Mecanismos Moleculares na Encefalopatia Pós-Séptica

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VIRGINIA LUIZ DE SOUSA 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
MECANISMOS MOLECULARES ENVOLVIDOS NO PREJUÍZO 
COGNITIVO TARDIO EM MODELO DE SEPSE EM CAMUNDONGOS 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Rio de Janeiro 
2019 
 
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VIRGINIA LUIZ DE SOUSA 
 
 
 
 
 
 
 
MECANISMOS MOLECULARES ENVOLVIDOS NO PREJUÍZO COGNITIVO TARDIO 
EM MODELO DE SEPSE EM CAMUNDONGOS 
 
 
 
Dissertação de Mestrado apresentada ao Curso de 
Pós-Graduação em Ciências Farmacêuticas da 
Faculdade de Farmácia da Universidade Federal do 
Rio de Janeiro, como requisito parcial à obtenção do 
título de Mestre em Ciências Farmacêuticas. 
Orientadoras Professoras Cláudia P. Figueiredo e 
Júlia R. Clarke . 
 
 
 
 
 
 
Rio de Janeiro 
2019 
3 
 
 
 
Luiz de Sousa, Virginia 
L725m MECANISMOS MOLECULARES ENVOLVIDOS NA 
FISIOPATOLOGIA DA ENCEFALOPATIA PÓS-SÉPTICA / 
Virginia Luiz de Sousa. -- Rio de Janeiro, 2019. 
75 f. 
 
Orientadora: Cláudia Pinto Figueiredo. 
Coorientador: Julia Clarke. 
Dissertação (mestrado) - Universidade Federal do 
Rio de Janeiro, Faculdade de Farmácia, Programa de 
Pós-Graduação em Ciências Farmacêuticas, 2019. 
 
1. Sepse. 2. memória. 3. encefalopatia. 4. 
estresse retículo. 5. microglia. I. Pinto 
Figueiredo, Cláudia, orient. II. Clarke, Julia , 
coorient. III. Título. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
CIP - Catalogação na Publicação 
Elaborado pelo Sistema de Geração Automática da UFRJ com os dados fornecidos pelo(a) 
autor(a), sob a responsabilidade de Miguel Romeu Amorim Neto - CRB-7/6283. 
 
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VIRGINIA LUIZ DE SOUSA 
 
 
MECANISMOS MOLECULARES ENVOLVIDOS NO PREJUÍZO COGNITIVO TARDIO 
EM MODELO DE SEPSE EM CAMUNDONGOS 
 
 
Dissertação de Mestrado apresentada ao Curso de Pós-
Graduação em Ciências Farmacêuticas da Faculdade de 
Farmácia da Universidade Federal do Rio de Janeiro, 
como requisito parcial à obtenção do título de Mestre em 
Ciências Farmacêuticas. 
 
 
Aprovada em ___/___/___ 
 
Orientador: 
______________________________________________________________________ 
Profª Drª Cláudia Pinto Figueiredo, PPGCF, UFRJ 
 
 
Coorientador: 
______________________________________________________________________ 
Profª Drª Júlia R. Clarke, PPGCF, UFRJ 
 
 
Banca examinadora: 
______________________________________________________________________ 
Profª Drª Yraima L. Cordeiro, PPGCF, UFRJ 
 
______________________________________________________________________ 
Profª Drª Ana Carolina de Siqueira, IBCCF, UFRJ 
 
______________________________________________________________________ 
Profª Drª Andreza F. de Bem, UNB, UFSM 
 
 
5 
 
RESUMO 
SOUSA, Virginia Luiz. Mecanismos moleculares envolvidos no prejuízo cognitivo tardio em 
modelo de sepse em camundongos. Rio de Janeiro, 2019. Faculdade de Farmácia, 
Universidade Federal do Rio de Janeiro, Rio de Janeiro, 2019. 
 
 A sepse é uma doença grave que afeta milhares de pessoas no mundo e possui uma 
alta taxa de mortalidade. Os indivíduos que sobrevivem à sepse têm sua qualidade de vida 
impactada pelas manifestações tardias da doença tornando-os incapacitados para realizar 
tarefas simples do dia-a-dia. A encefalopatia séptica (ES) é uma sequela frequentemente 
observada em sobreviventes da doença, podendo ser transitória ou persistir pelo resto da vida. 
O mecanismo envolvido nessa disfunção neurológica tardia ainda permanece obscuro, 
entretanto algumas evidências sugerem que o acúmulo de proteínas mal enoveladas e o 
―priming‖ microglial estejam envolvidos neste processo. Com objetivo de avançar no 
entendimento dos mecanismos moleculares envolvidos no prejuízo cognitivo tardio em 
pacientes sobreviventes de sepse utilizamos um modelo animal de ligação e perfuração do 
ceco (CLP) e investigamos se a persistência de prejuízos cognitivos e neuropsiquiátricos em 
animais sobreviventes de sepse está associada com a presença de estresse do retículo 
endoplasmático (RE) ou ativação microglial. Além disso, também avaliamos se os animais 
sobreviventes de sepse são mais susceptíveis aos efeitos tóxicos dos oligômeros do peptídeo 
β-amilóide (AβOs) sobre a função cognitiva, a indução de RE e a ativação microglial. Neste 
estudo observamos que os animais que sobreviventes à sepse apresentaram prejuízos 
cognitivos e alterações no sistema nervoso central (SNC) 30 dias após a sepse. A sepse não 
levou a um dano cognitivo per se permanente, visto que 45 dias após CLP os animais 
recuperaram a função cognitiva. Observamos que os animais sobreviventes de sepse 
apresentam níveis hipocampais de mRNA de XBP1 spliced (XBP1s) elevados 30 dias após 
CLP, retornando aos níveis basais 45 dias após cirurgia. Também observamos que não existe 
alteração nos níveis hipocampais de fator de ativação da transcrição 4 (ATF4) e proteína 
homologa da C/EBP (CHOP), 30 dias após CLP. Entretanto, os animais sobreviventes 
mostraram-se mais susceptíveis a desenvolver dano cognitivo e sináptico após administração 
icv de doses não-tóxicas de oligômeros de β-amilóide (AβOs), proteína abundante no cérebro 
de pacientes com doença de Alzheimer (DA). De maneira interessante, animais que 
sobreviveram à sepse (45 dias após CLP) apresentaram uma maior ativação microglial quando 
expostos a doses subtóxicas de AβOs, sem alterações significativas nos níveis das proteínas 
relacionadas ao estresse de ER. Coletivamente nossos resultados demostram que os animais 
que sobrevivem à sepse apresentam uma maior susceptibilidade para desenvolver prejuízos 
cognitivos e sinápticos após receberem um insulto com uma dose não tóxica de AβOs, sendo 
que essas manifestações não parecem estar envolvidas com o estresse RE. Entretanto, o 
aumento da ativação microglial após injeção de AβOs nos animais sobreviventes, sugere que 
o prejuízo cognitivo e sináptico estejam associados com o fenômeno de “priming” microglial. 
 
 
Palavras-chave: sepse; memória; encefalopatia; beta-amilóide; estresse retículo 
endoplasmático; microglia. 
 
 
6 
 
ABSTRACT 
SOUSA, Virginia Luiz. Molecular mechanisms associated with late cognitive impairment in 
a mouse model of sepsis. Rio de Janeiro, 2019. Faculdade de Farmácia, Universidade Federal 
do Rio de Janeiro, Rio de Janeiro,2019. 
 
 Sepsis is a severe inflammatory disease that causes high mortality. Patients that 
survive an episode of sepsis have impaired life quality for several years. Post-septic 
encephalopathy (ES) is frequently observed as a consequence of sepsis, and while in some 
patients it may be transient in nature, in others it may persist throughout their lifetime. The 
precise mechanisms underlying this late neurological dysfunction remain unclear, but 
evidence suggests that impaired formation and accumulation of misfolded proteins occurs in 
this pathology. In order to better understand this phenomenon, we used an animal model of 
cecum ligation and perforation (CLP) to investigated whether the persistence of cognitive and 
neuropsychiatric damage in sepsis-surviving animals is associated to the presence of 
endoplasmic reticulum (ER) stress in the hippocampus. We also evaluated whether sepsis 
surviving mice are more susceptible to the toxic effects of oligomers of amyloid-β peptide 
(AβOs) on cognitive function and ER induction. In this study, we observed that animals 
surviving sepsis presented cognitive impairment and alterations in the central nervous system 
(CNS) 30 days after sepsis. Sepsis survivors showed an increase in hipocamppal mRNA of 
XBP1 spliced (XBP1s), 30 days after CLP, which reached basal levels at 45 days post-
surgery. We also found no changes in hippocampal mRNA levels of ATF4 and CHOP, 30 
days after CLP. Sepsis did not lead to cognitive impairment per se in the later life of the 
animals (45 days after CLP), but was present in the experimental group receiving a subtoxicdose of AβOs, neurotoxins present in brains of Alzheimer's disease (AD) patients. Animals 
that survived sepsis have significantly greater microglial reactivity when treated with a 
subtoxic dose of AβOs and, in addition, the levels of XBP1, a factors associated to UPR was 
altered in these animals. Collectively, our results show that animals surviving sepsis have a 
greater susceptibility to cognitive impairment and neurological dysfunctions when exposed to 
a subtoxic dose of AβOs, and these manifestations do not appear to be involved in 
endoplasmic reticulum (ER) stress as seen that only XBP1 is altered. However, an 
exaggerated microglial activation was observed, suggesting the occurrence of microglial 
priming in the hippocampus of the survivors. 
 
