CCS-M-AntonioPalumboJunior

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Estudo in vitro do papel do estroma reativo na 
atividade das células tumorais prostáticas LNCaP 
 
 
 
 
Antonio Palumbo Júnior 
 
 
 
 
 Dissertação de Mestrado apresentada ao Programa de Pós-graduação em 
Ciências Morfológicas da Universidade Federal do Rio de Janeiro. 
 
 
 
ORIENTADORES: 
Prof. Luiz Eurico Nasciutti 
Profa. Etel Gimba 
 
 
 
 
 
Março, 2011 
 
 
 
 
 
 ii
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Antonio Palumbo Júnior 
 
Estudo in vitro do papel do estroma reativo na atividade das 
células tumorais prostáticas LNCaP 
 
Dissertação de Mestrado apresentada ao Programa de Pós-
graduação em Ciências Morfológicas da Universidade 
Federal do Rio de Janeiro, como pré-requisito para obtenção 
do título de Mestre em Ciências Morfológicas. 
 
Orientadores: 
 
 Luiz Eurico Nasciutti 
 Etel Gimba 
 
 
Rio de Janeiro, 
 2011 
 
 
 iii
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Ficha Catalográfica 
 
 
Júnior, Antonio Palumbo 
 
 Estudo in vitro do papel do estroma reativo na atividade das células 
tumorais prostáticas LNCaP / Antonio Palumbo júnior. – Rio de Janeiro: 
UFRJ / ICB, 2011. 
 
81f. 
 
 
Dissertação de Mestrado em Ciências Morfológicas – Universidade 
Federal do Rio de Janeiro, Programa de Pós - Graduação em Ciências 
Morfológicas, Rio de Janeiro, 2011. 
 
 
Orientadores: Luiz Eurico Nasciutti 
 Etel Gimba 
 
 
1. Próstata. 2. Câncer. 3. Interação Epitélio-Estroma. 4. 
Ciências Morfológicas - Tese. 
 
 
I. Nasciutti, Luiz Eurico. II. Gimba, Etel. III. Programa de 
Pós-Graduação em Ciências Morfológicas, Universidade federal do Rio de 
janeiro. 
 
 iv
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Estudo in vitro do papel do estroma reativo na atividade das 
células tumorais prostáticas LNCaP. 
 
Dissertação de Mestrado apresentada ao Programa de Pós-
graduação em Ciências Morfológicas da Universidade 
Federal do Rio de Janeiro, como pré-requisito para obtenção 
do título de Mestre em Ciências Morfológicas. 
 
 
Antonio Palumbo Júnior 
 
Aprovada em 
 
Profa. Dr. Helena Lobo Borges - UFRJ 
 
Prof. Dr. Róbson de Queiroz Monteiro - UFRJ 
 
Prof. Dr. Luiz Felipe Ribeiro Pinto - INCA 
 
 v
Agradecimentos: 
 
 
• A minha família Márcia, Beto e Noã, sem a qual este trabalho não seria 
possível, sem a qual a minha graduação não seria possível, sem a qual a 
minha educação não seria possível, sem à qual muito pouco ou quase nada 
seria possível. Realmente ainda não sei aonde posso e quero chegar, mas seja 
aonde for e quando for, saberei que foi graças a vocês. 
 
 
• Ao meu querido pai Antonio Palumbo, pelos exemplos de honestidade, retidão 
de caráter e seriedade. 
 
 
• Ao Prof. Luiz Eurico Nasciutti, pela liberdade de pensamento, pelo apoio 
incondicional, pelas broncas, pela paciência com as brincadeiras (quase 
sempre fora de hora) e pelos conselhos científicos ou mundanos, que mais do 
que essenciais para a realização deste trabalho, contribuem de maneira 
fundamental para a formação de meu caráter. 
 
• A minha família paulista: tia Luiza, Fernanda, Walquíria, Antonio Carlos, Ki, 
Glauce e Muriel. Muito obrigado pelo carinho e pela força sempre que precisei. 
 
• A Dra. Etel Gimba, pela competente orientação e pelos proveitosos 
questionamentos e sugestões durante o desenrolar deste trabalho, além da 
impecável revisão da dissertação. 
 
 
• Ao Prof. Leandro Miranda Alves, minha eterna gratidão por me abrigar 
inicialmente no laboratório de Interações Celulares e pelas orientações teóricas 
e práticas. 
 
 
• Ao grande amigo Prof. Daniel Escorsim Machado que além da amizade a 
mim dispensada é um grande exemplo de como o pragmatismo e a 
malemolência podem conviver em harmonia dentro da pesquisa e do ensino. 
 
 
• Ao Dr. Pedro Augusto Reis, pelas amostras cirúrgicas que possibilitaram a 
realização deste trabalho, pelas conversas enriquecedoras e altamente 
divertidas ao final das tardes de terça e sexta, pelo exemplo de como encarar a 
vida de maneira descontraída e quase irresponsável e pela inestimável ajuda 
no início de minha graduação, que julgo hoje como fundamental pela 
manutenção de minha escolha profissional. 
 
 
• Ao amigo Rômulo pela amizade, pela paciência e pelo seu bom caráter 
contagiante. 
 
 
 vi
• Aos amigos Leonardo e Juliana pelas horas de descontração dentro e fora do 
laboratório e pela ajuda sempre que necessário. 
• A Célia Palmero pelos muitos ensinamentos inerentes a nossa profissão e 
pela companhia sempre agradável. 
 
 
• A Eliane Gouvêa, pela ajuda prática na realização dos experimentos e pelo 
estímulo a atualização teórica. 
 
 
• Aos companheiros do laboratório de Interações Celulares: Natália, Flávia, 
Paula, Laína, Prof. Luiz Cláudio e Maria Aparecida, eu agradeço pelo 
prazeroso dia-dia e pela convivência. 
 
 
• Aos companheiros de PCM: Bruno, Klauss, Adelzon e Maria Alice. 
 
 
• Ao Prof. Felipe Leite de Oliveira, pelos ensinamentos e ensaios em citometria 
de fluxo, pelas tardes no “china” e pelos exemplos de simplicidade, humildade 
e competência. 
 
 
• A Profa. Márcia Cury El-Cheikh, pelas divertidas caronas para o outro lado da 
ponte, pelas conversas e conselhos de alto nível cultural e pela interessante 
visão política “ـــ�� ـــ� او����� 
 .”اداة
 
 
• A Luciana Bueno (INCA), pela simpatia e paciência ao me enviar protocolos e 
linhagens sempre que necessitei. 
 
 
• Aos amigos Luiz Cláudio “Dom” e Fernanda, pelo apoio, pela torcida e pela 
presença sempre positiva. 
 
• Ao laboratório de pinça óptica e em especial ao Prof. Nathan Bessa e ao 
Doutorando Bruno Pontes pelo auxílio nos ensaios de migração celular e na 
análise dos resultados. 
 
• A todos aqueles que passaram por minha vida e hoje talvez não saibam da 
importância ou sequer da existência deste momento, sei que não passaram à 
toa e apesar de não terem ficado, tenho certeza que as marcas e as lições 
destes encontros estão impressos nas entrelinhas deste trabalho. 
 
 
 
 
 
 
 
 vii
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
“Por educação eu perdi minha vida.” 
 
 Arthur Rimbaud 
 viii
SUMÁRIO 
Sumário: .............................................................................................................. Viii 
Resumo: ................................................................................................................. X 
Abstract: ................................................................................................................ Xi 
Lista de Ilustrações: ............................................................................................ Xii 
Lista de Abreviaturas: ........................................................................................ XiV 
 
 
 
1) Introdução: .................................... .................................................................... 2 
1.1) Morfologia das próstata: ................................................................................... 3 
1.2) Fisiologia da próstata: ...................................................................................... 7 
1.3 – Câncer de Próstata: ..................................................................................... 14 
1.4 – Estroma Reativo: .......................................................................................... 18 
2) Objetivos: ..................................... .................................................................... 23 
- Geral: .................................................................................................................. 23 
- Objetivos específicos: .........................................................................................23 
3) Metodologia: ................................... ................................................................. 24 
3.1 Obtençaõe caracterização da linhagem estromal: .......................................... 24 
3.2 Cultivo da linhagem LNCaP: ........................................................................... 25 
3.3 Co-cultura das células LNCaP com as células estromais: .............................. 26 
3.4 Cultivo de células LNCaP com meio condicionado das células estromais: .... 27 
3.5 Cultivo de células LNCaP sobre a matriz extracelular secretada pelas 
células estromais: .................................................................................................. 27 
3.6 Análise da morfologia das células LNCaP:...................................................... 28 
3.7 Ensaio de proliferação celular: ........................................................................ 28 
 ix
3.8 Avaliação do ciclo celular: ............................................................................... 30 
3.9 Ensaio de apoptose: ........................................................................................ 30 
3.10 Ensaio de migração celular: .......................................................................... 31 
3.11 Análise Estatística: ........................................................................................ 33 
 
 
 
4) Resultados: .................................... .................................................................. 34 
4.1 Caracterização do estroma reativo: ................................................................. 34 
4.2 Influência do estroma reativo sobre a morfologia das células LNCaP: ........... 36 
4.3 Os fatores solúveis e a matriz extracelular secretados pelo estroma 
reativo induzem a proliferação das células tumorais LNCaP: ............................... 38 
4.4 As interações célula/célula e célula/matriz extracelular modulam a 
sobrevivência das células tumorais LNCaP: ......................................................... 43 
4.5 A motilidade das células LNCaP é modulada de diferentes maneiras pelo 
estroma reativo: ..................................................................................................... 45 
4.6 A matriz extracelular secretada pelo estroma reativo induz a proliferação 
das células tumorais LNCaP independentemente do tecido de origem: ............... 47 
4.7 A matriz extracelular secretada pelo estroma reativo é rica em 
componentes fibrosos e glicoproteínas de adesão: .............................................. 49 
5) Discussão: ..................................... .................................................................. 51 
 
6) Conclusões: .................................... ................................................................. 64 
 
7) Considerações Finais: .......................... .......................................................... 65 
 
8) Perspectivas: .................................. ................................................................. 66 
 
