2010-dis-jjfevangelista

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UNIVERSIDADE FEDERAL DO CEARÁ 
FACULDADE DE MEDICINA 
DEPARTAMENTO DE FISIOLOGIA E FARMACOLOGIA 
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM FARMACOLOGIA 
 
 
 
 
JOÃO JOSÉ FERREIRA EVANGELISTA 
 
 
AÇÃO FARMACOLÓGICA DAS VITAMINAS A & E NA PRODUÇÃO DE 
OÓCITOS E EMBRIÕES BOVINOS 
 
 
 
 
 
 
 
FORTALEZA 
2010 
 
 
 
1 
JOÃO JOSÉ FERREIRA EVANGELISTA 
 
 
 
AÇÃO FARMACOLÓGICA DAS VITAMINAS A & E NA PRODUÇÃO DE 
OÓCITOS E EMBRIÕES BOVINOS 
 
 
 
Dissertação de Mestrado submetida à 
Coordenação do Programa de Pós-Graduação 
em Farmacologia do Departamento de Fisiologia 
e Farmacologia da Faculdade de Medicina da 
Universidade Federal Ceará, como requisito 
para obtenção do título de Mestre em 
Farmacologia. 
Área de concentração: Farmacologia 
 
 
 
 
Orientadora: Profa. Dra. Maria Elisabete Amaral de Moraes 
Co-Orientador: Prof. Dr. Rômulo José Vieira 
 
 
 
 
 
 
FORTALEZA 
2010 
 
 
 
2 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
E93a Evangelista, João José Ferreira 
 Ação farmacológica das vitaminas A & E na produção de 
oócitos e embriões bovinos / João José Ferreira Evangelista. – 
Fortaleza, 2010. 
 107 f. : il. 
 
 Orientador: Profa. Dra. Maria Elisabete Amaral de Moraes 
 Dissertação (Mestrado) – Universidade Federal do Ceará. 
Faculdade de Medicina. Programa de Pós-Graduação em 
Farmacologia. 
 
1. Recuperação de Oócitos 2. Desenvolvimento Embrionário 
3. Vitamina A 4. Vitamina E I. Moraes, Maria Elisabete Amaral 
de (Orient.) II. Título. 
 
 CDD: 615.1 
 
 
 
3 
JOÃO JOSÉ FERREIRA EVANGELISTA 
 
AÇÃO FARMACOLÓGICA DAS VITAMINAS A & E NA PRODUÇÃO DE 
OÓCITOS E EMBRIÕES BOVINOS IN VITRO 
 
 
 
 
Aprovada em: 07/01/2010. 
 
 
BANCA EXAMINADORA 
 
 
_________________________________________________________ 
Profa. Dra. Maria Elisabete Amaral de Moraes – Orientadora 
Universidade Federal do Ceará - UFC 
 
 
________________________________________________________ 
Prof. Dr. Rômulo José Vieira - Co-Orientador 
Universidade Federal do Piauí – UFPI 
Faculdade Integral Diferencial - FACID 
 
 
________________________________________________________ 
Prof. Dr. Francisco Vagnaldo Fechine Jamacaru 
Universidade Federal do Ceará - UFC 
 
 
________________________________________________________ 
Profa. Dra. Gisela Costa Camarão 
Universidade Federal do Ceará - UFC 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
4 
AGRADECIMENTOS 
 
 A Deus, por estar comigo em todos os momentos. 
 
 Ao meu Pai e Mestre Sérgio Evangelista, um grande exemplo de homem 
íntegro e um grande profissional, obrigado por estar do meu lado e vibrando por mais 
esta nova conquista. 
 
 A minha Mãe Zélia, guerreira em todos os sentidos, obrigado por me 
ajudar e estar do meu lado nas minhas derrotas e comemorar sempre os momentos de 
alegrias. 
 
 A minha esposa Janaina, que está e sempre estará ao meu lado, obrigado 
por me fazer me erguer das minhas derrotas e vibrar comigo nos momentos de alegrias 
e conquistas. 
 
 Ao meu filhão João Filho pela demonstração de uma Vida cheia de 
energia, e que tudo na vida vale a pena ser vivido, peço desculpas pela ausência em 
momentos difíceis e importantes, pelas brigas incontidas e desnecessárias, mas às 
vezes necessárias, obrigado por você existir! 
 
 Aos meus irmãos Serginho, Neusalídia, Patrícia e Ricardo, obrigado pela 
motivação e companheirismo, mesmo nos momentos de ausência. 
 
 Às minhas queridas Avós Lídia (in memorian) e Neusa (in memorian), 
obrigado por estar olhando por mim e vibrando por mais esta nova conquista. 
 
 
 Aos meus queridos Avôs João Evangelista (in memorian) e José Ferreira, 
dois grandes exemplos de vida que sempre estarão presentes no meu caminho 
profissional e nas minhas conquistas. 
 
 Ao meu Sogro Chico Monteiro, pelo exemplo de vida e um grande 
profissional que lutou pela vida. 
 
 A minha Sogra Helena Serra Azul, sempre presente e prestativa nos 
momentos mais oportunos, pelo exemplo de bondade e generosidade. 
 
 Professora Dra. Maria Elisabete Amaral de Moraes, pela orientação desta 
Dissertação, obrigado pela paciência e disponibilidade sempre em me ajudar em todos 
os momentos, que transcende a atividade didática profissional. 
 
 Ao professor Dr. Rômulo José Vieira, pela co-orientação desta dissertação 
e pela oportunidade que foi me dada para conhecer um grande profissional na área da 
Veterinária. 
 
 
 
 
5 
 
 À Embriotec Reprodução Animal Ltda, aos profissionais e amigos, Luiz 
Antônio Abadia, Mara Emília Noleto de Carvalho Abadia, Alexandre Sardinha 
Carvalhêdo, Emerson Martins Soares e Waldyr Velloso de Almeida Filho pela 
disponibilidade em ceder as instalações e proporcionarem condições necessárias para 
a execução desta dissertação. 
 
 Ao professor Dr. Arlindo de Alencar Araripe Moura, pela contribuição na 
realização deste projeto com seus conhecimentos e amizade. 
 
 Ao Dr. Carlos Eduardo Azevedo Souza, pelo préstimo apoio na realização 
deste projeto e pelo prazer desta nova amizade. 
 
 Ao Dr. Assis Roberto de Bem (in memorian), pelo seu exemplo de vida 
dedico a minha eterna gratidão aos conhecimentos recebidos para minha vida pessoal 
e profissional. 
 
 Ao amigo Regivaldo Vieira de Souza, por sempre participar de momentos 
importantes na minha vida profissional. 
 
 A todos os professores do Programa de Pós-Graduação do Departamento 
de Fisiologia e Farmacologia da Universidade Federal do Ceará, pelos ensinamentos a 
mim emitidos. 
 
 A todos da biblioteca, em especial para Norma de Carvalho Linhares, 
Rosane Maria Costa e Eliene Gomes Vieira Nascimento pela competência na 
orientação da normalização desta Dissertação. 
 
 A toda a minha FAMÍLIA e AMIGOS, que estiveram presentes e solidários 
na realização deste trabalho. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
6 
 
 
 
 
 
 
Estou convencido, porém, de que a rigorosidade, a séria disciplina intelectual, o exercício da 
curiosidade não me fazem necessariamente um ser mal-amado, arrogante, cheio de mim mesmo. 
Ou, em outras palavras, não é a minha arrogância intelectual a que fala de minha 
rigorosidade científica. Nem a arrogância é sinal de competência, nem a competência é causa 
de arrogância. Não nego a competência, por outro lado, de certos arrogantes, mas lamento 
neles a ausência de simplicidade que, não diminuindo em nada seu saber, os faria gente 
melhor. Gente mais gente. 
 
 
 
(Paulo Freire) 
 
 
 
 
 
 
 
 
7 
RESUMO 
 
 
Na produção in vitro (PIV) de embriões bovinos vários fatores contribuem para as 
variáveis na produção e qualidade dos oócitos e embriões. Avaliou-se o uso parenteral 
de vitamina A (VA) e vitamina E (VE) na produção de oócitos colhidos por aspiração 
folicular (OPU) e embriões por produção in vitro (PIV) em de vacas (n=22), sendo: 
Simental (S) (n=2); Nelore (N) (n=4); Brahma (B) (n=5) e Gir (G) (n=11). Todos os 
animais foram alocados na fase pré-tratamento (F1) (n=22) (não receberam vitaminas) 
e os mesmos animais utilizados para a fase pós-tratamento (F2) (receberam 1.000.000 
UI de vitamina A e 1g de vitamina E). A primeira OPU foi na F1, logo em seguida foi 
aplicado 1.000.000 UI de VA e 1g de VE, e após 12 dias realizou-se nova OPU para 
fazer a F2. Os oócitos (CCO) foram maturados, fecundados e cultivados in vitro. As 44 
OPU produziram 520 oócitos, 217 (F1) e 303 (F2), havendo efeito significativo, com 
acréscimo de 86 oócitos, obtendo média e desvio padrão 9,86±5,53 F1 e 13,77±2,0 F2, 
(*p<0,0219). Quando separada as raças NBG (Nelore, Brahma e Gir) (n=20) houve 
acréscimo de 95 oócitos, obtendo média e desvio padrão 9,90±5,81 F1-NBG e 
14,65±9,44 F2-NBG, (*p<0,0085). As 44 PIV produziram 224 embriões, sendo 93 F1 e 
131 F2, obtendo média e desvio padrão 4,23±3,09 F1 e 5,95±4,05 F2, (*p<0,0228). 
Quando separadaas NBG a produção foi de 214 embriões, havendo acréscimo de 38 
embriões, obtendo valores de 4,45±3,15 F1 e 6,25±4,09 F2, (*p<0,0285). Houve um 
efeito significativo na quantidade produzida de oócitos (n=22) e oócitos NBG (n=20). 
Houve efeito na produção de embriões de todas as raças (n=22) e embriões NBG 
(n=20). A suplementação com VA e VE aumentou o número de oócitos totais (1,7±0,7); 
oócitos NBG (1,8±0,8); embriões totais (3,9±1,6) e embriões NBG (4,7±1,6). A resposta 
da F2 comparado com a F1 na produção de oócitos e embriões foi significativa quando 
todas as raças estavam agrupadas e também quando foi agrupado apenas as Bos 
taurus indicus (NBG). O uso das vitaminas A e E pode ser usada para maior 
recuperação oócitária e embrionária em raças Zebuínas. 
Palavras-chave: Recuperação de Oócitos. Desenvolvimento Embrionário. Vitamina A. 
Vitamina E. 
 