 
Palavras-chave: sepsis; memory; encephalopathy; beta-amyloid; stress endoplasmic 
reticulum; microglial 
 
 
 
 
 
 
7 
 
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS 
 
Aβ – Beta Amilóide 
AβOs – Oligômeros de beta amilóide 
ATF4 – Fator de ativação da transcrição 4 
ATF6 – Fator de ativação da trascrição 6 
AKT – Proteína quinase específica de serina / treonina 
BCL2 – Célula-b de linfoma 2 
BHE – Barreira hemato-encefálica 
BIP – Proteína de imunoglobulina de ligação 
CHOP – Proteína homóloga da c/ebp 
CLP – Ligação e perfuração do ceco 
CREB – Proteína de ligação responsiva ao AMPc 
DA – Doença de Alzheimer 
DH – Doença de Huntington 
DNA – Ácido desoxirribonucléico 
DP – Doença de Parkinson 
EIF2Α – Fator de iniciação eucariótico alpha 
ELA – Esclerose lateral amiotrófica 
ERAD – Degradação associada ao retículo endoplasmático 
ES – Encefalopatia séptica 
FiO2 – Fração inspirada de oxigênio 
GADD – Parada de crescimento induzida por dano ao DNA 
GRP78 –Proteína regulada por glicose 78-KDA 
GSC – Escala de coma glasgow 
IL – Interleucinas 
IFNγ – Interferon gama 
8 
 
IRE1 – Proteína Cinase Dependente de Inositol 1 
LPS – Lipopolissacarídeo 
MIF – Fator de inibição migratória de macrófago 
mRNA – Rna mensageiro 
PAF – Fator de ativação plaquetária 
PAMPS – Padrões moleculares associados a patógenos 
PaO2 – Pressão arterial parcial de oxigênio 
PERK – Proteína quinase tipo PKR 
PCR – Reação em cadeia de polimerase 
PI3K – Quinase fosfatidilinositol 3 
PMDS – Doenças de proteínas mal-formadas 
PRRs – Receptores de reconhecimento de patógenos 
qSOFA – Rápida Avaliação sequencial de falência orgânica 
RE – Retículo endoplasmático 
SNC – Sistema nervoso central 
SOFA – Avaliação sequencial de falência orgânica 
TLRS – Receptores do tipo toll 
TNF – Fator de necrose tumoral alfa 
TXA2 – Tromboxano a2 
UPR – Resposta a proteinas mal-enoveladas 
UPS – Sistema ubiquitina-proteossoma 
UTI – Unidade de terapia intensiva 
XBP-1 – Proteína de ligação de x-box 1(x-box binding protein 1) 
 
 
 
 
9 
 
Sumário 
 
1. Introdução ....................................................................................................................................... 11 
1.1. Definição e epidemiologia da Sepse ........................................................................................ 11 
1.2. Fisiopatologia da Sepse .............................................................................................................. 14 
1.3. Disfunção Neurológica em pacientes pós-sépticos ................................................................ 16 
1.4. A microglia e o ―priming” microglial ...................................................................................... 19 
1.5. Resposta a proteínas não enoveladas (UPR) e o Estresse do retículo endoplasmático 
(RE).. ............................................................................................................................................ 22 
1.6. Doenças Neurodegenerativas e proteostase ............................................................................ 24 
1.7. Justificativa .................................................................................................................................. 27 
 
2. Objetivo Geral ................................................................................................................................ 29 
2.1. Objetivos Específicos ................................................................................................................. 29 
 
3. Metodologia .................................................................................................................................... 30 
3.1.Modelo animal .............................................................................................................................. 30 
3.2.Oligômeros do peptídeo β-amilóide (AβOs) ............................................................................ 31 
3.3.Injeção intracerebroventricular (ICV) ....................................................................................... 32 
3.4.Experimentos comportamentais ................................................................................................. 32 
3.4.1. Campo aberto ............................................................................................................................ 33 
3.4.2. Reconhecimento de objetos .................................................................................................... 34 
3.4.3. Suspensão Pela Cauda ............................................................................................................. 35 
3.5.Análise de expressão gênica por reação de transcrição reversa, seguida de reação da 
polimerase em cadeia (RT-PCR) ............................................................................................... 36 
3.5.1. Preparo das amostras de hipocampo ..................................................................................... 36 
3.5.2. Extração de RNA total do tecido e quantificação ............................................................... 36 
3.5.3. Síntese do DNA complementar ............................................................................................. 36 
3.5.4. RT-PCR .................................................................................................................................... 37 
3.6. Análise Imuno-histoquímica do tecido cerebral ..................................................................... 37 
3.7. Análise morfométrica da Microglia......................................................................................... 38 
3.8. Análise estatística dos dados ..................................................................................................... 38 
 
10 
 
4. Resultados ...................................................................................................................................... 39 
4.1.Caracterização do modelo animal de sepse através da ligação e perfuração do ceco (CLP). 
 ......................................................................................................................................................... 39 
4.2.Avaliação cognitiva dos animais sobreviventes de sepse ....................................................... 39 
4.3.Avaliação do comportamento tipo ansioso e depressivo dos animais sobreviventes de 
sepse ............................................................................................................................................... 41 
4.4.Animais sobreviventes de sepse apresentam reestabelecimento dos níveis hipocampais 
basais de TNF-α e CREB 45 dias após a cirurgia. ................................................................... 42 
4.5.Animais sobreviventes de sepse apresentam aumento do fator de transcrição XBP1, que 
regula positivamente a expressão de genes essenciais para a resposta a proteínas mal 
enoveladas (UPR) ........................................................................................................................43 
4.6. Animais sobreviventes de sepse são mais susceptíveis aos efeitos tóxicos dos 
oligômeros do peptídeo β-amilóide. ......................................................................................... 44 
 
5. Discussão ....................................................................................................................................... 50 
 
6. Conclusões ..................................................................................................................................... 57 
 
7. Referências Bibliográficas ........................................................................................................... 58 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
11 
 
1. Introdução 
1.1 Definição e epidemiologia da Sepse 
 As definições e conceitos de diagnóstico da sepse sofreram algumas alterações para 
facilitar o diagnóstico precoce e o uso de terapias apropriadas na sepse no ―The Third 
International Consensus Definitions for Sepsis and Septic Shock‖ (Sepsis-3) (SINGER et al., 
2016). Atualmente, a sepse é definida como ―uma disfunção orgânica potencialmente fatal 
que é causada por uma resposta desregulada do hospedeiro à uma infecção‖. Segundo esta 
mesma classificação, o choque séptico foi definido como ―sepse com alteração circulatória, 
celular e metabólica, associada a maior risco de morte‖ (OPAL et al., 2017). Esta redefinição 
enfatiza a relevância da resposta desregulada do indivíduo à infecção, alertando para o 
potencial letal da doença e necessidade de diagnóstico rápido e preciso (SINGER et al., 2016). 
Para o diagnóstico da sepse, atualmente utiliza-se as ferramentas de avaliação 
sequencial de falência orgânica (SOFA) ou quick SOFA (qSOFA) (Figura 1), as quais são 
utilizadas na beira do leito para identificar pacientes com suspeita de infecção e que estão sob 
maior risco de desfechos adversos. O score SOFA leva em consideração a relação de pressão 
parcial de oxigênio pela fração inspirada de oxigênio (PaO2/FiO2), hipotensão ou 
vasopressores, plaquetas, escala de coma Glasgow (GSC), bilirrubina e creatinina/oligúria, 
sendo recomendado para aplicação em pacientes internados em unidade de terapia intensiva 
(UTI). O escore varia de zero a 4, e uma pontuação igual ou superior a 2 representa disfunção 
orgânica. Para departamentos de emergência ou outras unidades hospitalares fora da UTI, a 
nova definição recomenda o uso do qSOFA ou SOFA (OPAL et al., 2017). Os critérios 
clínicos utilizados nesta avaliação são: 1) pressão sistólica menor que 100 mmHg; 2) 
frequência respiratória maior que 22/min; e 3) alteração do estado mental. Cada variável conta 
um ponto no score, portanto ele vai de 0 a 3. Uma pontuação igual ou maior a 2 indica maior 
risco de mortalidade ou permanência prolongada na UTI. O diagnóstico de sepse, portanto, é 
realizado quando existe suspeita ou certeza de infecção, e um aumento agudo de ≥ 2 pontos 
no SOFA ou qSOFA. Além desses scores, valores de exames laboratoriais, como PaO2, 
plaquetas, creatinina e bilirrubinas são necessários para completar a avaliação (OPAL et al., 
2017). É importante ressaltar que além da inclusão destas novas definições e critérios clínicos 
para sepse e choque séptico, alguns termos como septicemia, síndrome séptica e sepse grave 
foram eliminados durante a conferência de 2016 (SEPSIS-3). 
 
12 
 
 
 Figura 1: Tabela de critérios do SOFA atualizada pelo último consenso de definição de Sepse. 
 
A incidência de sepse na população mundial é alta, sendo considerada uma das 
principais causas de morte no mundo (CECCONI et al., 2018). Os dados globais sobre o 
número de casos trata-se de uma estimativa, pois a falta de uma definição globalmente 
padronizada para sepse e a ausência de critérios bem definidos dificultam a realização de um 
diagnóstico preciso prejudicando os estudos epidemiológicos. Os dados disponíveis na 
literatura são derivados de países de alta renda e a partir destes são realizadas estimativas 
mundiais, visto que em países de baixa e média renda as informações são escassas ou 
inexistentes (FLEISCHMANN et al., 2016) (ADHIKARI et al., 2010). Acredita-se que a 
sepse afeta entre 2 e 30% da população, variando de acordo com a região estudada 
(KEMPKER; MARTIN, 2016). 
O risco de ocorrência de sepse tem uma distribuição etária bimodal, com elevada 
incidência em bebês, havendo redução na infância, e voltando a aumentar na idade adulta com 
risco acentuado acima ou por volta dos 50-60 anos de idade. A doença é mais comum em 
indivíduos do sexo masculino (ANGUS et al., 2001a; DOMBROVSKIY et al., 2007a; 
MARTIN; MANNINO; MOSS, 2006). Evidências sugerem que indivíduos com maior 
número de comorbidades apresentam risco aumentado para o desenvolvimento de sepse, 
incluindo diabetes melittus, insuficiência cardíaca congestiva, doença pulmonar crônica, 
imunossupressão, doença hepática, câncer e doença renal crônica (BRUN-BUISSON et al., 
13 
 
1995; ESPER et al., 2006). A pneumonia é a causa mais comum de sepse, sendo responsável 
por aproximadamente metade dos casos, seguida por infecções intra-abdominais e do trato 
urinário (LAGU et al., 2012; VINCENT et al., 2009). Entre os agentes etiológicos gram-
positivos mais comumente isolados nos casos de sepse estão o Staphylococcus aureus e 
Streptococcus pneumoniae, sendo que a Escherichia coli, as espécies de Klebsiella e 
Pseudomonas aeruginosa predominam entre os isolados gram-negativos. É consenso que as 
infecções gram-negativas superam as gram-positivas na maioria dos casos da doença (OPAL 
et al., 2003; RANIERI et al., 2012; VINCENT et al., 2009). 
A taxa de mortalidade relacionada à sepse vem diminuindo nos últimos anos estando 
agora próxima de 20 a 30% (Figura 2), esse fato pode ser atribuído a fatores como o avanço 
clínico e tecnológico, introdução de cuidados intensivos modernos, melhor vigilância e 
monitoramento dos pacientes, conscientização dos profissionais de saúde e novos agentes 
terapêuticos (ANGUS & VAN DER POLL, 2013). Como resultado do declínio da 
mortalidade, observa-se uma população cada vez maior de sobreviventes de sepse, e esses 
indivíduos não raramente apresentam sequelas à longo prazo que podem levar a 
incapacidades, piora das condições de saúde e até morte precoce por diferentes causas 
(IWASHYNA et al., 2017; PRESCOTT et al., 2016). 
 
