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UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO DE JANEIRO INSTITUTO DE QUÍMICA PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIA DE ALIMENTOS ELIANA DA SILVA GULÃO MICROENCAPSULAÇÃO DE ÓLEO ESSENCIAL DE GENGIBRE (Zingiber officinale Roscoe) POR COACERVAÇÃO COMPLEXA Rio de Janeiro 2018 Eliana da Silva Gulão MICROENCAPSULAÇÃO DE ÓLEO ESSENCIAL DE GENGIBRE (Zingiber officinale Roscoe) POR COACERVAÇÃO COMPLEXA Rio de Janeiro 2018 Tese de Doutorado apresentada ao Programa de Pós- Graduação em Ciência de Alimentos, Instituto de Química, da Universidade Federal do Rio de Janeiro, como parte dos requisitos necessários a obtenção do titulo de Doutor em Ciência de Alimentos. Orientadora: Dra. Maria Helena Miguez da Rocha Leão Coorientadores: Dr. Edwin Elard Garcia Rojas Dra. Priscilla Vanessa Finotelli Eliana da Silva Gulão MICROENCAPSULAÇÃO DE ÓLEO ESSENCIAL DE GENGIBRE (ZINGIBER OFFICINALE ROSCOE) POR COACERVAÇÃO COMPLEXA Aprovada em: 09 de agosto de 2018 ________________________________________________ Maria Helena Miguez da Rocha Leão, PhD, UFRJ ________________________________________________ Maria Ivone Jacintho Barbosa, PhD, UFRRJ ________________________________________________ Valeria Pereira de Sousa, PhD, UFRJ _______________________________________________ Maria Alice Zarur Coelho, PhD, UFRJ _______________________________________________ Anna Paola Trindade Rocha Pierucci, PhD, UFRJ Tese de Doutorado apresentada ao Programa de Pós- Graduação em Ciência de Alimentos, Instituto de Química, da Universidade Federal do Rio de Janeiro, como parte dos requisitos necessários a obtenção do titulo de Doutor em Ciência de Alimentos. DEDICATÓRIA “Aos meus queridos pais, Derli Gulao e Ely Gulão † .” †in memorian AGRADECIMENTOS Aos meus pais, Ely Gulão e Derli Gulão, por serem mais do que eu poderia escolher, por mostrarem que não existe nada que não possa ser superado, pelo exemplo de resistência e luta que enfrentaram desde a infância, vivendo no interior em tempos que nem luz existia, onde criança ao invés de brincar e estudar precisava ir pra lavoura trabalhar. Evoluíram juntos e conseguiram ser uma exceção as estatísticas sociais, conquistando um lar, educação formal para si e as 4 filhas que geraram. Minha querida mãe, a pessoa mais doce, generosa e parceira que conheço e meu falecido pai, que foi o meu maior incentivador aos estudos... dedico este trabalho a vocês! Aos meus orientadores: Prof. Maria Helena Rocha-Leão por ter aceitado a orientação do projeto, por confiar no meu trabalho e pelas palavras de apoio. A Prof. Priscilla Finotelli, pela amizade e correções dos textos mesmo durante as férias! Ao Prof. Edwin pela amizade de sempre, por todo apoio desde o mestrado, por me ensinar a pesquisar desde os meus primeiros passos. A Professora Maria Alice Zarur Coelho por disponibilizar a estrutura de seu laboratório para o desenvolvimento desta tese, pelo acolhimento, carinho e generosidade ao longo destes anos. Muito obrigada! Ao Professor Bernardo pelo apoio, acolhimento e amizade. Ao Professor António Vicente e Dra. Isabel Bourbon, da Universidade do Minho, Portugal, pelo acolhimento, ensinamentos e apoio durante o doutorado sanduiche. A todos os “Lipinhos” (Laboratório de Indústrias e Processos) por me receberam tão bem e fazerem eu me sentir em casa! À técnica do laboratório de Microscopia, Diana, pela amizade e ajuda nas análises. A todos os funcionários do departamento de Engenharia Biológica da Uminho de Braga: muito obrigada! Ao querido amigo Clitor, pela amizade, conselhos, correções e orientações mesmo não sendo meu orientador. Tenho muito orgulho do amigo e profissional que é! Ao meu marido, Francisco Luiz, por ser um parceiro incrível e incentivador ao longo desses 6 anos de pós-graduação. Por entender minhas ausências, mudanças de cidade, depressão, sempre apoiando minhas decisões sem questionar, mesmo nas maiores dificuldades. Nossa parceria é meu maior orgulho! Amo você! A minha irmã, Sônia Gulão, por ser minha melhor amiga e cuidar de mim com tanto cuidado. Pela sua doçura, pelos papos que nunca perdem assunto, seus “apertos e agarros” e principalmente por me apoiar em tudo. A minha querida irmã, Ana Lúcia Gulão, pelo apoio, amizade e pelas conversas sobre natureza e belezas da vida! Amo você! Aos meus sobrinhos, André Luiz, Lucas, Biel e Juju, pelos momentos de leveza, alegria, farra, papos cabeça e por serem a coisa mais linda da minha vida! Aos cremosos do meu coração, ou seja, aos membros do laboratório 103 da Escola de Química, UFRJ, muito obrigada por ser esse grupo incrível! Obrigada por esses anos de diversão, tretas, memes infinitos, lamentações, problematizações, sessões de terapia em grupo, aulas de empoderamento, carinho e muito amor. Muitas vezes vocês foram alívio em momentos sufocantes e leveza em momentos tensos. Amo vocês! A Ariane Gaspar, “marida”, que chegou pra colorir ainda mais minha vida! Ainda bem que você tenho pertinho sempre! A querida amiga Luciana Bittencourt, por ter sido uma verdadeira parceira nessa jornada. Obrigada pela ajuda, amizade, guloseimas, risadas e por aturar meus desabafos. Ao amigo Júnior Lemos, por ser um irmão, amigo e compartilhar as alegrias e tristezas ao longo desses 6 anos de pós-graduação! Juntos sempre! Aos amigos Paula, Diego, Bianca, Silvana, Rafaela, Hingrid, Rahiane e todos os amigos que me rodeiam de muito amor. A querida Dra. Kelly Alencar pelo apoio, especialmente no início dessa jornada, e pela amizade e carinho de sempre! A todos do Leta (Laboratório de Tecnologia agroindustrial) da UFF, Volta Redonda, por sempre me acolherem, pela ajuda, trocas de experiência e papos no laboratório. A Professora Priscilla Amaral por possibilitar a utilização de seu laboratório e a todos do laboratório 123 pela ajuda e força! Ao Professor Mário Geraldo, da UFRRJ, pelos ensaios de Cromatografia. As técnicas Nathalie e Larissa pelo uso dos equipamentos do laboratório da Engepol. Ao CBPF (Centro Brasileiro de Pesquisas Físicas) pelos ensaios de FTIR. Ao Professor Marcelo e o Técnico Joel, do Instituto Militar de Engenharia, pelas análises no MEV. Ao Programa de Pós-Graduação em Ciência de alimentos (PPGCAL) pela oportunidade do curso e execução deste projeto. Ao coordenador Dr. Alexandre Guedes Torres pelo apoio e a todos os Professores pelos conhecimentos adquiridos durante esses anos. A CAPES pela bolsa de pesquisa concedida durante o Doutorado e durante o estágio sanduíche (PDSE) e ao CNPq pela bolsa de pesquisa ao final do doutorado. A todos envolvidos diretamente ou indiretamente com a execução deste trabalho, meu eterno agradecimento! RESUMO A interação entre proteínas e polissacarídeos pode resultar em novos produtos com propriedades superiores aos polímeros originais com grande potencial tecnológico e, neste contexto, a coacervação complexa é uma importante técnica de microencapsulação, especialmente de ingredientes lipídicos. As forças que regem a interação eletrostática nesta técnica sofrem influência de fatores intrínsecos e extrínsecos. Neste trabalho, foi estudada a interação entre a gelatina do tipo B (0,1, 0,2 0,3 0,5 e 1,0 % m/m) e a carboximetilcelulose de sódio (0,1% m/m) sob diferentes valores de pH (12,0-1,0) e diferentes concentrações de NaCl (0, 0,1, 0,25, 0,3 e 0,5 mol/L). A partir da titulação turbidimétrica, potencial zeta e tamanho de partículafoi constatada forte influência do pH, com maior interação entre os polímeros entre o pI da proteína e pKa do polissacarídeo (pH 3,5), em contrapartida, a força iônica não influenciou significativamente sem redução da interação. As condições ideais obtidas foram utilizadas para pesquisar a interação dos coacervados formados com diferentes concentrações de inulina e diferentes temperaturas através de ensaios dinâmicos no reômetro. Géis elásticos foram formados em todos os sistemas, com maiores valores de G’ nas menores concentrações de inulina pesquisadas (0,025 e 0,05g/g GE) a partir da temperatura de 40 °C. Através da espectroscopia de infravermelho e microscopia eletrônica de varredura foi possível confirmar a interação. Concentrações superiores (0,075 e 0,1 g/ g GE) representaram géis menos elásticos com menor interação. Os coacervados formados com e sem a presença da inulina encapsularam o óleo essencial de gengibre com eficiência de encapsulação de até 94 % para os coacervados utilizando inulina na ordem de 0,05 g/g GE e temperatura de 50 °C. As microcápsulas apresentaram baixos valores de higroscopicidade e solubilidade e diâmetro de partícula médio de 3,83 m. Microcápsulas coacervadas adicionadas de inulina forneceram maior estabilidade frente a diferentes valores de pH (3,5, 5,0 e 7,0) e temperaturas (25 e 80 °C) quando comparadas as microcápsulas sem a adição da inulina, além disso, representaram sistemas com liberação mais controlada do óleo essencial de gengibre em pH 2,0 e 7,0 a temperatura de 37 °C. Nas imagens de microscopia óptica de fluorescência foi possível observar a camada de gelatina no material de parede das microcápsulas formadas. As microcápsulas formadas possuem potencial para facilitar o emprego de óleos essenciais em alimentos, agregando valor nutricional e propriedades tecnológicas superiores na textura e estabilidade de diferentes alimentos. Palavras-chave: microencapsulação, polímeros, interação polimérica, coacervação complexa ABSTRACT The interaction between proteins and polysaccharides can result in new products with superior properties to the original polymers with great technological potential and, in this context, complex coacervation