NP/PEG (D), anisaldeído sulfúrico (E), 
dragendorff (F) e sulftato cérico (G). ..................................................................................... 105 
Figura 2. Extratos hexânicos de folhas (Fo), Caules (Ca) e Raízes (Ra) de Libidibia ferrea, 
eluídos com DCM/MeOH 1:1 (v/v) analisadas por Cromatografia em Camada Delgada 
Comparativa (CCDC) sob luz vísivel (A), UV 254 nm (B) e 365 UV nm (C) e reveladas com 
diferentes reagentes NP/PEG (D), anisaldeído sulfúrico (E), dragendorff (F) e suftato cérico 
(G). .......................................................................................................................................... 105 
Figura 3 Espectro de RMN de 1H em CDCl3 (300 MHz) obtidos de extratos hexânicos de folhas 
(a), caules (b) e raízes (c) de Lidibia ferrea ........................................................................... 106 
Figura 4. Espectro de RMN de 1H em DMSO (300 MHz) obtidos de extratos metanólicos de 
folhas (a), caules (b) e raízes (c) de Lidibia ferrea ................................................................. 107 
Figura 5. Espectro de RMN de 1H em DMSO-d6 (300 MHz) obtidos dos extratos metanólicos 
da raiz em fase DCM (a) e AcOEt (b) de plantas micropropagadas de Libidibia ferrea. ...... 108 
Figura 6. Espectro de massas da fase DCM obtida do extrato metanólico da raiz de L. ferrea. 
A: Ionização por electrospray (ESI -). B: Ionização química pressão atmosférica (APCI -). C: 
Ionização química pressão (APCI +). ..................................................................................... 109 
Figura 7. Taxa de mortalidade de larvas de Artemisa salina em função dos extratos testados de 
Libidibia ferrea. ...................................................................................................................... 114 
 
 
 
 
 
 
xiii 
 
LISTA DE ABREVIATURAS 
 
2,4-D: Ácido 2,4-Diclorofenoxiacético 
2ip: Isopenteniladenina 
AIA: Ácido 3-indol-acético 
ANA: Ácido naftalenoacético 
ANOA: Ácido beta-naftoxiacético 
ApCFA: Ácido p-clorofenoxiacético 
B5: Meio de Cultura de B5 Gamborg (1968) 
BAP: 6-benzilaminopurina 
DMSO: Dimetilsulfóxido ou sulfóxido de dimetilo 
EST: Escola Superior de Tecnologia 
IBA: Ácido 3-indol-butírico 
INPA: Instituto Nacional de Pesquisas da Amazônia 
KIN: 6-furfurilaminopurina ou cinetina 
LCTV: Laboratório de Cultura de Tecidos Vegetais 
LABB: Laboratório de Bioprospecção e Biotecnologia 
LASTED: Laboratório de Silvicultura e Tecnologias Digitais 
MS: Meio de Cultura de Murashige & Skoog (1962) 
TDZ: Tidiazuron ou N-fenil-N´-1,2,3-tiadizol-5,1-uréiaUEA: Universidade do Estado do Amazonas 
WPm: Meio de cultura Woody Plant de Lloyd & McCown (1980) 
ZEA: Zeatina 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
xiv 
 
SUMÁRIO 
 
1. INTRODUÇÃO .................................................................................................................. 17 
2. REFERENCIAL TEÓRICO ............................................................................................. 19 
2.1 Aspectos e características botânica, distribuição geográfica e uso de Libidibia ferrea ..... 19 
2.2 Propriedades teraupêuticas, químicas e farmacológicas de Libidibia ferrea ..................... 22 
2.3 Aspecto geral da cultura de células e tecidos vegetais ....................................................... 25 
2.4 Técnicas utilizadas para estudos de cultura de tecidos e células vegetais .......................... 26 
2.4.1 Micropropagação ............................................................................................................ 26 
2.4.2 Cultura de embriões zigóticos ......................................................................................... 26 
2.3.3 Embriogênese somática ................................................................................................... 26 
2.3.4 Cultura de calos .............................................................................................................. 26 
2.3.5 Suspensão celular ............................................................................................................ 27 
2.3.6 Microscopia eletrônica .................................................................................................... 27 
2.4 Fatores que inflenciam no sucesso da cultura de tecidos ................................................... 27 
2.4.1 Explante ........................................................................................................................... 28 
2.4.2 Assepsia ........................................................................................................................... 28 
2.4.3 Meios de cultura .............................................................................................................. 29 
2.4.4 Sacarose .......................................................................................................................... 30 
2.4.5 Vitaminas ......................................................................................................................... 30 
2.4.6 Inositol ............................................................................................................................. 30 
2.4.7 Reguladores de crescimento vegetal ............................................................................... 30 
2.4.8. Luz .................................................................................................................................. 31 
2.5 Metabólitos secundários de plantas .................................................................................... 32 
2.6 Metodologias utilizadas na busca de substâncias bioativas................................................ 35 
2.7 Fracionamento, isolamento e purificação de metabolótios secundários............................. 35 
2.8 Bioensaios para determinação do potencial medicinal de extratos de plantas ................... 36 
2.9 Ensaios antibacterianos ...................................................................................................... 37 
2.9.1 Métodos de difusão .......................................................................................................... 37 
2.9.2 Métodos de diluição ........................................................................................................ 37 
2.9.3 Bioautografia ................................................................................................................... 38 
2.10 Antioxidantes .................................................................................................................... 38 
2.10.1 Ensaio antirradicalar de sequestro do radical DPPH. ................................................. 39 
2.10.2 Atividade redutora do íon férrico (Fe3+) a íon ferroso (Fe2+) ...................................... 39 
xv 
 
3. JUSTIFICATIVA ............................................................................................................... 42 
4. OBJETIVOS ....................................................................................................................... 43 
4.1 Geral ................................................................................................................................... 43 
4.2 Específicos .......................................................................................................................... 43 
5. REFERÊNCIAS ................................................................................................................... 44 
CAPÍTULO I .......................................................................................................................... 55 
Cultura in vitro de embriões zigóticos e sementes de Libidibia ferrea .................................... 55 
Introdução ................................................................................................................................. 58 
Material e Métodos ................................................................................................................... 59 
Resultados e Discussão ............................................................................................................. 60 
Conclusões ................................................................................................................................ 66 
Agradecimentos ........................................................................................................................ 66 
Literatura citada ........................................................................................................................ 66 
CAPÍTULO II ........................................................................................................................ 69 
Indução de calos em explantes foliares e segmentos nodais de Libidibia ferrea 
(Fabaceae), uma notável planta de valor medicinal ............................................................. 69 
Introdução ................................................................................................................................. 71 
Material e métodos ................................................................................................................... 72 
Resultados e discussão ............................................................................................................. 72 
Conclusões ................................................................................................................................ 75 
Agradecimentos ........................................................................................................................ 75 
Referências bibliográficas ........................................................................................................ 76 
CAPÍTULO III ....................................................................................................................... 80 
Calogênese e regeneração de plantas in vitro de Libidibia ferrea (Fabaceae) ................... 80 
Introdução ................................................................................................................................. 82 
Material e métodos ................................................................................................................... 83 
Obtenção do material vegetal ................................................................................................... 83 
Estabelecimento in vitro ...........................................................................................................83 
Indução de calos em meios nutritivos com 2,4-D na ausência e presença de luz .................... 83 
Regeneração in vitro ................................................................................................................. 84 
Análise ultraestrutural de calos................................................................................................. 84 
Análise estatística ..................................................................................................................... 85 
Resultados e discussão ............................................................................................................. 85 
xvi 
 