 
 
 
8 
ABSTRACT 
 
The in vitro (IVP) bovine embryos production has several factors that contribute to the 
variables in the production and quality of oocytes and embryos. We evaluated the 
parenteral use of vitamin A (VA) and vitamin E (VE) in the production of oocytes 
collected by follicular aspiration (OPU) and embryos by in vitro production (IVP) in cows 
(n = 22), where: Simmental (S) (n = 2), Nelore (N) (n = 4), Brahma (B) (n = 5) and Gir 
(G) (n = 11). All animals were allocated in the pre-treatment (F1) (n = 22) (not receiving 
vitamins) and the same animals used for post-treatment (F2) (received 1,000,000 IU of 
vitamin A and vitamin 1g E). The first OPU was in F1, soon after 1,000,000 IU was 
administered 1 g of VE and VA, and after 12 days was held to make the new OPU F2. 
Oocytes (COC) were matured, fertilized and cultured in vitro. The OPU 44 yielded 520 
oocytes, 217 (F1) and 303 (F2), with significant effect, an increase of 86 oocytes, 
obtaining mean and standard deviation 9.86 ± 5.53 13.77 ± 2.0 F1 and F2, (*p <0.0219). 
When separate races NBG (Nelore, Brahman and Gir) (n = 20) there was an increase of 
95 oocytes, obtaining mean and standard deviation 9.90 ± 5.81 and 14.65 NBG F1-F2-
NBG ± 9.44, (*p <0.0085). The 44 IVP embryos produced 224, 93 F1 and 131 F2, 
getting mean and standard deviation 4.23 ± 3.09 5.95 ± 4.05 F1 and F2, (*p <0.0228). 
When separated from the NBG production was 214 embryos, with an increase of 38 
embryos, obtaining values of 4.45 ± 3.15 6.25 ± 4.09 F1 and F2, (*p <0.0285). There 
was a significant effect on the quantity produced of oocytes (n = 22) and NBG oocytes 
(n = 20). It was an increased in all breeds embryos production (n = 22) and NBG 
embryos (n = 20). Supplementation with VE and VA increased the total number of 
oocytes (1.7 ± 0.7); NBG oocytes (1.8 ± 0.8); total embryos (3.9 ± 1.6) and embryos 
NBG (4 7 ± 1.6). The response of the F2 compared to F1 in the production of oocytes 
and embryos was significant when all races were grouped together and also when it was 
grouped only Bos taurus indicus (NBG). The use of vitamins A and E can be used to 
greater oocyte recovery and embryo in Zebu breeds. 
Keywords: Oocyte Retrieval. Embryonic Development. Vitamin A. Vitamin E. 
 
 
 
 
9 
LISTA DE FIGURAS 
 
1 
 
 
Dinâmica do desenvolvimento folicular ovariano e secreção de 
gonadotrofinas durante ciclos estrais de 2 e 3 ondas em bovinos............ 
 
31 
2 
 
Doadoras de oócitos da raça Nelore ........................................................ 56 
3 
 
Doadoras de oócitos da raça Gir............................................................... 56 
4 
 
Bomba de Vácuo....................................................................................... 59 
5 
 
Doadora de oócitos da raça Nelore em processo de aspiração folicular... 60 
6 
 
 
Fotomicrografia de oócitos em placa de petri, momentos após aspiração 
folicular....................................................................................................... 
 
61 
 
7 
 
Acondicionamento de oócitos para transporte........................................... 63 
8 
 
Estufa de maturação oocitária................................................................... 64 
9 
 
Fotomicrografia de oócitos após maturação in vitro. ................................ 65 
10 
 
Fotomicrografia de oócitos após maturação in vitro.................................. 65 
11 
 
Fotomicrografia de oócito em processo de fecundação in vitro................. 66 
12 
 
Fotomicrografia de embriões em processo de cultivo in vitro.................... 67 
13 
 
Fotomicrografia de oócitos momentos após a aspiração folicular (OPU).. 70 
14 
 
Produção de oócitos verificada nas fases de pré e pós-tratamento 
considerando todos os animais estudados................................................ 
 
72 
 
15 
 
Produção de oócitos verificada nas fases de pré e pós-tratamento 
considerando conjuntamente as raças Nelore, Brahma e Gir................... 
 
72 
 
16 
 
 
 
Produção de oócitos verificada nas fases de pré e pós-tratamento 
considerando as quatro raças individualmente: Simental, Nelore, 
Brahma e Gir.............................................................................................. 
 
 
75 
17 
 
 
 
Comparação entre as raças Simental, Nelore, Brahma e Gir, em relação 
à produção de oócitos, em cada fase do estudo (pré e pós-
tratamento.................................................................................................. 
 
 
76 
18 
 
 
Eficácia do tratamento com as vitaminas A e E calculada em função da 
produção de oócitos para cada raça estudada: Simental, Nelore, 
Brahma e Gir.............................................................................................. 
 
 
77 
 
 
 
10 
19 
 
Fotomicrografia de embriões produzidos por fecundação in vitro............. 79 
20 
 
 
Produção de embriões verificada nas fases de pré e pós-tratamento 
considerando todos os animais estudados................................................ 
80 
 
21 
 
 
Produção de embriões verificada nas fases de pré e pós-tratamento 
considerando conjuntamente as raças Nelore, Brahma e Gir................... 
 
80 
22 
 
 
 
Produção de embriões verificada nas fases de pré e pós-tratamento 
considerando as quatro raças individualmente: Simental, Nelore, 
Brahma e Gir.............................................................................................. 
 
 
84 
23 
 
 
Comparação entre as raças Simental, Nelore, Brahma e Gir, em relação 
à produção de embriões, em cada fase do estudo (pré e pós-
tratamento)................................................................................................. 
 
 
85 
 
24 
 
 
 
Eficácia do tratamento com as vitaminas A e E calculada em função da 
produção de embriões para cada raça estudada: Simental, Nelore, 
Brahma e Gir.............................................................................................. 
 
 
86 
25 
 
 
Taxa de conversão de oócitos para embriões verificada nas fases de 
pré e pós-tratamento considerando todos os animais estudados............. 
 
88 
26 
 
 
Taxa de conversão de oócitos para embriões verificada nas fases de 
pré e pós-tratamento considerando conjuntamente as raças Nelore, 
Brahma e Gir.............................................................................................. 
 
 
88 
 
27 
 
 
 
Taxa de conversão de oócitos para embriões verificada nas fases de 
pré e pós-tratamento considerando as quatro raças individualmente: 
Simental, Nelore, Brahma e Gir................................................................. 
 
 
89 
28 
 
 
 
Comparação entre as raças Simental, Nelore, Brahma e Gir, em relação 
à taxa de conversão de oócitos para embriões, em cada fase do estudo 
(pré e pós-tratamento................................................................................ 
 
 
91 
29 
 
 
Eficácia do tratamento com as vitaminas A e E calculada em função da 
taxa de conversão de oócitos para embriõespara cada raça estudada... 
 
92 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
11 
LISTA DE TABELAS 
 
 
1 
 
 
 
 
Valores da média e desvio padrão do número de oócitos referentes às 
contagens efetuadas em todos os 22 animais estudados e nas 20 matrizes 
pertencentes às raças Nelore, Brahma e Gir em cada fase do estudo (pré e 
pós-tratamento).................................................................................................. 
 
 
 
71 
 
2 Valores da média e desvio padrão do número de oócitos referentes às 
contagens efetuadas nos animais pertencentes às raças Simental (2), Nelore 
(4), Brahma (6) e Gir (11) em cada fase do estudo (pré e pós-
tratamento)......................................................................................................... 
 
 
 
73 
 
3 Mediana, intervalo interquartil e valores mínimo e máximo da eficácia do 
tratamento com as vitaminas A e E, calculada em função da produção de 
oócitos, para cada raça individualmente e para todos os animais estudados... 
 
 
77 
 
4 Valores da média e desvio padrão do número de embriões referentes às 
contagens efetuadas em todos os 22 animais estudados e nas 20 matrizes 
pertencentes às raças Nelore, Brahma e Gir em cada fase do estudo (pré e 
pós-tratamento).................................................................................................. 
 
 
 
79 
 
5 Valores da média e desvio padrão do número de embriões referentes às 
contagens efetuadas nos animais pertencentes às raças Simental (2), Nelore 
(4), Brahma (6) e Gir (11) em cada fase do estudo (pré e pós-tratamento)...... 
 
 
83 
 
6 Mediana, intervalo interquartil e valores mínimo e máximo da eficácia do 
tratamento com as vitaminas A e E, calculada em função da produção de 
embriões, para cada raça individualmente e para todos os animais 
estudados.......................................................................................................... 
 
 
 
86 
 
7 Valores da média e desvio padrão da taxa de conversão referentes às 
observações realizadas em todos os 22 animais estudados e nas 20 
matrizes pertencentes às raças Nelore, Brahma e Gir em cada fase do 
estudo (pré e pós-tratamento)........................................................................... 
 
 
 
87 
 
8 Valores da média e desvio padrão da taxa de conversão referentes às 
observações realizadas nos animais pertencentes às raças Simental (2), 
Nelore (4), Brahma (6) e Gir (11) em cada fase do estudo (pré e pós-
tratamento)......................................................................................................... 
 
 
 
90 
 
9 Mediana, intervalo interquartil e valores mínimo e máximo da eficácia do 
tratamento com as vitaminas A e E, calculada em função da taxa de 
conversão de oócitos para embriões, para cada raça individualmente e para 
todos os animais estudados.............................................................................. 
 
 
 
92 
 
 
 
 
 
12 
LISTA DE QUADROS 
 
 
1 Produção de oócitos do grupo controle e tratado por aspiração folicular 
(OPU)................................................................................................................. 
 