 
 Figura 2: Gráfico demonstrativo da incidência da sepse versus mortalidade. Adaptado de Kumar G et al. Chest 
2011. 
 
 
14 
 
1.2. Fisiopatologia da Sepse 
A fisiopatologia da sepse é consideravelmente complexa, dinâmica e bastante variável, 
vários fatores podem ser determinantes na fisiopatologia da doença. Além disso, a resposta 
desregulada do hospedeiro frente a esta infecção pode diferir tanto a nível local, como 
sistêmico (GINSBURG & KOREN 2018). A detecção dos micro-organismos invasores pelo 
sistema imune inato ocorre via receptores de reconhecimento de patógeno (PRRs, do inglês, 
pathogen recognition receptors), tais como CD14 e receptores do tipo Toll (TLRs), que são 
expressos em barreiras epiteliais, bem como em células imunes, tais como células dendríticas 
e macrófagos (AKIRA; UEMATSU; TAKEUCHI, 2006; BAUER, 2002). Tais receptores 
reconhecem componentes estruturais bacterianos, chamados de padrões moleculares 
associados a patógenos (PAMPs, do inglês, pathogen-associated molecular patterns), como 
lipopolissacarídeo (LPS; o principal fator de virulência de bactérias Gram-negativas), 
peptideoglicano, ácido lipoteicóico (componente da parede celular de bactérias Gram-
positivas), flagelina e DNA bacteriano (ISHII et al., 2008; MEDZHITOV; JANEWAY, 1998; 
VAN DER POLL; OPAL, 2008). 
Os componentes da parede bacteriana são os principais ativadores da resposta do 
hospedeiro, os quais desencadeiam uma cascata inflamatória, com liberação de citocinas 
como o Fator de Necrose Tumoral alfa (TNF-), interferon-,e as Interleucinas (IL), que 
desempenham um papel central no desenvolvimento da sepse. Estas citocinas estimulam uma 
intensa resposta celular, com liberação de mediadores secundários, quimiotaxia e ativação de 
granulócitos. Outros mediadores são responsáveis pela reativação das células fagocitárias e da 
cascata inflamatória, formando um ciclo vicioso inflamatório (BENJAMIM, 2001; 
DENSTAEDT et al., 2018; PEREIRA JÚNIOR et al., 2013; SALLES et al., 2005). 
Simultaneamente, os microrganismos presentes no foco de infecção, ou sistemicamente, são 
fagocitados, causando um aumento do consumo de oxigênio pelos fagócitos e a produção de 
radicais livres de oxigênio (superóxidos, peroxidases etc), juntamente com proteases e 
hidrolases (lisozimas, elastase, colagenase etc). Essas propriedades fagocíticas e bactericidas 
são essenciais para a defesa normal do hospedeiro, mas, quando a ativação dos macrófagos e 
neutrófilos torna-se exacerbada, estas células podem contribuir para os efeitos deletérios da 
sepse (PEREIRA JÚNIOR et al., 2013). 
Estudos descrevem o envolvimento de vários mediadores na sepse, não havendo, 
aparentemente, um mediador central na patogênese da doença. Além do TNFα, Interferon-γ e 
15 
 
interleucinas, também estão envolvidos o fator de ativação plaquetária (PAF), leucotrienos, 
tromboxano A2 (TXA-2) e ativadores da cascata do complemento. A ativação de neutrófilos 
também desempenha um papel fundamental. Outros agentes que podem participar da cascata 
de sepse incluem moléculas de adesão, quininas, trombina, substância depressora do 
miocárdio, β-endorfina e proteínas de choque térmico (BONE et.al., 1991). A anergia, que é 
um estado de não-responsividade das células T frente ao antígeno, também pode estar 
implicada nos mecanismos da sepse (HEIDECK et al. 1999). Outro evento relatado na sepse é 
uma apoptose progressiva e profunda induzindo a perda de células imunes. Em geral os níveis 
de células B, células T (CD4) e células dentríticas foliculares foram significativamente 
reduzidos na fase crítica da doença (HOTCHKISS et al. 1999). 
Fatores genéticos também podem influenciar a resposta do hospedeiro. Vários 
polimorfismos genéticos têm sido associados à predisposição e ao desenvolvimento de sepse 
ou choque séptico e a um pior desfecho clínico. Polimorfismo nos genes que codificam 
citocinas pode determinar os níveis de citocinas pré e pró-inflamatórias afetando o perfil 
responsivo de cada indivíduo (SIPAHI et al. 2006). De maneira geral, a liberação desregulada 
de citocinas que ocorre na sepse pode causar disfunção endotelial, caracterizada por 
vasodilatação e aumento da permeabilidade capilar, que geralmente é associada com 
hipotensão, hemoconcentração, extravasamento macromolecular e edema, podendo culminar 
no choque séptico e morte (AIRD, 2003; AKIRA; TAKEDA, 2004; LAKHANI; BOGUE, 
2003; O’NEILL; GOLENBOCK; BOWIE, 2013; RIVERS et al., 2001). 
Embora tratamentos e procedimentos eficazes tenham sido adotados para reduzir a 
mortalidade na sepse, os sobreviventes apresentam severas complicações ao longo da vida 
como comprometimento físico e cognitivo (FERRANTE et al., 2015; IWASHYNA et al., 
2010). Pacientes que sobrevivem a quadros de sepse costumam apresentar nos anos seguintes 
à alta hospitalar uma queda acentuada na imunidade, ficando suscetíveis a patógenos 
oportunistas e, até mesmo, ao surgimento ou recaída de câncer (NASCIMENTO et al., 2017). 
Esses pacientes também apresentam um risco maior de eventos pulmonares e cardiovasculares 
ao longo da vida (F.A. et al., 2013; YENDE et al., 2014) além de desenvolverem limitações 
que os tornam incapazes de realizar atividades simples do dia-a-dia (IWASHYNA et al., 
2017). Evidências crescentes sugerem que os sobreviventes da sepse exibem complicações 
neurológicas de longo prazo e declínios substanciais na função cognitiva. Tais complicações 
são as sequelas mais comumente observadas nesses sobreviventes, podendo aumentar a 
suscetibilidade do cérebro a doenças neurodegenerativas e risco para o desenvolvimento de 
16 
 
demências (WIDMANN; HENEKA, 2014). No entanto, os mecanismos pelos quais a sepse 
induz disfunções cognitivas a longo prazo são pouco conhecidos e precisam ser elucidados. 
 
1.3. Disfunção Neurológica em pacientes pós-sépticos 
A maioria dos pacientes acometidos pela sepse apresenta disfunção cerebral aguda 
reversível, com alteração do estado mental, desatenção e pensamento desorganizado, 
conhecido por delírio associado à sepse ou encefalopatia séptica (ES) (JACKSON et al., 2009; 
SCHORR; DELLINGER, 2014). Este quadro está associado com o aumento da morbidade e 
mortalidade, além de maior tempo de permanência no hospital e elevados gastos em saúde 
(CHECINSKI et al., 2010; EIDELMAN, 2003; GORDON et al., 2004; MATOT; SPRUNG, 
2006). 
Apesar dos avanços da medicina intensiva terem reduzido significativamente a 
mortalidade dos pacientes acometidos pela sepse, os sobreviventes, muitas vezes, apresentam 
prejuízos neurocognitivos permanentes, mesmo após a completa recuperação clínica do 
paciente (CALSAVARA et al., 2016). O comprometimento cognitivo tardio observado em 
muitos sobreviventes de sepse cursa com alteração da atenção, fluência verbal, função 
executiva e memória verbal (SEMMLER et al. 2012), resultando em diminuição da qualidade 
de vida e aumento da morbidade em longo prazo (CHECINSKI et al., 2010; LANGA et al., 
2012; SCHORR; DELLINGER, 2014; WINTERS et al., 2010). Em estudos de 
acompanhamento em longo prazo, a maioria dos pacientes apresentou melhora na função 
cognitiva geral após 6 a 12 meses de alta hospitalar. No entanto, algumas habilidades 
cognitivas, como memória, não tiveram recuperação completa (ANGUS et al., 2001b; 
HEYLAND et al., 2000; HOPKINS et al., 1999). 
Embora exista um consenso de que pacientes sobreviventes da sepse tem maior risco 
de declínio cognitivo em relação à população controle (IWASHYNA et al., 2010), os dados 
referentes às consequências da sepse a médio e longo prazo são muito escassos (SCHERAG 
et al. 2017). Alguns estudos estimam que os danos cognitivos tardios decorrentes da sepse 
afetam entre 17 (IWASHYNA et al.,2010) e 60% dos pacientes (SEMMLER et al. 2013). 
Outros distúrbios comportamentais, como depressão e ansiedade, também podem acompanhar 
o prejuízo cognitivo a longo prazo (DAVYDOW et al., 2009; S. et al., 2016). A depressão 
frequentemente observada em sobreviventes da sepse, está associada de forma significativa ao 
comprometimento funcional tardio desses pacientes. Curiosamente, indivíduos com sintomas 
17 
 