is an important microencapsulation technique, especially of lipidic ingredients. The forces that regulate the electrostatic interaction in this technique are influenced by intrinsic and extrinsic factors. In this work, the interaction between gelatin (0.1, 0.2, 0.3, 0.5 and 1.0% w/w) and carboxymethylcellulose (0.1% w/w) were studied under different pH values (12.0-1.0) and different concentrations of NaCl (0.1, 0.25, 0.3 and 0.5 mol / L). From turbidimetric titration, zeta potential and particle size, a strong influence of the pH was observed, with higher interaction between polymers between pI of protein and pKa of the polysaccharide (pH 3.5). On the other hand, the ionic strength did not significantly influence, without reducing the interaction. The ideal conditions obtained were used to investigate the interaction of the coacervates formed with different concentrations of inulin at different temperatures through dynamic tests in the rheometer. Elastic gels were formed in all systems, with higher G' values at the lowest concentrations of inulin (0.025 and 0.05 g / g GE) at 40 °C. Through infrared spectroscopy and scanning electron microscopy it was possible to confirm the interaction. Higher concentrations (0.075 and 0.1 g / g GE) represented less elastic gels with less interaction. The coacervates formed with and without the presence of inulin encapsulated the essential ginger oil with satisfactory encapsulation efficiency, reaching a maximum of 94% for the coacervates using inulin in the order of 0.05 g / g GE at 50 °C. The microcapsules presented low hygroscopicity and solubility and average particle diameter of 3.83 μm. Coacervate microcapsules with addiction of inulin provided greater stability against different pH values (3.5, 5.0 and 7.0) and temperatures (25 and 80 ° C) when compared to microcapsules without the addition of inulin, besides that, it represented systems with more controlled release of ginger essential oil at pH 2.0 and 7.0 at 37 ° C. Through fluorescence optical microscopy images it was possible to observe the gelatin layer in the wall material of the microcapsules formed. The microcapsules obtained have the potential to facilitate the use of essential oils in food, adding nutritional value and superior technological properties in the texture and stability of different foods. Keywords: microencapsulation, polymers, polymeric interaction, complex coacervation SUMÁRIO 1. INTRODUÇÃO GERAL ................................................................................................. 21 1.1. OBJETIVO GERAL .................................................................................................. 24 1.2. OBJETIVOS ESPECÍFICOS .................................................................................... 24 CAPÍTULO I: ................................................................................................................... 25 REVISÃO DE LITERATURA ........................................................................................ 25 1. REVISÃO DE LITERATURA ........................................................................................ 26 1.1. PROTEÍNAS E POLISSACARÍDEOS: .................................................................... 26 1.2. MICROENCAPSULAÇÃO ...................................................................................... 27 1.1.1. Principais técnicas de microencapsulação empregadas em óleos essenciais ............. 30 1.1.2. Complexos coacervados............................................................................................. 36 Materiais utilizados na microencapsulação .............................................................................. 49 Óleos essenciais ........................................................................................................................ 56 Gengibre ................................................................................................................................... 57 REFERÊNCIAS ....................................................................................................................... 59 CAPÍTULO II: FORMAÇÃO DE COMPLEXOS COACERVADOS FORMADOS A PARTIR DE GELATINA E CARBOXIMETILCELULOSE DE SÓDIO ...................... 75 1. INTRODUÇÃO ................................................................................................................ 76 2. MATERIAL E MÉTODOS .............................................................................................. 78 2.1. MATERIAL ............................................................................................................... 78 2.2. MÉTODOS ................................................................................................................ 78 2.2.1. Formação dos complexos coacervados ...................................................................... 78 2.2.1.2. Titulação turbidimétrica: ........................................................................................ 79 2.2.1.3. Potencial zeta (Potencial- e tamanho de partícula .............................................. 79 2.2.1.4. Morfologia .............................................................................................................. 79 2.2.1.5. Estatística ............................................................................................................... 80 3. RESULTADOS E DISCUSSÃO ..................................................................................... 80 3.1. EFEITO DO PH E CONCENTRAÇÃO DE PROTEÍNA NA FORMAÇÃO DE COMPLEXOS COACERVADOS .......................................................................................80 3.2. INFLUÊNCIA DA FORÇA IÔNICA NA FORMAÇÃO DE COMPLEXOS COACERVADOS ................................................................................................................ 86 3.3. MORFOLOGIA ......................................................................................................... 89 4. CONCLUSÃO .................................................................................................................. 90 5. REFERÊNCIAS ............................................................................................................... 90 CAPÍTULO III ................................................................................................................. 95 INTERAÇÃO ENTRE GELATINA, CARBOXIMETILCELULOSE DE SÓDIO E INULINA ......................................................................................................................... 95 1. INTRODUÇÃO ................................................................................................................ 96 2. MATERIAL E MÉTODOS .............................................................................................. 97 2.1. MATERIAL ............................................................................................................... 97 2.2. MÉTODOS ................................................................................................................ 98 3. RESULTADOS E DISCUSSÃO ................................................................................... 100 4. CONCLUSÃO ................................................................................................................ 109 5. REFERÊNCIAS ............................................................................................................. 109 CAPÍTULO IV: MICROENCAPSULAÇÃO DE ÓLEO ESSENCIAL DE GENGIBRE (ZINGIBER OFFICINALE ROSCOE) UTILIZANDO COMPLEXOS COACERVADOS A PARTIR DE GELATINA E CARBOXIMETILCELULOSE E INULINA COMO AGENTE RETICULANTE ............................................................................................ 112 1. INTRODUÇÃO .............................................................................................................. 113 2. MATERIAL E MÉTODOS ............................................................................................ 115 2.1. MATERIAL ............................................................................................................. 115 2.2. MÉTODOS .............................................................................................................. 115 3. RESULTADOS .............................................................................................................. 119 3.1. Perfil químico do óleo essencial de gengibre: ............................................................. 119 3.2. Rendimento e eficiência da microencapsulação .......................................................... 120 3.3. Higroscopicidade e solubilidade .................................................................................. 124 3.4. Distribuição do tamanho de partícula .......................................................................... 125 3.5. Morfologia ................................................................................................................... 126 4. CONCLUSÃO: ............................................................................................................... 127 5. REFERÊNCIAS ............................................................................................................. 128 CAPÍTULO V ................................................................................................................ 134 ESTABILIDADE, CONTROLE DE LIBERAÇÃO E MORFOLOGIA DE MICROCÁPSULAS DE ÓLEO ESSENCIAL DE GENGIBRE UTILIZANDO COMPLEXOS COACERVADOS A PARTIR DE GELATINA E CARBOXIMETILCELULOSE E INULINA ................................................................ 