Efeito de diferentes concentrações de 2,4-D, meios de cultura e fontes de luz no processo 
calogênico ................................................................................................................................. 85 
Análise ultraestrutural de calos................................................................................................. 90 
Regeneração in vitro ................................................................................................................. 93 
Conclusão ................................................................................................................................. 96 
Agradecimentos ........................................................................................................................ 96 
Referências ............................................................................................................................... 96 
CAPÍTULO IV ....................................................................................................................... 99 
Bioprospecção de extratos de plantas micropropagadas de Libidibia ferrea....................99 
Introdução ............................................................................................................................... 101 
Material e métodos ................................................................................................................. 101 
Coleta e identificação do material vegetal .............................................................................. 101 
Obtenção dos extratos vegetais............................................................................................... 102 
Análise fitoquímica e fracionamento ...................................................................................... 102 
Avaliação da atividade antibacteriana. ................................................................................... 103 
Preparo das culturas bacterianas.............................................................................................103 
Atividade antioxidante ............................................................................................................ 103 
Curvas de calibração com ácido ascórbico. ............................................................................ 103 
Ensaio com 2,2-difenil-1-picrilhidrazila (DPPH). .................................................................. 104 
Fe3+ / fenantrolina. .................................................................................................................. 104 
Ensaio de toxicidade sobre Artemia salina............................................................................. 104 
Análise estatística: . ................................................................................................................ 104 
Resultados e discussão ........................................................................................................... 105 
Análise fitoquímica. ............................................................................................................... 105 
Avaliação da atividade antibacteriana. ................................................................................... 110 
Atividade antioxidante. ........................................................................................................... 111 
Toxicidade frente à Artemia salina. ....................................................................................... 113 
Conclusão ............................................................................................................................... 114 
Agradecimentos ...................................................................................................................... 114 
Referências ............................................................................................................................. 115 
CONSIDERAÇÕES FINAIS ............................................................................................... 117 
ANEXO 1 ............................................................................................................................... 118 
ANEXO 2 ............................................................................................................................... 120 
ANEXO 3 ............................................................................................................................... 122 
17 
 
1. INTRODUÇÃO 
A floresta Amazônica possui umas das biotas mais ricas do planeta ocupando 49% do 
território brasileiro, considerada uma fonte de oportunidades para o Brasil, em especial na 
pesquisa científica e tecnológica dos produtos naturais. A região Amazônica abrange uma 
grande diversidade de espécies que funcionam como um reservatório genético ainda pouco 
explorado, mas com grande potencial ornamental, cosmético, perfumaria, alimentício e 
farmacêutico para o bem estar humano (FERRAZ et al., 2009). 
Neste contexto, destaca-se a Libidibia ferrea (Fabaceae), popularmente conhecida como 
“pau-ferro” ou “jucá”, amplamente utilizada na medicina popular principalmente na região 
Norte e Nordeste do Brasil (COELHO-FERREIRA, 2009; OLIVEIRA et al., 2010). É uma 
espécie de notável valor medicinal, devido ao potencial do princípio ativo denominado de “Pau-
ferrol A” que atua contra a topoiosomerase II humana, e inibe o crescimento das células 
tumorais por meio da indução de apoptose, podendo ser utilizado como importante ferramenta 
no tratamento da leucemia HL60 humana (NOZAKI et al., 2007; OHIRA et al., 2013a). 
Diversas propriedades terapêuticas já foram avaliadas revelando resultados promissores para 
diversas finalidades, tais como: antidiarréicos, antianêmico, antidiabético, anticancerígeno, 
tratamento de tuberculose, fito-fortificantes de corpo, antitérmico, antidiarréico, antifúngica, 
anti-inflamatório e cicatrizante e outras (FERNANDES et al., 2016; GALLÃO et al., 2013; 
LIMA et al., 2011; LOPES et al., 2013a; NAKAMURA et al., 2002a; NAWWAR et al., 2015; 
PEREIRA et al., 2012). 
Essa espécie vem sofrendo um intenso processo de extrativismo praticado de maneira 
indiscriminada de suas populações naturais, provocando a erosão genética e a a destruição do 
seu habitat na Amazônia (BENEDITO et al., 2012). Estudos indicam que a propagação desta 
espécie é viável por sementes (FILHO et al., 2005; SCALON et al., 2011), por micropropagação 
(SILVA et al., 2018) e por regeneração de mudas em condições ex vitro (LENHARD et al., 
2013; LENHARD et al., 2010; LIMA et al., 2008; SANTOS et al., 2013). Entretanto, a baixa 
e irregular produção de sementes aliada, à elevada dormência tegumentar (COELHO et al., 
2010a), tem limitado a produção de mudas para a recomposição das populações naturais e os 
plantios ex situ. 
Frente a esta realidade, a cultura de células e tecidos vegetais, é uma alternativa eficiente 
para promover a reprodução de genótipos superiores através de condições in vitro (GEORGE 
et al., 2008; LOYOLA-VARGAS e OCHOA-ALEJO, 2012). É uma das ferramentas 
biotecnológicas mais importantes que podem ser usadas nos procedimentos da engenharia 
celular, engenharia genética e genômica funcional (BHOJWANI e DANTU2013a; 
18 
 
MIROSHNICHENKO et al., 2016), bem como na conservação de genótipos a longo prazo 
(BHOJWANI e DANTU, 2013c; LOYOLA-VARGAS; OCHOA-ALEJO, 2012). Entretanto, a 
cultura de células e tecidos baseia-se no fenômeno denominado de totipotência, ou seja, 
qualquer célula no organismo vegetal contém toda a informação genética necessária à 
regeneração de uma planta completa (CID e TEIXEIRA, 2014). Umas das peculiaridades da 
cultura de células e tecidos é a multiplicação sistematizada de plantas elites pelo processo da 
propagação in vitro (MORAIS et al., 2012). Além disso, pode ser empregada na produção de 
metabólitos secundários para fins teraupêuticos e farmacológicos (ARNALDOS et al., 2001; 
PEREIRA, 2009). 
Considerando a importância desta espécie e as vantagens das técnicas aplicadas ao 
cultivo in vitro, neste estudo, são abordados os métodos de propagação e produção de mudas e 
metabólitos secundários, na tentativa de solucionar o problema da demanda de mudas com alta 
qualidade genética. No primeiro capítulo foram avaliados a cultura in vitro de sementes e 
embriões zigóticos. No segundo capítulo, foram induzidos calos friáveis obtidos de explantes 
foliares e segmentos nodais. No terceiro capítulo, foi realizado a influência da luz de LEDs na 
calogênese e regeneração in vitro de plantas. No quarto capítulo foi realizado o estudo químico 
e biológico dos extratos obtidos de plantas micropropagadas de L. ferrea. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
19 
 