78 
 
2 Produção de embriões do grupo controle e tratado por produção in vitro 
(PIV)................................................................................................................... 
 
82 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
13 
LISTA DE ABREVIATURAS 
 
 
AF 
 
Aspiração folicular 
AR 
 
Ácido retinóico 
Be 
 
Blastocisto eclodido 
Bi 
 
Blastocisto inicial 
Bl 
 
Blastocisto 
Bx 
 
Blastocisto expandido 
CCO 
 
Complexo cumulus-oócito 
CE 
 
Ciclo Estral 
CEHC 
 
Hydroxychroman carboxietil 
CIV 
 
Cultivo in vitro 
CRBP 
 
Proteínas celulares de ligação com retinol 
FAO 
 
Food and Agriculture Organization of the United Nations 
FIV 
 
Fecundação ou Fertilização in vitro 
FSH 
 
Hormônio Folículo Estimulante 
GAP 
 
Junções com o citoplasma 
HECM 
 
Hamster Embryo Culture Medium 
IA 
 
Inseminação artificial 
IBGE 
 
Instituto Brasileiro de Geografia e Estatística 
IETS 
 
International Embryo Transfer Society 
IU 
 
Unidade internacional 
LH 
 
Hormônio luteinizante 
MII Metáfase II 
 
 
 
14 
 
MIV 
 
Maturação in vitro 
MZT 
 
Transição maternozigótica 
OPU 
 
 
Ovum pick-up - aspiração folicular transvaginal guiada por ultra-
sonografia 
PIV 
 
Produção in vitro de embriões 
PIVE 
 
Produção in vitro de embriões 
RBP 
 
Proteína de ligação do retinol 
SFB 
 
Soro fetal bovino 
SOF 
 
Synthetic Oviductal Fluid 
TALP 
 
Tyrode modificado 
TE 
 
Transferência de embriões 
TCM-199 
 
Meio Tissue Culture Medium 
TOC 
 
Tocoferois 
Toc-3 
 
Tocotrienois 
TRA 
 
Tecnologias de Reprodução Assistida 
VG 
 
Vesícula germinativa 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
15 
SUMÁRIO 
 
 
1 
 
INTRODUÇÃO............................................................................................ 17 
2 
 
REVISÃO DE LITERATURA...................................................................... 28 
2.1 
 
Fisiologia bovina....................................................................................... 28 
2.2 
 
Produção in vitro de embriões................................................................ 32 
2.3 
 
Vitaminas................................................................................................... 43 
2..3.1 
 
Vitamina A................................................................................................... 44 
2.3.2 
 
Vitamina E................................................................................................... 46 
3 
 
JUSTIFICATIVA......................................................................................... 51 
4 
 
OBJETIVOS............................................................................................... 52 
4.1 
 
Objetivos gerais........................................................................................ 52 
4.2 
 
Objetivos específicos............................................................................... 52 
5 
 
PROTOCOLO EXPERIMENTAL................................................................ 53 
5.1 
 
Local do experimento............................................................................... 53 
5.2 
 
Aspectos éticos........................................................................................ 53 
5.3 
 
Fluxograma................................................................................................ 54 
5.4 
 
Animais experimentais............................................................................. 55 
5.5 
 
Apresentação das Vitaminas................................................................... 57 
5.6 
 
Fases experimentais................................................................................ 
 
57 
5.7 
 
Metodologia experimental........................................................................ 57 
5.8 
 
Aspiração folicular.................................................................................... 58 
5.9 
 
Manipulação de oócitos........................................................................... 61 
 
 
 
16 
5.9.1 
 
Lavagem e seleção dos oócitos................................................................. 61 
5.9.2 
 
Transporte de oócitos................................................................................. 62 
5.9.3 
 
Maturação in vitro (MIV).............................................................................. 63 
5.9.4 
 
Fecundação in vitro (FIV)........................................................................... 66 
5.9.5 
 
Cultivo in vitro (CIV).................................................................................... 67 
5.10 
 
Análise estatística....................................................................................68 
6 
 
RESULTADOS........................................................................................... 70 
7 
 
DISCUSSÃO............................................................................................... 93 
8 
 
CONSIDERAÇÕES FINAIS....................................................................... 98 
9 
 
CONCLUSÃO............................................................................................. 99 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
17 
1 INTRODUÇÃO 
 
 
Os bovinos estão indubitavelmente entre as mais importantes espécies de 
animais domésticos no mundo, por isso eles estão incluídos nas “grande cinco” 
espécies cultivadas no mundo, juntamente com ovinos, caprinos, frangos e suínos. De 
acordo com a Food and Agriculture Organization of the United Nations (FAO), o 
tamanho da população mundial de bovinos domésticos é de cerca de 1,4 bilhões. Essa 
espécie também compreende uma notável diversidade. A FAO relata a existência de 
897 raças locais adaptadas a ambientes muito diferentes e difíceis, abrangendo desde 
montanhas a áreas desérticas e condições extremas em termos de umidade, 
temperatura e altitude (AJMONE-MARSAN; GARCIA, 2008). 
A domesticação bovina é um fato, em milênios de acasalamentos seletivos o 
homem tem moldado os ancestrais selvagens dos bovinos, produzindo uma série de 
raças principalmente domadas, produtivas e altamente diferenciadas por todo o mundo. 
A história dos bovinos domésticos teve início há cerca de 10.000 anos com a 
domesticação (AJMONE-MARSAN; GARCIA, 2008). 
A domesticação dos animais representou um marco na história da 
humanidade. Ela gradualmente transformou populações migratórias de caçadores em 
fazendeiros com assentamentos estáveis. Seguiram-se a segurança do alimento e 
abundância relativa, permitindo o crescimento da população, a estratificação 
progressiva da sociedade e o desenvolvimento da religião, cultura e ciência (AJMONE-
MARSAN; GARCIA, 2008). 
O rebanho bovino brasileiro em 2008 era composto de 202.287.196 cabeças, 
distribuídas em todo território segundo o Instituto Brasileiro de Geografia e Estatística 
(IBGE). O estado com maior população bovina é Mato Grosso com 26.018.216 animais 
e a menor população encontra-se no Distrito Federal com um rebanho de 80.000 
cabeças. O Ceará tem um rebanho de 2.460.523 bovinos (IBGE, 2008). De fundamental 
importância tem sido a nutrição do rebanho, pois influencia de forma significativa a 
eficiência reprodutiva dos animais (REICHENBACH, 2003). 
 
 
 
18 
A eficiência reprodutiva é determinante na obtenção de maior produtividade e 
retorno econômico nos sistemas de produção animal. As tecnologias utilizadas para 
influenciar a eficiência reprodutiva incluem as denominadas tecnologias de reprodução 
assistida (TRA), como a inseminação artificial, a sincronização dos ciclos reprodutivos, 
a produção in vivo e in vitro de embriões, a criopreservação de gametas e embriões, 
entre outras (PIVATO, 2006). 
No caso dos bovinos, em média, um macho gera entre 15 a 20 produtos por 
ano, enquanto uma fêmea, na maioria das vezes, gera uma cria por ano, o que 
corresponde a oito a dez produtos durante toda sua vida reprodutiva (ABADIA, 2006). 
A seleção genética em bovinos proporcionou animais com alta produção de 
leite e carne. No entanto, em condições naturais, vacas conseguem produzir no 
máximo, uma cria por ano. A multiplicação mais efetiva de fêmeas bovinas 
geneticamente superiores implica na necessidade de promover múltiplas ovulações 
como ferramenta importante para aumentar a produção de embriões (AMARAL et al., 
2004). 
Bem et al. (1995) relataram o enorme progresso científico no que concerne à 
embriologia nos mamíferos na década de 90 e mencionaram novas tecnologias que 
foram desenvolvidas e outras que estavam em desenvolvimento por centenas de 
equipes no mundo todo. Abordagens celulares, moleculares e genéticas já criavam 
novas oportunidades para o desenvolvimento da pecuária, nesta ocasião se incluía a 
transferência de embriões, como sendo a primeira das modernas tecnologias a ser 
incrementada em nível de campo. 
A partir da década de 50, a inseminação artificial (IA) e a criopreservação do 
sêmen derrubaram barreiras para a disseminação do material genético do macho. No 
entanto, somente a partir dos anos 80, houve melhor aproveitamento genético de 
fêmeas, com os avanços científicos determinados pela superovulação e transferência 
de embriões e, mais recentemente, pela produção “in vitro” (PIV) de embriões (LEIVAS, 
2006). 
No atual contexto de evolução da produtividade na pecuária nacional, 
associado às evoluções científicas e tecnológicas, várias biotecnologias ligadas a 
reprodução animal vêm sendo desenvolvidas e aprimoradas com o intuito de aumentar 
 
 
 
19 
a eficiência reprodutiva, maximizando a produção de animais geneticamente superiores, 
visando o aproveitamento deste material genético para obtenção do maior número de 
descendentes, em um curto período de tempo. Seguindo a evolução das principais 
biotecnologias adotadas e trabalhadas no Brasil, é importante ressaltar, inicialmente, o 
papel da IA, sendo a primeira biotecnologia adotada nos sistemas de produção 
brasileiros que visa à multiplicação genética de touros de alto valor (RENESTO, 2004). 
Os avanços obtidos nas biotécnicas reprodutivas ao longo dos anos 
permitiram uma maior participação da fêmea bovina no processo de melhoramento 
genético do rebanho. Isso porque, o número de descendentes deixados por uma única 
fêmea ao longo de sua vida reprodutiva aumentou significativamente com o 
aperfeiçoamento das técnicas de transferência e produção in vitro de embriões 
(GONÇALVES et al., 2007). 
Do ponto de vista do risco de doenças, o deslocamento de embriões é sem 
dúvida muito mais seguro para o comércio, que transportar animais ou sêmen 
(STRINGFELLOW et al., 1998). 
A produção in vitro de embriões (PIVE) expandiu-se nas diferentes espécies 
animais pouco tempo após o nascimento de Louise Brown em 1978, na Inglaterra, o 
primeiro bebê de proveta do mundo (VARAGO et al., 2008). 
Até a década de 40, o conhecimento sobre a fecundação in vitro (FIV) era 
baseado no estudo de ovócitos de estrelas do mar. Os invertebrados marinhos foram 
primeiramente utilizados na pesquisa, porque, ao contrário dos mamíferos, a 
fecundação ocorre externamente ao sistema reprodutor da fêmea. Embora o primeiro 
estudo relativo à fecundação em mamíferos tenha ocorrido em 1935, até a década de 
50 praticamente nenhum sucesso tinha sido obtido. Em 1951, Austin e Chang, 
observaram que, quando os espermatozóides eram depositados no trato reprodutivo da 
coelha logo após o momento da ovulação, poucos oócitos eram fecundados. Por outro 
lado, uma proporção muito grande de gametas era fecundada quando a inseminação 
ocorria na tuba uterina, várias horas antes da ovulação. Foi postulado que os 
espermatozóides de algumas espécies mamíferas necessitavam de algum tempo no 
trato reprodutivo feminino antes de adquirir a capacidade de penetrar nos oócitos. Este 
 