9) Referências Bibliográficas: .................... ........................................................ 67 
 
 
 x
 Resumo 
Júnior, Antonio Palumbo. Estudo in vitro do papel do estroma reativo na 
atividade das células tumorais prostáticas LNCaP. Rio de Janeiro, 2011. 
Dissertação de Mestrado – Programa de Pós-Graduação em ciências 
Morfológicas, Universidade Federal do Rio de Janeiro, Rio de Janeiro, 2011. 
Alterações no microambiente tumoral são eventos comuns em muitos tipos 
de câncer. Neste estudo, avaliamos o papel in vitro do estroma reativo na 
progressão do câncer de próstata. Para tal, foi isolada uma população de 
células estromais derivadas de hiperplasia prostática benigna e então avaliou-
se a influência do contato célula - célula, célula - fatores solúveis e célula-
matriz extracelular sobre a atividade tumoral das células LNCaP. Nossos 
resultados demonstraram respostas distintas mediadas pelas diferentes 
interações avaliadas neste trabalho. Ao passo que tanto as células estromais 
ou o meio condicionado produzido por estas, modularam apenas parcialmente 
os eventos relacionados com a progressão tumoral, como a proliferação ou a 
sobrevivência das células LNCaP, a matriz extracelular secretada pelas células 
estromais demonstrou-se capaz de modular positivamente além da proliferação 
e sobrevivência, também a migração das células LNCaP. Além disso, as 
células LNCaP tiveram sua morfologia característica preservada, somente 
quando cultivadas sobre a matriz extracelular. Desta maneira, podemos 
concluir que a matriz extracelular secretada pelo estroma reativo aumenta de 
maneira significativa o fenótipo maligno das células LNCaP, através da 
modulação de eventos, que contribuem para a progressão tumoral destas 
células in vitro. 
 xi
Abstract 
Júnior, Antonio Palumbo. Estudo in vitro do papel do estroma reativo na 
atividade das células tumorais prostáticas LNCaP. Rio de Janeiro, 2011. 
Dissertação de Mestrado – Programa de Pós-Graduação em ciências 
Morfológicas, Universidade Federal do Rio de Janeiro, Rio de Janeiro, 2011. 
Changes in the tumor microenvironment are a common feature of many 
cancers. Here we evaluated the in vitro role of reactive stroma in prostate 
cancer progression. For this purpose, it was isolated a population of reactive 
stromal cells derived from Benign Prostatic Hyperplasia, and using co-culture 
assays, it was analyzed the influence of cell-cell, cell-soluble factors and cell-
extracellular matrix interactions over the LNCaP prostate tumor cells. Our 
results showed distinct responses mediated by the distinct interactions: while 
stromal cells or their conditioned medium partially modulated events related to 
in vitro LNCaP cells survival or proliferation, the extracellular matrix increased 
all tumor progression marks. LNCaP cells cultured over the extracellular matrix 
secreted by prostate reactive stromal cells preserved their characteristic 
morphology, presented an induction of proliferation and migration and an 
inhibition of apoptosis. In summary, we conclude that extracellular matrix 
secreted by the reactive stroma significantly increases the malignant phenotype 
of LNCaP cells through modulation of events that contribute to in vitro tumor 
progression of these cells. 
 
 
 
 
 
 
 xii
Lista de Figuras: 
 
 
 
Figura 1 : Localização anatômica da próstata. Página 4. 
 
Figura 2: Esquema da divisão anatômica das zonas prostáticas. Página 5. 
 
Figura 3: Organização das glândulas prostáticas. Página 6. 
 
Figura 4: Histologia da próstata. Página 7. 
 
Figura 5: Esquema simplificado da interação entre o epitélio e o estroma na 
próstata. Página 13. 
 
Figura 6: Caracterização da linhagem estromal. Página 35. 
 
Figura 7: Morfologia das células LNCaP após distintas condições de cultivo. 
Página 37. 
 
Figura 8: Modelo esquemático de co-cultivo celular. Página 39. 
 
Figura 9: Separação celular por citometria de fluxo. Página 40. 
 
Figura 10: Análise da proliferação das células LNCaP através da incorporação 
de cristal violeta. Página 41. 
 xiii
Figura 11: Avaliação do ciclo celular das células LNCaP após cultivo sobre a 
MEC. Página 42. 
 
Figura 12: Avaliação da Apoptose por citometria de fluxo através da marcação 
para Anexina V. Página 44. 
 
 
Figura 13: Análise da migração celular por videomicroscopia. Página 46. 
 
 
 
Figura 14: Análise da proliferação das células LNCaP após cultivo sobre a 
MEC de três diferentes pacientes. Página 48. 
 
 
 
Figura 15: Identificação imunocitoquímica de elementos de MEC. Página 50. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 xiv
Lista de Abreviações: 
 
 
 
bFGF - fator de crescimento de fibroblastos básico 
 
BSS - solução salina balanceada 
 
CA - câncer 
 
CAF - fibroblastos associados aocâncer 
 
CaP - câncer de próstata 
 
CAPB - cancer, prostate and brain / câncer, próstata e cérebro 
 
CTGF - fator de crescimento de tecido conectivo 
 
DAPi - diamidino phenylindole dihydrochloride 
 
DHT - di-hidrotestosterona 
 
DMEM - dulbbecos modified eagles médium 
 
EGF - fator de crescimento epidermal 
 
FAK - kinase de adesão focal 
 
FGF - fator de crescimento de fibroblastos 
 
HPB - hiperplasia prostática benigna 
 
HPC - hereditary prostate câncer / câncer de próstata hereditário 
 
IGF - fator de crescimento semelhante a insulina 
 
KGF - fator de crescimento de queratinócitos 
 
MC - meio condicionado 
 
MEC - matriz extracelular 
 
MMP - metaloproteinase 
 
PBS - tampão fosfato salino 
 
PCAP - predisposing for prostate câncer / predisposição ao câncer de próstata 
 
PDGF - fator de crescimento derivado das plaquetas 
 
 xv
PIN - neoplasia intra epithelial 
 
PMSF - fluoreto do phenylmethanesulphonylfluoride 
 
PSA - antígeno prostático específico 
 
RA - receptor androgênico 
 
Rb - retinoblastoma 
 
SDF - fator de crescimento derivado do estroma 
 
SFB - soro fetal bovino 
 
TGF-β - fator de crescimento transformante beta 
 
VEGF - fator de crescimento endotelial vascular 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 1
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 2
1. Introdução 
 
 As glândulas acessórias do sistema reprodutor masculino de uma 
maneira geral requerem o pleno funcionamento testicular para o seu 
desenvolvimento, crescimento e secreção. Neste ambiente onde impera o 
estímulo androgênico mediado primariamente pela testosterona, produzida em 
sua maior parte pelo testículo, a próstata, as vesículas seminais e as glândulas 
bulbouretrais, formam um conjunto de glândulas acessórias que desempenham 
um destacado, mas ainda não totalmente compreendido, papel na reprodução. 
Estas glândulas apresentam diferenças evolutivas marcantes entre as 
espécies, quanto a sua anatomia, biologia, e fisiologia. A próstata 
especificamente é encontrada em todos os mamíferos, mas apresenta 
diferenças consideráveis quanto a sua bioquímica, anatomia e principalmente 
quanto à patologia. Um exemplo importante desta diferença reside em uma 
doença extremamente comum a homens e cães, a Hiperplasia Prostática 
Benigna (HPB), mas que se encontra ausente entre os demais mamíferos. A 
próstata também é acometida por um processo inflamatório recorrente em 
homens, denominado prostatite e também é o tecido de origem do segundo 
tipo de câncer mais comum entre a população masculina. Uma questão 
intrigante quanto ao alto índice de patologias prostáticas, encontra-se no fato 
de que as demais glândulas acessórias raramente apresentam alterações em 
sua fisiologia relacionadas com qualquer tipo de processo patológico. Assim 
como a fisiologia da próstata ainda não foi totalmente elucidada, os 
mecanismos que levam esta glândula a se tornar alvo de diferentes e 
constantes doenças, também estão longe de serem esclarecidos. Uma 
 3
distinção marcante entre a próstata e as demais glândulas acessórias é que 
esta não tem seu desenvolvimento e função controlados pela testosterona 
diretamente, mas sim pela di-hidrotestosterona (DHT), um metabólito resultante 
da conversão da testosterona pela enzima 5α-redutase e que possui uma 
afinidade pelo receptor androgênico (RA), pelo menos cinco vezes maior que a 
própria testosterona. Diferenças acerca da embriogênese prostática somam-se 
ao destacado papel do estímulo androgênico e ambos consistem no pilar 
básico para diversas explanações com base científica ou não, que tentam 
entender e responder o porquê deste órgão não vital, ser tão propício ao 
desenvolvimento de diversas patologias, que atualmente são responsáveis por 
grande parte da morbidade masculina no mundo (Walsh, 2003). 
 
 1.1 Morfologia da próstata 
 
 Em humanos, a embriogênese prostática se inicia no terceiro mês do 
desenvolvimento fetal, no seio urogenital e é controlada pela DHT. Ao contrário 
de outras estruturas do aparelho reprodutor masculino, como a vesícula 
seminal e o epidídimo, a próstata não deriva dos ductos de Wolff. O tecido 
epitelial encontrado na parte posterior do seio urogenital se organiza e migra 
em direção aos dois lados do verum montanum, antes de invadir o 
mesênquima adjacente para formar a próstata. Parte do tecido epitelial que 
forma a zona prostática mais interna aparentemente deriva do mesoderma, 
enquanto a parte que irá formar a porção mais externa da próstata, 
aparentemente deriva do endoderma. Estas diferenças no desenvolvimento da 
próstata parecem ir muito além do já complexo processo de embriogênese 
 4
deste órgão e podem em uma segunda instância, estarem relacionadas com 
uma patogênese intrínseca da próstata. Esta hipótese consiste no fato de a 
zona interna da próstata ser o local exclusivo de origem da HPB, enquanto que 
a zona externa é local onde mais de 90% dos casos de câncer de próstata 
(CaP) se originam (Walsh, 2003). 
 A próstata pesa aproximadamente entre 15 e 20 gramas e é a maior 
glândula acessória do sistema reprodutor masculino, sendo anatomicamente 
localizada logo abaixo da bexiga (Figura 1). A partir da uretra prostática, 
distinguem-se três zonas distintas: zona central, zona de transição e zona 
periférica (McNeal, 1990), (Figura 2). 
 