2. REFERENCIAL TEÓRICO 
2.1 Aspectos e características botânica, distribuição geográfica e uso de Libidibia ferrea 
A classificação taxonômica de Libidibia ferrea encontra-se descrita na Tabela 1 
(FORZZA et al., 2010). Recentemente, a nomenclatura de Libidibia ferrea foi modificada 
taxonômicamente, sendo anteriormente conhecida como Caesalpinia ferrea (QUEIROZ, 
2009). Diversos estudos químicos e farmacológicos, bem como a propagação vegetativa foram 
relatados utilizando-se a sinonímia desta espécie, incluindo os dois primeiros capítulos 
publicados desta Tese. 
Esta espécie, pode alcançar 10-15 m de altura, com um diâmetro do tronco de 40 a 60 
cm (Figura 1B). Suas folhas de árvore adulta podem medir cerca de 7-20 cm de comprimento 
(Figura 1A). Suas flores são pequenas e amarela com características aglomeradas (Figura 1A). 
Sua floração ocorre entre abril e maio e a frutificação entre maio e agosto (GALDINO et al., 
2007). 
Os frutos são denominados de vagens, cuja dimensões médias são de 8,3 x 1,8 x 0,8 cm 
e tem a cor verde quando imaturo, tornando-se marrom quando maduros (Figura 1C). Eles são 
indeiscente, com um lado oblongo, ligeiramente achatado, na forma sinuosa. As sementes são 
de forma discóide ou ovoide, com uma base achatada e ápice arredondado. O tamanho médio 
das sementes é 0,9 x 0,5 x 0,5 cm e suas cores variam de verde claro a amarelado (Figura 1D). 
As sementes apresentam características opacas, firmes em consistência, e são separados em 
poços individuais (Figura 1F) (GALDINO et al., 2007; LORENZI e MATOS, 2002) 
O jucá ou pau-ferro é nativo do Brasil (Figura 1E) e é endêmico nas regiões Norte 
(RODRIGUES et al., 2012) e Nordeste (QUEIROZ, 2009), sendo conhecida por vários nomes 
descritos em diferentes estados brasileiros, conforme mostrado na Tabela 2. Além disso, a 
espécie é cultivada em outros países para o uso de reflorestamentos de parques e ruas conhecida 
como “Brazilian ironwood” (MATOS, 2007). 
Além disso, essa espécie pode ser utilizada para o paisagismo, proporcionando boa 
sombra em ruas e avenidas. Também é indicada para reflorestamentos destinados à 
recomposição de Áreas de Preservação Permanente (APP) que foram degradadas. Apresenta 
uma grande importância também na indústria madeireira, por apresentar madeira muito dura e 
de longa durabilidade natural. Também é empregada na construção civil, na forma de vigas, 
esteios, caibros, escadas (LORENZI, 1992; MAIA, 2004) e utilizada na fabricação de móveis 
de luxo na Índia e Sri Lanka (MAIA, 2012, 2004; STASI, 2002). 
 
 
20 
 
Tabela 1. Classificação taxonômica de Libidibia ferrea 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Fonte: (QUEIROZ, 2009; FORZZA et al., 2010) 
 
 
Tabela 2. Alguns nomes populares de Libidibia ferrea conhecidos no Brasil 
 Fonte: STASI (2002) 
 
 
 
Nome científico Libidibia ferrea (Mart. ex Tul.) L. P. Queiroz var. ferrea 
Sinonimia Caesalpinia ferrea (Mart. ex Tul.) L. P. Queiroz 
Reino Plantae 
Filo Magnoliophyta (Angiospermae) 
Classe Magnoliopsida (Dicotiledonae) 
Subclasse Rosidae 
Ordem Fabales 
Família Fabaceae 
Subfamília Libidibiaceae (Caesalpinioideae, Leguminosae) 
Espécie Libidibia ferrea (Mart. Ex Tul) L.P. Queiroz var. ferrea 
Nome Estado 
Jucá Amazonas 
Ibirá-obi; imirá-obi; imirá-itá; jucá e pau-ferro-da-mata Espirito Santo 
Muirá-itá; muirá-obi; muirapixuma; mururé; pau-ferro-do-norte Pernambuco 
Pau-ferro-verdadeiro Rio Grande do Sul 
Peroba-sobro Bahia 
Quiripiranga Rio de Janeiro 
21 
 
Figura 1. Libidibia ferrea (Mart. Ex Tul.) L.P. QUEIROZ. (A) Aspecto geral da floração; (B) Detalhe do caule; (C) Fruto maduro; (D) 
Aspecto geral da semente; (E) Distribuição e ocorrência. 
 
 Fonte: SANTOS et al., (2018) 
22 
 
2.2 Propriedades teraupêuticas, químicas e farmacológicas de Libidibia ferrea 
Na medicina popular, algumas das suas propriedades terapêuticas têm sido relatada para 
diferentes tipos de tratamentos de doenças (Tabela 3). Além disso, é considerada uma das 71 
espécies da lista de plantas medicinais de interesse para o Sistema de Saúde Brasileiro e foi 
incluída no Formulário Nacional de Ervas Medicinais (BRASIL, 2011; MEDEIROS et al., 
2013; RIBEIRO et al., 2014). 
 
Tabela 3. Aplicações terapêuticas de Libidibia ferrea na medicina popular 
 
Estudos fitoquímicos (Figura 2) dos extratos hidroalcoólicos do caule, casca e folhas 
mostraram a presença de flavonóides, saponinas, taninos, cumarinas, esteróis e substâncias 
fenólicas. Da casca, derivados antracenicos e de saponinas, glicosídeos cardiotônicos, e os 
alcalóides também foram relatados (GONZALEZ et al., 2004). O ácido gálico e galato de 
metila foram isolados dos extratos etanólicos dos frutos (NAKAMURA et al., 2002b). 
 
 
 
 
Parte usada Uso na medicina popular Referências 
Casca 
Expectorante (RIBEIRO et al., 2014) 
Antidiarréicos (SIQUEIRA et al., 2012) 
Frutos 
Antianêmico e antidiabético para tratamento de 
distúrbios hemolíticos pulmonares 
(OLIVEIRA et al., 2010) 
Prevenção do câncer 
(NAKAMURA et al., 
2002a) 
Tratamento de tuberculose (STOREY e SALEM, 
1997) 
Fito-fortificantes de corpo (RODRIGUES, 2006) 
Sementes Tratamentos de hematomas e contusões (SOUZA et al., 2010) 
Casca do 
caule 
Antidiabético, antidiarreico e descongestivo para 
tratamento de feridas, enterocolites, reumatismo e 
para perda de peso; sopro, dor na coluna, tosse, 
dor inflamatória dos órgãos internos e externos, 
dor nos ossos 
(RIBEIRO et al., 2014; 
SANTOS et al., 2010) 
Pó da casca Tratamento de feridas cutâneas (OLIVEIRA et al., 2010) 
Raízes Antitérmico (MAIA, 2004) 
Frutos Antidiarréico, anticatarra e cicatrizante 
(LORENZI e MATOS, 
2002; MAIA, 2004) 
23 
 
Figura 2. Substâncias isoladas de Libidibia ferrea 
 Fonte: Costa et al., (2015) 
 
 
CAULE 
FRUTOS 
Pau-ferrol A 
Trímero chalcona 
Acidos palmítico e octacosanoico 
Ácidos graxos 
Ácido elágico 
Polifenol 
Sitosterol 
Terpenóide 
R = H, Ácido gálico 
R = CH3, Galato de metila 
R = C2H5, Galato de etilo 
 
Ácidos fenólicos 
 
 
 
 
24 
 
O extrato de benzeno dos frutos desta planta forneceu sitosterol e ácidos palmítico e 
octacosanóico. O extrato alcoólico também forneceu ácido gálico, além do galato de etilo e 
ácido elágico (REBOREDO et al., 2007). O Pau-ferrol, um trímero de chalcona isolado a partir 
de um extrato de acetona das hastes (NOZAKI et al., 2007), éum marcador fitoquímico 
importante da espécie. Estudos comprovam que o jucá possui diversas propriedades 
farmacológicas (Tabela 4). 
 