 
 
20 
conjunto de mudanças foi denominado de capacitação espermática (VARAGO et al., 
2008). 
Varago et al. (2008) relatam que o aumento no interesse na fecundação in 
vitro de oócitos de mamíferos ocorreu após a descoberta da capacitação espermática, 
em poucos anos, oócitos de coelha foram fecundados in vitro utilizando-se 
espermatozóides capacitados no útero. No entanto, somente após 20 anos é que o 
processo de fecundação de oócitos de coelha foi repetido, desta vez utilizando-se 
espermatozóides capacitados. 
Em bovinos, até 1985, poucos relatos de fecundação in vitro eram 
encontrados na literatura, e a maioria dos estudos era realizada na América do Norte, 
utilizando oócitos maturados in vivo. O nascimento do primeiro bezerro por fecundação 
in vitro ocorreu no dia 9 de junho de 1981.Nesse trabalho, foram utilizadas 22 doadoras 
e sete receptoras e, para a fecundação, foram utilizadas amostras de sêmen fresco e 
congelado. As amostras de sêmen eram de animais pré-selecionados para inseminação 
artificial, o que indicava uma boa qualidade seminal. A colheita dos oócitos foi realizada 
por via cirúrgica e foram recuperados 177 oócitos já maturados dos quais 52% foram 
fecundados. Embora grande quantidade de embriões tenha sido transferida, a gestação 
só foi alcançada em uma receptora, a qual havia recebido apenas um embrião no 
estágio de quatro células. O primeiro bezerro de fecundação in vitro nasceu pesando 45 
kg e, após alguns meses de observação, não foram constatadas alterações no 
desenvolvimento e comportamento do animal (VARAGO et al., 2008). 
Desde a década de 70 quando a transferência de embriões (TE) foi iniciada, 
esta tecnologia foi progressivamente propagada, passando a ser cada vez mais 
utilizada pelos técnicos atuantes nesse setor. Entretanto, foi a partir do ano 2.000 que 
se observou o expressivo crescimento da produção de embriões in vitro, o que fez com 
que o Brasil passasse a ser reconhecido como referência mundial na área de 
tecnologias de embriões. Nos últimos quatro anos, o Brasil foi responsável por 
aproximadamente 25% da produção total e 50% da produção in vitro de embriões 
bovinos no mundo (ALONSO, 2008). 
A Fertilização In Vitro (FIV), é considerada a terceira geração de 
biotecnologia aplicada ao Melhoramento Genético, após a IA e a TE (RENESTO,2004). 
 
 
 
21 
2004). O dado estatístico sobre o comércio de transferência de embriões elaborados 
pela “International Embryo Transfer Society” (IETS) em 2006, mostra que as 
transferências de embriões produzidos in vivo e de embriões PIV continuou a aumentar 
em pouco menos de um milhão de transferências. Em todo o mundo, mais de 670.000 
embriões produzidos in vivo foram transferidos, dos quais aproximadamente metade foi 
transferido a fresco e metade congelados. Em contrapartida, cerca de 292.000 
embriões PIV foram transferidos no mesmo ano, sendo a maioria (aproximadamente 
75%) transferida a fresco (LONERGAN, 2008). 
Segundo relatório apresentado pela IETS, o Brasil ocupa posição destacada 
entre os países que aplicam comercialmente e em larga escala as diversas 
biotecnologias da reprodução animal, tendo sido responsável por cerca de 200.000 
transferências de embriões bovinos produzidos in vitro (PIV) em 2006, o equivalente a 
aproximadamente 50% de todo movimento mundial (ALONSO, 2008). 
O Brasil ocupa uma posição de destaque no cenário mundial no uso da 
biotecnologia de produção in vitro (PIV) de embriões bovinos. Esta técnica tornou-se de 
eleição por muitos criadores pelas vantagens que apresenta como a redução do manejo 
na propriedade, além de oferecer bom índice de produção (LEIVAS, 2006). 
A produção in vitro de embriões (PIV) é uma importante biotécnica de 
reprodução assistida aplicável a mamíferos domésticos de interesse econômico. Essa 
biotécnica pode ser utilizada, alternativamente, para acelerar a produção de animais 
geneticamente superiores e impedir o descarte precoce de fêmeas portadoras de 
alterações adquiridas que as impeçam de reproduzir pela forma natural ou via 
transferência de embriões (TE). A PIV é também uma excelente ferramenta para 
pesquisa de fenômenos biológicos que ocorrem durante a maturação, fecundação e 
cultivo in vitro de oócitos, capacitação espermática e eventos relacionados ao início do 
desenvolvimento embrionário na fase de pré-implantação. Devido à sua capacidade de 
produzir um grande número de embriões, a PIV se tornou um instrumento indispensável 
para outras biotécnicas como a clonagem, a manipulação de genes e a transferência de 
núcleos (GONÇALVES et al., 2007). 
Na bovinocultura brasileira, essas tecnologias de reprodução assistida 
também vêm sendo amplamente utilizadas e adaptadas ao nosso sistema de produção 
 
 
 
22 
e, ao longo da sua evolução, tem revelado bons índices reprodutivos, confirmando ser 
um processo economicamente viável, bastante divulgado e empregado na pecuária 
moderna (RENESTO, 2004). 
A transferência de embriões em bovinos continua sendo um dos métodos 
mais econômicos e práticos para a obtenção do aumento das taxas de reprodução de 
fêmeas com alto valor genético, tanto em rebanhos de corte como de leite 
(REICHENBACH, 2003). 
Segundo Rumpf (2007) a PIV proporciona um melhor aproveitamento de 
matrizes de elevado mérito genérico, podendo chegar a produzir 36 crias por ano de 
uma única fêmea, para Varago et al. (2008) é possível obter entre 25 e 50 
bezerros/vaca/ano. Podendo ser utilizada em bezerras pré-púberes, vacas em início de 
gestação, vacas com subfertilidade adquirida e vacas senis. Renesto (2004) citou outra 
vantagem particular da FIV em relação a outras biotécnicas, que é a maximização do 
uso do sêmen, permitindo maior produção de embriões com doses de alto valor 
comercial e inclusive sêmen sexado. 
A biotecnologia de embriões também é importante para acelerar o 
melhoramento genético de gado e para as tecnologias emergentes como transferência 
nuclear de células somáticas (FEUGANG et al., 2009). 
A PIV utilizada convencionalmente para estudos básicos de gametas ou 
suporte para outras biotécnicas, tornou-se também uma importante ferramenta no 
melhoramento genético. Na década de 90, associada à obtenção crescente de 
resultados melhores e mais estáveis, passou a ser aplicada comercialmente em vários 
países. Fatos como estes permitiram o uso da OPU (ovum pick-up)/PIV em animais de 
diferentes categorias (idade, estatus reprodutivo, aptidão) e não apenas para animais 
com infertilidade adquirida ou que não respondem a superovulação, finalidade para a 
qual foi inicialmente proposta (LEIVAS, 2006). 
A produção in vitro (PIV) de embriões bovinos obteve avanços consideráveis 
nos últimos anos e está sendo rapidamente incorporada aos projetos de produção 
(ALVES et al., 2003). 
O sucesso da PIV está associado a diferentes variáveis como a raça, idade, 
fase do ciclo e principalmente o fator individual da doadora que é determinante no 
 
 
 
23 
número de oócitos viáveis (varia entre zero a mais de cem), ou mesmo índice de 
produção embrionária e bezerros nascidos. Fatores externos como temperatura, 
nutrição e condições de estresse podem favorecer, ou prejudicar os resultados de 
acordo com o potencial de cada animal. Além destes fatores, o sêmen utilizado para a 
fecundação, assim como o protocolo empregado em todo o processo de maturação in 
vitro (MIV), fecundação in vitro (FIV) e cultivo in vitro (CIV) são decisivos nos índices de 
produção e qualidade dos embriões (LEIVAS, 2006). 
A PIV de embriões bovinos é utilizada comercialmente com freqüência 
(LEIVAS, 2006; PASCHOAL et al., 2007), com o objetivo de se obter um maior número 
de produtos nascidos por ano de fêmeas selecionadas (LEIVAS, 2006), sendo 
importante para acelerar a produção de animais geneticamente superiores 
(GONÇALVES et al., 2007) e diminuir o intervalo entre gerações e acelerar o 
melhoramento genético animal (VARAGO et al., 2008). A pesquisa nesta área ainda é 
importante para a otimização dos resultados já estabelecidos com produção de 
embriões de melhor qualidade (PASCHOAL et al., 2008). 
A PIV em bovinos é freqüentemente utilizada para manejar gado com baixa 
fertilidade, mas está se tornando um método de escolha para ampliar o uso de sêmen 
raro e/ou caro ou para o uso mais eficiente de pequenas quantidades de sêmen tais 
como com espermatozóides sexados (LONG, 2008). 
A otimização da técnica de PIV visando à produção de embriões de boa 
qualidade e em número cada vez mais expressivo resultará na diminuição do custo por 
embrião produzido e possibilitará uma maior difusão da técnica entre os produtores. 
Ainda, tais melhorias seriam de grande valia para o aprimoramento de outras 
biotécnicasque dependam da PIV (GONÇALVES et al., 2008). 
Pierson e Ginther em 1984 relataram o início da técnica de detecção e 
monitoramento de estruturas ovarianas por ultra-sonografia transretal, e os mesmos em 
1987 comparam os resultados da ultra-sonografia com os resultados de cortes de 
ovários, sendo a técnica de ultra-som validada como uma ferramenta para detecção de 
folículos com diâmetro >2mm e para monitoramento de corpos lúteos (ADAMS; 
JAISWAL,2008). 
 Em 1985, no Canadá, a equipe de Sirard foi pioneira no uso de laparoscopia 
 