depressivos que são atingidos pela sepse tem maior predisposição a apresentar danos 
cognitivos (DAVYDOW et al. 2012). Assim como acontece em adultos, crianças que 
sobrevivem a episódios de sepse também são suscetíveis ao dano cerebral e prejuízo cognitivo 
na fase adulta (KAUR et al., 2015); porém idosos são mais propensos aos danos neurológicos 
dessa condição (D’AVILA et al. 2018). Vários estudos relatam uma associação entre o 
comprometimento cognitivo a longo prazo e a admissão de pacientes em UTIs, 
principalmente idosos submetidos à ventilação mecânica (VM) (GUERRA; LINDE-
ZWIRBLE; WUNSCH, 2012; HOPKINS et al., 1999, 2005). Um estudo de coorte 
retrospectivo identificou uma associação entre os riscos de demência à longo prazo e a 
admissão e permanência dos pacientes na UTI com uso de VM, os autores observaram 
também que internações mais prolongadas e mais reinternações na UTI estão 
significativamente associadas ao desenvolvimento de demência (LAI et al., 2017). 
Interessantemente, a demência causada pela sepse parece estar associada a um maior risco de 
doenças graves, incluindo a reincidência de sepse, e aumento substancial da mortalidade nesse 
grupo de indivíduos (LIAO et al., 2015; SHEN; LU; LI, 2012). Crianças que sobrevivem à 
sepse apresentam um comportamento semelhante. Através de um estudo exploratórioem uma 
população pediátrica, descobriu-se que crianças sobreviventes à sepse tinham padrão 
cognitivo bem abaixo da média e que a maioria delas precisaram frequentar escolas de 
educação especial no decorrer dos anos (MB et al., 2009). 
 A ES é uma condição que inclui todos os tipos de disfunção cerebral causada pela 
sepse, no entanto, sua fisiopatologia é complexa e pouco compreendida, estando 
provavelmente relacionada à liberação intensa de mediadores inflamatórios (LAMAR; 
HURLEY; TABER, 2011). Existem duas hipóteses para o mecanismo do declínio cognitivo 
tardio causado pela sepse, a hipótese do dano vascular e da neurodegeneração. Acredita-se 
que o dano vascular e a neurodegeneração presentes na ES possam ser mediados por 
desordens metabólicas, comprometimento da integridade da barreira hematoencenfálica 
(BHE), liberação de neurocitocinas inflamatórias, estresse oxidativo e ativação microglial 
acentuada. Esses eventos podem culminar em isquemia, hipóxia e apoptose que clinicamente 
podem se manifestar agudamente em forma de delírio (ANNANE et al., 2005; DE BRUIJN et 
al., 2014; POLITO et al., 2013; SHARSHAR et al., 2003; HOPKINS et al., 2010; TACCONE 
et al., 2014; TSURUTA & ODA, 2016). 
Um estudo prévio de nosso grupo de pesquisa demonstrou que animais sobreviventes 
de sepse apresentam níveis elevados de mRNA para TNF-α e prejuízo na sinalização de 
18 
 
insulina no hipocampo, 30 dias após indução da sepse (NEVES et al., 2018). As quinases 
fosfatidilinositol 3 (PI3Ks) são enzimas responsáveis pela transdução de sinais intracelulares, 
desempenhando papel na regulação da proliferação e migração celular, na sobrevivência da 
célula, na resposta inflamatória, na expressão gênica, no metabolismo celular, nos rearranjos 
do citoesqueleto e no fluxo de cálcio. As vias de sinalização celular relacionadas ao PI3K 
desempenham papel importante na patogênese das doenças que apresentam componente 
inflamatório, tais como câncer, infarto do miocárdio, aterosclerose, lesão por isquemia e, 
sobretudo, a sepse. Esta via também regula a expressão de outros fatores de transcrição 
relacionados com a memória, e desempenha um papel essencial na plasticidade sináptica e em 
funções cognitivas. A perda sináptica tem sido melhor correlacionada a prejuízo de memória 
em comparação a outros marcadores de neurodegeneração em algumas formas de demência, 
incluindo a doença de Alzheimer (SHANKAR; WALSH, 2009). Resultados anteriores do 
nosso grupo de pesquisa mostraram que os níveis de sinaptofisina são marcadores adequados 
de dano sináptico e se correlacionam bem com prejuízos cognitivos em camundongos 
(FIGUEIREDO et al., 2013a; MEDEIROS et al., 2010). Além disso, a ligação e perfuração do 
ceco (CLP), utilizado como modelo de sepse, induz um efeito deletério persistente nos 
terminais pré-sinápticos hipocampais, demonstrado pelos níveis reduzidos de sinaptofisina em 
comparação aos animais controle 30 dias após a cirurgia (NEVES et al., 2018). 
A via PI3K / Akt também pode mediar a ativação do fator de transcrição de ligação 
responsiva ao AMPc (CREB) (DU; MONTMINY, 1998; PUGAZHENTHIT et al., 2000) e 
está implicada no controle da fosforilação de CREB nos neurônios (LIN et al., 2001; 
PERKINTON et al., 2002). Além disso, já está bem estabelecido que CREB atua como um 
fator de transcrição importante dessa via relacionado com a cognição, onde é verificada uma 
associação entre a regulação negativa de AKT/CREB e déficit de memória (BARCO; 
MARIE, 2011; BENITO; BARCO, 2010; IMPEY et al., 1998). Corroborando com outros 
autores, dados anteriores do nosso grupo demonstraram uma diminuição da expressão de 
CREB total e da fosforilação em resíduos de serina 133 no hipocampo de animais submetidos 
ao modelo CLP, o que sugere que a inflamação ocasionada pela sepse possa estar induzindo a 
diminuição da atividade deste importante fator de transcrição envolvido nos mecanismos de 
formação e evocação da memória. Importante ressaltar que as alterações cognitivas e 
neurológicas estavam presentes 30 dias após a cirurgia, porém esses eventos não foram 
observados aos 45 dias após a indução da sepse, indicando que os animais sobreviventes já se 
encontravam completamente recuperados (NEVES et al., 2018). Além disso, já está bem 
19 
 
estabelecido o papel da transcrição mediada por CREB no processo de síntese de proteína 
(DASH; MOORE; DIXON, 2018; KAANG; KANDEL; GRANT, 1993) e que também exerce 
um papel essencial para a consolidação da memória de longo prazo (JOSSELYN; 
MORTEZAVI; SILVA, 2005). 
 
1.4. A microglia e o priming microglial 
Durante o quadro séptico diversas citocinas pró-inflamatórias são liberadas, tais como 
interleucina (IL)-1, IL-6, IL-12, fator de necrose tumoral alfa (TNF-α), interferon gama (IFN-
γ) e fator de inibição migratória de macrófago (MIF). O TNF-α é considerado uma citocina 
pró-inflamatória central na patogênese da sepse (BEUTLER; CERAMI, 2003). Em baixos 
níveis de secreção, o TNF-α tem um efeito benéfico na estimulação e coordenação de muitas 
das respostas imunes para a contenção da infecção local, mas em níveis elevados os seus 
efeitos podem ser prejudiciais para o paciente, uma vez que desencadeia uma cascata de 
ativação de outros mediadores, tais como IL-1β e IL-6, associados à lesão celular (NEILSON; 
KAVANAGH; RAO, 1996). Durante a infecção, as células residentes nos tecidos respondem 
rapidamente produzindo TNF-α, que por sua vez ativam várias células locais, induzindo a 
expressão de outros genes pró-inflamatórios (BRADLEY, 2008). O TNF-α está associado 
ainda com a ativação da microglia e a liberação de outras citocinas no tecido cerebral como 
IL-1β e IL-6 (LEE; NAGAI; KIM, 2002). 
A microglia é uma célula imune residente no SNC (LULL; BLOCK, 2010); em 
condições homeostáticas é responsável por promover a saúde neuronal através de múltiplas 
funções (ERIC THOMAS, 1992; LI; BARRES, 2018). Consideradas como macrófagos 
cerebrais, as microglias são responsáveis pela eliminação de agentes infecciosos, células 
mortas, sinapses redundantes, agregados de proteínas e outros antígenos particulados e 
solúveis que podem colocar em risco o SNC (COLONNA; BUTOVSKY, 2017). A microglia 
é uma célula dinâmica, podendo assumir vários fenótipos distintos de acordo com o 
microambiente em que se encontra (NIMMERJAHN; KIRCHHOFF; HELMCHEN, 2005). 
Classicamente, as células microgliais são classificadas de acordo com sua forma em três 
subtipos amplamente distintos: compacto, longitudinalmente ramificado e radialmente 
ramificado (LAWSON et al., 1990), de modo que que essas morfologias estão intimamente 
relacionadas ao seu estado funcional (DAVIS; FOSTER; THOMAS, 1994). No entanto, 
estudos recentes sugerem que a microglia pode apresentar fenótipos mais variáveis dentro 
20 
 
desta visão tradicional e atualmente aceita de que a morfologia microglial varia entre 
―repouso ramificado‖ e ―ativado amebóide‖ (FERNÁNDEZ-ARJONA et al., 2017). Em 
condições saudáveis, predomina o fenótipo ―repouso‖ caracterizado por uma morfologia 
ramificada. Quando em ―repouso‖, as microglias permanecem em estado de alerta, 
monitorando seu ambiente (NIMMERJAHN; KIRCHHOFF; HELMCHEN, 2005; OLAH 
et al., 2011) e contribuindo para a homeostase através de podas sinápticas, regulação da 
atividade neuronal, e da transmissão sináptica (LI et al., 2012). A microglia torna-se 
ativada em reposta a qualquer tipo de evento patológico ou mudança na homeostase 
cerebral como inflamação, lesão cerebral, ou estímulos imunológicos, adquirindo assim a 
forma ameboide e pouco ramificada. Como a microglia tem estados de ativação 
multifacetados em doenças e lesões do SNC, essas células podem ter papéis benéficos ou 
prejudiciais dependendo do contexto (LI; BARRES, 2018), influenciando fortemente o 
resultado patológico ou resposta a um estressor através da liberação de uma infinidade de 
substâncias, incluindo citocinas,quimiocinas e fatores de crescimento (Figura 3) (WOLF; 
BODDEKE; KETTENMANN, 2017). 
 