134 1. INTRODUÇÃO .............................................................................................................. 135 2. MATERIAL E MÉTODOS ............................................................................................ 136 2.1. MATERIAL ............................................................................................................. 136 2.2. MÉTODOS .............................................................................................................. 137 3. RESULTADOS E DISCUSSÃO ................................................................................... 139 3.1. ESTABILIDADE FÍSICA DE MICROCÁPSULAS GE-CMC E GE-CMC-IN .... 139 3.2. PERFIL DE LIBERAÇÃO DAS MICROCÁPSULAS DE ÓLEO ESSENCIAL DE GENGIBRE ........................................................................................................................ 147 3.3. MORFOLOGIA DAS MICROCÁPSULAS DE ÓLEO ESSENCIAL DE GENGIBRE ........................................................................................................................ 149 4. CONCLUSÃO ................................................................................................................ 150 5. REFERÊNCIAS ............................................................................................................. 151 CONCLUSÃO GERAL ................................................................................................. 156 SUGESTÕES PARA TRABALHOS FUTUROS .......................................................... 157 ANEXOS ........................................................................................................................ 158 ÍNDICE DE FIGURAS CAPÍTULO I: REVISÃO DE LITERATURA Figura 1. Ilustração esquemática representando a estrutura de microcápsulas e microesferas. 28 Figura 2. Esquematização das principais etapas envolvidas no processo de microencapsulação por spray drying 32 Figura 3. Esquema do processo de coacervação complexa entre um polímero aniônico (ácido hialurônico, HA) e um polímero catiônico (quitosana) no pH 5,0. 37 Figura 4. Curvas de turbidez de amostras contendo WPI (0,025% m/m), FG (0,025% m/m) e misturas dos dois polímeros na razão 1:1 (Ct: 0,05% m/m) durante a titulação ácida do pH 6,0 ao pH 1,4. As fotografias demonstram as mudanças visuais da turbidez em amostras contendo as misturas entre os polímeros 40 CAPÍTULO II: FORMAÇÃO DE COMPLEXOS COACERVADOS FORMADOS A PARTIR DE GELATINA E CARBOXIMETILCELULOSE DE SÓDIO Figura 1. Potencial das amostras contendo diferentes concentrações de gelatina. T°: 25°C; NaCl: 0 mol; pH: 3,5. 81 Figura 2. Tamanho de partícula de amostras contendo diferentes concentrações de GE, contendo 0 mol de NaCl com pH ajustado para 3,5; (*) índice de polidispersão. 81 Figura 3. Turbidez das amostras contendo 0,1% CMC e diferentes concentrações de gelatina do pH 12-1,0. (●): 0,1% GE; (○): 0,2% GE; (▼): 0,3% GE; (■): 0,5% GE e (□): 1,0% GE; 0 mol/L. 82 Figura 4. Fotografias de misturas na proporção 3:1 GE/CMC em diferentes valores de pH, sendo: I: 1,5; II: 2,5; III: 3,5; IV: 4,5; V: 5,5 e VI: 6,5. NaCl: 0 mol/L. 83 Figura 5. Potencial zeta das amostras contendo 0,1% CMC, 0,3% GE e das misturas na proporção 3:1 GE/CMC em diferentes valores de pH. (NaCl: 0 mol/L; Temperatura: 25°C). 84 Figura 6. Tamanho de partícula de amostras com proporção 3:1 GE/CMC em diferentes valores de pH. (*) índice de polidispersão. 85 Figura 7. Diagrama de estado das amostras contendo diferentes proporções de polímero, sendo A: 1:1 GE/CMC; B: 2:1GE/CMC e C: 3:1 GE/CMC em diferentes concentrações salinas. (●) pHØ1 e (▼) pHØ2 86 Figura 8. Influência da força iônica na turbidez de misturas contendo diferentes concentrações de proteína e NaCl. A: 1:1 GE/CMC; B: 2:1: GE/CMC e C: 3:1 GE/CMC, sendo (■) 0 mol/L; (●) 0,1 mol/L;(▲) 0,2 mol/L; (●)0,3 mol/L; (▼)0,5 mol. 87 Figura 9. Tamanho de partícula de amostras contendo 0,1% CMC e diferentes concentrações de GE e NaCl no pH 3,5. (▼) 0,3%; (○) 0,2% GE e (●) 0,1% GE. 88 Figura 10. Imagem de microscopia óptica a 40x das amostras contendo proporção de 3:1 GE/CMC em pH 3,5. 89 Figura 11. Imagens de microscopia eletrônica de varredura a 12.000 vezes de complexos coacervados na proporção 3:1 GE/CMC no pH 3,5, sendo A: obtida com aceleração de 10 KV e B: obtida com aceleração de 15 KV 90 CAPÍTULO III: INTERAÇÃO ENTRE GELATINA, CARBOXIMETILCELULOSE DE SÓDIO E INULINA Figura 1. Módulo de armazenamento a diferentes temperaturas de amostras contendo GE, GE-CMC e GE-CMC-IN em pH 3,5; Frequência: 1 Hz 101 Figura 2. Módulo de armazenamento (G’) a diferentes frequências de amostras submetidas à temperatura de temperatura de 60 ºC contendo GE, GE-CMC e GE- CMC-IN; pH: 3,5. 104 Figura 3. Capacidade de retenção de água de géis GE-CMC e GE-CMC-IN preparados a 60°C. 105 Figura 4. Microscopia eletrônica de varredura de géis preparados a partir de GE, CMC e 0,05 g/ g GE de inulina, submetidos a diferentes temperaturas, sendo: a) 60 °C; b) 70 °C e c) 90 °C. 106 Figura 5. Espectros de infravermelho de GE, CMC, IN e dos complexos coacervados GE-CMC e géis GE-CMC-IN 0,05g obtidos a 60 °C. 108 CAPÍTULO IV: MICROENCAPSULAÇÃO DE ÓLEO ESSENCIAL DE GENGIBRE (ZINGIBER OFFICINALE ROSCOE) UTILIZANDO COMPLEXOS COACERVADOS A PARTIR DE GELATINA E CARBOXIMETILCELULOSE E INULINA COMO AGENTE RETICULANTE Figura 1. Distribuição de tamanho de partícula de microcápsulas de óleo essencial de gengibre na razão 1:1 polímero total: óleo essencial, sendo: A) Microcápsulas não reticuladas e B) Microcápsulas reticuladas com inulina 0,05 g/g GE a 50 °C. 126 Figura 2. Imagem de microscopia óptica a 400 x de microcápsulas de óleo essencial de gengibre em proporção 1:1 polímero total: óleo essencial. A) microcápsulas reticuladas com inulina a 0,05 g/g GE a 50 °C; B) microcápsulas não reticuladas; C) emulsão de óleo essencial de gengibre em proporção 1:1 polímero total: óleo essencial sem ajuste de pH 127 CAPÍTULO V: ESTABILIDADE, CONTROLE DE LIBERAÇÃO E MORFOLOGIA DE MICROCÁPSULAS DE ÓLEO ESSENCIAL DE GENGIBRE UTILIZANDO COMPLEXOS COACERVADOS A PARTIR DE GELATINA E CARBOXIMETILCELULOSE E INULINA Figura 1. Imagens de microscopia óptica a 400x de microcápsulas de óleo essencial de gengibre coacervadas a partir de GE-CMC e GE-CMC-IN no ponto 0. A) GE-CMC, pH 2,0; B) GE-CMC, pH 3,5; C) GE-CMC, pH 5,0 e D) GE-CMC, pH 7,0; E) GE- CMC-IN, pH 2,0; F) GE-CMC-IN, pH 3,5; G) GE-CMC-IN, pH 5,0 e E) GE-CMC- IN, pH 7,0. Temperatura: 25 °C. 139 Figura 2. Imagens de microscopia óptica a 400x de microcápsulas de óleo essencial de gengibre coacervadas a partir de GE-CMC após 2 horas de ensaio. A) GE-CMC, pH 2,0; B) GE-CMC, pH 3,5; C) GE-CMC, pH 5,0 e D) GE-CMC, pH 7,0. Temperatura: 25 °C. 141 Figura 3. Imagens de microscopia óptica a 400x de microcápsulas de óleo essencial de gengibre coacervadas a partir de GE-CMC-IN após 28 horas de ensaio. A) GE-CMC- IN, pH 2,0; B) GE-CMC-IN, pH 3,5; C) GE-CMC-IN, pH 5,0 e D) GE-CMC-IN, pH 7,0. Temperatura: 25 °C. 142 Figura 4. Imagens de microscopia óptica a 400x de microcápsulas de óleo essencial de gengibre coacervadas a partir de GE-CMC e GE-CMC-IN após 7 dias. A) GE-CMC, pH 2,0; B) GE-CMC, pH 3,5; C) GE-CMC, pH 5,0 e D) GE-CMC, pH 7,0; E) GE- CMC-IN, pH 2,0; F) GE-CMC-IN, pH 3,5; G) GE-CMC-IN, pH 5,0 e E) GE-CMC- IN, pH 7,0. Temperatura: 25 °C. 144 Figura 5. Imagens de microscopia óptica a 400x de microcápsulas de óleo essencial de gengibre coacervadas a partir de GE-CMC e GE-CMC-IN após 8 horas. A) GE-CMC, pH 2,0; B) GE-CMC, pH 3,5; C) GE-CMC, pH 5,0 e D) GE-CMC, pH 7,0; E) GE- CMC-IN, pH 2,0; F) GE-CMC-IN, pH 3,5; G) GE-CMC-IN, pH 5,0 e E) GE-CMC- IN, pH 7,0. Temperatura: 80 °C. 145 Figura 6. Imagens de microscopia óptica a 400x de microcápsulas de óleo essencial de gengibre coacervadas a partir de GE-CMC-IN após 48 horas. A) GE-CMC-IN, pH 2,0; B) GE-CMC-IN, pH 3,5; C) GE-CMC-IN, pH 5,0 e D) GE-CMC-IN, pH 7,0. Temperatura: 80 °C. 146 Figura 7. Perfil de liberação do óleo essencial de gengibre de microcápsulas GE-CMC e GE-CMC-IN no pH 2,0 a 37°C. A) GE-CMC e B) GE-CMC-IN. 148 Figura 8. Perfil de liberação do óleo essencial de gengibre de microcápsulas GE-CMC e GE-CMC-IN no pH 7,0 a 37°C. A) GE-CMC e B) GE-CMC-IN. 149 Figura 9. Imagens de microscopia óptica de fluorescência a 400x de microcápsulas de óleo essencial de gengibre a partir de GE-CMC-IN. A. Óleo essencial de gengibre; B. Gelatina corada com rodamina B; C: Gelatina não corada; D: GE-CMC-IN no filtro verde; E: GE-CMC-IN no filtro vermelho; F: sobreposição das imagens D e E. 150 ÍNDICE DE TABELAS Tabela 1. Composição química do óleo essencial de gengibre 119 Tabela 2. Rendimento e eficiência de encapsulação do óleo essencial de gengibre em microcápsulas de gelatina e carboximetilcelulose contendo diferentes razões polímero total: óleo essencial. 121 Tabela 3. Eficiência (%) da encapsulação do óleo essencial de gengibre em microcápsulas na razão 1:1 polímero total:óleo essencial de gengibre reticuladas com inulina. 