 
 
 
Figura 1: Localização anatômica da próstata . A próstata está situada no 
assoalho da bexiga, de onde parte a uretra que irá penetrar a glândula 
prostática. (http://www.enetural.pt/artigos/conteudos/artigos/prostata) 
 5
O estudo clássico de McNeal (1990) demonstrou que existem diferenças 
histológicas importantes entre as diferentes zonas prostáticas. Na parte mais 
interna do órgão, composta pela zona central e de transição, onde encontram-
se respectivamente as glândulas da mucosa e da sub-mucosa, nota-se uma 
predominância do componente estromal (Figura 3). Já na parte mais externa da 
próstata, formada pela zona periférica onde se encontram as glândulas 
principais, o componente glandular está em maior quantidade (Figura 3). 
Histologicamente a próstata é formada por 30 a 50 unidades túbulo alveolares 
que são constituídas por um epitélio glandular do tipo cubóide simples que 
forma o parênquima do órgão (Figura 4). Apesar do epitélio prostático se 
organizar em apenas uma camada, este é caracterizado fenotipicamente pela 
existência de diferentes tipos célulares (Leenders, 2000). Sabe-se que no 
compartimento epitelial prostático são encontradas células luminais 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Figura 2: Esquema da divisão anatômica das zonas prostáticas. De acordo 
com a proximidade da uretra, a próstata é dividida em três zonas: a zona mais 
próxima da uretra é denominada de zona central (CZ), a zona posterior a zona 
central é denominada de zona de transição (TZ) e a zona mais externa e, 
portanto a mais distante da uretra prostática é denominada de zona periférica 
(PZ). Modificado a partir de Walsh, 2007. 
Vesícula Seminal 
Uretra 
Verum Montanum 
Coronal Sagital 
Ductos ejaculatórios 
Vaso Deferente 
 6
presença de células luminais terminalmente diferenciadas que expressam as 
citoqueratinas 8 e 18 (Okada, 1992), células tronco basais que originalmente 
expressam as citoqueratinas 5, 14 e 18 em pequena quantidade (Yang, 1997), 
além das células neuroendócrinas, cujo fenótipo ainda não é bem estabelecido, 
mas que aparentemente parecem expressar o mesmo padrão de citoqueratinas 
das células tronco encontradas no compartimento basal (Xue, 1997). O 
estroma da próstata é composto por um rico tecido fibromuscular, composto 
por fibroblastos, miofibroblastos, células musculares lisas, células do sistema 
imunológico como macrófagos e plasmócitos, além de vasos sanguineos, 
nervos e uma grande quantidade de elementos de matriz extracelular (MEC) 
(Kierszenbaum, 2008). 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Figura3: Organização geral das glândulas prostáticas. Notar a localização 
das glândulas da mucosa na zona central, glândulas da sub-mucosa na zona 
de transição e glândulas principais na zona periférica (Modificado a partir de 
Kierszenbaum, 2002). 
 
 7
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
1.2 Fisiologia da próstata 
 
O fluido produzido pela glândula prostática é um importante constituinte do 
líquido seminal e assim como os fluidos oriundos das demais glândulas 
acessórias do sistema reprodutor masculino, este contribui com uma série de 
proteínas e elementos químicos que aparentemente não são essenciais para a 
fertilização, mas que podem otimizar as condições deste processo, exceção 
feita à frutose, que é secretada em grande quantidade pela vesícula seminal e 
Figura 4: Histologia da próstata. O epitélio glandular cúbico simples prostático é 
sustentado por um estroma caracterizado pela presença dos tecidos muscular liso e 
conjuntivo (Junqueira e carneiro, 2004). 
 
 8
que comprovadamente exerce um papel fundamental como fonte energética 
para os espermatozóides. Acredita-se que o líquido prostático desempenhe 
uma espécie de efeito tampão no processo de fertilização. Assim, este fluido 
aumentaria a motilidade e a sobrevivência dos espermatozóides, assim como o 
transporte espermático tanto no trato genital masculino quanto no feminino 
(Walsh, 2003). A concentração de ácido cítrico no líquido seminal é de 500 a 
1000 vezes maior que a encontrada no plasma. A maior parte deste citrato é 
oriunda do líquido prostático, já que esta glândula apresenta uma inabilidade 
intrínseca de sua mitocôndria na oxidação deste composto (Costello, 1998). A 
atividade de enzimas que degradam poliaminas como a diamina oxidase, tem 
sido relacionada com alterações na concentração de ácido cítrico na próstata e 
de acordo com dados obtidos por Gonzáles (1994), estas alterações podem 
culminar em importantes implicações na dinâmica do processo de fertilização. 
Outro elemento encontrado em grande quantidade no líquido seminal é o zinco 
e assim como ocorre com o ácido cítrico, este íon é secretado primariamente 
pela próstata, sendo este o local do organismo onde há a maior concentração 
deste metal (Mackenzie, 1962). Além de fazer parte da organização estrutural 
de diversas proteínas como as metaloproteinases, alterações no nível do zinco 
encontrado na próstata têm sido relacionadas com patologias típicas deste 
órgão. Na HPB o nível de zinco aumenta em relação à próstata normal, ao 
passo que no CaP o nível de zinco diminui (Byar, 1974). Recentemente o 
estudo da expressão e da atividade do principal receptor intracelular para o 
zinco, a proteína metalotioneína, tem ajudado a elucidar a importância deste 
elemento, em especial seu papel no processo de apoptose de linhagens 
tumorais prostáticas (Wei e Feng, 2008). Outra importante função do zinco é o 
 9
seu papel bacteriostático, conforme descrito por Fair em 1976, ao constatar em 
um estudo clínico uma diminuição de 80% na concentração deste metal no 
líquido prostático de homens com inflamação crônica do órgão (prostatite), em 
relação a homens saudáveis. 
 Dentre as proteínas secretadas pela próstata, o antígeno prostático 
específico (PSA), pode ser considerado o mais importante e conhecido produto 
sintetizado por esta glândula, muito em função de sua importância como 
marcador de doenças da próstata, como a HPB e o CaP. O PSA é uma 
glicoproteína que atua como uma serina protease e é quase que 
exclusivamente encontrado nas células epiteliais prostáticas (Rittenhouse, 
1998). Foi descoberto na década de 70 (Ablin, 1970) e passou a ser utilizado 
em larga escala como um marcador de malignidades da próstata a partir do 
final da década de 80 (Seamonds, 1988). Ainda que existam relatos científicos 
da presença sérica desta proteína em mulheres (Yu et al, 1995) e em alguns 
tipos de carcinomas como o renal e o da glândula adrenal, de maneira geral o 
PSA pode ser considerado como uma proteína exclusiva da glândula prostática 
(Levescue et al, 1995). Como o PSA é uma serino protease, uma explanação 
plausível acerca de seu papel biológico, seria a sua atividade na liquefação do 
coágulo seminal que é rico em semenogelina, um subtrato natural para esta 
proteína, mas até o momento, não só a real função do PSA, como a 
importância dos eventos de coagulação e liquefação do sêmem no processo 
reprodutivo permanecem ainda não totalmente compreendidas (Walsh, 2003). 
O antígeno prostático específico de membrana (PSMA) é uma glicoproteína 
não solúvel ligada à membrana das células epiteliais prostáticas. A análise da 
expressão do RNAm do PSMA em material proveniente de biópsias de CaP 
 10
demonstrou que esta proteína também pode ter um destacado papel na 
clínica, como um marcador físico das células tumorais prostáticas (Wright et al, 
1995). 
 A fosfatase ácida prostática foi considerada como o principal meio de 
monitoramento na progressão do CaP, até a descoberta do PSA. Esta proteína 
secretada em grande quantidade pela próstata tem a capacidade de hidrolisar 
diversos substratos em seus resíduos tirosina, portanto pode estar envolvida 
em uma série de vias de sinalização oncogênicas, ainda que seu papel 
biológico como constituinte seminal não tenha siso elucidado (Lin e Clinton, 
1986). 
 
Controle endócrino 
 
A próstata é estimulada em seu crescimento, manutenção e função 
secretora pela presença continuada de certos hormônios e fatores de 
crescimento. Acima de tudo está o pró-hormônio testosterona que é produzido 
principalmente pelas células de Leydig dos testículos, que são responsáveis 
pela produção de 90 a 95% deste hormônio. Estas células sofrem o estímulo 
da hipófise através do hormônio luteinizante (LH) ou hormônio estimulador das 
células intersticiais (ICSH), que por sua vez é controlado pelo hipotálamo por 
meio da liberação do LHRH. Os restantes 5 a 10% da testosterona são 
produzidos pelas glândulas supra-renais. A testosterona deve ser convertida no 
interior da próstata no androgênio ativo di-hidrotestosterona (DHT), pela ação 
da enzima 5α-redutase. Noventa por cento dos andrógenos prostáticos estão 
na forma de DHT, principalmente os derivados dos androgênios testiculares. 
 11
No interior da célula, tanto a testosterona quanto a DHT ligam-se à mesma 
proteína, o receptor de androgênio (RA) de alta afinidade. A DHT é um 
androgênio mais potente que a testosterona em virtude de sua maior afinidade 
pelo RA. O RA então se liga a elementos responsivos no DNA, o que resulta 
em aumento da transcrição dos genes androgênio-dependentes e, ao final, 
estimula a síntese de proteínas (ex. PSA) (Walsh, 2003). 
A enzima 5α-redutase tem um importante papel no desenvolvimento e na 
homeostase prostática e possui duas isoformas com distribuições distintas 
entre os tecidos. A 5α-reductase I é encontrada na pele e no couro cabeludo 
em maior quantidade e em menor escala na próstata, e possivelmente está 
envolvida com a retração e formação da linha capilar (McConnell, 1995). A 5α-
reductase II é encontrada nas células basais do epitélio prostático e também 
em seu estroma (Silver, 1994). Segundo estudo de Berman (1995), enquanto o 
tipo I é predominantemente encontrado nas células epiteliais, o tipo II é 
encontrado majoritariamente nas células de origem mesenquimal. Estes dados 
vieram a confirmar de maneira indireta os dados publicados por Cunha e 
colaboradores (1983), que constataram a influência endócrina do estroma 
prostático no desenvolvimento e na manutenção da glândula. 
Outro elemento de suma importância na glândula prostática é RA. O RA é 
um membro da superfamília dos receptores nucleares, onde também se 
encontram receptores para glicocorticóides, ácido retinóico, estrogênio, 
progesterona, etc. O RA localiza-se no citoplasma das células e após a 
interação ao ligante (testosterona ou DHT)este transloca para o núcleo de 
onde irá modular a expressão e repressão dos chamados genes andrógenos 
dependentes (Kiprianou e Isaacs, 1989). Existe uma relação intrínseca entre o 
 12
RA e o andrógeno, pois se sabe que na ausência do estímulo androgênico, o 
RA fica retido no citoplasma e, portanto a mensagem mediada por esta 
interação ligante/receptor que culminaria com a transcrição nuclear, não 
acontece (Husmann, 1990). Por outro lado já foi demonstrado que a expressão 
aumentada do RA no CaP está relacionada com o mal prognóstico da doença 
(Gelmann, 2002), o que não chega a ser uma surpresa já que a base no 
tratamento do CaP consiste justamente na interrupção da sinalização 
androgênica mediada pelo RA (Silva Neto, 2008). De maneira paradoxal a 
estes dados, Lin demonstrou em 2006 que a expressão deste receptor por si só 
é um pré-requisito celular para que linhagens tumorais prostáticas andrógeno-
dependentes ou não, possam ativar as vias responsáveis pela morte celular 
programada após exposição à radiação. 
 