 
 
24 
para recuperação de ovócitos de bovinos maturados in vivo, do ovário de vacas 
doadoras. Em 1988, Pieterse e colaboradores, na Holanda, descreveram a técnica de 
aspiração transvaginal de ovócitos bovinos, usando o auxílio da ultra-sonografia, e 
constataram que era um meio que tornava possível repetidas recuperações de ovócitos 
de uma mesma doadora (PIVATO, 2006). 
No início da década de 90, com a introdução da OPU, seguida pela PIV, a 
expectativa no incremento da produtividade das fêmeas aumentou (RENESTO, 2004). 
A aplicação em escala comercial da PIV se tornou viável após o advento da aspiração 
folicular in vivo e pelo aprimoramento das condições de cultivo in vitro (GONÇALVES et 
al., 2008; PONTES et al., 2008; VARAGO et al, 2008), tendo sido utilizada como 
instrumento importante para exploração maximizada do potencial reprodutivo dos 
rebanhos, diminuindo o intervalo entre gerações e acelerando o melhoramento genético 
animal. Nesta espécie, a produção in vitro de embriões alcançou um desenvolvimento 
tecnológico que atualmente permite a sua aplicação em escala comercial, podendo-se 
obter entre 50 a 100 embriões/fêmea/ano (VARAGO et al., 2008). 
O ganho genético anual em um rebanho com um programa de superovulação 
e transferência de embriões em fêmeas selecionadas é de 1,8 a 2,4 %. Utilizando-se 
novilhas selecionadas pelo pedigree, o índice aumenta, variando entre 2,6 a 3,5%. À 
medida que se avança no emprego de tecnologia, os índices aumentam mais, como no 
caso da bipartição de embriões chegando a 4% (BEM et al., 1995). O ganho genético 
obtido em programas de melhoramento animal, através do emprego de tecnologias de 
embriões, foi estimado em 18 a 22% (REICHENBACH, 2003). Na última década, os 
produtores de leite e carne bovina incrementaram consideravelmente o uso da 
aspiração folicular (OPU) associada à produção in vitro de embriões (PIV) (BRUM et al., 
2006). 
A aspiração folicular transvaginal guiada por ultra-sonografia (OPU) pode ser 
realizada a campo e empregada na produção de embriões bovinos, favorecendo os 
programas de melhoramento genético (ALVES et al., 2003). Kruip e colaboradores 
(1994), recomendaram que a OPU pode ser realizada de forma repetida em vacas com 
até 12 anos ou gestantes. 
 Atualmente, a PIV de embriões compreende três etapas desenvolvidas em 
 
 
 
25 
laboratório: a maturação oocitária in vitro, a fecundação dos oócitos in vitro e o cultivo 
embrionário in vitro até os estádios de mórula e blastocisto, quando os embriões 
poderão ser transferidos ou criopreservados. No entanto, o desenvolvimento da técnica 
se deu de maneira progressiva, sendo que os índices de produção embrionária 
alcançados atualmente e a realização de todo o procedimento dentro do laboratório (in 
vitro) só foi possível após anos de pesquisas em diferentes áreas da biotecnologia e da 
fisiologia. Como exemplo de pesquisas, há o estudo da função, desenvolvimento e 
metabolismo de gametas e embriões, utilização da ultra-sonografia, desenvolvimento de 
fármacos seguros e efetivos como as prostaglandinas e implantes liberadores de 
hormônios, desenvolvimento de meios de cultivo, entre outros. Hoje, é possível produzir 
embriões na espécie bovina, sem levar em consideração o estágio do ciclo estral das 
doadoras, podendo-se repetir o procedimento sem interferir negativamente no número 
de oócitos recuperados (VARAGO et al., 2008). 
O uso comercial em larga escala da PIV está, portanto, vinculada à melhoria 
dos índices zootécnicos e consequentemente a diminuição dos custos. Tendo em vista 
que a aspiração pode ser feita a campo, enquanto a PIV requer laboratório adequado, a 
tendência é que ocorra, no Brasil, o mesmo que em outros países como Alemanha, 
França e Canadá, onde existem laboratórios regionais de PIV que recebem os oócito 
aspirados por veterinários que atuam em fazendas. No laboratório é produzido o 
embrião in vitro que é entregue ao veterinário que o transferirá para vacas receptoras 
que levarão a gestação a termo (RUMPF, 2007). 
 Diversos parâmetros são utilizados para avaliar a qualidade dos embriões 
PIV como morfologia, criotolerância, transcrição (mRNA), eclosão in vitro e prenhez 
após a transferência. Entretanto, nenhuma dessas técnicas permite uma seleção 
eficiente que assegure bons índices de prenhez. O aumento da eficiência da PIV está 
condicionado ao desenvolvimento de trabalhos que visem aperfeiçoar e simplificar as 
condições de cultivo durante as várias etapas do processo, principalmente no que se 
refere à maturação citoplasmática e molecular de oócitos obtida in vitro (GONÇALVES 
et al., 2008). 
Um aumento do interesse na fecundação in vitro de oócitos de mamíferos 
ocorreu após a descoberta da capacitação espermática e, em poucos anos, oócitos de 
 
 
 
26 
coelha foram fecundados in vitro utilizando-se espermatozóides capacitados no útero. 
No entanto, somente após 20 anos é que o processo de fecundação de oócitos de 
coelha foi repetido, desta vez utilizando-se espermatozóides capacitados in vitro 
(VARAGO et al., 2008). 
A atenção conferida nos últimos anos a vitamina A e seus derivados, 
coletivamente conhecidos como retinóis, é devido aos seus efeitos sobre a reprodução 
bovina, que vão desde o desenvolvimento folicular até a fase de pré-implantação 
embrionária (GOMEZ et al., 2006). A demanda de vitamina A em vacas superovuladas 
é estimada maior, tornando a suplementação uma proposta viável interferindo no 
ambiente uterino, no maior aporte de nutrientes para o embrião, entendendo-se assim o 
seu efeito benéfico (AMARAL et al., 2004). 
A vitamina A tem função importante no crescimento, morfogênese e 
diferenciação celular. A utilização desta vitamina em cultivo de embriões in vitro, 
confere melhores resultados de obtenção de blastocistos. As taxas de prenhez são 
animadoras quando comparadas com o grupo que não recebeu suplementação, talvez 
por um melhor desenvolvimento e diferenciação do trofoectoderma (HIDALGO et al., 
2003). 
Livingston et al. (2004) reconheceram que os retinóis são importantes 
reguladores do desenvolvimento nos vertebrados, diferenciações celulares e funções 
teciduais. Estudos demonstraram que o desempenho tanto in vivo como in vitro 
reprodutivo é influenciado por estas substâncias, nos eventos que incluem o 
desenvolvimento folicular, maturação oocitária e o desenvolvimento inicial do 
blastocisto. No ambiente de cultivo de células em atmosfera de CO2 é confirmado a sua 
ação antioxidante. 
A vitamina E ocorre naturalmente nas membranas celulares e está presente 
na proteção celular do estresse oxidativo. Cultura de embriões in vitro adicionada de 
vitamina E, obtiveram melhorias desde o desenvolvimento embrionário inicial, expansão 
do blastocisto a um melhor desenvolvimento gestacional (OLSO, 2000). 
Koo et al. (1997) relataram que a adição de composto de vitaminas aos meios 
de cultura não melhoram a qualidade e quantidade de embriões suínos no 
desenvolvimento “in vitro”, contrariando o relato de Naruse e colaboradores (2006) onde 
 
 
 
27 
a adição foi positiva para o desenvolvimento e melhoria da qualidade do embrião desta 
espécie. 
Segundo Velas-Pereira et al. (2002), a vitaminaE exerce papel importante na 
contenção da fragilidade eritrocitária de bovinos tratados com gossipol. 
 A viabilidade econômica da técnica de produção in vitro de embriões está 
intimamente relacionada à eficiência dos laboratórios. Não apenas com relação à taxa 
de produção dos embriões, mas principalmente com a qualidade do embrião, a 
capacidade de estabelecer gestação, desenvolvimento fetal e placentário normais, 
obtenção de gestações saudáveis e viáveis. Embora o custo da produção in vitro de 
embriões seja superior ao da transferência de embriões, justifica-se o seu emprego em 
caso de fêmeas com distúrbios reprodutivos adquiridos que inviabilizem a produção de 
descendentes (VARAGO et al., 2008). 
A necessidade de compreensão exata das exigências metabólicas e 
fisiológicas do oócito e do espermatozóide, bem como dos embriões em sistemas de 
cultivo in vitro apontam para a realização de novas pesquisas até que seja estabelecida 
a condição ideal para que o maior número possível de oócitos maturados in vitro possa 
ser fecundado e sustentem o subseqüente desenvolvimento do embrião (VARAGO et 
al., 2008). 
Apesar dos avanços ocorridos nos últimos anos nessa biotécnica de PIV, 
várias questões relacionadas à avaliação da competência biológica dos gametas e ao 
próprio sistema de cultivo precisam ser esclarecidas (RUMPF, 2007). 
 Há poucas informações na literatura sobre a ação farmacológica da vitamina 
A e E de forma combinada na produção e qualidade de oócitos e embriões. Além disso, 
existe carência de trabalhos que correlacionam a importância das vitaminas e as 
respostas reprodutivas dos animais. 
A oferta suficiente de alimentos saudáveis, a prevenção e controle de 
enfermidades e a sobrevivência harmoniosa do homem nos diferentes ecossistemas é 
sem dúvida o maior desafio da ciência na atualidade. O investimento na biotecnologia 
animal no Brasil é respaldado por dois principais fatos. O primeiro é o fato que o Brasil 
ainda lidera a lista dos países com maior biodiversidade e o segundo, é que o mercado 
interno por carne e leite é o terceiro maior do mundo (RUMPF, 2007). 
 