122 LISTA DE ABREVIAÇÕES GE Gelatina CMC Carboximetilcelulose IN Inulina pI Ponto isoelétrico WPI Proteína isolada do leite GA Goma arábica NaCl Cloreto de sódio BSA Albumina sérica bovina FG Goma de semente de linhaça FTIR Espectroscopia de infravermelho com transformada de Fourier G’ Módulo de armazenamento ou elasticidade G” Módulo de dissipação ou perda QTS Quitosana β-Lg β -lactoglobulina µ Mobilidade eletroforética 21 1. INTRODUÇÃO GERAL Proteínas e polissacarídeos são polímeros amplamente utilizados em diversos alimentos e sua interação constitui uma alternativa tecnológica para o recobrimento de compostos bioativos e obtenção de novos ingredientes funcionais (LIU; CHAPEL; SCHATZ, 2017). A coacervação envolve a separação de proteínas e polissacarídeos em duas fases imiscíveis no meio aquoso, uma fase densa constituída pelos polímeros, decorrente da atração eletrostática que ocorre através de cargas opostas (fase de coacervado) e uma fase diluída que surge no sobrenadante (DUHORANIMANA et al., 2017; LV et al., 2013; SCHMITT; TURGEON, 2011). A formação dos coacervados pode ser influenciada por fatores intrínsecos do polímero, como a estrutura e densidade das cargas, bem como por fatores extrínsecos, como o pH, força iônica e temperatura (PRIFTIS; TIRRELL, 2012; SOUZA et al., 2013; TURGEON; SCHMITT; SANCHEZ, 2007). O pH pode influenciar a atração eletrostática das cargas, principalmente quando proteínas e outras biomoléculas estão inseridas no sistema, pois estes componentes normalmente são originados de dissociação ou associação com prótons, podendo depois sofrer variação com o pH (DE KRUIF; WEINBRECK; DE VRIES, 2004; SCHMITT; TURGEON, 2011). Por sua vez, a presença de sal no sistema pode influenciar de forma positiva ou negativa na interação eletrostática, diminuindo a ligação entre os polímeros ou até mesmo contribuindo para a maior formação de coacervados (DA S. GULÃO et al., 2014; DE KRUIF; WEINBRECK; DE VRIES, 2004). Diversos polímeros já foram estudados na formação de complexos coacervados para encapsulação de compostos bioativos. A gelatina do tipo B (GE) é uma proteína obtida a partir da hidrólise parcial do colágeno sobre condições ácidas e possui ponto isoelétrico entre 4,6 e 5,2 (ANVARI et al., 2015). As gelatinas possuem caráter anfótero, ou seja, apresentam carga negativa acima de seu pontoisoelétrico e positiva abaixo dele, permitindo seu emprego na técnica de microencapsulação por coacervação, e, atualmente é a proteína mais utilizada na encapsulação de óleos devido a sua capacidade emulsificante (EGHBAL; CHOUDHARY, 2018). A carboximetilcelulose (CMC) é um hidrocolóide obtido através da reação entre a celulose e o monocloroacetato de sódio, tendo como principal característica a capacidade de formar géis (DUHORANIMANA et al., 2017). Devido as suas propriedades, tais como: 22 capacidade de retenção de água, solubilidade em água fria e quente, aumento da viscosidade da solução, resistência a óleos, gorduras e solventes orgânicos, adesividade e habilidade para formar filmes, a CMC possui uma ampla aplicação na formulação de muitos produtos alimentícios (BURGARDT et al., 2014). A microencapsulação por coacervação complexa é utilizada na separação de fases de dois polímeros com cargas opostas, com a formação do coacervado como material de parede e as gotículas de emulsão óleo-em-água como núcleo. A técnica demonstrou eficiência na encapsulação em diversos estudos (DIMA et al., 2014; ERATTE et al., [s.d.]; KAUSHIK et al., 2016), porém, a eficiência e as propriedades da microcápsula podem ser aprimoradas utilizando-se um agente reticulador ou formador de ligações cruzadas (cross-linker), transformando o material de parede em uma membrana mais rígida e resistente a condições adversas, como por exemplo, variações de pH, uma vez que a coacervação complexa é formada a partir de interações eletrostáticas e, portanto, sofrem grande influência deste fator (PENG et al., 2014). Além disso, a reticulação pode auxiliar no controle da liberação do composto bioativo encapsulado (BOURBON et al., 2016). Os agentes de reticulação tradicionais utilizados no método de coacervação complexa incluem produtos químicos tais como formaldeído e glutaraldeído. Estes produtos químicos são altamente tóxicos e proibidos nas aplicações da indústria alimentar. Assim, um grande desafio é desenvolver microcápsulas utilizando agentes reticuladores não tóxicos e favoráveis ao meio ambiente (PENG et al., 2014). Embora alguns reticulantes não tóxicos, como a transglutaminase (NAWONG et al., 2016; TELLO et al., 2016) e o ácido tânico (KOUPANTSIS; PAVLIDOU; PARASKEVOPOULOU, 2016) já tenham sido estudados, o preço exorbitante da transglutaminase e o sabor particular do ácido tânico limitam sua aplicabilidade no processamento de alimentos. A inulina (IN), um carboidrato de reserva que pode ser encontrado especialmente nas raízes do alho, aspargos, alcachofra ou raiz da chicória, vem sendo amplamente estudada devido a sua capacidade de formar géis através de interações com outros polímeros (GLIBOWSKI, 2009; KIM; FAQIH; WANG, 2001; KRYSTYJAN et al., 2015; NIETO- NIETO et al., 2015). NIETO-NIETO et al. (2015) demonstraram a capacidade da inulina em formar ligações cruzadas (cross-linking) com a proteína da aveia, mesmo em baixas concentrações. As forças responsáveis pela interação e formação do gel foram interações hidrofóbicas, ligações dissulfeto e de hidrogênio quando aplicadas determinadas temperaturas. 23 Segundo os autores, a inulina forma nanopartículas nos espaços vazios da rede de proteínas realizando um efeito de preenchimento e criando zonas de junção. Apesar de o polissacarídeo ser amplamente estudado quanto a sua capacidade de gelificação e até mesmo ser utilizado na encapsulação de óleos e compostos bioativos aplicando-se outras técnicas de encapsulação, especialmente a técnica de spray dryer (BEIRÃO-DA-COSTA et al., 2013; YANG et al., 2016), não há estudos utilizando a inulina como agente encapsulante na coacervação complexa. Além disso, a inulina possui propriedades nutricionais incluindo efeitos de fibras alimentares, estimulação do crescimento de bífidobactérias no cólon e modulação sistêmica do metabolismo lipídico (GLIBOWSKI, 2009). As enzimas digestivas no intestino humano não possuem a capacidade de hidrolisar este polissacárido, assim, a inulina atinge o cólon de forma não digerida e produz um efeito prebiótico (SHOAIB et al., 2016). O gengibre é um rizoma pertencente à família de Zingiberaceae e devido ao seu sabor quente e doce geralmente é aplicado como especiaria em alimentos há cerca de 2.000 anos, ou, ainda mais atualmente, em tratamentos terapêuticos (YEH et al., 2014). Na literatura apresenta certificadas capacidades antioxidante e antibacteriana (BELLIK, 2014; YEH et al., 2014) adicionalmente em tratamentos terapêuticos contra diversas doenças (IMANI et al., 2015; YEH et al., 2014). Seu óleo essencial pode apresentar as seguintes classes de compostos: álcoois terpênicos terciários e ésteres, ésteres terpenos alifáticos, hidrocarbonetos, terpenos alifáticos e aromáticos (DIMA et al., 2014). Pesquisas revelaram que, a partir dessas classes, uma série de compostos possui atividade antioxidante e antibacteriana (BALCÃO et al., 2013; DEANS; RITCHIE, 1987; OUEDRHIRI et al., 2016), no entanto, são compostos voláteis de difícil aplicação na indústria de alimentos, por isso, a microencapsulação torna-se uma técnica atraente na preservação de compostos instáveis, facilitando sua aplicação nos mais variados setores alimentares (DIMA et al., 2014; DONG et al., 2011). 24 1.1. OBJETIVO GERAL Investigar a formação de complexos coacervados formados entre a gelatina do tipo B e carboximetilcelulose de sódio e sua interação com a inulina para encapsulação do óleo essencial de gengibre, bem como caracterizar os produtos formados. 1.2. OBJETIVOS ESPECÍFICOS Pesquisar os fatores que influenciam a formação de complexos coacervados entre gelatina do tipo B e carboximetilcelulose de sódio; Caracterizar os complexos coacervados formados entre gelatina do tipo B e carboximetilcelulose de sódio; Pesquisar a interação térmica entre a inulina, gelatina e carboximetilcelulose; Produzir e caracterizar microcápsulas coacervadas contendo o óleo essencial de gengibre, utilizando a inulina para enrijecer o material de parede; Avaliar a estabilidade das microcápsulas e perfil de liberação do óleo essencial de gengibre. 25 CAPÍTULO I: REVISÃO DE LITERATURA 26 1. REVISÃO DE LITERATURA 1.1. PROTEÍNAS E POLISSACARÍDEOS: A estrutura dos alimentos é constituída por uma montagem complexa de vários ingredientes alimentares, tais como proteínas, carboidratos, lipídios, minerais, água e aditividos como emulsionantes e conservantes. Entre esses componentes, proteínas e polissacarídeos são os materiais mais utilizados no processamento de alimentos. Eles desempenham um papel sinérgico na estruturação das fases volumosas dos sistemas coloidais, enquanto também proporcionam propriedades de estabilidade através de uma combinação de várias interações moleculares (WIJAYA et al., 2017). Geralmente, interações entre proteínas e polissacarídeos podem ocorrer de forma não covalente ou covalente (DICKINSON, 2008). As interações não-covalentes são inespecíficas e podem ser divididas em dois grupos: atração e repulsão entre polímeros de cargas opostas. Este tipo de interação em solução contribui para a formação de complexos e para a imiscibilidade (incompatibilidade termodinâmica) de polímeros. Estas interações são afetadas principalmente por fatores intrínsicos (natureza do polímero, densidade de carga e concentração) e fatores extrínsicos (pH, força iônica, temperatura). Já as interações covalentes são altamente específicas, estabelecendo uma ligação permanente e uma interação irreversível entre proteínas e polissacarídeos (SCHMITT et al., 1998). Interações não específicas e específicas têm sua própria funcionalidade, que é afetada pela magnitude dessas interações (atração ou repulsão,grau de energia de ligação, etc). Interações específicas, fortes e irreversíveis entre a proteína e o polissacarídeo durante a formação do complexo são estabelecidas por ligação covalentes ou hidrofóbicas. Essa interação é comumente conhecida como glicosilação de proteínas e polissacarídeos, alcançada pela reação química de grupos amino das proteínas e grupos carboxílicos dos polissacarídeos, resultando em uma amida ligada covalentemente. A ligação covalente pode ser induzida pela desidratação do complexo (por exemplo, através da reação de Maillard), com aquecimento ou pela adição de um agente de reticulação (por exemplo, glutaraldeído) (SCHMITT et al., 1998). Em contraste com os complexos não covalentes, os complexos ou conjugados covalentes não são responsivos ao pH e às mudanças de força iônica (WIJAYA et al., 2017). 