Thiago-Ferreira

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UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO DE JANEIRO 
THIAGO FERREIRA DOS SANTOS 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
DESENVOLVIMENTO DE MÉTODO PARA DETECÇÃO DE ADULTERANTES EM 
CAFÉS COMERCIAIS BRASILEIROS POR PCR EM TEMPO REAL 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
RIO DE JANEIRO 
2013 
1 
 
Thiago Ferreira dos Santos 
 
 
 
 
 
DESENVOLVIMENTO DE MÉTODO PARA DETECÇÃO DE ADULTERANTES EM 
CAFÉS COMERCIAIS BRASILEIROS POR PCR EM TEMPO REAL 
 
 
 
 
 
 
 
Orientadores: Prof.ª Dr.ª Adriana Farah. 
 Dr.ª Edna Maria Morais Oliveira. 
 
 
 
 
 
 
 
 
Rio de Janeiro 
2013 
Dissertação de Mestrado apresentada ao Programa de 
Pós Graduação em Ciência de Alimentos, Instituto de 
Química, da Universidade Federal do Rio de Janeiro, 
como parte dos requisitos necessários à obtenção do 
título de Mestre em Ciência de Alimentos. 
2 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 S237 
Santos, Thiago Ferreira. 
 Desenvolvimento de método para detecção de adulterantes em 
cafés comerciais brasileiros por PCR em tempo real. / Thiago 
Ferreira dos Santos. – Rio de Janeiro : UFRJ, 2013. 
 78 f. 
 Dissertação (mestrado) – Universidade Federal do Rio de 
Janeiro, 
 Instituto de Química, 2013. 
. 
Orientadores: Adriana Farah de Miranda Pereira e Edna Maria 
Morais Oliveira. 
 
 1. Ciência dos Alimentos. 2. Café. 3. Reação em cadeia. 4. Polimerase. 
5. Tempo real. 6. Adulterante. 7. Fraude. I. Pereira, Adriana Farah de 
Miranda. II. Oliveira, Edna Maria Morais. III. Universidade Federal do Rio 
de Janeiro. Programa de Pós Graduação em Ciências dos 
3 
 
Thiago Ferreira dos Santos 
 
 
DESENVOLVIMENTO DE MÉTODO PARA DETECÇÃO DE ADULTERANTES EM 
CAFÉS COMERCIAIS BRASILEIROS POR PCR EM TEMPO REAL 
 
 
 
 
 
 
Aprovada por: 29/05/2013 
 
 
__________________________________________ 
(Prof.ª. Drª Adriana Farah de Miranda Pereira, Instituto de Nutrição 
Universidade Federal do Rio de Janeiro – UFRJ) 
 
 
__________________________________________ 
(Prof. Dr. Joab Trajano Silva Instituto de Química. 
Universidade Federal do Rio de Janeiro – UFRJ) 
 
__________________________________________ 
(Dr. Otniel Freitas Silva. Embrapa Agroindústria de Alimentos - CTAA) 
 
 
 
Dissertação de Mestrado submetida ao Programa de 
Pós-Graduação em Ciências de Alimentos, Instituto de 
Química, da Universidade Federal do Rio de Janeiro - 
UFRJ, como parte dos requisitos necessários à 
obtenção do título de Mestre em Ciências de 
Alimentos. 
4 
 
RESUMO 
 
FERREIRA, Thiago Santos. Biblioteca e memória: Detecção de Adulterantes em Cafés 
Comerciais Brasileiros por PCR em Tempo Real. Rio de Janeiro, 2013. Dissertação 
(Mestrado em Ciências de Alimentos)- Instituto de Química, Universidade Federal do Rio de 
Janeiro. Rio de Janeiro, 2013. 
 
 O café é uma das principais bebidas comercializadas em todo o mundo. Durante o seu 
processamento, este produto pode ser intencionalmente adulterado com materiais de baixo 
custo, principalmente cereais. Muitas técnicas têm sido desenvolvidas em todo o mundo a fim 
de determinar marcadores para a detecção de adulterantes em café torrado e moído e café 
solúvel. No entanto, estes métodos podem apresentar baixa sensibilidade e especificidade. 
Embora a tecnologia de DNA recombinante tenha demonstrado ser uma ferramenta 
promissora para determinar a autenticidade de alimentos processados, não tem sido utilizada 
para detectar adulterantes em café. O objetivo do presente trabalho de dissertação foi 
desenvolver um método para detectar e estimar as concentrações de adulterantes comumente 
adicionados a cafés comerciais brasileiros, por PCR em Tempo Real. O método desenvolvido 
foi sensível e específico para quantificar até 8,1pg, 0,3pg e 2,6 pg de DNA de cevada, milho e 
arroz, respectivamente. Vinte e uma amostras de diferentes qualidades adquiridas no mercado 
brasileiro foram avaliadas para detecção de adulterantes. Dez amostras puras de café arábica e 
conilon foram usadas como controle, não apresentando DNA de cereais. As oito amostras 
comercialmente classificadas como gourmets ou superiores também não apresentaram cevada, 
milho ou arroz na sua composição. No entanto, a cevada foi detectada em todas as doze 
amostras avaliadas de café do tipo tradicional, sem selo de pureza e de menor custo. O milho 
foi detectado apenas em uma amostra tradicional, além da cevada, enquanto o arroz não foi 
detectado em nenhuma amostra comercial. Os teores variaram de 1,0 a 2,5% em café torrado 
e moído e de 2,3 % a 5,2% em café solúvel. A técnica de PCR em Tempo Real demonstrou 
ser adequada para a detecção de alimentos adulterantes em café torrado moído e café solúvel. 
Palavras chave: Café, PCR em Tempo Real, adulterante, fraude. 
 