 
 
28 
2 REVISÃO DE LITERATURA 
 
 
2.1 Fisiologia bovina 
 
 
A fêmea bovina tem em seus ovários ao nascimento em torno de 150 mil 
folículos primordiais (0 a 700.000). Ao chegar a puberdade este número diminui ficando 
entre 12.000 a 86.000, e destes, somente poucos chegam a ovulação (0,01%) durante 
o período de vida, enquanto o restante sofre atresia (PIVATO, 2006). 
A foliculogênese é o processo de desenvolvimento pelo qual um folículo 
primordial ativado se desenvolve até o tamanho de folículo pré-ovulatório 
acompanhando o crescimento e a diferenciação do oócito e da camada de células da 
granulosa que o circunda. Baseado nas várias características morfológicas, incluindo o 
número de camadas de células da granulosa que circunda o oócito, as características 
morfológicas das células da granulosa, o diâmetro do oócito e do folículo, além da 
presença ou ausência do antro cheio de líquido, os folículos são classificados de várias 
maneiras, mas em geral podem ser classificados como primordial, primário, secundário 
ou terciário (antral ou vesicular) (ADAMS; JAISWAL, 2008). 
Para Adams e Jaiswal (2008) o início do crescimento folicular, chamado de 
ativação, inicia-se com a transformação das células achatadas da pré-granulosa do 
folículo primordial em uma única camada de células cúbicas da granulosa (células 
foliculares), e o folículo passa a ser denominado de folículo primário. A proliferação das 
células da granulosa resulta em um aumento do número de camadas ao redor do 
oócito. Um folículo com duas a seis camadas de células da granulosa é chamado de 
folículo secundário, e um folículo com mais de seis camadas de células e com um antro 
cheio de líquido é denominado de folículo terciário (ou antral). O diâmetro de um folículo 
primordial mede cerca de 0,04 mm e o diâmetro do menor folículo antral é 0,25 mm. O 
folículo de Graaf ou pré-ovulatório passa a ser chamado de folículo ovulatório após o 
pico pré-ovulatório de gonadotrofina. Em bovinos, os folículos primordial, primário, 
secundário e terciário surgem pela primeira vez nos dias 90, 140, 210 e 250 de 
 
 
 
29 
gestação, respectivamente. O tempo necessário para um folículo crescer do maior 
estágio pré-antral (folículo secundário) até o tamanho de folículo ovulatório maduro é 
estimado em cerca de 42 dias. 
O ciclo estral (CE) bovino é compreendido pelos eventos reprodutivos que se 
apresentam entre dois períodos de receptividade sexual (estro). As fêmeas da espécie 
bovina ao atingirem a puberdade exibem comportamento estral em média a cada 21 
dias, variando de 17 a 24 dias tanto em raças européias quanto zebuínas até que a 
prenhez se estabeleça (RENESTO, 2004). 
Durante o ciclo estral ocorrem importantes alterações no córtex ovariano que 
incluem crescimento e atresia de vários folículos antrais até o aparecimento do folículo 
ovulatório, bem como a formação e lise do corpo lúteo. O crescimento folicular na 
espécie bovina exibe padrão contínuo de crescimento e atresia dos folículos ovarianos 
que se inicia na vida fetal, passa pela puberdade e continua na vida reprodutiva até a 
senilidade. Muitos estudos com ultra-sonografias seriadas foram realizados e 
demonstraram que durante o ciclo estral de novilhas ou vacas Bos taurus indicus e Bos 
taurus taurus ocorrem duas ou três ondas de crescimento folicular (RENESTO, 2004). 
Este processo contínuo de crescimento e regressão dos folículos, que leva ao 
crescimento do folículo pré-ovulatório, é conhecido como dinâmica folicular, enquanto 
que o padrão de crescimento e atresia de um grupo de folículos ovarianos é 
denominado onda de crescimento folicular. Cada onda folicular é composta por três 
fases: recrutamento ou emergência, seleção e dominância (RENESTO, 2004). 
A emergência da primeira onda folicular é observada em torno de um dia e 
meio após a ovulação quando um conjunto de folículos antrais dependentes de FSH 
começa a se desenvolver. Foi observado um aumento na concentração plasmática de 
FSH que antecede um a dois dias a emergência de cada onda folicular. Em torno de 
três a quatro dias após a emergência da onda o hormonio foliculo estimulante (FSH) 
reduz para níveis basais e o futuro folículo dominante é selecionado, continua seu 
crescimento, enquanto o restante dos folículos detém seu crescimento ou regridem e 
são chamados de subordinados (RENESTO, 2004). 
A emergência das ondas foliculares em bovinos é caracterizada pelo 
crescimento repentino (em dois ou três dias) de oito a 41 pequenos folículos, que são 
 
 
 
30 
inicialmente detectados por ultra-sonografia com um diâmetro de três a quatro mm. Por 
cerca de dois dias, a taxa de crescimento é similar entre os folículos da onda, e então 
um folículo é selecionado para continuar crescendo (folículo dominante) enquanto que 
os restantes dos folículos subordinados tornam-se atrésicos e regridem (ADAMS; 
JAISWAL, 2008). 
A maioria dos ciclos estrais em bovinos (ou seja, > 95%) é composta ou por 
duas ou três ondas foliculares. Parece não haver preferência de raça ou idade 
específica para um dado padrão de ondas em Bos taurus taurus. Um aumento na 
proporção do padrão de três ondas, no entanto, foi associado a um baixo padrão 
nutricional e estresse térmico (ADAMS; JAISWAL, 2008). Em ambos os padrões de 
ciclo estral – duas e três ondas, a emergência da primeira onda coincide com o dia da 
ovulação (Dia zero). A emergência da segunda onda ocorre no 9° ou 10° dia para ciclos 
de duas ondas, e no 8° ou 9° dia para ciclos de três ondas. Nos ciclos de três ondas, 
uma terceira onda surge no 15° ou 16° dia. Sob a influência da progesterona (por 
exemplo, no diestro), o folículo dominante de ondas sucessivas sofre atresia. O folículo 
dominante presente no início da luteólise torna-se o folículo ovulatório,e a emergência 
da próxima onda é atrasada até o dia da ovulação subseqüente. O corpo lúteo começa 
a regredir mais cedo nos ciclos de duas ondas (16° dia) do que nos ciclos de três ondas 
(19° dia), resultando em um ciclo estral correspondentemente menor (20 dias versus 23 
dias, respectivamente). Portanto, o ciclo estral de 21 dias em bovinos existe somente 
como uma média entre os ciclos de duas e três ondas (Figura 1). 
O número de folículos recrutados dentro de cada onda varia amplamente 
entre os indivíduos, mas é altamente repetido em um mesmo indivíduo. O padrão de 
ondas é repetível nos indivíduos, e a duração da dominância da primeira onda reflete o 
padrão da onda. A presença dos receptores de FSH nas células da granulosa e a 
resposta ao FSH exógeno fornecem argumento para a hipótese de que a dinâmica 
folicular pré-antral torna-se progressivamente sincronizada a um padrão de ondas 
(ADAMS; JAISWAL, 2008). 
In vivo, os folículos préovulatórios atingem um diâmetro de 12-20mm, e 
ovulam um oócito com núcleo e citoplasma maturados adequadamente. Entretanto, os 
oócitos coletados para PIV são em sua maioria oriundos de pequenos folículos antrais 
 
 
 
31 
(GONÇALVES et al., 2008). A tuba uterina é o local da fecundação e desenvolvimento 
embrionário in vivo (RENESTO, 2004). 
Provavelmente o responsável pela queda do FSH antes da seleção é a 
produção de estradiol e inibina, sobretudo pelas células da granulosa do folículo 
dominante, que atuam inibindo a liberação de FSH pela hipófise anterior. As 
concentrações de FSH são mantidas em níveis basais até o folículo dominante da 
primeira onda perder sua dominância,resultando em aumento nos níveis de FSH e 
subseqüente emergência da segunda onda folicular (RENESTO,2004). 
 
Figura 1 - Dinâmica do desenvolvimento folicular ovariano e secreção de gonadotrofinas durante ciclos 
estrais de duas e três ondas em bovinos. 
Fonte: Adams e Jaiswal (2008). 
 
 
 
 
32 
Os dois ovários atuam primariamente como uma unidade única, ou seja, cada 
onda folicular inclui folículos de ambos os ovários, que respondem em harmonia. O 
folículo dominante suprime os subordinados e a emergência de uma nova onda através 
de um canal sistêmico ao invés de um canal local. A presença de um folículo dominante 
em um ovário não tem nenhum efeito que não poderia ser visto igualmente no outro 
ovário. Portanto, nenhuma relação intra-ovariana foi encontrada em relação à 
localização dos sucessivos folículos dominantes durante o ciclo estral (ADAMS; 
JAISWAL, 2008). 
A seleção do folículo dominante está associada ao declínio dos níveis de FSH 
na circulação durante os três primeiros dias da onda. Folículos pequenos da onda 
emergente (ou seja, < 6 mm) são dependentes de concentrações elevadas de FSH 
circulante para continuar se desenvolvendo – em face ao declínio do FSH após o pico, 
eles atingem um platô e começam a regredir dentro de duas a cinco dias. De maneira 
oposta, o folículo destinado a tornar-se dominante pode manter a proliferação celular e 
a produção de estradiol apesar do declínio na concentração do FSH, uma habilidade 
que parece ser produzida pela manutenção da alta expressão de mRNA do receptor de 
FSH e da afinidade de ligação com FSH (ADAMS; JAISWAL, 2008). 
 
 
2.2 Produção in vitro de embriões 
 
 
Na década de 60, Edwards verificou que o desenvolvimento da maturação 
nuclear dos oócitos, a partir da remoção dos mesmos do ambiente folicular, era um 
fenômeno comum em várias espécies, incluindo a bovina. Ao cultivar in vitro oócitos 
inclusos em folículos e oócitos livres, foi possível concluir que o fator inibitório da 
maturação estava presente no folículo, pois este desaparecia com a remoção dos 
oócitos do ambiente folicular (VARAGO et al., 2008). 
O início da embriogenese é um processo complexo, caracterizado pelo uso 
de proteínas maternas e transcrições no desenvolvimento do embrião até a sua 
ativação do genoma (FEUGANG et al., 2009). 
 