27 O pH determina a magnitude das interações não covalentes que afetam as propriedades estruturais dos complexos eletrostáticos. A coacervação complexa de proteínas e polissacarídeos pode ser resultado de uma interação eletrostática fraca, levando à formação de complexos solúveis, dependendo da densidade de carga dos polímeros (WEINBRECK et al., 2004). Por outro lado, a forte complexação ocorre quando os biopolímeros carregam cargas exatamente opostas, resultando em complexos insolúveis ou formação de partículas maiores (>1 µm) (TURGEON; SCHMITT; SANCHEZ, 2007). A formação de partículas ocorre aleatoriamente devido à agregação resultando na separação de fases entre a água e a fase sólida (precipitação). Por outro lado, quando dois biopolímeros em determinada razão carregam fortes cargas negativas ou positivas (densidade de carga não oposta), as misturas podem formar fases segregativas. Em ambos os tipos de ligação, as microestruturas formadas influenciam diferentes propriedades dos alimentos, como por exemplo, a reologia (isto é, as propriedades mecânicas do produto) ou outras propriedades de textura. Além disso, podem ser empregadas em diferentes aplicações, como na microencapsulação para aplicação em alimentos, indústria farmacêutica, cosméticos ou de materiais. 1.2. MICROENCAPSULAÇÃO Microencapsulação é o processo pelo qual vários ingredientes alimentícios podem ser armazenados dentro de um invólucro ou revestimento microscópico para proteção e/ou posterior liberação. Mais especificamente, a microencapsulação é o processo de envolver pequenas partículas, um líquido ou um gás dentro de uma camada de revestimento ou dentro de uma matriz. Tradicionalmente, a microencapsulação não utiliza cápsulas maiores que 3 mm de comprimento. De uma forma geral, cápsulas que possuam tamanho em um intervalo de 100 nm a 1000 nm são classificadas como microcápsulas e as que possuem tamanho entre 1 nm e 100 nm são classificados como nanocápsulas (SOBEL; VERSIC; GAONKAR, 2014). As micropartículas são subdivididas em microesferas e microcápsulas, segundo a sua estrutura, como pode ser observado na Figura 1. São denominadas microesferas as partículas compactas constituídas por uma rede polimérica, na qual a substância ativa se encontra distribuída no seu estado sólido ou molecular. Já as 28 microcápsulas são as partículas constituídas por um núcleo interno contendo o agente ativo recoberto por uma camada de polímero de espessura variável (GOUIN, 2004a). Figura 1. Ilustração esquemática representando a estrutura de microcápsulas e microesferas. A microencapsulação é uma tecnologia versátil usada em vários setores, como nas indústrias farmacêutica, química, alimentícia e agrícola. Uma das razões para o uso desta tecnologia é a proteção de ingredientes, ou seja, evitar a degradação resultante da exposição a fatores ambientais, como água, oxigênio, calor e luz. Tradicionalmente, isso é feito para melhorar o prazo de validade do material ativo. Em alguns casos, o encapsulamento pode ser usado para mascarar sabor, odor e cor indesejáveis, evitando assim a interferência no desempenho do produto. A facilidade de manuseio é outra razão para microencapsular, pois ele pode ser usado como um método simples para converter um ingrediente alimentar líquido em um sólido (pó). A microencapsulação pode ser usada para prevenir reações e interações indesejáveis entre ingredientes alimentícios ativos. Considerando a facilidade de manuseio, a microencapsulação também oferece a oportunidade de reduzir a volatilidade de vários ingredientes alimentícios, além da possibilidade de controlar a liberação do ativo encapsulado (LIDERT, 2005; MARTÍN et al., 2015; VASISHT, 2014). 29 A nomenclatura comum usada para definir as várias partes da microcápsula inclui a terminologia para o material de revestimento bem como o ingrediente a ser encapsulado. O ingrediente a ser encapsulado é geralmente chamado de ativo, núcleo, fase interna, encapsulado ou preenchimento. O material que envolve o ativo é comumente chamado de casca, material de parede, revestimento, fase externa, fase de suporte ou membrana. O material de parede é geralmente insolúvel e não reativo ao núcleo. É responsável por 1 a 80% das microcápsulas em peso e podem ser utilizados açúcares, gomas, proteínas, polissacarídeos naturais e modificados, lipídios, ceras e polímeros sintéticos (SOBEL; VERSIC; GAONKAR, 2014; VASISHT, 2014). Tecnologias sofisticadas e diferentes materiais foram desenvolvidos ao longo dos anos (BEIRÃO-DA-COSTA et al., 2013; GARCÍA-SALDAÑA et al., 2016; GOMEZ-ESTACA et al., 2016; NAWONG et al., 2016; YU; LEE, 1997) e uma variedade extremamente ampla de funcionalidades pode agora ser alcançada através da microencapsulação. Algumas tecnologias de microencapsulação, embora cientificamente impressionantes, podem não ser apropriadas para todas as aplicações. Quando a microencapsulação é usada para evitar a degradação excessiva de um ingrediente sensível, para reduzir o aparecimento de sabores voláteis durante o cozimento ou para economizar em um ingrediente caro, o custo em uso deve, na verdade, ser menor do que o ingrediente não encapsulado. No entanto, se a microencapsulação fornecer ao ingrediente uma propriedade única que não é alcançável sem encapsulação, o custo em uso pode ser considerado superior. Todavia, o custo do processo deve ser considerado e especialmente a indústria de alimentos também visa tecnologias limpas e econômicas, por isso, também se faz necessária pesquisa por técnicas simples e também eficientes (GOUIN, 2004a; LIDERT, 2005). A liberação controlada de ingredientes alimentícios é uma funcionalidade chave que pode ser fornecida pela microencapsulação. Uma liberação oportuna e direcionada melhora a eficácia dos aditivos alimentares e amplia a gama de aplicação de ingredientes alimentícios, melhorando assim a relação custo-benefício para o fabricante de alimentos. Aditivos reativos, sensíveis ou voláteis (vitaminas, culturas, compostos voláteis, etc.) podem ser transformados em ingredientes estáveis através da microencapsulação. Com propriedades de liberação controlada cuidadosamente ajustadas, a microencapsulação não é mais apenas uma técnica de valor agregado, mas uma fonte de ingredientes novos com propriedades atrativas e que anteriormente eram de difícil aplicação (GOUIN, 2004a; MARTÍN et al., 2015). 30 O sistema de microencapsulação deve ser projetado objetivando um mecanismo de liberação. O núcleo pode ser liberado em diferentes estágios do ciclo de processamento, armazenamento e consumo e o mecanismo de liberação usado dependerá em grande parte do tipo de alimento/bebida e do local em que a carga precisa ser liberada. A água (umidade) é usada como mecanismo de liberação para liberar um ativo durante a reidratação e a dissolução de um pó alimentar quando a água é adicionada, o mesmo é aplicável quando a saliva dissolve um produto alimentarpronto para consumo durante a mastigação. O calor é usado como mecanismo de liberação para liberar um ativo após o aquecimento, cozimento ou tratamento térmico de um produto alimentício, como por exemplo, a adição de água quente ao pó alimentar usado para preparar bebidas quentes (café, chá, achocolatados) e sopas. O cisalhamento mecânico (mastigação) é usado como mecanismo de liberação durante a mastigação de um alimento pronto para o consumo. As enzimas e o pH são utilizados como mecanismo de liberação quando um agente ativo tem que ser administrado no trato gastrointestinal (isto é, na boca, no estômago, no intestino delgado ou no cólon), por exemplo, a matriz/material de parede composto por um amido (sensível à amilase na boca) é ideal para a liberação na boca e quando a matriz é composta por proteína, ela se desintegra na presença de proteases no estômago (NAZZARO et al., 2012; PARETA et al., 2014; SOBEL; VERSIC; GAONKAR, 2014; VASISHT, 2014; YANG et al., 2016). Como observado, diversos tipos de material de parede e tipos de acionamento podem ser utilizados, por isso é importante conhecer as principais técnicas de microencapsulação hoje empregadas. 1.1.1. Principais técnicas de microencapsulação empregadas em óleos essenciais Diferentes métodos foram propostos para a produção de microcápsulas (BELŠČAK-CVITANOVIĆ et al., 2016; CHEW; NYAM, 2016; ERATTE et al., [s.d.]; GOMEZ-ESTACA et al., 2016). Geralmente, essas técnicas podem ser divididas em duas categorias principais: métodos químicos e físicos; este último pode ser subdividido em técnicas físico-químicas e físico-mecânicas. 31 Nos últimos anos, a demanda por produtos contendo óleos essenciais vem crescendo e ainda espera-se expandir e aumentar sua diversidade. Óleos essenciais podem ser responsáveis por diferentes fragrâncias e sabores, sendo componentes importantes em produtos domésticos, como por exemplo, produtos de lavanderia, em cosméticos ou como aditivos em alimentos devido às propriedades funcionais dos diversos óleos essenciais existentes. Publicações e patentes publicadas recentemente na área de microencapsulação sugerem que os setores industrial e acadêmico estão empenhados em explorar essa área, especialmente nas indústrias de cosméticos e alimentos (MARTINS et al., 2014). A seguir serão apresentadas as principais técnicas de encapsulação de óleos e lipídeos no geral. 