 
 
 
 
 
Figura 3: Figura esquemática da morfologia microglial. (https://www.novusbio.com/research-
areas/neuroscience/neuroscience-cell-identity-markers) 
 
Embora a microglia tenha a função de fornecer neuroproteção, ela também tem a 
capacidade de danificar e matar neurônios. Quando uma ameaça surge, a microglia 
rapidamente se torna ativada para enfrentar o insulto, porém, em alguns casos, sua ativação 
não é capaz de reestabelecer a homeostase em seu microambiente, fazendo com que esta 
permaneça em seu estado ativado na insistente tentativa de eliminar o agente agressor. Nestas 
circunstâncias, a microglia desregulada e permanentemente ativa, muitas vezes se torna 
prejudicial à saúde cerebral podendo fagocitar sinapses de modo exagerado, matar neurônios 
ou induzir astrogliose. Sua ativação prolongada e desnecessária pode levar ao acúmulo de 
21 
 
agregados proteicos no SNC ocasionando um ciclo inflamatório vicioso que pode progredir 
para neurodegeneração grave (LULL; BLOCK, 2010; PERRY; NICOLL; HOLMES, 2010). 
Na última década, um número crescente de estudos investigou a importância das 
células microgliais em funções como a memória. Em estado saudável, a microglia secreta 
fator neurotrófico derivado do cérebro (BDNF) e outras citocinas anti-inflamatórias como IL-
4 e IL-10, que contribuem positivamente para a função sináptica e formação de memória 
(FERRINI; DE KONINCK, 2013; PARKHURST et al., 2013). Contudo, em uma condição 
neurodegenerativa, a microglia ativada secreta citocinas pró-inflamatórias que causam 
toxicidade em neurônios. No entanto, não está claro se o estresse tem qualquer papel na 
regulação da população e na ativação de células microgliais sob o cérebro saudável ou 
doente. A microglia responde prontamente às alterações patológicas no sistema nervoso 
central (SNC) tornando-se mais susceptível à ativação; desta forma, a inflamação sistêmica 
afeta a microglia, podendo contribuir para a patogênese de doenças neurodegenerativas 
crônicas e sua progressão (PERRY, 2004). O microambiente do SNC tem um profundo 
efeito no fenótipo microglial e muitos grupos demonstraram claramente a estreita relação 
entre as placas de peptídeo β-amilóide (Aβ) e a microglia ativada em pacientes com Doença 
de Alzheimer (DA) e em modelo animal da doença (CAI; HUSSAIN; YAN, 2014; SONDAG; 
DHAWAN; COMBS, 2009). Trabalhos produzidos nos últimos anos, mostram que as funções 
da microglia como fagocitose alterada, poda sináptica e secreção de citocinas podem 
influenciar significativamente para progressão de doenças neurodegenerativas 
(CUNNINGHAM, 2013; MATHYS et al., 2017; SONG; COLONNA, 2018). 
O ―priming‖ microglial é um evento que também pode contribuir para o 
agravamento de distúrbios neurológicos. Se trata de um fenômeno que corresponde a uma 
resposta exagerada ou aumentada da microglia a um segundo estímulo inflamatório e é 
observado em diversas condições associadas à neurodegeneração crônica 
(CUNNINGHAM, 2013; PERRY, 2010). Nesta circunstância, uma infecção transitória, ou 
exposição a baixos níveis de patógenos infecciosos (isto é, abaixo daqueles necessários 
para causar sinais clínicos), faz com que a microglia já primada fique superativada 
(OHMOTO et al., 1999). Em modelo animal de Doença de Parkinson (DP), DA e outras 
doenças neurodegenerativas, existem evidências de que insultos inflamatórios aliados a um 
possível estado de microglia já ―primada‖ pode induzir respostas amplificadas de 
mediadores inflamatórios no SNC levando a perda neuronal e contribuindo para a 
progressão das doenças neurodegenerativas (PERRY, 2010). Um estudo recém-publicado 
22 
 
do nosso grupo de pesquisa demonstrou através de abordagens in vitro e in vivo que as 
células microgliais de camundongos infectados com Escherichia coli sofrem ativação 
exacerbada quando expostas a baixas doses de oligômeros do peptídeo β-amilóide (AβOs), 
e esse evento foi acompanhado por prejuízos cognitivos. Interessantemente, após o 
tratamento com minociclina, um antibiótico que inibe a polarização pró-inflamatória 
microglial, os animais infectados voltaram a apresentar resposta microglial normalizada a 
AβOs e a função cognitiva foi restaurada (FROST et al., 2019)(Figura 4). 
 
 Figura 4: Esquema demonstra a diferença entre a resposta inflamatória da microglia naive e a microglia 
primada no SNC no primeiro e segundo insulto. 
 
1.5. Resposta a proteínas não enoveladas (UPR) e o Estresse do retículo 
endoplasmático (RE) 
A maquinaria responsável pelo controle de qualidade do enovelamento protéico no RE 
é particularmente muito sensível a quaisquer perturbações na homeostase celular. Estados de 
hipóxia, isquemia, privação de sono, inanição, infecções, excesso de lipídeos e/ou 
carboidratos, flutuações da homeostase do cálcio e estresse oxidativo comprometem todo 
processo de qualidade do enovelamento, acarretando em uma maior produção e acúmulo de 
proteínas mal enoveladas no lúmen do RE (WANG; KAUFMAN, 2016). A persistência 
dessas perturbações leva ao acúmulo de proteínas mal enoveladas e sobrecarga de todo 
sistema de processamento com progressiva diminuição da atividade das chaperonas e da 
degradação proteica via proteassomas. Esta condição de acúmulo traz diversos prejuízos 
funcionais à célula, sendo denominada estresse do retículo endoplasmático (RE) 
23 
 
(RUTKOWSKI; KAUFMAN, 2004). Para amenizar os efeitos deletérios e preservar a 
integridade celular enquanto persiste a condição de estresse do RE, a célula inicia um 
processo adaptativo conhecido como resposta a proteínas não enoveladas (unfoldedprotein 
response - UPR), no qual são ativados mecanismos adaptativos visando o restabelecimento da 
homeostase do RE (RUTKOWSKI; KAUFMAN, 2007). 
A UPR é caracterizada como uma cascata de sinalização com finalidade de: 1) resgatar 
a qualidade da síntese proteica; 2) atenuar a síntese global de proteínas; 3) degradar mRNA’s 
aberrantes; 4) aumentar a síntese de proteínas chaperonas e de enzimas antioxidantes; 5) 
aumentar a expressão gênica dos componentes de degradação associado ao ER (ERAD); 6) e 
respostas de autofagia. Além da modulação do correto enovelamento proteico, a UPR também 
está relacionada ao metabolismo de aminoácidos, função mitocondrial e detoxificação 
(RUTKOWSKI; KAUFMAN, 2007). A UPR inicia-se com a ativação de 3 proteínas 
associadas à membrana do RE que desencadeiam vias sinalizadoras de resposta, são elas: a 
enzima 1 dependente de inositol (IRE1), o fator de ativação da transcrição 6 (ATF6) e a 
proteínaquinase do retículo endoplasmático semelhante a PKR (PERK) (RUTKOWSKI; 
KAUFMAN, 2004). 
A IRE1 é uma proteína transmembrana e quando ativada se autofosforila e dimeriza, 
ativando a atividade endonuclease, levando ao processamento de mRNAs que codificam o 
fator de transcrição nuclear da proteína de ligação de x-box (XBP1). Para se ativar a XBP1 
remove um íntron de 26 nucleotídeos, induzindo um frame-shift em sua tradução e criando 
um novo domínio C-terminal, resultando na expressão de um fator de transcrição mais ativo e 
estável, o XBP1 spliced (XBP1s). Este fator ativo se transloca para o núcleo e aumenta a 
expressão gênica relacionada aos mecanismos de degradação associado ao RE (ERAD) e 
chaperonas (HETZ; SAXENA, 2017a). A Proteína quinase tipo PKR (PERK) quando se 
dimeriza induz por autofosforilação a ativação de seu domínio quinase. A ativação da Perk 
atenua a síntese de proteínas por meio da fosforilação do fator eucariótico iniciador de 
tradução 2 (eIF2α). O eIF2α também permite a tradução do mRNA que codifica o fator de 
ativação transcricional 4 (ATF4), induzindo expressão gênica relacionada à ERAD, 
enovelamento de proteínas, metabolismo de aminoácidos e autofagia – mecanismo regulado 
pelos lisossomos de eliminação de agregadosproteicos e organelas danificadas (WALTER; 
RON, 2011). De modo igualmente importante, o ATF4 transcreve outro fator de transcrição 
da proteína homóloga da c/ebp (CHOP), GADD34 e vários membros da família BCL2 que 
desempenha um papel essencial na morte celular (HAN et al., 2013) (Figura 5). 
24 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Figura 5: Cascata de sinalização adaptativa da UPR (SALVADÓ et al., 2015). 
 
Em conjunto, a XBP1s, ATF6 e o ATF4 regulam a expressão e a atividade de 
marcadores chave para o controle de danos relacionados ao estresse do RE. No entanto, em 
condições onde este quadro de estresse de RE é demasiadamente grave e/ou prolongado, a 
UPR pode não ser capaz de controlar a expansão de efeitos deletérios do lúmen para a célula. 
Nestas condições as mesmas proteínas sensoras da UPR responsáveis por iniciar uma 
sinalização pró-adaptativa ao estresse podem iniciar uma sinalização pró-apoptótica, levando 
a morte celular precoce (HETZ; SAXENA, 2017a). 
 
1.6. Doenças Neurodegenerativas e proteostase 
A proteostase é o equilíbrio entre os processos responsáveis pela geração e produção 
de proteínas funcionais. A alteração da proteostase e a neuroinflamação são características 
importantes de algumas doenças neurodegenerativas (BALCH et al., 2008). A inflamação 
cerebral frequentemente coexiste com o processo degenerativo em diferentes doenças 
cerebrais. Fatores fisiológicos e patológicos podem prejudicar o equilíbrio entre a síntese e a 
25 
 
degradação proteica, resultando no acúmulo de proteínas mal enoveladas (CABRAL-
MIRANDA; HETZ, 2017). A agregação anormal de proteínas é uma característica central de 
algumas doenças neurodegenerativas, incluindo doença de Alzheimer (DA), doença de 
Parkinson (DP), esclerose lateral amiotrófica (ELA), doença de Huntington (DH) e distúrbios 
relacionados a proteína do príon, coletivamente classificadas como doenças de proteínas mal-
enoveladas (HETZ; SAXENA, 2017b). Acredita-se que o acúmulo de proteínas mal 
enoveladas esteja envolvido na indução do estresse do RE, resultando em prejuízos na síntese 
proteica, disfunção neuronal e até morte celular. Em condições de estresse, as células 
respondem para evitar danos por meio da ativação de vias de resposta adaptativa conhecidas 
como resposta a proteínas mal enoveladas (UPR) (HETZ; CHEVET; HARDING, 2013; 
RON; WALTER, 2007; WALTER; RON, 2011). Evidências demonstram que a 
neuroinflamação altera a produção e o correto enovelamento das proteínas cerebrais, tornando 
a atividade de degradação proteassômica insuficiente. A falha desse sistema de degradação 
pode acabar alterando a expressão de genes responsáveis pela síntese de proteínas ligadas ao 
estresse do retículo endoplasmático (ER) (PINTADO et al., 2012, 2017). 
O RE é um evento de extrema relevância no contexto da (LI et al., 2013; 
REMONDELLI; RENNA, 2017, LOURENÇO et al., 2013). Acredita-se que o acúmulo de 
proteínas mal formadas esteja envolvido na indução do estresse do RE, resultando em 
disfunção neuronal e morte celular. Um estudo demonstrou aumento dos níveis de 
fosforilação de IRE1 (p-IRE1), p-PERK e p-eIF2α em neurônios de tecido cerebral post-
mortem de pacientes com DA, sugerindo a existência de ativação da UPR no hipocampo e no 
córtex temporal destes indivíduos. Os autores também observaram os neurônios que 
apresentam emaranhados neurofibrilares da proteína Tau fosforilada apresentam altos níveis 
de BiP e p-IRE1 (NIJHOLT et al., 2012). 
Estudos demonstram que o peptídeo β-amiloide (Aβ) esteja envolvido na ativação da 
UPR durante a patogênese da e que os fragmentos do Aβ possam ser gerados no ER das 
células neuronais (COOK et al., 1997). Embora não esteja claro como Aβ extracelulares 
sinalizam para o ER, foi demonstrado que o Aβ extracelular pode induzir a UPR (SUEN et 
al., 2003). Além disso, evidências demonstram que os três principais sensores de estresse do 
RE são ativados na DA e que eles são acionados pelo Aβ (LEE et al., 2010b). O RE 
também tem importante função no controle dos níveis de cálcio intracelular (MARCHI et 
al., 2018) e o aumento do estresse de RE resulta em uma liberação anormal de cálcio, que 
podem levar a disfunção mitocondrial e morte celular (PINTON et al., 2008). Neste sentido, 
26 
 