 
 
33 
 Além da maturação nuclear e citoplasmática, foi constatado que as células 
foliculares, ou seja, as células da granulosa e do “cumulus oophorus” têm um papel 
importante durante a aquisição da competência oocitária na maturação in vitro. Oócitos 
com massa de células do cumulus claras e expandidas apresentavam maiores taxas de 
clivagem após a fecundação in vitro comparados àqueles sem células do cumulus ou 
com o cumulus compacto (VARAGO et al., 2008). 
A origem folicular do oócito tem influência significativa sobre o seu potencial 
de desenvolvimento e parece que depois que o oócito é removido do folículo seu 
potencial de desenvolvimento é limitado (LONERGAN, 2008) e que as condições de 
cultura pós-fertilização influenciam a qualidade e a viabilidade destes blastocistos 
(FEUGANG et al., 2009). Enquanto a adição de uma variedade de gonadotrofinas, 
esteróides e fatores de crescimentos têm sido relatados por aumentar o 
desenvolvimento do blastocisto, esse aumento tende a ser modesto e raramente se 
aproxima, por exemplo, daquele obtido com oócitos maturados in vivo. A capacidade 
intrínseca de desenvolvimento do oócito, avaliado pelo desenvolvimento até o estágio 
de blastocisto, tem sido positivamente relacionada com o tamanho do folículo antral do 
qual ele é removido, com o estágio da onda folicular, e com o local de maturação (in 
vivo vs in vitro) (LONERGAN, 2008). 
Inúmeras evidências têm sido apresentadas nos últimos anos, indicando que 
o potencial de desenvolvimento de embriões in vitro, depende da qualidade dos 
ovócitos dos quais se originam. Está bem estabelecido que somente ovócitos 
competentes tenham a capacidade de terem desenvolvimento embrionário normal. 
Essa competência é progressivamente adquirida durante os estágios finais da 
foliculogênese, através de várias mudanças celulares e moleculares que conferem ao 
ovócito a capacidade de completar a divisão meiótica, garantir uma fecundação 
monospérmica, descondensar a cabeça do espermatozóide, transpor a transição 
materno-zigótica e prosseguir o seu desenvolvimento. Portanto, quando um ovócito 
imaturo é removido do folículo, ele deve ser capaz de sofrer não só a maturação 
nuclear e citoplasmática, mas também a maturação molecular (DODE, 2006). 
Tendo em vista que oócitos maturados in vitro, quando comparados aos in 
vivo apresentam menores taxas de blastocisto, pode-se supor que o baixo 
 
 
 
34 
desenvolvimento embrionário se deve a deficiência do oócito, seja na maturação 
nuclear, citoplasmática ou na molecular. Vários fatores podem afetar o sucesso da 
maturação oocitária, entre eles pode-se citar a morfologia do complexo cumulus-oócito 
(CCO), as condições de maturação e a competência do oócito (DODE, 2006). 
A associação íntima entre células do cumulus e oócito é um requisito básico 
para o crescimento folicular normal e aquisição da competência, assim como para 
coordenação da maturação nuclear e citoplasmática. As células do cumulus são células 
da granulosa especializadas, que estão metabolicamente associadas com o oócito 
através de projeções celulares que atravessam a zona pelúcida e formam pequenas 
junções com o citoplasma (gap). Essas junções são a única entrada de substâncias ou 
estímulos no ooplasma. No oócito imaturo essas células estão muito compactadas e 
durante a maturação iniciam a secreção de ácido hialurônico que se deposita entre 
elas, separando-as e causando expansão. Essa ligação metabólica vai diminuindo 
gradativamente à medida que a expansão aumenta. A maturação de oócitos bovinos na 
presença de um inibidor das junções gap, visando bloquear a comunicação entre 
oócitos e células do cumulus, causa uma diminuição drástica na taxa de blastocisto, 
confirmando que a presença dessas células é essencial para a maturação completa. 
Além das características morfológicas, as condições de cultivo também afetam 
drasticamente o processo de maturação. A presençade hormônios, substâncias 
antioxidantes, fatores de crescimento, temperatura, atmosfera gasosa, são alguns 
fatores que influenciam no sucesso da maturação (DODE, 2006). 
Tentativas para melhorar a competência de oócitos bovinos têm sido 
realizadas, utilizando agentes fisiológicos e farmacológicos, para reter ovócitos imaturos 
em estágio de vesícula germinativa, por vários períodos de tempos antes da maturação 
in vitro (DODE, 2005). 
In vivo, a maturação nuclear do oócito inicia após o pico pré-ovulatório de 
hormônio luteinizante (LH) durante o estro (GONÇALVES et al., 2008). 
A origem do folículo é vital para conferir aos oócitos, o ambiente necessário 
para adquirir competência para o desenvolvimento, e que a qualidade intrínseca do 
oócito no início do processo de produção in vitro é o fator mais importante em 
determinar o seu destino final (DODE, 2006). 
 
 
 
35 
 Um oócito competente difere de um incompetente por sua capacidade de 
sustentar o desenvolvimento embrionário até o estágio de blastocisto, essa diferença é 
o resultado da expressão diferenciada de genes. Se os estoques de mRNA maternos 
contribuem para a competência, mudanças qualitativas e quantitivas devem existir entre 
RNA de ovócitos competentes e incompetentes (DODE, 2006). 
Para que o oócito seja capaz de ser fecundado e posteriormente se 
desenvolver até o estádio de blastocisto, ele precisa ser maturado e, durante essa fase, 
sofrer diversas transformações tanto em seu citoplasma quanto em seu núcleo. Durante 
todo o seu desenvolvimento, o oócito se encontra no estádio diplóteno da prófase I ou 
estádio de vesícula germinativa (VG). In vivo, o reinicio da meiose ou maturação tem 
início após o pico préovulatório de LH durante o estro e, in vitro, a retirada do oócito do 
contato com as células foliculares é suficiente para dar início ao processo de maturação 
nuclear. A maturação nuclear do oócito compreende a progressão do estádio diplóteno 
da primeira prófase meiótica até a fase de metáfase II (MII). Em bovinos, o período de 
maturação varia de 18 a 24 horas em atmosfera controlada contendo 5% de CO2 em ar 
e umidade saturada. In vitro, diferentes condições de cultivo já foram testadas para a 
maturação de oócitos e vários meios de maturação (Fluído sintético de oviduto (SOF), 
DMEM, Ham’s F-10, Ham’s F-12 e meio de cultivo tecidual 199-TCM 199). O TCM199 é 
o meio mais difundido entre os laboratórios de produção in vitro, sendo, geralmente, 
suplementado com soro fetal bovino (SFB), FSH, LH, piruvato e antibiótico, entretanto 
existem variações entre os diferentes protocolos de PIV (GONÇALVES et al., 2007). 
Os oócitos adquirem progressivamente a capacidade de completar a 
maturação nuclear, citoplasmática e suportar o desenvolvimento embrionário até a fase 
final de crescimento. A maioria dos oócitos colhidos para PIV está inclusos em 
pequenos folículos antrais e, apesar de competentes para o reinício da meiose, 
apresentam baixa capacitação para o desenvolvimento embrionário. In vivo, a 
capacitação é adquirida ao longo do desenvolvimento folicular devido às alterações 
moleculares e ultra-estruturais ocorridas no oócito durante esse período, que o tornam 
apto a suportar as fases iniciais do desenvolvimento embrionário. Em suporte a essa 
idéia, oócitos derivados de folículos grandes são mais capacitados para o 
desenvolvimento embrionário que oócitos oriundos de folículos pequenos. Entretanto, o 
 
 
 
36 
tamanho folicular não parece ser único responsável pela total capacitação dos CCOs. 
Oócitos coletados seis horas após o pico pré-ovulatório de LH e maturados in vitro, 
apresentam uma elevada taxa de desenvolvimento embrionário, muito semelhante à 
obtida in vivo (GONÇALVES et al., 2007). 
In vivo, o espermatozóide percorre um longo trajeto para chegar ao 
infundíbulo e fecundar o oócito. Durante esse percurso, glicosaminoglicanas presentes 
no trato genital feminino induzem sua capacitação (GONÇALVES et al., 2008). 
A produção in vitro de embriões ainda permite o aumento do potencial de 
exploração zootécnico de fêmeas de genética superior em um menor período de tempo, 
uma vez que as sessões de aspiração folicular podem ser realizadas a cada 15 dias. 
Realizada nesta periodicidade, ou mesmo mensalmente, com índices de produção de 
40%, seu rendimento pode superar aquele obtido pela transferência de embriões, e a 
relação custo/benefício pode se tornar justificável (VARAGO et al., 2008). 
A técnica de PIV compreende algumas etapas que vão desde a recuperação 
dos oócitos até o cultivo embrionário in vitro. Há mais de uma década, a técnica de 
aspiração folicular transvaginal tem sido a melhor opção para a recuperação de oócitos 
in vivo na espécie bovina. A OPU apresenta uma maior flexibilidade em relação a TE, 
pois permite a obtenção de oócitos de fêmeas a partir dos seis meses de idade (ainda 
com resultados inferiores nessa idade), de vacas prenhes até o terceiro mês de 
gestação ou mesmo após o parto. A eficiência do procedimento de aspiração folicular 
(AF) transvaginal está relacionada à metodologia utilizada, e esta, interfere na 
quantidade e morfologia dos complexos cumulus oócitos (CCOs), e consequentemente 
na competência para o desenvolvimento embrionário. A aspiração folicular duas vezes 
por semana produz uma maior percentagem de embriões grau um e um maior número 
de embriões transferíveis do que aspirações realizadas uma vez por semana. No 
entanto, a aspiração folicular semanal de animais da raça Nelore pode produzir um 
bezerro por semana através da PIV, isso demonstra a capacidade da associação 
OPU/FIV em multiplicar de maneira rápida e eficiente animais geneticamente superiores 
(GONÇALVES et al., 2007). 
Existem fatores técnicos e biológicos que influenciam o resultado da AF. 
Dentre os fatores biológicos, pode-se citar: freqüência e momento da aspiração 
 
 
 