1.1.1.1. Spray drying e spray cooling: Os métodos spray drying e spray cooling são usados há muitos anos como técnicas de microencapsulação e ambos os processos possuem muitas semelhanças. A ténica de microencapsulação por spray drying é um processo comercial de relativo baixo custo que é usado principalmente para o encapsulamento de fragrâncias, óleos e aromas. Tem sido amplamente utilizada na secagem de alimentos sensíveis ao calor, produtos farmacêuticos e outras substâncias devido à rápida evaporação do solvente das gotículas. Embora na maioria das vezes seja considerado um processo de desidratação, a secagem por atomização também pode ser usada como um método de encapsulação quando retém materiais "ativos" dentro de uma matriz protetora, que é essencialmente inerte ao material que está sendo encapsulado (MAHDAVI et al., 2014). As partículas do núcleo são dispersas em uma solução de polímero e pulverizadas em uma câmara quente, como ilustrado na Figura 2. O material de parede solidifica nas partículas do núcleo e o solvente evapora de forma com que as microcápsulas obtidas formem estruturas do tipo polinuclear. As propriedades do produto seco dependem das propriedades físicas e químicas da alimentação no aparelho, do design do secador e da operação em si. Os benefícios da técnica de spray drying incluem a capacidade de produzir pós de tamanho de partículas específico e teor de umidade, independente da capacidade do secador. É uma operação contínua e fácil por ser totalmente controlada automaticamente com um tempo de resposta rápido, e também 32 é aplicável a materiais tanto sensíveis quanto resistentes ao calor (KESHANI et al., 2015). Figura 2. Esquematização das principais etapas envolvidas no processo de microencapsulação por spray drying (RÉ, 2006). Apesar de relativamente simples, a técnica pode envolver interações complexas, como os parâmetros do aparato e alimentação que influenciam a qualidade do produto final. Os produtos secos por pulverização têm propriedades importantes como tamanho uniforme de partícula, boa fluidez, baixa densidade aparente, alta solubilidade, teor reduzido de umidade, estabilidade térmica e adequação para outras aplicações. Tais características do produto dependem principalmente das propriedades físicas dos alimentos, componentes dos equipamentos e parâmetros de processamento. Ao modificar o processo de secagem por pulverização, é possível alterar e controlar as propriedades mencionadas dos pós produzidos (I RÉ, 1998; MENG; CLOUTIER, 2014). Embora a técnica de spray dryer seja bem difundida na indústria de alimentos, existem algumas desvantagens dessa técnica, como: a produção de micropartículas não uniformes; limitação na escolha de materiais de parede (deve possuir baixa viscosidade em concentrações relativamente altas); produção de pós muito finos que podem necessitar de processamento adicional; pode causar alterações em materiais sensíveis ao 33 calor; e principalmente, pode haver perdas na fase final de recuperação do produto (MAHDAVI et al., 2014). Normalmente, as condições e as variáveis do processo spray cooling são muito similares às do processo de spray dryer. No processo spray cooling, o agente a encapsular é disperso ou dissolvido no agente encapsulante fundido, e não numa solução. Posteriormente, esta dispersão quente é pulverizada numa corrente de ar frio, formando as micropartículas, devido à solidificação do veículo. Para além desta diferença em relação à técnica de spray drying, ainda existe o facto deste processo não utilizar água ou solventes orgânicos, utilizar menos energia e menos tempo no seu processamento, traduzindo-se em vantagens consideráveis deste método (JYOTHI SRI et al., 2012). Nesta técnica, a solidificação do revestimento ocorre por congelamento térmico do agente encapsulante fundido, ao passo que, no caso do spray drying, a solidificação do revestimento é efetuada pela evaporação rápida do solvente. Resumindo, a grande diferença entre estes dois métodos é a forma como o revestimento solidifica (JYOTHI SRI et al., 2012). 1.1.1.2. Liofilização A liofilização é uma técnica de desidratação por congelamento, na qual a exclusão da água dos alimentos é feita por sublimação, à baixa pressão, a partir dos produtos previamente congelados (Costa, 2007). De uma forma geral, os liofilizadores mantêm os alimentos congelados a uma temperatura entre -40 e -90ºC e, em seguida, com o aumento gradativo da temperatura, a água congelada é retirada sob a forma de vapor. A liofilização ocorre em três estágios: congelamento do alimento em um ultrafreezer ou nitrogênio líquido, remoção da água por sublimação e secagem dos alimentos (FELLOWS et al., 2006). A vantagem de utilizar a liofilização está no fato de ser utilizada baixa temperatura, o que contribui por manter as propriedades nutricionais e sensoriais do produto final, ou ainda manter suas características funcionais, especialmente em compostos instáveis como os pigmentos, sendo possível manter sua cor e seu sabor natural (OR E PERE A; MURAD, 2005). No entanto, trata-se de uma operação lenta com custo muito elevado, o que pode acarretar em custos adicionais da produção. 34 Segundo Evangelista (1992), a liofilização ou desidratação a frio, apresenta vantagens sobre a secagem por spray-drying, já que não submete o alimento a altas temperaturas. Assim, é uma tecnologia quepermite aliar as vantagens da desidratação normal a outros efeitos benéficos no alimento como o aumento de vida útil do alimento pela diminuição da sua atividade de água e da redução de peso e volume favorecendo a comercialização do produto, a liofilização agrega outras vantagens da secagem como: a) Manutenção da forma original do alimento - a retirada da agua por sublimação mantem intactas as estruturas do alimento, possibilitando ainda a reidratação mais completa; b) Manutenção do valor nutritivo - as estruturas proteicas e o conteúdo de vitaminas, especialmente as termolábeis, são mantidas no processo, já que o calor não é aplicado ao alimento; c) Manutenção das características sensoriais- o sabor, o odor e o aroma dos alimentos não são alterados pela liofilização, pois os componentes que conferem tais características são termolábeis e, não havendo aplicação de calor, são mantidas no processo. HEINZELMANN et al., (2000) observaram que microcápsulas de óleo de peixe em matrizes de caseinato de sódio e lactose produzidas por liofilização apresentaram estruturas altamente porosas e uma curta vida de prateleira. Em estudos semelhantes, ANWAR; KUNZ, (2011) compararam as características do óleo de peixe microencapsulado por spray dryer e liofilização, evidenciando que a estrutura porosa e irregular das microcápsulas liofilizadas acelera a oxidação devido ao fácil acesso do oxigênio ao interior desses pós. Em contrapartida, ensaios envolvendo microcápsulas de óleo essencial de orégano encapsuladas com inulina, gelatina e sacarose por liofilização e spray dryer demonstraram que houve maior retenção do óleo essencial nas microcápsulas produzidas por liofilização (BEIRÃO DA COSTA et al., 2012). . 35 1.1.1.3. Gelificação iônica Em alguns casos, como na aplicação de óleos, ingredientes voláteis ou sujeitos a oxidação, o uso de baixas temperaturas durante o processo de encapsulação é recomendado para evitar a ocorrência de reações indesejáveis e volatilização do produto. Neste contexto, o processo de gelificação iônica é recomendado, sendo o alginato o polímero mais utilizado. Basicamente, a formação de microcápsulas resulta da produção de uma emulsão, no caso de um componente ativo hidrofóbico, em uma solução de alginato. Subseqüentemente, a emulsão é gotejada em uma solução de cálcio, onde a gelificação ocorre na superfície das gotas até que ocorra a formação completa de microcápsulas (gelificação externa) (DIAS et al., 2017). O ácido algínico e seus sais são copolímeros em bloco, contendo blocos de homopolímeros MM e GG e blocos mistos contendo seqüências irregulares de unidades M e G. A ligação de cátions divalentes e a subsequente formação de gel dependem da composição e arranjo dos blocos de resíduos. Os blocos GG têm ligação preferencial locais com ións divalentes, tais como Ca2 + , e os ións ligados interagem com outros blocos GG para formar ligações que levam à formação de gel. Com a adição da solução de alginato de sódio a uma solução de cálcio, a polimerização interfacial é instântanea, com precipitação do alginato de cálcio seguida por uma gelificação mais gradual do interior à medida que os íons de cálcio penetram nos sistemas de alginato. O tamanho das esferas é geralmente dependente da viscosidade da solução de polímero, do diâmetro do orifício e da distância entre a saída e a solução de coagulação (ANAL; SINGH, 2007). No geral, as esferas produzidas possuem tamanho de 1 a 10000 m o que pode limitar sua aplicação em alimentos (COMUNIAN; FAVARO-TRINDADE, 2016). O alginato é um biopolímero que possui propriedades gelificantes excepcionais, permitindo uma formação fácil do gel em condições seguras e suaves. Consequentemente, é frequentemente utilizado para encapsular vários materiais, tais como células, enzimas e lípidos (DIAS et al., 2017). 