o acúmulo de peptídeos Aβ no cérebro dos portadores de DA pode desencadear o estresse 
do RE, e consequentemente a perturbação da homeostase do cálcio, e levando a célula à 
apoptose (KATAYAMA et al., 2004; NAKAGAWA et al., 2000). 
Alguns achados mostram que a ativação de eIF2α, dowstream na via da PERK, 
reverte o comprometimento da memória em um modelo animal da (MA et al., 2013) e 
diminui a neurotoxicidade da Aβ em células tratadas com o peptídeo (LEE et al., 2010a). 
Além disso, a análise de diferentes modelos de camundongos transgênicos revelou que nas 
fases iniciais da o metabolismo da XBP1 está aumentado (REINHARDT et al., 2014). Este 
aumento parece reverter a degeneração induzida por Aβ
 
in vivo (CASAS-TINTO et al., 
2011) e in vitro (KANEKO et al., 2010). Pesquisas recentes apontam que a superexpressão 
de XBP1 melhora o prejuízo de memória em modelo animal da. 
Apesar do acúmulo de evidências que demonstram um aumento no estresse de RE 
em doenças neurodegenerativas e amiloidoses, o papel do estresse de RE na progressão 
dessas doenças e na patogênese de Aβ ainda é amplamente desconhecido e controverso. Em 
conjunto, os achados da literatura demonstram a complexidade dos fenótipos induzidos pelo 
estresse do RE, e de como é diversificado seu efeito na patogenia amilóide, levantando a 
questão se o estresse de RE é benéfico ou não para as células quando instigadas pelo Aβ. 
A encefalopatia séptica apresenta algumas semelhanças com outras doenças 
neurodegenerativas, sendo que alguns achados neuropatológicos de pacientes com DA são 
também observados em sobreviventes da sepse. As principais características neuropatológicas 
da são a presença de placas senis extracelulares compostos de agregados fibrilares de Aβ e 
emaranhados neurofibrilares intracelulares, formadas principalmente pela hiperfosforilação da 
proteína Tau (LASAGNA-REEVES et al., 2012; LIU et al., 2013; SERRANO-POZO et al., 
2011). Nosso grupo descreveu recentemente que o hipocampo de animais sobreviventes de 
sepse apresenta aumento dos níveis da proteína tau (NEVES et al., 2018). Além disso, 
Gasparotto e colaboradores descreveram que o cérebro de animais submetidos ao modelo 
experimental de sepse apresentam, além de aumento fosforilação da proteína tau, um acúmulo 
do peptídeo Aβ, assim como acontece na DA (GASPAROTTO et al., 2018). 
Em relação à sepse é importante ressaltar que a produção abundante de citocinas, 
estado de hipóxia, produção de espécies reativas de oxigênio e influxo de cálcio comumente 
observados na doença, podem fomentar respostas como o estresse do RE e a UPR 
(KAUFMAN et al., 2002; MARCINIAK; RON, 2006; MARTINS et al., 2016). Esses 
27 
 
mecanismos são ativados com objetivo de proteger as células contra agentes estressores. Além 
disso, acredita-se que o estresse do RE esteja intrinsecamente envolvido no processo 
inflamatório atuando como um poderoso regulador das respostas das células imunes através 
de diferentes estímulos (GROOTJANS et al., 2016). Os sensores de estresse do RE presentes 
na membrana do retículo estão envolvidos com produção de citocinas inflamatórias e 
modulação do sistema imune, porém pouco se sabe sobre o papel de ramos individuais de 
UPR no destino e na função dos neurônios após a sepse ou na sua fase mais tardia. 
Considerando que já foi estabelecido que a UPR altera a função cognitiva (CORNEJO; 
HETZ, 2013; ZHU et al., 2017), hipotetizamos que o estresse do RE e a UPR poderiam estar 
de alguma forma envolvida com os mecanismos fisiopatológicos associados aos prejuízos de 
memória dos sobreviventes de sepse. Neste contexto, pretendemos investigara atuação das 
vias de sinalização da UPR e a presença do estresse do RE na encefalopatia pós-séptica. 
Também pretendemos avaliar se os animais sobreviventes de sepse são mais susceptíveis a 
neurotoxicidade induzida pelos oligômeros do peptídeo β-amilóide, principais neurotoxinas 
presentes no cérebro dos pacientes com DA, e se este fenômeno está relacionado com o 
estresse de RE. Neste sentido, o objetivo deste estudo é contribuir para o entendimento dos 
mecanismos fisiopatológicos envolvidos na encefalopatia pós-séptica e identificar novos alvos 
para prevenção e/ou tratamento para as sequelas cognitivas que acometem milhões de 
indivíduos no mundo. 
 
1.7. Justificativa 
A sepse representa um sério problema no sistema de saúde global e tem despertado 
atenção em todo o mundo por provocar um elevado número de mortes todos os anos 
(DEUTSCHMAN&TRACEY 2014; HOTCHKISS et al. 2016). Curiosamente, poucas 
informações sobre epidemiologia da sepse estão disponíveis na literatura, principalmente 
quando se trata de países em desenvolvimento (BALLESTER et al., 2008; IÑIGO et al., 
2006). Entretanto, é consenso que a incidência de sepse está aumentando, provavelmente em 
função do envelhecimento populacional, que resulta em uma população mais vulnerável 
acometida por diferentes comorbidades (ANGUS et al., 2001b), e embora alguns estudos 
demonstrem que houve aumento da incidência da doença, estes mesmos estudos descrevem 
que a taxa de casos fatais tem diminuído ao longo dos anos (DOMBROVSKIY et al., 2007b; 
LAGU et al., 2012; MARTIN et al., 2003a). Possivelmente, isto reflete o impacto da maior 
28 
 
conscientização, dos avanços em relação ao diagnóstico mais precoce e preciso, tratamentos 
imediatos com antimicrobianos adequados, e o controle metabólico mais eficaz (UNITS; 
BRAZIL, 2006). 
Apesar dos avanços da medicina intensiva terem reduzido significativamente a 
mortalidade dos pacientes acometidos pela sepse, os sobreviventes, muitas vezes, apresentam 
prejuízos neurológicos permanentes, mesmo após a completa recuperação clínica do paciente, 
resultando em diminuição da qualidade de vida e aumento da morbidade em longo prazo 
(CHECINSKI et al., 2010; IWASHYNA et al., 2010; SCHORR; DELLINGER, 2014; 
WINTERS et al., 2010). Estudos de acompanhamento em longo prazo demonstram que a 
maioria dos pacientes apresentam incapacidades físicas, psicológicas e cognitivas de longo 
prazo com implicações sociais e de cuidados de saúde significativos (ANGUS et al., 2001b; 
HEYLAND et al., 2000). Estudos neuropsicológicos associados com neuroimagem 
envolvendo pacientes sobreviventes de sepse demonstraram evidências de atrofia do 
hipocampo e disfunção cognitiva tardia, com alterações em atenção, fluência verbal, função 
executiva e memória verbal (SEMMLER et al., 2013). 
Nosso e outros grupos de pesquisa sugerem que os prejuízos cognitivos observados 
nos sobreviventes de sepse são clinicamente comparáveis com os prejuízos de memória dos 
pacientes com doença de Alzheimer (DA) em estágios iniciais, podendo-se sugerir que alguns 
mecanismos possam ser similares em ambas as demências. Existem evidências que os 
sobreviventes da sepse possam ser mais suscetíveis a doenças neurodegenerativas ao longo da 
vida, no entanto, isso não está bem estabelecido, e os mecanismos envolvidos nesse processo 
são desconhecidos. Vários estudos descrevem eventos que possam estar relacionados com 
doenças neurodegenerativas, entre eles, inflamação, acúmulo protéico no SNC, estresse do 
RE, UPR e ―priming” microglial. Buscaremos ao longo deste trabalho investigar a presença 
destes eventos no SNC de animais sobreviventes da sepse e avaliar a participação desses 
fenômenos no desenvolvimento do prejuízo cognitivo tardio possivelmente presente nesse 
modelo de sepse. 
 
 
 
 
29 
 
2. Objetivo Geral 
Investigar se o prejuízo cognitivo observado em animais sobreviventes de sepse está 
associado com a presença de estresse do retículo endoplasmático (RE) hipocampal ou 
ativação microglial. Também pretendemos avaliar se os animais sobreviventes à sepse são 
mais susceptíveis aos efeitos tóxicos dos oligômeros do peptídeo β- amilóide (AβOs) sobre a 
função cognitiva. 
 
2.1. Objetivos específicos 
 Investigar se o prejuízo cognitivo observado em animais sobreviventes de sepse (30 e 45 
dias após CLP) está associado com a ocorrência de estresse de retículo endoplasmático 
(RE) no hipocampo. 
 
 Avaliar se os animais sobreviventes de sepse com função cognitiva reestabelecida (45 
dias após CLP) são mais susceptíveis a desenvolver prejuízo cognitivo induzido pela 
administração de uma dose subtóxica de AβOs (1 pmol/sítio, icv). 
 