37 
folicular, fisiologia, condição corporal, raça e idade da doadora. Na verdade, estes 
fatores são reflexos do momento do ciclo estral, do status reprodutivo, da nutrição e dos 
efeitos do ambiente (PIVATO, 2006). 
Um dos estudos pioneiros foi realizado por Chang (1955) utilizando oócitos de 
coelho. Neste estudo, observou-se que a maturação in vitro aparentemente não era 
afetada pela adição de extratos de pituitária ao meio de cultivo, pelo tamanho do folículo 
e pelo status reprodutivo do animal. Os primeiros trabalhos experimentais em 
embriologia de mamíferos foram realizados com coelhos, tendo em vista características 
biológicas favoráveis. O tamanho do oócito relativamente grande facilitou a 
manipulação, e a ovulação induzida pelo acasalamento foi importante para 
determinação precisa da idade do embrião (VARAGO et al., 2008). Os ovócitos 
maturados in vivo são mais competentes que os maturados in vitro (KASTELIC, 2006). 
Em bovinos, tanto a MIV como a FIV dos oócitos é conduzida por 18 à 24h, à 
temperatura de 39ºC, em atmosfera de 5% de CO2 em ar com umidade saturada, sendo 
o CO2 utilizado para controlar o pH dos meios tamponados com bicarbonato. A 
concentração de oxigênio geralmente não é controlada nestas fases, sendo 
aproximadamente 20%, o que difere muito da concentração de 5% de O2 encontrada no 
trato reprodutivo das fêmeas, ou mesmo do líquido de folículos em crescimento. A alta 
concentração de oxigênio pode ser tóxica para oócitos e embriões de mamíferos, pela 
formação de radicais livres e liberação de substâncias tóxicas no meio, baixa 
concentração de oxigênio (5%O2) apresenta melhores resultados de produção de 
blastocistos e também de qualidade dos mesmos, especialmente em sistemas de 
cultivo desprovidos de células somáticas. O controle da concentração de oxigênio 
durante a MIV e FIV para níveis próximos aos do trato reprodutivo pode ser uma 
alternativa para a melhoria do processo de PIV (LEIVAS, 2006). 
A atmosfera gasosa com 5% de O2 é utilizada na tentativade mimetizar o 
ambiente encontrado no oviduto e embora 5% de O2 não aumente os índices de 
produção quando comparada a sistemas que utilizam o co-cultivo com células 
somáticas, a mesma está associada à produção de embriões de melhor qualidade 
(LEIVAS, 2006). 
 A adequação da concentração de oxigênio durante o cultivo in vitro de 
 
 
 
38 
embriões para níveis próximos aos do trato reprodutivo pode ser uma alternativa para 
incremento na eficiência da produção embrionária (PONTES et al., 2008). 
Na maioria dos laboratórios, no processo de fecundação in vitro em bovinos 
usa-se sêmen congelado. No entanto, após a descongelação, é necessário selecionar 
os espermatozóides vivos e capazes de fecundar. Esta seleção é realizada na maioria 
das vezes pela separação em gradiente de Percoll, embora outros sistemas possam ser 
utilizados como o “swim-up” ou o lavado espermático. O percoll é composto por 
partículas de sílica coloidal coberto com polivinilpirrolidona, preparado em diferentes 
concentrações para formar um gradiente descontínuo de duas ou três fases (90, 45 e 
30%) para separação espermática (VARAGO et al., 2008). 
Após a fusão do espermatozóide com o oócito, ocorre a ativação, evidenciada 
na maioria dos mamíferos pela exocitose dos grânulos corticais e retomada da meiose. 
O núcleo espermático se descondensa e transforma-se no pronúcleo masculino. O 
pronúcleo migra para o centro do oócito, o envelope nuclear se desintegra e ocorre a 
associação dos cromossomos para a primeira divisão mitótica, a clivagem. 
Consequentemente inicia-se o desenvolvimento embrionário por sucessivas divisões e 
alterações morfológicas para a formação de mórulas e blastocistos (VARAGO et al., 
2008). 
Atualmente, o processo de fecundação in vitro na espécie bovina é o que 
apresenta maior sucesso dentre todas as espécies, sendo que 40% ou mais dos oócitos 
maturados e fecundados in vitro podem se desenvolver até blastocisto, e muitos 
bezerros já nasceram após a utilização destas técnicas (VARAGO et al., 2008). 
Técnicas de preparação de sêmen são usualmente utilizadas na produção in 
vitro de embriões (PIV) bovinos visando melhorar a qualidade espermática após 
descongelação. Dentre estas técnicas, a centrifugação em gradiente de Percoll tem sido 
a mais utilizada (CARVALHO et al., 2008). 
Terminada a etapa de maturação, os oócitos precisam ser fecundados para 
que sejam capazes de se desenvolver até o estádio de blastocisto. In vivo os 
espermatozóides necessitam chegar à ampola do oviduto para fecundar o oócito. 
Durante esse percurso, principalmente no ístmo, glicosaminaglicanos induzem a 
capacitação dos espermatozóides. A capacitação nada mais é que uma 
 
 
 
39 
desestabilização da membrana plasmática, pela remoção de algumas proteínas, sem 
modificações morfológicas, mas bioquímicas, resultando em uma hiperativação 
espermática. Esse processo torna possível a ligação do espermatozóide à zona 
pelúcida, onde ocorre a reação do acrossomo. In vitro, para que esse processo ocorra, 
os meios usados devem fornecer um ambiente adequado. O meio mais usado para 
fecundação in vitro é o FERT-TALP, que contém em sua constituição fatores capazes 
de promover a capacitação espermática como é o caso da heparina. Outros fatores 
importantes para a motilidade e suporte do gameta masculino como a epinefrina, 
hipotaurina e penicilamina também estão presentes no meio. O co-cultivo 
(espermatozóide e oócito) é realizado por um período de 18 a 22 horas, em temperatura 
de 39°C e atmosfera com 5% de CO2 em ar e umidade saturada. Os espermatozóides 
viáveis contidos em uma palheta de sêmen precisam ser separados do plasma seminal, 
crioprotetores, extensores e dos espermatozóides mortos antes de serem co-cultivados 
com os oócitos. Para bovinos, os métodos de separação espermática mais utilizados 
são o gradiente de PERCOLL e o swim-up. Após a separação, os espermatozóides são 
diluídos a uma concentração final de 1 a 5 x 106 espermatozóides viáveis/ml de meio 
(GONÇALVES et al., 2007). 
Após o maior entendimento do processo de fecundação em mamíferos, meios 
capazes de favorecer o crescimento embrionário até o estádio de blastocisto 
começaram a ser desenvolvidos. Em 1967, um primeiro trabalho demonstrou que 
zigotos de rata evoluíam até o estádio de duas células embrionárias na presença de 
lactato e piruvato. Um ano depois, Whitten e Biggers obtiveram desenvolvimento de 
embriões em um meio simples, sem o aporte de substâncias macromoleculares de 
origem materna. No entanto, durante o cultivo, muitos embriões paravam o 
desenvolvimento entre duas e 16 células dependendo da espécie estudada. Anos mais 
tarde esta parada foi denominada de bloqueio do desenvolvimento embrionário, que 
corresponde até hoje a uma resposta embrionária aos efeitos adversos ou carenciais do 
sistema de produção no momento da transição do genoma materno para o embrionário. 
Na espécie bovina, os embriões sofrem bloqueio no estágio de oito células (VARAGO et 
al., 2008). 
 O aperfeiçoamento dos sistemas de cultivo in vitro (CIV) permitiram o avanço 
 
 
 
40 
de outras biotécnicas tais como a clonagem e a manipulação de genes. No entanto, o 
gargalo da PIV está na baixa produção e qualidade de embriões, em conseqüência da 
deficiência dos processos in vitro para uma adequada maturação citoplasmática do 
oócito, dificultando os processos de preservação dos oócitos e embriões e, 
consequentemente, a implantação em sistemas de produção animal. Estudos básicos 
da regulação da maturação de oócito são essenciais para a geração de conhecimentos 
necessários para o aumento dos índices de produção de embriões in vitro 
(GONÇALVES et al., 2007). . 
 O momento crítico para o desenvolvimento embrionário inicia logo após a 
fecundação quando o cromossomo feminino reinicia a segunda meiose para formar o 
pró-núcleo feminino. O embrião, em sua fase inicial de desenvolvimento, é dependente 
do material genético materno acumulado durante a maturação citoplasmática. Essa fase 
dura até a ativação do genoma embrionário, a qual ocorre, em bovinos, no estádio de 8-
16 células e é conhecida como “transição maternozigótica” (MZT). A transcrição 
deficiente do genoma embrionário durante essa fase leva ao bloqueio do 
desenvolvimento em várias espécies. Esse fato foi um dos principais entraves da 
produção in vitro de embriões bovinos nas décadas de 60 e 70, entretanto esta 
dificuldade contribuiu para o desenvolvimento dos sistemas de cultivo embrionário 
(GONÇALVES et al., 2007). 
O tempo de cultivo in vitro varia de sete a nove dias, dependendo do objetivo 
da rotina de PIV, em temperatura de 39ºC com atmosfera controlada (5% de O2, 5% de 
CO2 e 90% de N2) e umidade saturada. A taxa de blastocisto geralmente é avaliada no 
sétimo dia de cultivo in vitro sendo que, os blastocistos produzidos podem permanecer 
na estufa de cultivo até o nono dia caso se deseje avaliar a taxa de eclosão in vitro 
(GONÇALVES et al., 2007). 
Antes mesmo da descoberta do bloqueio embrionário, em 1955, Averill e 
colaboradores reportaram a possibilidade de cultivar embriões ovinos utilizando a 
transferência de embriões no estádio de duas ou quatro células para o oviduto de 
coelhas. Em bovinos, este fato só foi reportado anos mais tarde, quando foi 
comprovado que embriões bovinos em estádio inicial de desenvolvimento poderiam ser 
cultivados até a fase de blastocisto fora do ambiente uterino de fêmeas bovinas. Assim 
 
 
 
41 
como na espécie ovina, estes trabalhos foram realizados utilizando a transferência dos 
embriões para a tuba uterina de coelhas (VARAGO et al., 2008). 
As células somáticas do folículo