Interação Epitélio – Estroma 
 
Atualmente não restam dúvidas quanto à importância do componente 
estromal na fisiologia da próstata. O conceito ultrapassado de que o estroma 
prostático exercia uma mera função de suporte físico, já não mais condiz com 
os dados obtidos nas últimas décadas. O papel fundamental desempenhado 
por este compartimento começa ainda no desenvolvimento embrionário da 
glândula, passa pela produção e armazenamento de fatores de crescimento e é 
de suma importância na funcionalidade do órgão (Cunha, 
1976,1983,1992,1994,1995). Dados científicos demonstraram que o estroma 
desempenha um papel muito mais importante do que se supunha em relação a 
patologias como a HPB e o câncer (Tuxhorn, 2001). A base desta interação se 
 13
encontra no constante fluxo de informações mediadas por gases, hormônios e 
fatores de crescimento (Figura 5) que são produzidos pelo estroma, ou pelo 
menos passam por ele e por sua MEC especializada denominada de 
membrana basal, antes de atingirem o parênquima glandular (Steiner, 1993 e 
Sikes, 1995). 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Figura 5: Esquema simplificado da interação entre o epitélio e o estroma na 
próstata . A DHT é produzida principalmente no estroma prostático, e irá atuar de 
maneira autócrina sobre as próprias células estromais, assim como de maneira 
parácrina sobre as células epiteliais, induzindo a transcrição de genes mitogênicos, que 
irão estimular a proliferação de ambas as populações celulares. (Modificado a partir de 
Kierszenbaum, 2002). 
 