 Avaliar se os animais sobreviventes de sepse com função cognitiva reestabelecida (45 
dias após CLP) são mais susceptíveis a desenvolver estresse do RE hipocampal após 
administração de uma dose subtóxica de AβOs (1 pmol/sítio, icv). 
 
 Avaliar se os animais sobreviventes de sepse com função cognitiva reestabelecida (45 
dias após CLP) são mais susceptíveis à ativação microglial após a administração de uma 
dose subtóxica de AβOs (1 pmol/sítio, icv). 
 
 
 
 
 
 
 
 
30 
 
3.0. Metodologia 
3.1. Modelo animal 
Foram utilizados camundongos Swiss machos com idade entre 6 e 8 semanas, pesando 
entre 25 a 30 g, oriundos do Centro de Criação de Animais de Laboratório 
(CECAL/FIOCRUZ) ou do biotério do Laboratório de Neurociências da Faculdade de 
Farmácia da Universidade Federal do Rio de Janeiro (UFRJ). Os animais foram acomodados 
em grupos de cinco por gaiola, com ração e água fornecidos ad libitum e com ciclos de 
claro/escuro de 12 horas. Todos os procedimentos experimentais envolvendo animais foram 
realizados em conformidade e aprovados pela Comissão de Ética no Uso de Animais (CEUA) 
da UFRJ sob o número de protocolo 174/18. 
 A indução de sepse foi realizada pelo modelo de ligação e perfuração do ceco (CLP, 
do inglês cecal ligation and puncture) (BAKER et al., 1983; WICHTERMAN; BAUE; 
CHAUDRY, 1980), que consiste em inicialmente, anestesiar os camundongos, no qual foi 
utilizado Ketamina 100 mg/kg e Xilazina 20 mg/kg administrados por via intraperitoneal (IP). 
Após a realização de tricotomia na região abdominal e assepsia com álcool 75 %, os 
camundongos foram submetidos a uma laparotomia com incisão longitudinal de 
aproximadamente 1 cm na linha média abdominal para permitir a exposição do ceco. O ceco 
foi firmemente ligado com fio de seda 3,0 mm, na região abaixo da válvula ileocecal, 
perfurado, transpassado uma única vez com uma agulha estéril calibre 18 G e, logo após, foi 
levemente comprimido para extravasamento do conteúdo fecal. Em seguida, o ceco foi 
recolocado na cavidade peritoneal, a qual foi suturada com grampos pós-cirúrgicos 
(AUTOCLIP BD 9 mm) (Figura 6). Todos os animais foram devolvidos às suas gaiolas, com 
livre acesso a comida e água. Alguns animais (falso-operados ou sham) foram submetidos aos 
mesmos procedimentos cirúrgicos, contudo, o ceco não foi ligado, tampouco perfurado. Finda 
a cirurgia, os animais receberam hidratação (1mL de solução fisiológica subcutânea, 
imediatamente), para reposição de fluido (BENJAMIM et al., 2014) e antimicrobiano 
(Meropenem 10 mg/Kg, i.p., administrados 5, 24 e 48h após a cirurgia). Além da 
sobrevivência, foram observados os sinais clínicos de instalação de uma resposta inflamatória 
sistêmica como piloereção, tremores, prostração, atonia muscular e diminuição da 
movimentação. Esses sinais clínicos intensos foram facilmente identificados nos animais do 
grupo CLP, mas não nos do grupo sham. 
 
31 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Figura 6: Estágios da cirurgia CLP. (A e B) Animal anestesiado, tricotomizado e feita incisão. Em seguida, 
(C) o ceco é exposto, (D) amarrado, (E) perfurado por agulha hipodérmica e colocado de volta no abdômen (F) 
Incisão fechada com grampo. Fonte: adaptadode RITIRSCH et al., 2009. 
 
Após 45 dias, os animais foram subdivididos em 4 grupos: animais sham que 
receberam injeção intracerebroventricular (ICV) de veículo, animais sham que receberam 
injeção ICV de uma dose não tóxica de Aβ (1 pmol/sítio), animais CLP que receberam 
injeção ICV de veículo (PBS) e animais CLP que receberam injeção ICV de 1pmol de Aβ. 
Esses animais receberam a injeção ICV no 45º dia. No 46º dia foi realizado o teste de 
reconhecimento de objetos para avaliar a memória declarativa, no 47º dia teste de esquiva 
inibitória (Step-down inhibitory avoidance) para avaliar memória de medo e sacrifício dos 
animais no 48º dia para retirada do hipocampo para avaliação bioquímica. 
 
3.2. Oligômeros do peptídeo β-amilóide (AβOs) 
 Os AβOs foram gentilmente cedidos pelo prof. Dr. Sérgio Teixeira Ferreira 
(Laboratório de Doenças Neurodegenerativas, Universidade Federal do Rio de Janeiro - 
UFRJ, Brasil). Foram produzidos à partir do peptídeo sintético Aβ1-42 (American Peptide, 
EUA) conforme descrito anteriormente por LAMBERT et al., 1998 e mais recentemente por 
FIGUEIREDO et al., 2013. As preparações são rotineiramente validadas pelo mesmo 
laboratório por cromatografia líquida de alta eficiência de exclusão de tamanho e 
ocasionalmente por western-blot usando anticorpos específicos para oligômeros de β-
amilóide. 
 
32 
 
3.3. Injeção intracerebroventricular (ICV) 
A injeção ICV se iniciou com animais sendo anestesiados usando um sistema de 
vaporização com fornecimento de oxigênio constante e 2,5% de Isoflurano (Cristália, Brasil) 
no interior de uma caixa de acrílico retangular. Uma vez anestesiados, os animais foram 
imobilizados e tiveram sua pele da cabeça gentilmente esticada na direção posterior. As 
injeções foram realizadas cerca de 1 mm lateralmente do ponto equidistante dos dois olhos e 
cerca de 0,1 mm posterior da linha imaginária desenhada do ponto mais posterior dos olhos 
(Figura 3). Foram utilizadas agulhas gengivais 30 G cortadas com 3 mm de comprimento 
acopladas a uma seringa Hamilton de 10 µl. As injeções foram realizadas por um pesquisador 
treinado que obteve mais de 85% de sucesso em treinamento feito com corante azul nos 
mesmos locais alvo das injeções deste experimento a fim de averiguar a acurácia das mesmas 
no ventrículo lateral. Cada animal recebeu 3 µl de solução de acordo com o protocolo 
utilizado. 
 
Figura 7: Esquema do sítio de injeção utilizado na injeção ICV (GLASCOCK et al., 2011). 
 
3.4. Experimentos comportamentais 
 Utilizamos dois desenhos experimentais nesse estudo (Figura 8). No primeiro, um 
grupo de animais foi submetido ao modelo de CLP para indução da sepse, e após 30 dias os 
camundongos sobreviventes foram submetidos a testes comportamentais. Em seguida as 
estruturas cerebrais desses animais foram coletadas e armazenadas a -80 
o
C para posterior 
análise. Outro grupo de animais foi submetido ao modelo CLP de sepse e 45 dias depois foi 
feita uma injeção ICV de uma quantidade subtóxica de oligômeros de AβOs (1 pmol) nos 
33 
 
sobreviventes da sepse e somente depois foram submetidos aos testes comportamentais. As 
estruturas cerebrais desse grupo também foram coletadas para análise. 
 Importante destacar que esse tempo foi escolhido porque dados anteriores do nosso 
grupo de pesquisa, que também utilizou o modelo animal CLP para investigar os danos 
neurocognitivos causado pela sepse, mostraram alterações comportamentais e neurológicas 
nos animais sobreviventes 30 dias após a cirurgia. Esses animais foram avaliados 45 dias 
depois e nenhuma alteração foi detectada, sugerindo total recuperação. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Figura 8: Desenho experimental (A e B). Em (A) Camundongos swiss adultos machos foram submetidos à 
cirurgia e CLP para indução da sepse. Após 30 dias, os animais sobreviventes passaram por uma bateria de testes 
comportamentais para avaliar possíveis prejuízos neurocognitivos. No dia seguinte foi realizada a coleta das 
estruturas cerebrais para posterior análise. (B) Camundongos swiss adultos machos foram submetidos à cirurgia 
de CLP para indução da sepse. Após 45 dias, os animais sobreviventes receberam uma injeção ICV de uma dose 
subtóxica de oligômeros de AβOs (1 pmol) e 24 horas depois os animais foram submetidos aos testes 
comportamentais. 
 
 
3.4.1. Campo aberto 
A avaliação da atividade motora dos animais foi realizada através do teste do campo 
aberto. O aparato do campo aberto (CA) consiste em uma caixa medindo 50 cm x 50 cm x 39 
cm de madeira e com um chão de cor preta (Figura 9) colocada numa sala com baixa 
luminosidade e isolada acusticamente. 
Animais foram previamente ambientados durante 1h na sala de experimentação. 
Durante o experimento, cada animal foi colocado no centro da arena e deixou-se que este 
34 
 
explorasse livremente, enquanto registrava o seu comportamento durante cinco minutos. Após 
cada sessão, a arena foi limpa com uma solução de etanol 70%, para minimizar as pistas de 
odor deixadas pelo animal anterior. Os parâmetros comportamentais analisados foram: o 
número de cruzamentos (quando o animal cruza com as quatro patas um dos quadrantes da 
arena) o tempo que o animal permanece no centro do aparato e a distância percorrida. Esses 
parâmetros avaliam o comportamento tipo ansioso e a atividade locomotora dos animais. 
 
 
Figura 9: Aparato do campo aberto. Consiste em uma caixa de fundo 
preto. Em cada sessão experimental, são avaliados o tempo que os animais 
permanecem no centro (área vermelha) e a distância percorrida. Esses 
parâmetros são utilizados como medida do comportamento tipo ansioso e 
das atividades locomotora dos animais, respectivamente. 
 