36 1.1.1.4. Cocervação complexa As técnicas de coacervação podem ser divididas em dois grupos principais: aquoso e orgânico. A coacervação em fase aquosa só pode ser usada para encapsular materiais insolúveis em água (materiais do núcleo hidrofóbico apresentados no estado sólido ou líquido). Por outro lado, a coacervação em fase orgânica permite o encapsulamento de material hidrossolúvel, mas requer o uso de solventes orgânicos. A coacervação na fase aquosa é classificada em simples ou complexa com base no mecanismo de separação de fases envolvido. Na simples coacervação, a solução contendo o polímero é adicionada de eletrólitos, como o sulfato de sódio, ou é dessolvatado pela adição de um solvente não miscível com a água, como o etanol, ou pelo aumento/diminuição da temperatura. . Essas condições promovem as interações macromolécula-macromolécula em detrimento das interações macromolécula-solvente. Por outro lado, a coacervação complexa é essencialmente impulsionada pelas forças de atração de polímeros com cargas opostas (CASTRO-ROSAS et al., 2017; PRIFTIS; TIRRELL, 2012). A coacervação complexa pode ser usada para encapsulação, imobilização de enzimas, formação de filmes de embalagem e produção de emulsões ou géis alimentares. Os coacervados formados também são usados como encapsulantes, aditivos, emulsionantes e modificadores de viscosidade na indústria alimentícia (EGHBAL; CHOUDHARY, 2018) porém, para isso, faz-se necessário o entendimento dos parâmetros que influenciam na interação polimérica para obter as melhores condições de formação dos coacervados e consequente microencapsulação. A seguir, serão apresentados os principais tópicos envolvidos na formação dos complexos coacervados. 1.1.2. Complexos coacervados O primeiro estudo publicado sobre complexos coacervados data em 1911, e descrevia a interação eletrostática envolvendo gelatina de peixe e goma arábica (TIEBACKX, 1911). Em seguida, Bungenberg de Jong e Kruyt introduziram pela primeira vez o nome “coacervação complexa” para distingui-la da simples coacervação de um único polímero. Bungenberg de Jong primeiro investigou sistematicamente a 37 coacervação complexa da goma arábica-gelatina, um sistema polissacarídeo-proteína. O Cientista Aleksander Oparin citou seu trabalho e mencionou a similaridade de protocélulas e coacervados, sugerindo que a vida tenha sido gerada em gotas coacervadas. A primeira análise teórica da coacervação complexa foi fornecida por Voorn e Overbeek (OVERBEEK; VOORN, 1957). Modelos teóricos subseqüentes foram citados por Veis e Aranyi (VEIS; ARANYI, 1960) e outros (SATO; NAKAJIMA, 1974; TAINAKA, 1979). Atualmente é definido pela IUPAC (União Internacional de Química Pura e Aplicada) como sendo uma separação coloidal de sistemas em duas fases líquidas (LV et al., 2013). A coacervação refere-se ao fenômeno de separação de fases entre dois polieletrólitos opostamente carregados em duas fases líquidas: uma fase densa carregada de polieletrólitos e uma fase diluída, sendo a fase densa denominada fase de coacervado e a fase diluída conhecida como fase de equilíbrio (COMERT; DUBIN, 2017; LIU et al., 2017). A fase de coacervado inicia-se com o surgimento de partículas normalmente micrométricas, que sofrem coalescência, formando uma separação de fases macroscópica, como pode ser observado na Figura 3 (JHO et al., 2017). Figura 3. Esquema do processo de coacervação complexa entre um polímero aniônico (ácido hialurônico, HA) e um polímero catiônico (quitosana) no pH 5,0. Fonte: Jho et al. (2017). 38 O fato de as proteínas normalmente manterem sua estrutura e funcionalidade em ambos os tipos de interação, tem despertado o interesse para aplicações in vitro e in vivo, no controle de liberação de medicamentos (KWON; KIM, 2011), purificação de proteínas (XU et al., 2011), biomateriais (STEWART; WANG; SHAO, 2011), engenharia de tecidos (TOH et al., 2005) e na ciência de alimentos(WANG et al., 2017). Os complexos coacervados podem ser utilizados para processos de obtenção de diversos ingredientes alimentares, contudo, para a utilização destes complexos em alimentos industrializados, é necessário fazer um estudo detalhado do seu comportamento frente às variações de pH, sal e temperatura de sistemas onde possam ser utilizados (KAYITMAZER et al., 2013; LIU et al., 2017). 1.1.2.1. Principais fatores que influenciam a formação dos complexos coacervados: Complexos coacervados são líquidos viscosos que consistem em macromoléculas opostamente carregadas (LINDHOUD et al., 2007). Estas macromoléculas podem ser constituídas por poliânions ou policátions, dependendo do grupo funcional disponível na cadeia (BENGOECHEA et al., 2011). A formação dos coacervados pode ser influenciada por fatores intrínsecos do polímero, como a natureza e densidade das cargas, e, principalmente por fatores extrínsecos, como o pH, força iônica e temperatura (CHAI; LEE; HUANG, 2014; DUHORANIMANA et al., 2017; LV et al., 2013). A força iônica e temperatura são fatores importantes que podem influenciar nas diferentes fases de transição na interação entre os polímeros, porém, o pH é o fator mais importante nesses sistemas. pH e razão proteína/polissacarídeo: O pH pode influenciar a atração eletrostática das cargas, principalmente quando proteínas estão inseridas no sistema, pois estes componentes normalmente são originados de dissociação ou associação com prótons, podendo depois sofrer variação com o pH (LV et al., 2013; PRIFTIS; TIRRELL, 2012). 39 A maior parte das interações que ocorrem no processo de coacervação complexa é do tipo eletrostática, por isso é necessário que os valores de pH do meio de reação estejam em um valor onde os polímeros apresentem-se com cargas opostas, por exemplo, para sistemas formados entre proteínas e polissacarídeos, a interação eletrostática ocorrerá em pH abaixo do ponto isoelétrico (pI) das proteínas, onde se apresentam suficientemente protonadas para que ocorra a reação de complexação com polissacarídeos aniônicos (CAPITANI et al., 2005). Utilizando técnicas de espalhamento de luz, podem ser observados valores de pH críticos ao longo da formação dos complexos, sendo estes: pHc onde inicia-se a interação eletrostática entre os polímeros levando ao aumento da turbidez do sistema, porém, a interação ainda não é forte o suficiente para levar a formação dos complexos coacervados, formando então os chamados complexos solúveis (TURGEON; SCHMITT; SANCHEZ, 2007); pHᴓ1 ou pHφ quando ocorre a separação de fases líquido-líquido ou fase de coacervado, correspondendo à fase de transição dos complexos solúveis para complexos insolúveis, quando os polímeros apresentam-se com cargas totalmente opostas (COMERT; DUBIN, 2017; KAYITMAZER et al., 2013; TURGEON; SCHMITT; SANCHEZ, 2007); Neste pH, mudanças macroscópicas na turbidez ocorrem até atingir o máximo (pHopt ou pHmax), onde complexos neutros são formados porque biopolímeros de cargas opostas atingem uma equivalência elétrica (EGHBAL; CHOUDHARY, 2018). Ainda, em alguns sistemas, dependendo da natureza do polímero, pode ser identificado o chamado pHᴓ2, quando ocorre a dissociação da interação entre os polímeros em um valor de pH em que não apresentem mais cargas opostas (KAYITMAZER et al., 2013; PRIFTIS; TIRRELL, 2012). Duas abordagens são usadas principalmente para a otimização da coacervação complexa: densidade de carga superficial (potencial zeta) e turbidez em função do pH e da razão polimérica. A propriedade elétrica da superfície dos biopolímeros é um parâmetro importante para verificar a complexação e estabilidade de coacervatos formados. A utilização de espectrofotômetro UV-Vis para medir a turbidez das misturas poliméricas também é uma ferramenta para pesquisar a formação de coacervados. A turbidez da solução inicial translúcida contendo apenas um tipo de biopolímero é aumentada pela adição de outra solução de biopolímero. A produção de partículas 40 maiores ao atingir um patamar de turbidez indica a interação eletrostática entre polímeros contendo cargas negativas e positivas, após ajuste de pH, resultando na coalescência dos complexos coacervados e formação de fase de coacervado insolúvel visível (EGHBAL; CHOUDHARY, 2018). As diferentes fases podem ser melhores identificadas na Figura 4, onde pode ser observado o comportamento da turbidez em relação ao pH na interação eletrostática em sistemas contendo 1:1 WPI-goma de linhaça (FG). Figura 4. Curvas de turbidez de amostras contendo WPI (0,025% m/m), FG (0,025% m/m) e misturas dos dois polímeros na razão 1:1 (Ct: 0,05% m/m) durante a titulação ácida do pH 6,0 ao pH 1,4. As fotografias demonstram as mudanças visuais da turbidez em amostras contendo as misturas entre os polímeros. Fonte: Liu, J. et al. (2017). LIU et al., (2010b) investigaram os efeitos do pH (6,0-1,4) e a razão entre biopolímeros (1:15 a 15:1 m/m) na formação de complexos coacervados entre albumina sérica bovina (BSA) e goma de semente de linhaça (FG) (Linum usitatissum L). Apesar de possuir cargas negativas em pH 5,4 (> pI de BSA = 4,9), os complexos formados entre os dois biopolímeros foram resultado de interações entre bandas positivas de BSA e grupos carboxila de FG. A turbidez aumentou no pH 4,8, ilustrando a formação de complexos insolúveis entre macromoléculas com cargas opostas. A maior quantidade de 41 complexos insolúveis foi formada em pHmax 3,4, e abaixo deste valor ocorreu a dissociação dos coacervados devido à protonação progressiva dos grupos carboxila de FG. A razão proteína/polissacarídeo (R) e a consequente concentração total de biopolímero desempenhou um papel importante na coacervação, assim, a turbidez e o potencial zeta aumentaram com o aumento da concentração de BSA. A razão teve correlação positiva com pHφ1, pHmax e pHφ2, mas não afetou significativamente o pHc. Autores ilustraram que independência de pHc à razão também foi