 14
1.3 Câncer de Próstata 
 
Em termos de valores absolutos, o adenocarcinoma de próstata é o sexto 
tipo de câncer mais comum no mundo, sendo o mais prevalente entre os 
homens e só nos Estados Unidos da América, estimam-se pelo menos 
200.000 novos casos de CaP ao ano, sendo que deste total, algo em torno de 
30.000 indivíduos vão a óbito em virtude da doença (Damber, 2008). No Brasil, 
segundo dados do Ministério da Saúde, eram esperados para o ano de 2010 o 
surgimento de 50.000 novos casos de CA de próstata (INCA, 2010). Este 
câncer pode ser considerado como típico da terceira idade, pois apresenta uma 
magnitude de mortalidade mais baixa que a incidência, sendo relativamente 
comum o achado acidental deste tipo de tumor em indivíduos na faixa etária 
acima dos 50 anos de idade, após autópsia (Albertsen, 2011). 
Não restam dúvidas que o aumento mundial na detecção do CaP e a 
queda em sua mortalidade nas últimas décadas podem ser diretamente 
correlacionados com a implementação extensiva nos sistemas de saúde, do 
exame diagnóstico que quantifica a presença sérica do PSA (Potosky, 1993). 
Esta evolução na diagnose do CaP não reflete o mesmo padrão quando se 
avalia a complexa biologia deste tumor, que pode apresentar uma série de 
fatores de risco ainda não muito bem compreendidos, entre eles: herança 
familiar, dieta, hábito de vida e origem étnica (Colloca, 2011). 
As alterações somáticas que levam à gênese do câncer de próstata não 
exibem um padrão marcante como em outros tipos de tumores. Diversos genes 
já mapeados podem sofrer deleções, translocações, mutações e amplificações 
em sua expressão, contribuindo assim, para uma assinatura genética variável 
 15
e, portanto singular deste tumor. Como consequência desta peculiaridade, o 
que se têm é um crescimento maligno que do ponto de vista clínico, podendo 
ser extremamente indolente em determinadas situações e altamente agressivo 
em outras (Park, 2009). Além disso, a variabilidade genética deste câncer 
dificulta ainda mais a correlação de sua gênese com possíveis fatores de risco 
(Kessler, 2003). 
Uma seqüência de eventos relacionados com a carcinogênese prostática 
foi proposta por Bostwick em 1996 e atualizada por Leite (Ferreira, 2010). 
Mutações germinativas podem afetar genes como o HPC (Hereditary Prostate 
Cancer) e PCAP (Predisposing for Prostate Cancer) ou então os genes que 
codificam o RA ou metaloproteinases de matriz (MMP) podem ter sua estrutura 
alterada por polimorfismos. Neste estágio, a célula epitelial normal passa a 
exibir um padrão chamado de atrofia inflamatória proliferativa. Em um segundo 
estágio é comum a metilação e o conseqüente silenciamento do gene GSTP1, 
que codifica a enzima glutationa transferase. Esta enzima é responsável pela 
proteção do DNA contra danos oxidativos. Com este silenciamento, a célula 
fica exposta a uma série de elementos potencialmente carcinogênicos, que 
podem contribuir para que a célula epitelial normal seja agora classificada 
como uma neoplasia intraepitelial (PIN). A partir daí, eventos progressivos 
como a reativação da telomerase, a perda de função em supressores de tumor 
como p53, Rb e PTEN, além do ganho de função em oncogenes como c-MYC 
e RA, irão promover a transformação contínua de neoplasia intraepitelial a 
carcinoma localizado, carcinoma metastático e finalmente carcinoma 
metastático andrógeno-independente. 
 16
Assim como no desenvolvimento normal da próstata, a testosterona têm 
um papel fundamental no desenvolvimento do câncer de próstata. Através de 
seu metabólito mais ativo, a DHT, irá se ligar ao RA e assim ambos irão mediar 
a sinalização intracelular que irá culminar com a transcrição de genes que 
codificam diversos fatores de crescimento. Entre eles está o fator de 
crescimento epidermal (EGF), o fator de crescimento de fibroblastos (FGF), o 
fator de crescimento semelhante à insulina (IGF), que irão controlar eventos 
como a proliferação e a diferenciação celulares (Boyle, 2003). O RA tem papel 
também destacado neste eixo de sinalização, pois além de exibir um aumento 
em sua expressão em tumores hormônio-refratários e, portanto mais 
agressivos, este pode apresentar uma promiscuidade a outros ligantes, como o 
IGF-1, EGF e KGF (fator de crescimento de queratinócitos), o que pode 
explicar em parte a continuidade da mensagem que originalmente só seria 
possível com a presença do andrógeno (Gelmann, 2002). 
Estima-se que em torno de 10% dos casos de CaP tenham origem 
hereditária. O mapeamento de genes como o HPC1, HPC2, PCAP e CAPB 
(Cancer, Prostate and Brain), leva a crer que a herança familiar neste tipo de 
tumor possa ser ainda maior. A elevada prevalência deste tumor em indivíduos 
com idade avançada e outros fatores, como a ausência de diferenças 
fenotípicas entre o câncer hereditário e o esporádico, têm dificultado uma maior 
correlação entre a carga hereditária e a carcinogênese prostática (Ferreira, 
2010). A distribuição mundial deste câncer também é bastante variável. 
Enquanto os EUA apresentam uma incidência classificada como muito alta, a 
Europa é tida como um continente com uma incidência muito baixa, assim 
como a Ásia (Boyle, 2003). Uma diferença marcante desta distribuição é 
 17
revelada quando a prevalência do CaP é avaliada entre diferentes gruposétnicos. Afro-americanos apresentam uma razão entre incidência e mortalidade 
bem maior que indivíduos brancos. Esta diferença chega a 60% na chance de 
desenvolvimento da doença e a 200% quanto ao risco de óbito em virtude 
deste tumor (Hsieh, 2003). Parte da diferença na penetrância do câncer de 
próstata entre distintos grupos étnicos pode ser explicada pelo padrão de 
polimorfismo no gene do RA que indivíduos de etnia afro-americana 
apresentam. Neste caso, o gene do RA apresenta uma área de repetição de 
poliglutamina (CAG) curta, que se correlaciona com uma maior responsividade 
ao andrógeno, ao passo que asiáticos apresentam esta mesma seqüência 
(CAG) mais longa, portanto o RA é menos responsivo ao andrógeno. 
Consequentemente, estes indivíduos possuem uma predisposição genética 
atenuada quanto à gênese do câncer de próstata (Ferreira, 2010). 
Evidências que correlacionem à dieta e o câncer de próstata estão 
diretamente ligadas ao consumo de carne, em especial a vermelha, pois esta 
ainda é considerada como a principal fonte de acúmulo de gordura em países 
ocidentais (Kolonel, 1999). Como conseqüência do acúmulo de gorduras, as 
alterações nos níveis hormonais e a síntese de eicosanóides podem afetar a 
proliferação das células tumorais, a resposta imunológica e a metástase (Boyle, 
2003). Por outro lado, dados demonstram que indivíduos que consomem 
regularmente vegetais, em particular o tomate que é rico em licopeno, podem 
prevenir o risco do surgimento do câncer de próstata em 25%. Este carotenóide 
é capaz de seqüestrar espécies reativas de oxigênio, capazes de lesar o DNA 
das células epiteliais prostáticas (Clinton, 1996). 
 18
A composição corporal reconhecidamente altera os níveis de testosterona 
e estrogênio circulantes. Indivíduos com maior percentual de gordura 
apresentam maiores níveis de estrogênio circulante que testosterona. Estudos 
demonstraram que ratos, camundongos e cães tratados com estrogênio por 
períodos prolongados, sofreram um aumento significativo no tamanho de suas 
próstatas, sugerindo assim, que estes mesmos efeitos possam ocorrer em 
humanos. Quanto ao consumo de álcool e tabaco os dados parecem ser 
inconclusivos. Enquanto o cigarro parece não estar relacionado com o 
surgimento do tumor prostático, mas sim com sua progressão, o álcool em 
quantidade média não demonstra nenhuma correlação associativa com o 
câncer de próstata (Boyle, 2003). 
1.4 Estroma reativo 
No século passado a teoria reducionista foi levada ao extremo pelos 
pesquisadores e graças a esta maneira de se analisar sistemas complexos, 
onde as partes são fragmentadas, em prol do conhecimento mais a frente de 
um todo, muito do que se sabe até então sobre a biologia tumoral floresceu sob 
esta ótica. A segregação de tecidos em células e de células em moléculas 
forneceu avanços admiráveis principalmente quanto à biologia molecular dos 
tumores. Por outro lado, no final do mesmo século a comunidade científica 
percebeu que o pilar reducionista outrora tão fértil em informações, já não mais 
respondia certos aspectos relacionados à gênese e à progressão tumoral. 
Desta maneira, a ciência que invariavelmente passa por ciclos de descobertas 
e retrocessos, teve a percepção de que nem todo o repertório de uma célula 
tumoral é oriundo de informações contidas em seu DNA, constatando assim, 
que mais que uma doença celular, o câncer, é uma doença tecidual. Sendo 
 19
uma doença tecidual, um componente hoje fundamental a ser avaliado sob 
vários aspectos da biologia do tumor, são as células não neoplásicas, que são 
parte inerente de grande parte dos cânceres. Como 90% dos casos de câncer 
em humanos são derivados de tecido epitelial, sendo estes patologicamente 
classificados como carcinomas, as tais células não neoplásicas em questão, 
que compõe estes tumores, fazem parte do estroma tumoral. Este estroma 
varia de órgão para órgão e é de origem mesenquimal, sendo formado por uma 
grande variedade de células e por dezenas de moléculas solúveis, insolúveis e 
estruturais, que medeiam grande parte da troca de informações entre este 
compartimento e o componente neoplásico propriamente dito. Hoje se sabe 
que o estroma pode ser um ativo colaborador do tumor e possivelmente isto 
aconteça através da recapitulação de programas celulares pré-existentes, mas 
que neste caso são utilizados fora do contexto normal dos tecidos. Trabalhos 
como o de Radisky (2005) reforçam esta constatação ao demonstrar que o 
aumento na expressão da MMP-3 por si só é suficiente para induzir a 
transformação de células epiteliais normais em células tumorais, através de 
eventos relacionados com a transição epitélio-mesenquima. Aparentemente, 
programas biológicos como a cicatrização tecidual são reativados de maneira 
perniciosa pelas células tumorais, visando à contribuição do estroma, em 
benefício exclusivo das células neoplásicas. De fato, existem similaridades 
intrigantes que permeiam o processo de cicatrização de uma lesão e a 
progressão tumoral, que talvez constituam a base dos eventos biológicos que 
são reutilizados nesta interação entre estes dois compartimentos teciduais 
(Weinberg, 2008). 
 20
Entre a cascata de eventos envolvidos no processo de cicatrização, 
destacam-se a liberação de fatores como o fator de crescimento derivado das 
plaquetas (PDGF), o fator de crescimento transformante beta (TGF-β), além de 
fatores vaso-ativos. Estes fatores produzidos pelas plaquetas irão atuar de 
forma diferente no estroma adjacente, assim o PDGF irá estimular a 
proliferação dos fibroblastos e o TGF-β irá induzir a secreção de MMPs por 
estas células. Os fibroblastos por sua vez secretam fatores como o FGF, que é 
capaz de induzir a proliferação das células epiteliais. Com a ativação das 
MMPs, há um remodelamento da MEC que abrirá espaço para novas células e 
irá liberar uma série de outros fatores de crescimento como o fator de 
crescimento de fibroblastos básico (bFGF), TGF-β, FGF, EGF e PDGF, que 
estavam ligados de forma inativa a componentes da MEC, como os 
proteoglicanos. Alguns destes fatores irão também atrair células 
imunocompetentes, entre elas, macrófagos, monócitos e neutrófilos. Estas por 
sua vez, além de reciclarem a matéria orgânica oriunda do processo de 
cicatrização, secretarão fatores pró-angiogênicos como o fator de crescimento 
endotelial vascular (VEGF), que irá estimular a proliferação das células 
endoteliais, responsáveis pela formação de novos vasos sanguíneos no sítio da 
lesão. Ao mesmo tempo em que todos estes eventos estão acontecendo no 
estroma, às células epiteliais reduzem sua adesão à MEC e umas às outras, 
alterando a expressão de integrinas e suprimindo a expressão de caderinas, 
com o intuito de tornarem-se mais móveis e repovoarem o local lesionado 
(Dvorak, 1986). De fato, estas alterações na homeostase tecidual causadas por 
uma lesão, em muito se assemelham com o que acontece com o 
microambiente onde surge o tumor. Vários estudos têm mostrado que o 
 21
estroma tumoral difere significativamente do estroma normal (Condon, 2005; 
Berry, 2008; Taylor, 2008; Josson, 2009; Nong Niu 2009). A alteração tecidual 
causada pelo CaP, por exemplo, leva a um aumento na proliferação e invasão 
das células tumorais, fazendo com que o estroma prostático gere uma resposta 
similar ao observado no processo de cicatrização (Singh, 2004). Os trabalhos 
clássicos de Olumi (1998,1999) forneceram as primeiras confirmações 
científicas sobre a importância do estroma na progressão do CaP. Nestes 
trabalhos, demonstrou-se que as células tumorais LNCaP quando injetadas em 
camundongos NUDE, não eram capazes de gerar tumores, já quando estas 
foram co-inoculadas juntamente com células estromais prostáticas, vários 
tumores foram gerados nestes mesmos animais. Os dados produzidos por 
Olumi também revelaram que as células estromais eram capazes de induzir aformação de tumores em camundongos NUDE, quando co-inoculadas com 
células transformadas, mas não neoplásicas. Na ocasião dos trabalhos acima 
referidos, o termo utilizado para identificar as células não neoplásicas 
associadas ao carcinoma era o de fibroblastos associados ao câncer (CAF). 
Posteriormente este termo caiu em desuso, pois distinguia apenas um 
componente, dentre os vários que constituem o estroma. Desde então, este 
compartimento passou a ser caracterizado de estroma reativo, por apresentar 
um fenótipo diferenciado do estroma normal, em função de um aumento no 
número de miofibroblastos, uma diminuição no número de células musculares 
lisas, além de uma maior deposição de componentes da MEC (Untergasser, 
2005). Além disso, vários fatores que são secretados durante o processo de 
cicatrização, também são liberados com a formação do estroma reativo em 
resposta ao crescimento tumoral (Tuxnorn, 2001). Entre eles, estão fatores 
 22
como o FGF-2 (Yang, 2008), o fator de crescimento de tecido conectivo 
(CTGF) (Yang, 2005), o VEGF, o PDGF (Condon, 2005) e o TGF-β 
(Untergasser, 2005). O TGF-β em especial, desempenha um papel 
fundamental na formação do estroma reativo, desencadeando a mudança no 
fenótipo das células que compõem este compartimento. Sob a influência deste 
fator, o estroma prostático que originalmente era composto por um grande 
número de células musculares lisas, caracterizadas pela expressão de 
proteínas de citoesqueleto como desmina, calponina, além da cadeia pesada 
da miosina, agora se torna mais fibroso, com um significativo aumento no 
numero de miofibroblastos (Tuxhorn, 2002; Tabela 1). Esta mudança no 
fenótipo estromal também induz o remodelamento da MEC, que irá levar à 
liberação de novos fatores de crescimento e de moléculas da MEC, como os 
colágenos I e III (Untergasser, 2005), tenascina C e versican, (Xue, 1998 e 
Ricciardelli, 1998), além das MMPs 2 e 9 (Wilson, 2002). Também foi 
demonstrado que o TGF-β quando inibido, diminui a formação de novos vasos 
sanguíneos em modelo de xenoenxerto de CaP (Tuxhorn, 2002), assim como 
reduz a apoptose dos miofibroblastos prostáticos (Singh, 2004). Foi 
demonstrado pela técnica de microarranjos de DNA que o estroma reativo 
apresenta uma assinatura genética singular em comparação ao estroma 
normal, sendo este então caracterizado pelo aumento na expressão dos genes 
MRE11A, HUS1 e RAD17 (Ittmann, 2009). Coforme relatado neste mesmo 
trabalho, estes genes estão relacionados com o processo de reparo do DNA e 
com o aumento na geração de espécies reativas de oxigênio em virtude do 
processo inflamatório desencadeado pelas células tumorais. A reatividade 
estromal prostática não é uma resposta exclusiva do crescimento neoplásico 
 23
maligno. A HPB que é caracterizada como um crescimento tumoral benigno da 
próstata (Walsh, 2003) e ocorre de maneira concomitante ao câncer, em mais 
de 80% dos casos (Bushman, 2009). Além disso, ambas as patologias são 
marcadas pela presença de um forte processo inflamatório (Theyer, 1992), 
onde ocorre a liberação de fatores como o TGF-β e a interleucina 8, que 
contribuem para a formação de um estroma que também é caracterizado como 
reativo, pois este apresenta um fenótipo similar ao observado no estroma 
tumoral (Schauer., 2007). Em função do exposto acima e em virtude de 
aspectos éticos que impossibilitam a obtenção de fragmentos de câncer de 
próstata em estágio inicial, a utilização de tecido derivado de HPB para 
obtenção in vitro do estroma reativo, representa em nosso ponto de vista, o 
modelo de estudo ideal para se avaliar como as interações mediadas por este 
compartimento contribuem para a progressão tumoral prostática. Desta 
maneira, nós “dissecamos” o estroma reativo in vitro avaliando como as 
interações célula-célula, célula-MEC e célula-fatores solúveis influem na 
progressão tumoral das células LNCaP . 
vimentina + 
α - actina de músculo liso + 
desmina - 
calponina - 
cadeia pesada da miosina - 
 
 
 Tabela 1: Padrão de expressão de elementos do citoesqueleto pelo estroma reativo 
de próstata (Tuxhorn, 2001). 
 24
2. OBJETIVO GERAL 
Avaliar in vitro a influência do estroma reativo sobre a progressão tumoral 
prostática, utilizando as células LNCaP. 
 