 
 
3.4.2. Reconhecimento de objetos 
 Quando roedores são apresentados a objetos familiares e novos, eles despendem um 
tempo maior para explorar o objeto novo. Este comportamento típico tem sido utilizado no 
desenho de um paradigma comportamental conhecido como tarefa de reconhecimento de 
objetos (RO) o qual vem sendo amplamente utilizado para avaliar os mecanismos envolvidos 
na formação de memórias declarativas (MOSES; COLE; RYAN, 2005). Para realização deste 
experimento, os animais foram deixados na sala de experimentação em suas gaiolas para 
ambientação sob luz indireta antes de iniciar propriamente o teste. Em seguida, 
individualmente colocados em um aparato de campo aberto contendo 2 objetos (padronizados 
anteriormente) diferentes (A e B) sendo-lhes permitido explorá-los livremente durante 5 min e 
sendo gravadas todas as sessões pelo software ANY-Maze (Stoelting CO., IL USA) para 
contabilização ao final do teste para que a presença do experimentador e possíveis ruídos não 
interferissem no comportamento dos animais e mascarassem os resultados. A sessão de teste 
foi realizada entre 1 e 3h após a sessão de treino. Durante o teste, os animais foram 
reintroduzidos individualmente no aparato de campo aberto e mantidos por 5 min, sendo que 
um dos objetos apresentados durante o treino foi aleatoriamente substituído por um objeto 
novo (B será substituído por C). O tempo gasto explorando cada objeto foi medido por um 
observador e expresso como percentagem do tempo total de exploração findado o teste. Para 
35 
 
determinação de possíveis alterações na função motora, a exploração e o ato de levantar sobre 
as duas patas dianteiras, executados pelos animais durante a fase de habituação foi 
quantificado (Figura 10). 
 
 
 
 
 
 
 
Figura 10: Teste de reconhecimento de objetos. São ilustradas as sessões de habituação, treino e teste, com os 
objetos utilizados em cada etapa. 
 
3.4.3. Suspensão Pela Cauda 
O teste de suspensão pela cauda tem como objetivo avaliar o comportamento tipo 
depressivo dos camundongos (CRYAN; MOMBEREAU;VASSOUT, 2005). Neste teste, os 
camundongos são suspensos pela cauda com fita adesiva, e presos no aparato, de forma que 
não possam escapar e nem se segurar nas superfícies próximas. O aparato é posicionado a 
aproximadamente 1 metro de altura do chão. Durante o teste com duração de 6 minutos, os 
animais saudáveis tentam escapar da situação, enquanto os animais com comportamento tipo 
depressivo apresentam um tempo maior de imobilidade. O tempo de imobilidade de cada 
animal é calculado e usado como parâmetro de avaliação. Após o teste, os animais são 
devolvidos às suas respectivas gaiolas (Figura 11). 
 
 
 
 
 
Figura 11: Esquema ilustrativo do teste Suspensão pela Cauda. 
 
 
36 
 
3.5. Análise de expressão gênica por reação de transcrição reversa, seguida de reação 
da polimerase em cadeia (RT-PCR) 
 
3.5.1. Preparo das amostras de hipocampo 
Os animais foram anestesiados e eutanasiados por deslocamento da cervical com 
posterior retirada do cérebro e coleta do hipocampo, que foi imediatamente colocado em 
microtubos de 2 mL e armazenado a -80°C para melhor conservação do conteúdo de mRNA. 
 
3.5.2. Extração de RNA total do tecido e quantificação 
O isolamento do RNA total do tecido foi feito utilizando-se o método básico 
recomendado de extração de RNA usando TRIzol (Invitrogen Life Technologies) e 
homogeneização do tecido com um pistão. Cada 100 mg de tecido macerado recebe 1 mL de 
reagente TRIzol e é acrescido de 250 µL de clorofórmio, sendo então transferido para 
microtubo, e agitado vigorosamente. Após 5 min de incubação a temperatura ambiente para 
permitir a completa dissociação dos complexos de nucleoproteínas, a solução foi centrifugada 
por 12.000 x g durante 15 min a 4°C. A fase aquosa (até 60% do volume original de TRIzol) 
foi então transferida novamente para um microtubo limpo contendo isopropanol (0,5 mL de 
Isopropanol por mL de TRIzol usado), incubada por 10 min a temperatura ambiente e 
precipitada por centrifugação (12.000 x g, 30 min a 4 °C). O pellet foi lavado 3 vezes com 
500 µL de etanol 75%, e seco a 37 °C por 10 min. O preparo foi então ressuspendido em 10 
µL de água livre de RNAse. O RNA total foi quantificado no Nanodrop (ND-
1000Spectrophotometer). 
 
3.5.3. Síntese do DNA complementar 
Realizou-se a síntese do DNA complementar a partir de 1 µg de RNA total. Após um 
passo inicial de incubação com a DNAse I, para eliminação de possível DNAcontaminante, 
seguiu-se exatamente a especificação do fabricante da enzima utilizada (Superscrypt III – 
Invitrogen). 
 
 
37 
 
3.5.4. RT-PCR 
A expressão de genes de interesse foi analisada por PCR em um sistema de RT-PCR 
utilizando o kit SYBR (Applied Biosystems). Actina foi utilizado como controle endógeno. 
Os primers para amplificação dos alvos utilizados nas reações de PCR foram sintetizados pela 
Invitrogen: para ATF4, forward: 5’-GCCGGTTTAAGTTGTGTGCT-3’, reverse: 5’-
CTGGATTCGAGGAATGTGCT-3’; CHOP, forward: 5’-
CGGAACCTGAGGAGAGAGTG-3’, reverse: 5’-CGTTTCCTGGGGATGAGATA-3’;
 XBP1s, forward: 5′-GAGTCCGCAGCAGGTG-3′, reverse: 5′-
GTGTCAGAGTCCATGGGA-3′; TNF-α, forward: 5’-CTGAACTTCGGGGTGATCG-
3’, reverse: 5’-GCTTGGTGGTTTGCTACGAC-3’. Os valores limites de ciclo (Ct) foram 
utilizados para calcular as mudanças na expressão de gene utilizando o método 2
-ΔCt
. Em 
todos os casos, os volumes de reação foram de 15 µL. 
 
3.6. Análise Imuno-histoquímica do tecido cerebral 
 Camundongos swiss machos adultos (3 meses de idade; n = 3-6) foram utilizados 
neste estudo. Todos os procedimentos foram aprovados pelo Comitê de ética no Uso de 
Animais. Após os testes comportamentais os camundongos foram anestesiados com uma 
solução contendo cetamina e xilazina (0,1 mg / g, intraperitoneal) e perfundidos por via intra-
cardial com 4% de paraformaldeído (PFA) e PBS 0,1 M, pH 7,4, 50 mL por animal. Os 
cérebros foram removidos, pós-fixados durante a noite por imersão na solução de PFA a 4 ° C 
e transferidos para álcool 70% 24 horas depois. Em seguida os cérebros foram enviados para 
serem cortados e processados. As lâminas contendo os cortes histológicos foram 
confeccionadas a partir de blocos de parafina. Antes da marcação imuno-histoquímica, os 
cortes foram desparafinados e diafanizados, e em seguida submetidos à recuperação de 
antígeno onde ficaram submersos em banho-maria por 40 minutos em temperatura constante 
de 95-98ºC no tampão citrato 0,01M pH 6,0. Os cortes foram então incubados na solução 
bloqueio A do kit de polímeros de imuno-peroxidade (N-Histafine Mouse Stain Kit,) por 60 
minutos. Depois foram lavados em PBS e incubados com anticorpo primário com anti-IBA1 
de coelho policlonal (1:500, WAKO Chemicals USA, Inc., Richmond, VA, EUA) por 24 
horas. Em seguida os cortes foram lavados com PBS e incubados com reagente bloqueio B do 
kit de polímeros de imuno-peroxidase. A marcação foi revelada com solução cromógena 
38 
 
composta por 60 mg de DAB dissolvido em 2 ml de DMSO e diluído em 100 ml de PBS mais 
60 ul de peróxido de hidrogênio e em seguidas contra-coradas com hematoxilina. 
 
3.7. Análise morfométrica da Microglia 
 Para analisar a reatividade microglial nesse trabalho, utilizamos o método 
morfométrico baseado no medida do diâmetro de Feret máximo-mínimo (feret máx-min) nas 
células imunorreativas para IBA1, um marcador de microglia Feret é definido como a 
distância entre duas linhas paralelas desenhadas tangencialmente ao corpo da célula. O Feret 
mínimo é a linha mais curta desenhado no corpo da célula e o Feret máximo é a mais longa, 
como mostrado nas linhas azul e púrpura, respectivamente, na Figura 12A. Em um corpo 
celular esférico (microglia em repouso), a diferença entre os ferets máx-min tende a zero, em 
contrapartida, a microglia reativa exibe um corpo celular de área maior e de redondeza 
diminuída, refletido por uma diferença significativamente maior entre os ferets máx-min 
(Figura 12B e C) (TORRES-PLATAS et al., 2014). 
 
Figura 12: (A) imagem representativa do método de Feret min-máx, (B) imagem de célula microglial 
em repouso exibindo um pequeno corpo celular circular e (C) imagem de uma célula microglial 
reativada  exibindo um corpo celular amebóide com alguns processos ramificados. (Imagem adaptada 
de TORRES-PLATAS et al., 2014). 
 
3.8. Análise estatística dos dados 
Todas as análises estatísticas foram realizadas com o programa GraphPadPrism v. 6 e 
utilizaram como níveis de significância 5%. Nos experimentos de reconhecimento de objetos, 
foi utilizado o teste-t contra o valor teórico de 50% (one-sample t-test). Para todos os demais, 
foi utilizado análise de variância (ANOVA) de uma via e teste pos-hoc de Holm-Sidak. 
 
39 
 
4. Resultados 
 
4.1. Caracterização do modelo animal de sepse através da ligação e perfuração do ceco 
(CLP). 
De acordo com estudos epidemiológicos, a mortalidade na sepse varia entre 20 e 50% 
(DELLINGER et al., 2004; FLEISCHMANN et al., 2016). Nossos resultados demonstram o 
potencial translacional do modelo de CLP, visto que o grupo controle (Sham) apresentou 
100% de sobrevivência, e o grupo submetido à CLP apresentou aproximadamente 30% de 
mortalidade nos primeiros sete dias após o procedimento (Figura 13), sendo que após sete dias 
não foi observada mortalidade. 
 
Figura 13: Mortalidade dos animais submetidos ao modelo de ligação e perfuração do ceco (CLP). Os grupos 
falso-operado e CLP (Sham) apresentaram 100% e 34% de sobrevivência, respectivamente, depois de 7 dias de 
avaliação. *P=0.002 Log-Rank (Mantel-Cox) test, n=87 animais, sendo 29 do grupo Sham e 58 do grupo CLP. 
 
4.2. Avaliação cognitiva dos animais sobreviventes de sepse 
Estudos prévios de nosso grupo demonstraram que os animais sobreviventes de sepse 
apresentam prejuízo locomotor nos dias iniciais após a CLP, o que impossibilita a realização 
de tarefas