observada por VINAYAHAN; WILLIAMS; PHILLIPS (2010) para misturas de BSA / goma arábica, pois complexos solúveis poderiam ser formados entre uma razão de 10:1 polissacarídeo- proteína (∼10 moléculas de BSA por molécula de goma arábica). O aspecto termodinâmico mais significativo da coacervação complexa é que a energia livre de Gibbs reduz com a diminuição da contribuição da entalpia eletrostática e com o aumento da entropia eletrostática. A coacervação possui diferentes termodinâmicas a partir da formação de agregados solúveis e da formação de complexos insolúveis. Medidas termodinâmicas para coacervação podem ser diretamente assumidas a partir da calorimetria. As medições calorimétricas são conduzidas principalmente por entropia, isto é, podem ser exotérmicas ou endotérmicas, indicando as interações polissacarídeo-proteína com base em condições diferentes (DEVI et al., 2017). GIRARD; TURGEON; GAUTHIER (2002) determinaram a entalpia, entropia, constante de ligação e estequiometria dos complexos de β-lactoglobulina e pectina de alta metoxilação usando a calorimetria de titulação isotérmica (ITC). Seus resultados mostraram que os complexos interpoliméricos solúveis foram conduzidos por entalpia e entropia, enquanto a complexação dos complexos solúveis com a formação dos complexos insolúveis foi conduzida por entalpia. Força iônica: A força iônica do meio e a concentração de polieletrólitos presentes em solução desempenham relevante importância para evitar a supressão do fenômeno. Deve haver uma equivalência elétrica entre as moléculas para que ocorra o ponto ótimo na formação dos complexos coacervados. Segundo WANG et al., (2005), dois efeitos podem ocorrer com a adição de sal no sistema: (1) maior repulsão eletrostática pela competição pelos sítios de ligação no polímero ou (2) maiorestabilidade dos agregados formados. Apesar de estudos na 42 literatura observarem diminuição na atração eletrostática com menor formação de coacervados (EMEK SEYREK et al., 2003; TOKLE; MCCLEMENTS, 2011; WANG et al., 2005), alguns estudos demonstraram que o aumento da força iônica pode contribuir ou não reduzir a formação de coacervados (DA S. GULÃO et al., 2014; WEINBRECK et al., 2004), pois a presença de íons pode promover uma maior solubilidade dos polímeros, levando ao enrolamento da molécula e expondo mais as suas frações hidrofóbicas, favorecendo assim outros tipos de ligação além da iônica (BURGESS, 1990). Segundo RU et al., (2012), quando um sistema é formado apenas por ligações eletrostáticas, a presença da força iônica pode inibir as ligações, porém sabe-se que apesar da complexação ser proveniente principalmente destas ligações, outras também podem estar presentes como ligações hidrofóbicas, ligações de hidrogênio ou força de Van der Waals. Em sistemas polipeptídicos preparados com poliácido/polibase na proporção 1:1 e pequenas quantidades de sal (até 40 mM de NaCl) ocorreu o aumento do tamanho dos coacervados levando a um aumento na turbidez dos sistemas. Os autores observaram que a presença de pequenas quantidades de sal durante a complexação permitiu processos de rearranjo que facilitaram a formação dos complexos insolúveis (PRIFTIS; TIRRELL, 2012). Temperatura: A temperatura influencia a interação entre proteínas e polissacarídeos: temperaturas mais baixas favorecem ligações de hidrogênio e as temperaturas mais altas levam a um aumento nas interações hidrofóbicas e covalentes devido à exposição de sítios ativos. Estruturas induzidas por altas temperaturas podem ser encontradas na formação de complexos estáveis de dispersão de mistura de proteína-polissacarídeo. O aumento da temperatura pode estabilizar a formação de complexos, tornando-os menos sensíveis ao pH, através da formação de ligações hidrofóbicas entre os grupos hidrofóbicos das proteínas e polissacarídeos. Assim, os conjugados são formados pelo aquecimento dos polímeros, levando à ligação permanente proteína-polissacarídeo com propriedades únicas para evitar a agregação estrutural e a gelificação. Durante a formação de complexos não covalentes, ou seja, eletrostáticos, LIU et al., (2010a) demonstraram através de dados turbidimétricos, que a temperatura entre 4ºC 43 e 45ºC não influenciou de forma significativa na formação de coacervados entre proteínas de ervilha e goma arábica. Porém, quando utilizada temperatura acima de 55ºC, a formação dos complexos foi consideravelmente reduzida. O mesmo foi observado por GIRARD; TURGEON; GAUTHIER, (2002) utilizando β-lactoglobulina e pectina na formação de coacervados. Na maioria dos estudos sobre a formação dos complexos coacervados foi demonstrada uma prevalência de ligações de hidrogênio entre proteínas e polissacarídeos quando utilizadas baixas temperaturas em sua formação, enquanto em temperaturas mais elevadas ocorre maior formação de ligações hidrofóbicas (HUANG et al., 2012). Alguns autores sugerem que a interação eletrostática seja mais importante na fase inicial da interação polimérica (pHᴓ1) e que durante a fase de coacervação (pHᴓ2) as ligações de hidrogênio sejam as mais predominantes (NIGEN et al., 2007). ANVARI et al., (2015) observaram a influência da temperatura na formação de complexos coacervados formados entre gelatina de peixe e goma arábica, evidenciando diferenças no rendimento e na estrutura dos complexos. A fração volumétrica da fase de coacervado e o rendimento total aumentaram pela redução da temperatura. A espectroscopia de infravermelho com transformada de Fourier (FTIR) mostrou que, a 10 °C, a alta coalescência de biopolímeros na fase de coacervação pode estar relacionada ao estabelecimento de ligações de hidrogênio mais fortes entre os polímeros. A fase de coacervado exibiu maior tensão de cisalhamento à medida que a temperatura diminui. Em comparação com os biopolímeros isoladamente, os complexos estavam expostos a mudanças estruturais e conformacionais, especialmente a temperaturas mais baixas nas quais as ligações de hidrogênio se tornam mais fortes. Ao contrário de altas temperaturas (acima de 40 °C) onde foi verificado maior comportamento viscoso (G” > G’), o módulo de armazenamento dos coacervados (G’) à 10 °C aumentou ao longo de toda a frequência estudada devido à mobilidade molecular reduzida, aumento da estruturação e ligações de hidrogênio reforçadas. 1.1.2.2. Propriedades e estrutura dos complexos coacervados As proteínas e polissacarídeos podem contribuir na estrutura e textura do alimento, pela sua capacidade de agregação e formação de géis. As proteínas são conhecidas por apresentarem a capacidade de emulsificação e formação de espuma, 44 enquanto os polissacarídeos possuem propriedades de retenção de água e espessamento e as funções de ambos os polímeros podem influenciar em outros ingredientes dos alimentos, sendo assim possível controlar sua estabilidade e propriedades reológicas (DICKINSON, 2003). Propriedades emulsificante e estabilizante As emulsões podem ser classificadas em duas categorias: simples ou múltiplas. Na primeira categoria, duas classes podem ser descritas: a emulsão óleo/água e a emulsão água/óleo. As emulsões múltiplas consistem em sistemas mais sofisticados, sendo eles: emulsão óleo/água/óleo ou água/óleo/água. As emulsões também podem ser classificadas de acordo com o seu tamanho de gota, em três categorias: macroemulsões, microemulsões e nanoemulsões (DICKINSON, 2009; MCCLEMENTS, 2012). Os agentes emulsionantes são amplamente utilizados na indústria de alimentos para o controle de ingredientes ativos, solubilização e encapsulação. Podem ser classificados em quatro categorias, segundo BOUYER et al., 2012: (I) íons não- surfactantes que podem adsorver na superfície da gota, sem afetar a tensão superficial; (II) pequenos coloides não-surfactantes que adsorvem e formam uma barreira física entre as gotas, assim previnem ou retardam a coalescência; (III) surfactantes monoméricos que diminuem a tensão interfacial e aumentam a estabilidade da emulsão; (IV) surfactantes poliméricos que além de provocar a diminuição da tensão interfacial, também induz ligações esféricas e principalmente eletrostática, alterando a viscosidade na maior parte dos sistemas, melhorando a estabilidade da emulsão. A fim de utilizar tecnologias limpas, os polímeros naturais veem substituindo os surfactantes sintéticos, que podem ser potencialmente irritantes ao organismo (MCCARTHY et al., 2014). Todas as proteínas e alguns polissacarídeos têm a capacidade emulsificante, no entanto alguns polissacarídeos tem a capacidade de estabilizar emulsões apenas aumentando a viscosidade da fase contínua, enquanto associados às proteínas, possuem uma maior capacidade emulsificante (BOUYER et al., 2012). A interação entre proteínas e polissacarídeos pode ajudar a manter e até aumentar a propriedade emulsificante das proteínas em determinados valores de pH e em relação ao ponto isoelétrico da proteína (MCCARTHY et al., 2014). A superfície 45 ativa dos complexos proteínas-polissacarrídeos, pode ainda, contribuir para a estabilidade das emulsões por aumentar a viscosidade da fase aquosa imediatamente adjacente à interface da emulsão (XU; YAO, 2009; YE; SINGH, 2006). Diversos estudos mostraram melhor estabilidade de emulsões, atribuível à presença de interações interfaciais associativas entre proteínas e polissacarídeos (BOUYER et al., 2012; DARDELLE; ERNI, 2014; EVANS; RATCLIFFE; WILLIAMS, 2013; FIGUEIREDO FURTADO et al., 2017; KLEIN et al., 2010; TIPPETTS; MARTINI, 2012). Dois procedimentos alternativos para a formação de emulsões podem ser usados. O primeiro consiste em preparar uma solução
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