 
2.1. OBJETIVOS ESPECÍFICOS 
 
 
• Estabelecer e caracterizar morfologicamente uma população estromal 
homogênea derivada de Hiperplasia Prostática Benigna. 
 
• Estabelecer co-culturas de células estromais com as células tumorais 
LNCaP. 
 
• Avaliar a morfologia, a atividade proliferativa, a apoptose e a migração 
das células LNCaP co-cultivadas com as células estromais, cultivadas na 
presença de meio condicionado produzido pelas células estromais e cultivadas 
sobre substrato de matriz extracelular secretado pelas células estromais. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 25
3. MATERIAIS E MÉTODOS 
 
3.1. Obtenção e caracterização da população homogên ea de células estromais de 
HPB 
 
 Fragmentos de ressecção trans uretral prostática (RTU) foram obtidos de 
cirurgias realizadas no Hospital Geral do Andaraí, oriundos de paciente com 
critérios clínicos para HPB, com indicação cirúrgica e PSA inferior a 2,5, e 
utilizados para a obtenção das células estromais. Este procedimento foi 
aprovado pelo Comitê de Ética do Hospital Universitário Clementino Fraga Filho 
da Universidade Federal do Rio de Janeiro, protocolo nº CAAE-0029.0.197.000-
05. O diagnóstico de HPB foi confirmado pelo exame histopatológico dos 
fragmentos teciduais restantes. O material foi acondicionado em Dulbbecos 
Modified Eagles Médium (DMEM; Sigma) estéril com penicilina/estreptomicina a 
1% e preservado no gelo para evitar contaminação antes do processamento. 
Fragmentos de 1 a 3 mm3 foram cultivados em placa de 24 poços contendo 
DMEM suplementado com 10% de Soro Fetal Bovino (SFB). Os fragmentos 
foram mantidos sob condições controladas de CO2 (5%) e temperatura (37ºC), 
sendo o meio trocado a cada dois dias. Após as células aderirem ao fundo da 
placa de cultura, estas foram tripsinizadas e passadas para garrafas de 25 mm. 
Após sucessivas passagens, foi estabelecida uma população homogênea de 
células estromais de HPB. 
 A fim de identificar o fenótipo das células estromais derivadas de HPB, 
em cada passagem as culturas foram caracterizadas imunocitoquímicamente 
para elementos do citoesqueleto. Após a remoção dos sobrenadantes, as 
células foram lavadas por duas vezes com PBS, antes de serem fixadas com 
paraformaldeído 4% (Sigma), por dez minutos em temperatura ambiente. Após a 
 26
fixação, foram lavadas por três vezes com PBS e então incubadas em uma 
solução de NH4Cl 50 nM (Vetec), por 30 minutos. Os sítios inespecíficos foram 
bloqueados após 30 minutos de incubação com PBS/BSA 5% e em seguida 
foram adicionados os anticorpos primários overnight. Para a identificação dos 
elementos do citoesqueleto foram utilizados os anticorpos anti-vimentina 
(Sigma, na diliuição de 1/100), anti-α-actina de músculo liso (Sigma, 1/400), anti-
citoqueratina peptídeo 18 (Sigma, 1/400) e anti-desmina (Dako, 1/50). Para a 
identificação das proteínas da MEC foram utilizados os anticorpos anti-
fibronectina (Sigma, 1/200), anti-laminina (Sigma, 1/100), anti-colágeno tipo I 
(Novotec, 1/25), anti-colágeno tipo III (Novotec, 1/25), anti-colágeno tipo IV 
(Sigma, 1/200) e anti-condroitin sulfato (Sigma, 1/200). Após a incubação com 
os anticorpos primários, as células foram lavadas com PBS e incubadas por 
duas horas com anticorpo secundário Alexa 488 Goat Anti Mouse (Invitrogen). 
Os núcleos celulares foram marcados com DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole 
dihydrochloride, Santa Cruz Biotechnology). Ao final, as células foram lavadas 
com águadestilada e montadas sobre lâminas histológicas com N- propilgalato 
(Sigma), antes de serem analisadas e fotografadas (Hamamatsu orca2), por 
meio de microscopia de fluorescência (Confocal Olympus IX81). 
 
3.2. Cultivo da linhagem de células tumorais prostá ticas LNCaP 
 
A linhagem de células LNCaP é caracterizada como uma linhagem tumoral 
humana de CaP andrógeno-dependente de baixa agressividade, derivada de 
metástases linfonodais (Julius, 1983). Esta linhagem foi obtida no Instituto 
Nacional do Câncer (INCA) e mantida rotineiramente em meio de cultura RPMI 
suplementado com 10% de SFB, exceto na condição controle ou nas condições 
 27
experimentais (sobre as células estromais, na presença do meio condicionado 
ou sobre a MEC), em que a suplementação de SFB adotada foi a mínima 
necessária para a manutenção da viabilidade celular (0,5%) sem, contudo 
interferir na análise dos experimentos . 
 
3.3. Co-cultura das células LNCaP com as células es tromais 
 
1x105 células estromais foram cultivadas em placa de 6 poços com meio 
completo por 72 horas. Após atingirem a confluência, o meio foi retirado, os 
poços lavados com solução salina balanceada (BSS) e as células estromais 
foram incubadas com o corante fluorescente vital green CMFDA (Molecular 
Probes) numa concentração de 5µM em DMEM sem soro, por 45 minutos. Este 
marcador intracelular é capaz de se difundir pela membrana plasmática de 
células vivas e possui em sua estrutura o diacetato de fluoresceína, que uma 
vez em meio intracelular é convertido por esterases e enzimas do complexo 
glutationa transferase em um composto fluorescente e estável, por pelo menos 
72 horas. Após esta etapa, as células foram lavadas e incubadas por mais uma 
hora em DMEM suplementado com 10% de SFB antes de serem lavadas mais 
uma vez com BSS. Após as células estromais incorporarem o corante, 2,5 x 
105 células LNCaP foram lançadas sobre estas, em meio DMEM com 0,5% de 
SFB, por um período de 72 horas. Após este período, as células LNCaP foram 
separadas das células estromais marcadas com o corante por citometria de 
fluxo (MoFlo, Dako Cytomation) e então submetidas a ensaios de proliferação e 
apoptose. A excitação do fluorocromo foi feita a partir de um laser de argônio 
com um comprimento de onda de 488 nm e a emissão coletada através de um 
filtro de 530/40 nm. 
 28
3.4. Cultivo de células LNCaP com o meio condiciona do produzido pelas 
células estromais 
 
5x104 células estromais foram cultivadas em placa de 24 poços com meio 
completo por 96 horas. Após atingirem a confluência, o meio foi retirado, os 
poços lavados com BSS e as células foram cultivadas por mais 24 horas em 
DMEM com 0,5% de SFB. Passado este período, o sobrenadante (meio 
condicionado) foi coletado, clarificado (centrifugado) e adicionado às células 
LNCaP (1x105), sendo estas cultivadas por 72 horas. 
 
3.5. Cultivo de células LNCaP sobre a matriz extrac elular secretada pelas 
células estromais 
 
5x104 células estromais foram cultivadas em placa de 24 poços com meio 
completo por 96 horas. Após atingirem a confluência, o meio foi retirado, os 
poços lavados com PBS suplementado com cloreto de cálcio (PBS-Ca) e então 
foram adicionados 300µL do tampão de lise celular composto por PBS-Ca; 
Leupeptina (Sigma 20 µM); PMSF (Sigma 1mM); Triton X-100 (Sigma 0,1%) e 
Hidróxido de Amônio (Vetec 0,1 nM) por 15 minutos. Este tampão é composto 
por reagentes como o hidróxido de amônio que lisam estruturas celulares de 
modo que somente as proteínas secretadas pelas células estromais são 
preservadas, pois inibidores de protease como o PMSF e a leupeptina 
impedem a degradação peptídica por MMP’s por exemplo. Após esta etapa, os 
poços foram lavados por três vezes com PBS-Ca e então 1x105 células LNCaP 
foram cultivadas sobre o tapete de MEC secretada pelas células estromais 
durante 72 horas. 
 
 29
3.6. Análise da morfologia das células LNCaP 
 
A morfologia das células LNCaP foi avaliada por microscopia de contraste 
de fase e por marcações para o citoesqueleto de actina, com a toxina fúngica 
faloidina. Para a análise da morfologia das células LNCaP cultivadas sobre as 
células estromais utilizou-se a citoqueratina peptídeo 18, que é um marcador 
tipicamente epitelial, não expresso por células de origem mesenquimal, como 
as células do estroma. Após a remoção do meio de cultura, as células foram 
lavadas por duas vezes com PBS, antes de serem fixadas com 
paraformoldeído 4%, por dez minutos em temperatura ambiente. Após a 
fixação, as células foram lavadas por três vezes com PBS e então foram 
incubadas em uma solução de NH4Cl 50nM por trinta minutos. Após rápida 
lavagem e permeabilização com Triton X-100 0,1%, por 30 minutos, as células 
foram incubadas com faloidina Cy3 (Sigma), diluída na proporção de 1/100 em 
PBS, em câmara escura e úmida por 60 minutos. Após a incubação e lavagem 
das células por três vezes novamente com PBS, estas foram reincubadas com 
DAPI por 5 minutos. Ao final, as células foram lavadas com água destilada e 
montadas sobre lâminas histológicas com N- propilgalato, antes de serem 
analisadas e fotografadas. 
 