Tabela 4. Atividades biológicas de Libidibia ferrea 
 
 
Extratos 
avaliados 
Atividades biológicas Referências 
Folhas 
 
Atividade antioxidante (PORT’S et al., 2013) 
Atividades antibiofilme (TRENTIN et al., 2011) 
Atividade larvicida 
(CAVALHEIRO et al., 2009; DE S. LUNA et al., 
2005) 
Frutos 
Atividade antifúngica (MARTINS et al., 2014) 
Atividade antioxidante (BARROS et al., 2014; DA SILVA et al., 2011) 
Atividade hepatoprotetiva (BARROS et al., 2014) 
Atividade antifertilidade (LUCINDA et al., 2010) 
Atividade reprodutiva (PETERS et al., 2008) 
Atividade antimicrobiana (MARREIRO et al., 2014) 
Atividade citotóxica e 
clastogênica 
(BÊCCO DE SOUZA et al., 2006) 
Atividade anti-tumoral (NAKAMURA et al., 2002b) (UEDA et al., 2001) 
Atividade anti-inflamatória e 
analségica 
(CARVALHO et al., 1996; DIAS et al., 2013; 
LIMA et al., 2012; PEREIRA et al., 2012) 
Sementes 
Atividade antinociceptiva (SAWADA et al., 2014) 
Atividade de inibição enzimática (CAVALHEIRO et al., 2009) 
Atividade antivírus (LOPES et al., 2013b) 
Atividade antifúngica (BARIANI et al., 2012) 
Casca 
Atividades anti-inflamatória, 
analgésica e antimicrobiano 
(DE ARAÚJO et al., 2014) 
Atividades antioxidadentes e 
hepatoprotetiva 
(BARROS et al., 2014) 
Atividade hipoglicêmica (VASCONCELOS et al., 2011) 
Atividade cardiovascular (MENEZES et al., 2007) 
Atividade inibitória da 
proliferação celular e 
topoisomerase II humana 
(NOZAKI et al., 2007; OHIRA et al., 2013b) 
Atividade antibacteriana (PEREIRA et al., 2006) 
25 
 
2.3 Aspecto geral da cultura de células e tecidos vegetais 
A cultura de células e tecidos vegetais é o conjunto de técnicas utilizadas para cultivar 
in vitro células e tecidos vegetais em meio nutritivo sintético, de composição química definida, 
sob condições adequadas de assepsia, nutrição e fatores ambientais visando produzir uma nova 
planta. Essas técnicas apresentam importância prática para área agrícola e florestal, onde 
aparecem como uma das metodologias mais polivalentes que tem como um dos principais 
objetivos a manipulação de plantas, inclusive ao nível molecular quando necessário. Além 
disso, tem conquistado destacada posição na recuperação de plantas; na propagação comercial; 
no melhoramento genético; no manejo, no intercâmbio e na conservação de germoplasma; e em 
outras aplicações com as pesquisas em fisiologia vegetal e produção industrial in vitro de 
metabólitos secundários (CARVALHO et al., 2013). 
A cultura de tecidos de plantas possibilita fornecer ao produtor mudas de alta qualidade 
genética e quantidade suficiente para suprir a necessidade do mercado em curto espaço de 
tempo (BHOJWANI e DANTU, 2013b). Dentre as técnicas de cultura de tecidos vegetais, 
destacam-se a micropropagação, a embriogênese somática, a calogênese (cultura de calos), a 
cultura de embriões e a suspensão celular visando à produção de metabólitos secundários 
(MORAIS et al., 2012), conforme mostrado na figura 3. 
 
Figura 3. Princípio geral da cultura de células e tecidos vegetais 
Fonte: KERBAUY (1997) 
26 
 
2.4 Técnicas utilizadas para estudos de cultura de tecidos e células vegetais 
2.4.1 Micropropagação 
A micropropagação de plantas representa uma alternativa para a propagação comercial 
de espécies de interesse econômico, entre as quais as que apresentam propriedades medicinais 
com valor farmacológico reconhecido. A crescente demanda da indústria farmacêutica por 
plantas com alta qualidade genética e fisiológica, bem como com capacidade de síntese de 
metabólitos secundários, por meio do melhoramento genético, justificam a utilização desta 
técnica (BHOJWANI e DANTU, 2013d; DEBERGH e READ, 1991; GRATTAPAGLIA e 
MACHADO, 1998). 
2.4.2 Cultura de embriões zigóticos 
 Este tipo de cultivo tem sido usado para superar a dormência de sementes, em virtude 
da imaturidade do embrião ou da presença de substâncias inibidoras no endosperma; estudar os 
aspectos nutricionais e fisiológicos do desenvolvimento do embrião; testar a viabilidade de 
sementes; recuperar híbridos raros de cruzamentos incompatíveis; e como fonte de explantes 
devido a elevada totipotência (DODEMAN et al., 1997; HASLAM e YEUNG, 2011). 
2.3.3 Embriogênese somática 
 Embriogênese somática, adventícia ou assexual são termos usualmente empregados 
para designar o processo pelo qual células haplóides ou somáticas desenvolvem-se por meio de 
diferentes estádios embriogênicos, dando origem a uma planta, sem que ocorra a fusão de 
gametas. A embriogênese somática é um método importante para propagação de plantas elite 
in vitro, em larga escala. Além de servir de modelo para estudos básicos relacionados com a 
fisiologia do desenvolvimento do embrião, esse sistema vem sendo utilizado para produção de 
plantas transgênicas e sementes sintéticas (DODEMAN et al., 1997; MORAIS et al., 2012; 
ZIMMERMANNN, 2014). 
2.3.4 Cultura de calos 
 Esta técnica possibilita a obtenção de grande quantidade de plantas a partir de um único 
explante, sendo um dos procedimentos mais eficientes na produção rápida de plantas in vitro 
(GALÁZ-ÁVALOS et al., 2012). O cultivo de calo in vitro é considerada uma técnica eficiente 
para obtenção de embriões somáticos, possibilitando elevadas taxas de multiplicação e resulta 
em embriões individualizados que se desenvolvem em plantas completas (BHOJWANI e 
DANTU, 2013b; HASLAM e YEUNG, 2011; ISAH, 2016). 
27 
 