 
3.7. Ensaio de proliferação celular 
 
O cristal violeta é um corante catiônico e, portanto possui uma alta afinidade 
por estruturas aniônicas como o DNA, que em função disso é utilizado para 
avaliar a proliferação de células in vitro. Logo, quanto maior o número de 
células, maior será a quantidade de cristal violeta incorporada ao DNA e sendo 
 30
assim maior será a absorbância gerada. Após lavagem com PBS, as células 
foram fixadas em etanol 100% por 10 minutos e então coradas com cristal 
violeta 0,05% (Vetec) por mais 10 minutos. Após a incorporação do corante, as 
células foram lavadas com água destilada e incubadas em metanol por 5 
minutos em uma placa agitadora. Após a solubilização do corante pelo metanol, 
o sobrenadante foi recolhido e a absorbância quantificada em leitor de ELISA 
(iMARK BIO-RAD) a 490 nm. A proliferação também foi avaliada pela 
imunomarcação para histona H3p. Após a remoção dos sobrenadantes, as 
células foram lavadas por duas vezes com PBS, antes de serem fixadas com 
paraformaldeído 4% (Sigma), por dez minutos em temperatura ambiente. Após a 
fixação, foram lavadas por três vezes com PBS e então incubadas em uma 
solução de NH4Cl 50 nM (Vetec), por 30 minutos. Os sítios inespecíficos foram 
bloqueados após 30 minutos de incubação com PBS/BSA 5% e em seguida foi 
adicionado o anticorpo primário anti-histona H3p na diluição de 1/500 overnight. 
Após a incubação com o anticorpo primário, as células foram lavadas com PBS 
e incubadas por duas horas com anticorpo secundário Alexa 488 Goat Anti 
Rabbit (Invitrogen). Os núcleos celulares foram marcados com DAPI (4',6-
diamidino-2-phenylindole dihydrochloride, Santa Cruz Biotechnology). Ao final, 
as células foram lavadas com água destilada e montadas sobre lâminas 
histológicas com N- propilgalato (Sigma), antes de serem analisadas e 
fotografadas (Hamamatsu orca2), por meio de microscopia de fluorescência 
(Confocal Olympus IX81). 
 
 
 
 
 31
3.8. Avaliação do ciclo celular 
 
O iodeto de propídeo é um fluorocromo que possui alta afinidade por 
estruturas eletronegativas como o DNA. Este se intercala entre as bases 
nucléicas nitrogenadas e desta forma é possível correlacionar às fases do ciclo 
celular de acordo com a quantidade de DNA ligada ao iodeto de propídeo. 
Após serem tripsinizadas, as células LNCaP foram centrifugadas e 1x105 
células foram ressuspendidas em 200 µL da solução de iodeto de propídeo 
(PBS; Triton X-100 0,1%; Rnase 0,1% e iodeto de propídeo 50µg/mL – Sigma) 
e incubadas por 5 minutos no gelo. Após o tempo de incubação, o ciclo celular 
foi avaliado por citometria de fluxo (FACScalibur Becton Dickison) após a 
aquisição de 20.000 eventos. A excitação do fluorocromo foi feita a partir de umlaser de argônio com um comprimento de onda de 488 nm e a emissão 
coletada através de um filtro de 630/22 nm. 
 
 
 
 
3.9. Ensaio de apoptose 
 
Em uma situação de homeostase celular, o fosfolipídio fosfatidilserina se 
localiza na face interna da membrana citoplasmática, e durante o estágio inicial 
do processo de apoptose, este é externalizado. A proteína anexina V é capaz 
de se ligar a fosfatidilserina e, portanto detectar fases iniciais da morte celular 
por apoptose. As células LNCaP foram tripsinizadas, centrifugadas e tiveram 
seu sobrenadante recolhido. 1x105 células foram ressuspendidas em 400 µLde 
tampão de ligação acrescido de 5 µL de anexina V FITC e 5 µL de iodeto de 
 32
propídeo (Apoptosis Detection Kit II BD Biosciences), por 15 minutos em 
temperatura ambiente. Após o tempo de incubação, a porcentagem de células 
positivas para anexina V foi avaliada por citometria de fluxo (FACScalibur 
Becton Dickison), após a aquisição de 20.000 eventos. A excitação do 
fluorocromo foi feita a partir de um laser de argônio com um comprimento de 
onda de 488 nm e a emissão foi coletada através de um filtro de 530/30 nm. 
 
3.10 Ensaio de migração celular 
 
Após serem tripsinizadas, 1x105 células LNCaP foram cultivadas sobre as 
células estromais, sobre a MEC ou com o meio condicionado, por um período 
de doze horas, em uma câmara de cultivo com condições controladas de CO2 e 
temperatura, adaptada a um microscópio invertido Nikon Eclipse TE300. 
Durante este período, foram capturadas imagens da cultura por contraste de 
fase, a cada minuto, com o auxílio de uma câmera fotográfica Hamamatsu 
C2400. Após a montagem dos filmes de cada situação de cultivo, 10 células 
diferentes foram marcadas com um ponto preto, de diâmetro cerca de 10 
vezes menor que o diâmetro da célula, com o auxílio do programa image J 
(National Institute of Health, USA), em intervalos de tempo de 10 minutos. As 
trajetórias das células marcadas foram obtidas usando o programa ImageJ e a 
partir das mesmas, usando o programa Kaleidagraph (Synergy Software, USA), 
duas velocidades de deslocamento das células foram determinadas, a 
velocidade de afastamento Va e a velocidade tangencial Vt. A velocidade de 
afastamento representa o maior deslocamento realizado pela célula em relação 
ao seu ponto de partida. Ela é obtida dividindo-se o deslocamento máximo 
 33
realizado pela célula pelo tempo de observação, que no caso foi de 12 horas. 
A velocidade tangencial representa o deslocamento total realizado pela célula 
no período de 12 horas de observação. Neste caso, ao invés de se avaliar o 
deslocamento referente ao ponto inicial e ao ponto mais distante alcançado 
pela célula, todo o trajeto percorrido por ela é levado em consideração. Na 
determinação da velocidade tangencial considera-se o movimento da célula 
como tendo sido realizado sem mudanças de direção, ao longo de uma reta. A 
velocidade tangencial diz respeito a como a maquinaria da célula está 
preparada para migração. Já a velocidade de afastamento traz informação de 
quão direcionado está o movimento da célula. Para avaliar o erro na 
determinação da velocidade tangencial que vem da marcação de células 
realizadas anteriormente às análises de suas trajetórias, um filme com 72 
imagens iguais obtidas de uma foto de um instante qualquer na situação 
controle foi criado. O procedimento de marcação e análise das imagens foi 
realizado como descrito anteriormente e a velocidade de erro Verro foi 
deterinada. A velocidade de erro é originada por deslocamentos aleatórios que 
surgem no processo de marcação das células. Para essa situação a velocidade 
resultante da soma da velocidade tangencial e a velocidade de erro pode ser 
escrita como: .errotR VVV
rrr
+= (equação1). Utilizando a Equação 1, o módulo de 
VR é escrito como: ),cos(2222 θtRerrotR VVVVV ++= (equação 2), onde θ é o ângulo 
formado entre as velocidades tangencial e de erro. θ varia aleatoriamente no 
processo de marcação. Assumindo que tanto Vt como Verro são constantes no 
processo e que apenas o ângulo θ varia no processo de 
marcação: ,)cos(2222 θtRerrotR VVVVV ++= (equação 3), onde 
 34
corresponde ao valor médio da grandeza em seu interior: .
1
1
∑
=
=
N
i
iyN
y 
(equação 4). Como 0)cos( =θ tem-se que: ,222 errotR VVV += (equação 5) 
da qual se obtém o valor da velocidade tangencial 
corrigida: .222 erroRt VVV −= 
 
 
3.11. Análise Estatística 
 
As análises estatísticas foram realizadas utilizando-se o programa 
GraphPad Prism 4.0. Os dados obtidos foram analisados através do teste T de 
Student, exceto nos ensaios de migração, onde foi utilizado o teste não 
paramétrico de Kruskal-Wallis, com aproximação gaussiana na determinação 
do valor. Os valores considerados estatisticamente significativos foram aqueles 
em que a diferença foi inferior a p<0.05. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 35
4. RESULTADOS 
 
4.1. Caracterização do estroma reativo 
 
A partir da obtenção de fragmentos de HPB, obtivemos uma cultura 
primária deste tecido, cujas células foram caracterizadas a cada passagem, 
onde observou-se uma diminuição gradativa na quantidade de células 
arredondadas de aspecto epitelial e um aumento na quantidade de células 
alongadas e com prolongamentos de aspecto fibroblastóide, conforme 
demonstrado pelas imagens obtidas por microscopia de contraste de fase 
(Figura 6 A,B). Após seis passagens obteve-se uma população de células 
fibroblastóides positivas para vimentina (Figura 6 C,D), α-actina de músculo liso 
(Figura 6 E,F) e negativas para citoqueratina 18 (Figura 6 G) e desmina (Figura 
6 H), revelando assim o isolamento de uma população homogênea de células 
estromais e de fenótipo reativo. 
 