2.3.5 Suspensão celular 
Este bioprocesso é utilizado para a obtenção e proliferação de células em meio líquido, 
sob condição de agitação contínua, para evitar possíveis gradientes nutricionais e gasosos no 
meio de cultura. Além de ser uma técnica eficiente de multiplicação rápida, as suspensões 
celulares tem uma grande aplicação para os estudos de bioquímica, genética, citologia, 
fisiologia vegetal e fitopatologia. Este tipo de cultivo também é empregado na produção de 
metabólitos secundários ou material clonal em escala comercial pela utilização de biorreatores 
(GALÁZ-ÁVALOS et al., 2012; MOSCATIELLO et al., 2013). 
2.3.6 Microscopia eletrônica 
O microscópio eletrônico de transmissão (MET) foi introduzido como ferramenta de 
pesquisa em meados de 1950 e sua utilização trouxe contribuições significativa ao 
conhecimento humano possibilitando a visualização de detalhes das amostras ao nível de 
escalas nanométricas nas áreas biológicas e da ciências de materais. Simultaneamente, por volta 
de 1950 outro importante instrumento surge denominado de microscopia eletrônica de 
varredura (MEV), a qual influenciou uma segunda revolução no estudo da microscopia 
confocal, devido à alta profundidade de campo resultando aspecto de resolução tridimensional 
às imagens (ALVES, 2004). 
Para fins de culturas de tecidos vegetal, os aspectos morfolológicos de células 
embriogênicas vêm sendo bastante utilizados pelas análises ultraestrutural, por meio de MEV 
em diversos grupos de pesquisas. Esta análise tem sido descrita em estudos de embriogênese 
somática para diferentes espécies, a exemplo de Bysonima intermedia (NOGUEIRA et al., 
2007) e Heliconia chartaceae (ULISSES et al., 2010). Este tipo de microscopia foi bastante 
adequado para análise das células, demonstrando aspectos tridimensionais da estruturas 
celulares e morfologia externas das mesmas. 
Muitas estruturas celulares e macromoléculas apresentam dimensões na escala dos 
nanômetros, por exemplo, mitocôndrias, membranas, vacúolos, leucoplastos, entre outros 
podem ser visualizados por meio da MET, como demonstrado em Bysonima intermedia 
(NOGUEIRA et al., 2007). 
 
2.4 Fatores que inflenciam no sucesso da cultura de tecidos 
O sucesso da cultura de células e tecidos depende de vários fatores durante as etapas 
como: estado fisiológico da planta matriz, coleta de explantes, esterilizaçãodos meios de 
28 
 
cultura, condições de incubação, manipulação de subculturas, uso de reguladores de 
crescimento, meio de cultura, luminosidade, entre outros (CID e TEIXEIRA, 2014; QUISEN 
e ANGELO, 2008). 
2.4.1 Explante 
 A micropropagação é um termo utilizado exclusivamente para refere-se à propagação 
in vitro a partir de alguma parte específica da planta baseada na capacidade morfogenética e 
totipotencialidade das células (BHOJWANI e DANTU, 2013d). Qualquer tecido e/ou parte da 
planta destinada ao uso no cultivo in vitro denomina-se explante. Deste modo, podem ser 
usados nas culturas: fragmentos de raízes, hipocótilos, epicótilos, cotilédones, flores e folhas, 
embriões, gemas axilares ou apicais e outros (CID e TEIXEIRA, 2014). A escolha do explante 
poderá ser determinado por vários fatores, tais como: disponibilidade de material, nível de 
contaminação, juvenilidade e estação do ano (CID e TEIXEIRA, 2014; QUISEN e ANGELO, 
2008). 
 Segundo GRATTAPAGLIA e MACHADO (1998), a fonte de variação do crescimento 
in vitro entre os explantes pode estar relacionda com o seu tamanho e com a sua posição, quando 
seccionado do explante de origem. DHAR e JOSHI (2005) relatam que nem todos os explantes 
reagem da mesma forma a uma determinada condição in vitro, conforme observado no estudo 
de Saussurea obvallata (planta medicinal e ornamental), verificou-se que os explantes foliares 
apresentaram as melhores respostas quando comparados com raízes, hipocótilo e cotilédones 
usados na indução de calos e de organogênese. 
O suplemento nutricional é outro fator que poderá variar conforme o explante. Esse 
aspecto nutricional será abordado um pouco mais adiante. A viabilidade do explante é um 
aspecto vital a ser considerado, pois muitos embriões, especialmente de sementes recalcitrantes 
(a exemplo de seringueira e do café, etc.), podem estar em condições não viáveis para seu 
cultivo in vitro (CID e TEIXEIRA, 2014). 
2.4.2 Assepsia 
 A desinfestação, ou seja, a remoção de contaminantes existentes na superfície do 
explante oriundo de material de campo ou de casa de vegetação, é um passo inevitável na 
cultura in vitro. Na tentativa de produzir plantas sadias livres de patógenos, a propagação in 
vitro, a partir de sementes, apresenta-se como forma viável de produção, no entanto, diversos 
fatores podem afetar o potencial germinativo das sementes promovendo a formação de 
plântulas anormais, dentre eles, a presença de microrganismos, como fungos. Sendo assim, para 
que a propagação in vitro torne-se fonte confiável de material asséptico, os métodos de 
29 
 
desinfestação devem ser eficazes, proporcionando a ausência de agentes patológicos (CID e 
TEIXEIRA, 2014; MORAIS et al., 2012). 
 Segundo EFFEGEM et al., (2014) as substâncias mais utilizadas nos processos de 
desinfestação são os compostos a base de cloro ativo (2,0% a 2,5%) e etanol (70%). O 
hipoclorito de sódio (NaOCl) poderá ser usado em uma formulação mais concentrada (10% a 
12%). Nesse caso, dada a alta concentração, o produto deverá ser usado numa forma mais 
dilúida, conforme observado no estudo de Libidibia ferra (SILVA et al., 2018). Outra 
formulação comercial para a assepsia dos explantes é o hipoclorito de cálcio (CaOCl2), 
geralmente a 7% (p/v). Contudo, nesse caso é recomendado previamente filtrar o produto (CID 
e TEIXEIRA, 2014). O uso de hipoclorito pode ser testado a diferentes concentrações e tempo 
de imersão, como por exemplo 0,0; 5,0; 10; 20; 30 minutos, etc. É recomendado que, durante 
esse tempo, os explantes fiquem sob agitação. Após esse tratamento, os explantes devem ser 
lavados com água destilada e autoclavada para que os resíduos do hipoclorito sejam removidos. 
 Com relação ao fungicida benomil (cabriotop), a experiência prática também tem sido 
satisfatória. Por exemlo, quando as sementes de L. ferrea colhidos no campo foram tratados 
com hipoclorito de sódio 0,25% (v/v) – depois com benomil a 2% (v/v) por 60 minutos – e, em 
seguida, foram inoculados em meios de cultura, a contaminação dos explantes foi reduzida 
(SILVA et al., 2018). 
 Por fim, o tipo de explante de cada espécie usadas são questões muitos importantes que 
necessitam ser consideradas para as fases subsequentes da propagação in vitro (KUMAR e 
REDDY, 2011). 
2.4.3 Meios de cultura 
Os meios nutritivos usados na cultura de tecidos, quanto aos nutrientes, baseiam-se nas 
exigências de crescimento e desenvolvimento das plantas, com algumas modificações para 
atender às necessidades específicas das condições in vitro (CALDAS et al., 1998). A 
composição dos meios de cultura utilizados na micropropagação varia de acordo com a espécie 
e as diferentes etapas do processo, ou seja, assepsia, multiplicação e enraizamento in vitro (CID 
e TEIXEIRA, 2014). Dentre os meios de cultura mais utilizados para a micropropagação, 
destacam-se o MS (MURASHIGE e SKOOG, 1962), Wood Plant Medium - WPM (LLOYD; 
MCCOWN, 1981) e Gamborg B5 (GAMBORG et al., 1968). Os ingredients tradicionais de um 
meio nutritivo são: compostos inorgânicos, orgânicos, inertes e complexas substâncias naturais 
(CID e TEIXEIRA, 2014). A seguir, serão elencados os ingredientes dos meios nutritivos de 
forma suscinta para a cultura de tecidos. 
30 
 
 2.4.4 Sacarose 
 O uso deste composto é fundamental para o crescimento das plantas, devido à 
fotossíntese da planta. A sacarose é um dos carboidratos mais usados na preparação de meios 
nutritivos. Sua concentração mais usual varia de 2% a 3%. Mas, ela pode ser utilizada em 
concentrações maiores de 6%, como no caso de embriões, na indução de bulbilhos de alho ou 
na tuberização em raízes de mandioca (CID e TEIXEIRA, 2014). 
2.4.5 Vitaminas 
 As vitaminas utilizadas na cultura de tecidos fazem parte do grupo das hidrosolúveis. 
Este grupo é composto por diferentes vitaminas, tais como: B1 (tiamina), B2 (riboflavina), B6 
(piridoxina), ácido pantotênico, ácido nicotínico (niacina), ácido fólico, ácido ascórbico, biotina 
e cobalamina. Dessa lista, a tiamina, o ácido nicotínico e a pirixodina estão presentes em sua 
grande maioria nos meios nutritivos. Enquanto que a biotina e o ácido pantotênico são de uso 
mais restritos (CID e TEIXEIRA, 2014). 
2.4.6 Inositol 
Este composto orgânico de baixo peso molecular (180 g), é solúvel em água e 
rotineiramente usado na preparação de meios. Eventualmente, apresenta um efeito benéfico e 
não se conhecem respostas inibitórias ou essenciais nas concentrações utilizadas (50 mg L-1 a 
100 mg L-1) (CID e TEIXEIRA, 2014). 
2.4.7 Reguladores de crescimento vegetal 
Os fitormônios vegetais podem ser definidos como substâncias naturais ou sintéticas 
(fitorreguladores) que são adicionados ao meio de cultura, com a finalidade de induzir 
modificações nos padrões de crescimento e desenvolvimento do explante (CID e TEIXEIRA, 
2014). Os reguladores vegetais são amplamente utilizados na suplementação dos meios de 
cultura para suprir deficiências hormonais, e também estimular o desenvolvimento da planta 
durante todo o processo de propagação in vitro (MIRANSARI e SMITH, 2014). As principais 
classes de hormônios são as citocininas e auxinas responsáveis pela indução e multiplicação de 
gemas na maioria das espécies vegetais, com variações nas concentrações exógenas necessárias. 
Entretanto, as concentrações mais utilizadas destes hormônios, normalmente, giram em torno 
de 0,1 e 5,0 mg L-1 (RADEMACHER, 2015) 
As auxinas mais utilizadas na técnica de cultura de tecidos são: AIA (ácido 3-indol-
acético), o IBA (ácido 4-indol-butírico), o 2,4-D (ácido 2,4-diclorofenoxiacético), o ApCFA 
(ácido p-clorofenoxiacético) e o ANA (ácido 1-naftalenoacético) (PEIXOTO, 2011). A ação 
31 
 
das auxinas é verificada na indução do alongamento celular e diferenciação de raízes em 
culturas in vitro, indução de embriogênese, o aumento da friabilidade de calos, o alongamento 
de entrenós (QUISEN et al., 2008).As citocininas constituem um grupo de reguladores indispensáveis à divisão celular, 
quebra de dormência apical, indução e proliferação de gemas axilares e diferenciação de gemas 
adventícias, indução de parte aérea em calos (TAIZ et al., 2017). CID e TEIXEIRA (2014) 
descrevem que as citocininas mais usadas em cultura de tecidos são a KIN (6-
furfurilaminopurina, também conhecida como cinetina), o BAP (6-Benzilaminopurina), o 2ip 
(N-Isopentinilaminopurina), Zea (Zeatina) e TDZ (Thidiazuron). 
2.4.8. Luz 
A luz, por ser fonte primária de energia relacionada à fotossíntese (HEO et al., 2006) e 
fenômenos morfogenéticos (TAIZ et al., 2017), é considerado um dos principais fatores que 
influenciam o crescimento e o desenvolvimento das plantas (GUPTA e AGARWAL, 2017). 
Em um laboratório de cultura de tecidos, é preciso tomar cuidado com a energia radiante para 
promover um bom desenvolvimento do cultivo in vitro (CID e TEIXEIRA, 2014). 
 Tradicionalmente, a iluminação das culturas in vitro por lâmpadas de descarga de gás 
(LDGs), comumente lâmpadas fluorescentes (Fls) emitem luz branca com padrões de emissão 
de 400 a 700 nm (nanômetros), que são os comprimentos efeitivos para a fotossíntese (BANTIS 
et al., 2018). A morfogênese das plantas e seus aspectos relacionados são regulados 
principalmente por vários fotorreceptores que são ativados por fótons nas regiões azul e 
vermelha do espectro de luz. De acordo com CID e TEIXEIRA (2014) os fótons apresentam 
diferentes valores de energia. Assim, os fótons da região ultravioleta são mais energéticos que 
os da região vermelha (Tabela 5). Uma parcela significativa da produção espectral provenientes 
por LDGs não é utilizada pelo cultivo de plantas in vitro (DUTTA GUPTA e JATOTHU, 2013). 
Além disso, o excesso de irradiação de luz pode causar danos e oxidação nas plantas (DIETZ 
et al., 2016). Além do desperdício de energia devido a fótons de comprimentos de onda 
indesejados e excesso de irradiação de luz, os LDGs também dissipam muita energia como 
calor. Assim, os LDGs podem não ser a escolha ideal para iluminar as culturas mantidas in 
vitro, e há uma necessidade de uma fonte de luz eficiente para melhorar a taxa de 
micropropagação com plantio de qualidade e reduzir o custo de propagação (GUPTA; 
AGARWAL, 2017). 
Com o avanço da tecnologia, os diodos emissores de luz (LEDs) foram propostos 
recentemente como uma fonte de luz eficiente em termos energéticos para várias aplicações de 
32 
 