 
 
 
 
 
 36
 
 
 
 
 
 
 CS 
 
C 
VM 
A B 
 αααα- SMA 
LM FN 
E F 
H 
VM 
A 
D C 
H G 
F E 
B 
B C 
D E 
F G 
V
M 
V
M 
α α 
B 
V
M 
α 
Act 
E 
CK (-
) 
G 
DM (-
) 
H 
V
M 
C 
α 
Act 
F 
V
M 
D 
V
M 
C 
A B 
100 µm 
100 µm 
100 µm 
 50 µm 
100 µm 
 50 µm 
100 µm 100 µm 
H G 
F E 
D C 
Figura 6: Caracterização da linhagem estromal. Micrografias de contraste de fase 
de cultura primária prostática (A-B) e de imunomarcação para vimentina (C-D), α-
actina de músculo liso (E-F), citoqueratina 18 (G) e desmina (H). Notar a presença de 
células com morfologia arredondada tipicamente epitelial ainda na 1ºpassagem (A – 
seta) e de células com aspecto tipicamente fibroblastóide a partir da 6º passagem 
(B) e de fenótipo reativo (C-H). 
 37
4.2. Influência do estroma reativo sobre a morfolog ia das células LNCaP 
 
As células LNCaP apresentaram uma clara diferença quanto à sua 
morfologia entre as distintas condições de cultivo. Quando cultivadas na 
presença de meio suplementado com quantidade mínima de SFB (0,5%) 
(controle; Figura 7A, B) ou mesmo sobre as células estromais, estas células 
apresentaram uma forma mais arredondada, formando pequenos grumos, que 
muitas vezes se dispunham de maneira cordonal (Figura 7 C,D). Este padrão 
de organização morfológica foi similar aquele observado quando as células 
LNCaP foram cultivadas com o meio condicionado (Figura 7 E,F). Quando 
cultivadas sobre o tapete de matriz extracelular produzido pelas células 
estromais (Figura 7 G,H) ou em meio completo (Figura 8 A), a morfologia das 
células LNCaP diferiu de maneira considerável em relação às condições 
anteriores. Nestas circunstâncias, pode-se notar uma maior confluência da 
cultura, uma maior expansão citoplasmática com um consequente aumento no 
número de interconexões entre as células, formando uma monocamada em 
forma de rede com a típica morfologia fusiforme que caracteriza estas células. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 38
 
 
 
 
 
 
200 µm 
200 µm 
200 µm 
200 µm 
B 
H 
D 
F 
A 
G 
C 
E 
100 µm 
100 µm 
100 µm 
100 µm 
H 
F 
D 
B 
Figura 7: Morfologia das célulasLNCaP após distint as condições de cultivo. 
Controle (células cultivadas com 0,5% SFB) (A-B), células cultivadas sobre as 
células estromais (C-D), com meio condicionado (E-F) e sobre a MEC secretada. 
Micrografias de contraste de fase (A,C,E,G), de marcação para faloidina (B,F,H) e de 
imunomarcação para citoqueratina 18 (D). 
 
 
 39
4.3. Os fatores solúveis e a matriz extracelular se cretados pelo estroma 
reativo induzem a proliferação das células tumorais LNCaP 
 
Após o co-cultivo das células estromais marcadas com Green CMFDA, 
com as células LNCaP (Figura 8 A,B), verificou-se a eficiência de separação 
deste modelo por citometria de fluxo (Figura 9 A,B), permitindo assim, a 
segregação de ambas as populações celulares com uma eficiência de 99.30%. 
Após isto, foi verificado que as células LNCaP quando cultivadas sobre as 
células estromais não exibiram diferença significativa quanto a sua atividade 
proliferativa (Figura 10 A). Já quando estas células foram cultivadas na 
presença do meio condicionado produzido pelas células estromais, pode-se 
notar um aumento significativo na proliferação das células LNCaP em relação 
ao controle (Figura 10 B), mas que ainda assim, foi menos significativo que o 
aumento na proliferação induzido pela MEC (Figura: 10 C,D). Além disso, 
quando cultivadas sobre a MEC estromal, as células LNCaP demonstraram um 
perfil de ciclo celular, típico de células que estão se dividindo ativamente, com 
um percentual de células na fase S significativamente maior que o controle, 
além de um maior percentual de células também na fase G2/M (Figura 11 A,B). 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 40
 
 
 
 
 
 
Figura 8: Modelo esquemático de co -cultivo celular. Obtenção das células estromais 
a partir de fragmentos de HPB obtidos por ressecção trans uretral prostática e 
isolamento da população estromal após seis sucessivas passagens. Co-cultivo das 
células LNCaP com as células estromais marcadas com green CMFDA (B). Micrografia 
de microscopia de fluorescência das células estromais marcadas com green CMFDA 
após 72 horas de cultivo (C). 
B 
C 
 41
 
 
Figura 9: Separação celular por citometria de fluxo . Padrão de emissão de 
fluorescência das células LNCaP (A superior esquerda), padrão de emissão de 
fluorescência das células LNCaP pós sorting (A superior direita). Diferenças nos picos de 
emissão de fluorescência da co-cultura entre as células estromais marcadas com Green 
CMFDA e as células LNCaP (B inferior esquerda) e padrão de emissão de fluorescência 
das células LNCaP após o sorting da co-cultura (B inferior direita). 
 42
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Figura 10: Análise da proliferação das células LNCa P através da incorporação de 
cristal violeta. Análise colorimétrica da incorporação de cristal violeta setenta e duas 
horas após o cultivo das células LNCaP sobre as células estromais (A), com o meio 
condicionado (B) e sobre a MEC (C). Imunomarcação para histona H3p após cultivo das 
células LNCaP sobre a MEC (D). Notar que apesar de o meio condicionado e a MEC 
induzirem a proliferação das células LNCaP, a MEC o fez de maneira mais acentuada. 
D/O = Densidade Óptica; ** = p<0.01, *** = p<0.0001. 
 
 
 43
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Figura 11: Avaliação do ciclo celular das células LNCaP após c ultivo sobre a MEC. 
Após setenta e duas horas de cultivo, as células LNCaP foram marcadas com iodeto de 
propídeo e analisadas por citometria de fluxo (A). Percentual de células na fase S e 
G2/M do ciclo celular (B). * = p<0.05. Observe a diferença significativa de células LNCaP 
na fase S do ciclo celular em relação ao controle quando cultivadas sobre a MEC 
produzida pelo estroma reativo. 
 
 
 
 44
4.4. As interações célula/célula e célula/matriz ex tracelular modulam a 
sobrevivência das células tumorais LNCaP 
 
O percentual de células LNCaP positivas para a proteína Anexina V 
quando cultivadas sobre as células estromais (Figura 12 A) ou sobre a MEC 
produzida por estas células (Figura 12 C), foi significativamente menor que o 
controle (meio com quantidade mínima de SFB) em ambas as situações. Isto 
demonstra que tanto os elementos de matriz extracelular produzidos pelo 
estroma reativo, quanto as próprias células estromais modulam positivamente a 
sobrevivência das células LNCaP. ao impedir que estas entrem em apoptose 
(Figura 12 D). Quando cultivadas na presença do meio condicionado, não foi 
verificada diferença significativa no percentual de células LNCaP positivas para 
a proteína Anexina V em relação ao controle (Figura 12 B). 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 45
 
 
 
 
 
Figura 12: Avaliação da Apoptose por citometria de fluxo através da marcação 
para Anexina V. Histograma referente a emissão de fluorescência para Anexina V nas 
células LNCaP cultivadas por setenta e duas horas sobre as células estromais (A), na 
presença do meio condicionado (B) e sobre a MEC (C). Percentual de células positivas 
para anexina V (D). * = p<0.05. Note que as células LNCaP entraram menos em 
apoptose sobre as células estromais ou quando cultivadas sobre a MEC, 
 46
 
 
4.5 A motilidade das células LNCaP é modulada de d iferentes maneiras 
pelo estroma reativo 
 
O ensaio de videomicroscopia utilizado para avaliar a migração das células 
LNCaP, revelou que as interações entre os componentes estromais e as 
células tumorais geram respostas distintas quanto à motilidade destas células. 
Quando comparadas à situação controle (Figura 13 A), a velocidade de 
afastamento foi significativamente diferente para as demais situações 
consideradas, sendo que a maior diferença foi observada quando as células 
LNCaP foram cultivadas sobre a MEC (Figura 13 A). Por outro lado, a 
velocidade tangencial, que representa o deslocamento total das células LNCaP 
em determinado período de tempo foi significativamente diferente em relação à 
situação controle para as células cultivadas sobre a MEC (Figura 13 B) e para 
células cultivadas sobre células estromais (Figura 13 B). Não houve diferença 
significativa entre os valores da velocidade tangencial obtidos para a situação 
controle e para células LNCaP cultivadas na presença do meio condicionado 
produzido pelas células estromais (Figura 13 B). 
 
 
 
 
 
 47
 
 
Figura 13: Análise da migração celular por videomic roscopia. Velocidade de 
afastamento das células LNCaP (A) e velocidade tangencial das células LNCaP (B). 
* = p < 0.05, ** = p < 0.01, *** = p<0.001 
 
 48
4.6. A matriz extracelular secretada pelo estroma r eativo induz a 
proliferação das células tumorais LNCaP independent emente do tecido de 
origem 
 
Como a linhagem estromal isolada em nosso estudo foi derivada de um 
único paciente com HPB, nós decidimos verificar se a contribuição da MEC 
para a progressão tumoral in vitro das células LNCaP observada em nossos 
dados, não era resultado apenas de uma interação singular, entre a MEC 
produzida por nossa linhagem estromal e as células LNCaP. Para tal, nós 
isolamos duas outras linhagens estromais primárias de HPB e juntamente com 
a linhagem que foi utilizada em nosso estudo, nós avaliamos a proliferação das 
células LNCaP sobre a MEC produzida por estas três diferentes linhagens. 
Observamos que a proliferação das células LNCaP foi positivamente modulada 
pela MEC secretada por todas as linhagens estromais (Figura 13). 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 49
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
controle P1 P2 P3
0
1
2
72 horas
D
/O
 (
57
0 
nm
)
* * 
* * 
* * 
Figura 14: Análise da proliferação das células LNCaP após cultivo sobr e a MEC de 
três diferentes pacientes. Análise colorimétrica da incorporação de cristal violeta, setenta 
e duas horas após o cultivo das células LNCaP, sobre a MEC obtida a partir do isolamento 
de linhagens estromais, oriundas de três diferentes pacientes. Paciente 1 (P1), paciente 2 
(P2) e paciente 3 (P3). Notar que MEC derivada dos três pacientes