cultura de tecidos vegetais. A emissão de faixa de onda estreita e o controle dinâmico da 
intensidade de luz em sistemas de iluminação baseados em LED permitem a personalização da 
qualidade espectral para atender às necessidades das plantas (BATISTA et al., 2018). A 
precisão na conversão de energia elétrica para fótons de comprimentos de onda específicos na 
densidade de fluxo de fótons fotossintéticos (DFFF) desejada, com perda de calor 
insignificante, torna os LEDs mais eficientes no consumo de energia do que todas as outras 
fontes de iluminação artificial disponíveis (GUPTA e AGARWAL, 2017). 
 O sucesso da regeneração de plantas in vitro depende muito da qualidade dos espectros 
e da eficiência de fótons das fontes de luz artificial. Os LEDs são a fonte ideal que pode fornecer 
espectros necessários para estimular respostas organogênicas e embriogênicas. Painéis de LED 
com espectros de emissão correspondentes aos espectros de absorção de fotorreceptores 
vegetais podem culminar na formação de plântulas influenciando a morfogênese e o 
metabolismo das plantas (MASSA et al., 2008). Diversos estudos demostram as aplicações bem 
sucedidas de LEDs que favorece o crescimento in vitro e a morfogênese de várias espécies de 
plantas (DUTTA GUPTA e JATOTHU, 2013). 
 
Tabela 5. Comparação entre o conteúdo energético de três comprimentos de ondas 
Comprimento de onda (λ) Energia (KJ mol-1) 
UV (280 nm) 471 
Azul (425 nm) 274 
Vermelha (640nm) 181 
Fonte: CID e TEIXEIRA (2014). 
 
2.5 Metabólitos secundários de plantas 
 Os metabólitos secundários acumuladas em plantas e microorganismos possuem um 
enorme valor agregado do ponto de vista econômico devido aos compostos identificados, pois 
poucos são aqueles utilizados como drogas, saborizantes, fragrâncias, inseticidas ou corantes 
(FILOVÁ, 2014). De todas as drogas usadas na medicina ocidental cerca de 25% são derivadas 
de plantas, quer como um composto puro (fármaco) ou como derivado de um produto de síntese 
natural. 
Mais de 50 mil metabólitos secundários já foram identificados em espécies de 
angiospermas, e são sintetizados em diferentes compartimentos celulares, por quatro vias de 
biossíntese, são elas: via do acetato malonato, do ácido mevalônico (MEV), do metileritritol 
fosfato (MEP) e do ácido chiquímico. Através dessas vias são formados os três principais 
33 
 
grupos de metabólitos secundários: terpenos, substâncias fenólicas e substâncias nitrogenadas 
(Figura 4) (MOREIRA 2015). Além destes grupos, também merecem destaque os derivados de 
ácidos graxos e os policetídeos aromáticos. (FRANÇA, 2017) 
Apesar do desenvolvimento nas áreas de síntese orgânica, microbioligia industrial e 
biologia molecular, parte dos fármacos continua sendo provenientes de matérias-primas 
vegetais. A seguir uma lista de fármacos com elevado valor terapêutica obtidos de matérias-
primas vegetais é apresentada na Tabela 6. 
 
Tabela 6. Exemplos de fármacos obtidos de matérias-primas vegetais 
Fármaco Utilização terapêutica Espécie 
Artemisina (terpenos) Antimalárico Artemisia annua L. 
Atropina Anticolinérgico Atropa beladona L. 
Cafeína Estimulante central Coffea spp. 
Capsaicina Anestésico tópico Capsicum spp. 
Colchicina Antirreumático Colchium autumnale L. 
Digoxina, digitoxina Cardiotônicos Digitalis purpura L. 
Emetina Amebicida Carapichea ipecacuanha (Broth) 
L. 
Escopolamina Antiparkinsoniano Datura spp. 
Estrofantina (ouabaína) Cardiotônio Strophanthus spp. 
Fisostigmina Antiglaucomatoso Physostigma venenosum Balf. 
Galantamina Anticolinesterásico Galanthus woronowii Losinsk 
Hiosciamina Anticolinérgico Hyoscyanus muticus L. 
Morfina, codeína Analgésico/antitussígeno Papaver somniferum L. 
Pilocarpina antiglaucomatoso Pilocarpus jaborandi Holmes 
Quinina, quinidina Antimalárico/antiarrítmico Cinchona spp. 
Reserpina Anti-hipertensivo Rauvolfia spp. 
Tubocurarina Bloqueador neuromuscular Chondrodendron tomenstosum 
Ruiz & Pav. 
Vimblastina, vincristina Antineoplásicos Catharantus roseus L. 
Fonte: BERNARDES et al., (2017) 
 
 
 
34 
 
Figura 4. Esquema geral das vias de biosíntese do metabolismo vegetal secundário (retângulos rosas) e suas conexões com o metabolismo 
primário (retângulos vermelhas), em detalhe os metabólitos primários (verde) e os secundários (azul). 
 Fonte: MOREIRA (2015) 
35 
 
2.6 Metodologias utilizadas na busca de substâncias bioativas 
O processo de caracterização é considerado uns dos principais métodos para a 
identificação de grupos de metabólitos de uma determinada espécie vegetal cuja constituição é 
desconhecida (REGINATTO, 2017). Esta busca pode ser feita através do fracionamento 
biomonitorado ou bioguiado ou de forma mais clássica, através do fracionamento dos extratos 
ativos e posterior avaliação das substâncias isoladas nos ensaios para o qual o extrato foi ativo 
(LAHLOU, 2013). Cada passo do fracionamento é geralmente guiado por um bioensaio e o 
processo é chamado de bioensaio (SARKER e NAHAR, 2007). O esquema a seguir (Figura 5) 
apresenta uma visão geral do processo tradicional biomonitorado de descoberta de drogas de 
um produto natural. 
 
Figura 5. Esquema de processo de descoberta de produtos naturais. 
Fonte: SARKER e NAHAR (2007) 
 
2.7 Fracionamento, isolamento e purificação de metabolótios secundários. 
O procedimento para o fracionamento inicia com a avaliação biológica e também 
fitoquímica dos extratos vegetais atravésdo uso de técnicas como a cromatografia em camada 
delgada comparativa (CCDC) e de reveladores químicos e físicos. Desse modo, escolhe-se o 
extrato a fracionar, seja por apresentar elevada atividade biológica ou por indicar a presença de 
metabólitos de interesse para o grupo de pesquisa (AZMIR et al., 2013). O fracionamento é 
realizado utilizando diferentes técnicas como a cromatografia em coluna aberta, partição 
36 
 
liquido-liquido, cromatografia em camada delgada preparativa, cromatografia liquida de alta 
eficiência (CLAE), entre outras (LIANG et al., 2004). 
 No acoplamento destas técnicas, faz-se uso de métodos eficientes de separação, como 
CLAE e CG, com técnicas espectrométricas que funcionam para detecção, como 
espectrofotometria de UV-Visível (DAD), espectrometria de massas (MS e MS-MS) e 
ressonância magnética nuclear (RMN), fornecendo importante informações adicionais sobre a 
estrutura química dos componentes da amostra (LIANG et al., 2004; MUKHERJEE, 2018). O 
fracionamento por partição tem por objetivo separar os compostos considerando sua 
solubilidade e seu coeficiente de partição em diferentes solventes (REGINATTO, 2017). Para 
esse procedimento, a escolha dos solventes é baseada no grau de polaridade crescente (Figura 
6). Portanto, as substâncias isoladas são identificadas e avaliadas quanto a suas atividades 
biológicas através dos bioensaios (AZMIR et al., 2013). 
 
Figura 6. Processo de partição com solventes de polaridade crescente. 
Fonte: REGINATTO (2017) 
 
2.8 Bioensaios para determinação do potencial medicinal de extratos de plantas 
Bioensaios ou ensaios biológicos são testes feitos em laboratório que determinam o grau 
ou o efeito biológico de uma substância desconhecida ou de uma substância-teste (como drogas, 
 hormônio, químicos, etc). Entretanto, os bioensaios diferem principalmente quanto ao tempo 
de exposição do organismo-teste ao agente ou substância a ser testado (ADENUBI et al., 2018; 
ZOU et al., 2016). 
37 
 
Dentre os tipos de bioensaios, destacam-se: os ensaios in vivo que são aqueles realizados 
com organismos vivos e os ensaios in vitro, que são aqueles realizados em equipamentos 
laboratoriais, como placas de petri e microplacas (CARVALHO, 2016a). Nos últimos 30 anos, 
os ensaios biológicos in vitro tem sido bastante utilizado para descoberta de novas drogas 
devido ao seu potencial que podem testar muitas amostras para a atividade em um curto período 
de tempo e em pequenas escalas (microplacas), proporcionando resultados significativos 
quanto ao número de réplicas suficiente para efetuar a análise estatística, como o caso dos testes 
antibacterianos, antioxidantes e de toxicidade frente à Artemia salina (SOUZA-MOREIRA et 
al., 2010). 
 
2.9 Ensaios antibacterianos 
As plantas podem contribuir na descoberta de novos antibióticos, pois é possível que 
produtos naturais antimicrobianos possam ser biossintetizados para prevenir e/ou combater o 
ataque de microorganismos patogênicos às plantas (GUIMARÃES et al., 2010). Os principais 
métodos microbiológicos para avaliar a atividade antibacteriana estão classificados em três 
tipos: métodos de difusão, métodos de diluição e bioautografía (RIOS et al., 1988). As técnicas 
de difusão têm sido amplamente usadas para avaliar extratos de plantas com atividade 
antimicrobiana (RAMIREZ e CASTAÑO, 2009). 
2.9.1 Métodos de difusão 
De acordo com VANDEN BERGHE e VLIETINCK (1991), os ensaios de difusão são 
métodos quantitativos, nos quais o efeito pode ser graduado. A difusão consiste em uma 
substância a ser ensaiada em um meio de cultura sólido e inoculado com o microrganismo. A 
partir desse processo de difusão ocorre o aparecimento de um halo, no qual não há crescimento 
do microorganismo, denominado halo de inibição. Diversos tipos de reservatórios podem ser 
utilizados incluindo discos de papel, cilindros de porcelana ou de aço inoxidável e poços feitos 
no meio de cultura (VALGAS et al., 2007). RIOS et al., (1988) relata que a substância ou extrato 
a ser testado é colocado em contato com o meio de cultura inoculado, e a maneira como se 
processa esse contato define os diferentes métodos de difusão, dentre eles, método do disco 
difusão, método dos cilindros e método de poços 
2.9.2 Métodos de diluição 
O método de diluição em caldo é uma técnica in vitro realizada através de macrodiluição 
em tubos, e microdiluição em microplacas de 96 poços, os quais são preparados adicionando-
se concentrações seriadas da substância que está sendo avaliada, colocando-se uma solução 
38 
 
padrão do inóculo das bactérias teste, sendo estas posteriormente incubadas durante 24 horas 
(VALGAS, et. al., 2007). Após incubação, o crescimento do microrganismo é determinado pela 
leitura visual direta ou turbidimétrica pelo uso de espectrofotômetro em diferentes 
comprimentos de onda adequados (VANDEN BERGHE e VLIETINCK, 1991). 
A avaliação do método de diluição é observado de forma quantitativa à atividade de 
uma determinada substância antimicrobiana frente às bactérias, determinando a concentração 
mínima inibitória (CMI), cuja concentração mais baixa da substância testada é capaz de inibir 
o crescimento bacteriano após o tempo de incubação. Enquanto que a concentração mínima 
bactericida (CBM) é considerada como concentração da substância testada capaz de evitar ou 
impedir o crescimento de bactérias, a qual é determinada depois de realizar-se uma subcultura 
em placas de ágar sem o antibacteriano, com o conteúdo dos poços onde não houve aparente 
crescimento de bactérias no ensaio do CMI (CLSI 2002). 
2.9.3 Bioautografia 
Conforme RIOS et al., (1988) relatam que os ensaios bioautográficos são aqueles que 
empregam placas de cromatografia de camada fina (CCF) para a análise. Neste contexto, os 
compostos separados por CCF são colocados por contato em placas de ágar previamente 
inoculadas com o microrganismo teste. Tais zonas de inibição de crescimento microbiano 
indicam a presença de substâncias antimicrobianas (BRANDÃO, 2004). Estes métodos 
apresentam enorme importância na pesquisa de compostos antimicrobianos vegetais, pois 
permitem a localização direta dos constituintes ativos a partir de uma matriz complexa sendo, 
portanto, considerado um método qualitativo (HOSTETTMANN e MARSTON, 1994; 
HOSTETTMANN e TERREAUX, 2000). 
 
2.10 Antioxidantes 
Antioxidantes são substâncias químicas ou produtos biológicos capazes de agir contra 
os danos normais causados pelos efeitos do processo fisiológico de oxidação (ZAMORA, 
2007). Tanto nutrientes (vitaminas e minerais) como enzimas (proteínas no corpo que ajudam 
as reações químicas) são considerados antioxidantes. Acredita-se que os antioxidantes ajudam 
na prevenção do desenvolvimento de doenças crônicas, como o câncer, doenças cardíacas, 
derrame, Mal de Alzheimer, artrite reumatoide e catarata, por esta razão têm sidos realizados 
estudos nas buscas dos compostos antioxidantes (KORGE et al., 2008; MANSUROĞLU et al., 
2015; PAN et al., 2013). 
39 
 
O estresse oxidativo ocorre quando a produção de moléculas prejudiciais, denominadas 
de radicais livres, está além da capacidade protetora das defesas antioxidantes. Os radicais livres 
são átomos químicamente ativos ou moléculas que apresentam um número ímpar de elétrons 
na sua órbita externa, a exemplo de ânion superóxido, o radical hidroxila, os metais de transição, 
como o ferro e o cobre, o ácido nítrico e o ozônio, considerados radicais livres (GENESTRA, 
2007). 
Ensaios in vitro têm demonstrado a importância de dietas ricas em frutas e vegetais pela 
presença de antioxidantes que ajudam no combate aos radicais livres, que em consumo 
moderado, são benéficos à saúde humana. Em contrapartida alguns testes in vitro e in vivo 
demonstram que, em certas condições e concentrações erradas, algumas das substâncias com 
efeitos antioxidantes podem apresentar o efeito contrário, sendo necessários mais