 
5 
 
ABSTRACT 
 
FERREIRA, Thiago Santos. Biblioteca e memória: Detection of Adulterants in Brazilian 
Commercial Coffees by Real-Time PCR based method. Rio de Janeiro, 2013. Master Degree 
Dissertation (Food Science) - Instituto de Química, Universidade Federal do Rio de Janeiro. 
Rio de Janeiro, 2013. 
It is well known that coffee is one of the main food products commercialized in the 
world. During processing, coffee can be intentionally adulterated with cheaper materials, 
including grains and cereals, such as barley, corn and rice. Many techniques have been 
developed in order to establish suitable parameters and markers for detection of adulteration 
of ground roast coffee and instant coffee. However, these methods may present low sensitivity 
and specificity. Although the recombinant DNA technology has shown to be a promising tool 
to determine the authenticity of processed foods, it has not been used to detect coffee 
adulteration. The goal of the present dissertation was the development of a method to detect 
and estimate the concentrations of contaminants commonly found in commercial Brazilian 
coffees, using q-PCR technique. The method was sensitive and specific to quantify down to 
8.1pg / 0.3pg / 2.6pg of barley, corn and rice DNA, respectively. Ten control samples were 
evaluated and did not present barley, corn or rice. From the twenty one samples acquired in 
the Brazilian market, eight, classified as gourmets or superior, did not present the respective 
adulterants in their composition. The 12 low cost samples, however, were adulterated, 
especially with barley, in percentages varying between 1% and 2.5 % in ground roast coffee 
and between 2.3 % and 5.2 % in instant coffee. Corn was only detected in one traditional 
sample, in addition to barley and rice was not detected in any of the commercial samples. The 
Real-Time PCR method showed to be suitable for detection of low amounts of food 
adulterants in roasted coffee. 
 
Keywords: Adulterants, Coffee, Real Time PCR. 
 
 
 
6 
 
SUMÁRIO 
 
RESUMO 3 
ABSTRACT 4 
GLOSSÁRIO 5 
AGRADECIMENTOS 7 
LISTA DE TABELAS 9 
LISTA DE ILUSTRAÇÕES 10 
LISTA DE SIGLAS 13 
INTRODUÇÃO16 
1. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA 18 
1. 1 O CAFÉ 18 
1. 1. 1 Classificação Botânica 18 
1. 1. 2 Beneficiamento do café 19 
1. 1. 3 Torração do café 22 
1. 1. 4 Principais defeitos do café 24 
1. 1. 5 Dados de consumo 26 
1. 1. 6 Composição química do café 27 
1. 2 AUTENTICIDADE DO CAFÉ 28 
1. 2. 1 Método para detecção de adulterantes em café 32 
1. 2. 2 PCR em tempo real 35 
1. 2. 3 Sistemas de detecção para PCR em tempo real 37 
2 JUSTIFICATIVA 40 
3 OBJESTIVOS 40 
3. 1 OBJETIVO GERAL 40 
3.2 Objetivos específicos 40 
4 MATERIAIS E METODOS 41 
4. 1 FERRAMENTAS DE BIOINFORMÁTICA 41 
7 
 
4. 1. 1 Definição dos marcadores moleculares e dos sistemas de detecção para os 
adulterantes 41 
4. 2 AMOSTRAGEM E TORREFAÇÃO 41 
4. 2. 1 Amostras controle 41 
4. 2. 2 Amostras comerciais 42 
4. 3 Adulterações de amostras de café em laboratório 42 
4. 4 Extração de DNA 42 
4. 4. 1 Extração e quantificação de DNA a partir de amostras in natura 43 
4. 4. 2 Extração e quantificação de DNA a partir de amostras processadas 44 
4. 4. 2. 1 Escolha do método de extração de DNA para as amostras torradas e moídas 44 
4. 4. 2. 2 Análise da amplificabilidade 47 
4. 5 SELETIVIDADE E ESPECIFICIDADE DOS PRIMERS 47 
4. 5. 1 PCR convencional 47 
4. 5. 2 Especificidade com PCR em Tempo Real 48 
4. 6 SENSIBILIDADE E LINEARIDADE 48 
4. 6. 1 Construção da curva padrão, limite de detecção (LD) e limite de quantificação 
(LQ) 48 
4. 7 DETECÇÃO DOS ADULTERANTES 49 
4. 8 FLUXO GRAMA EXPERIMENTAL 50 
5 RESULTADOS E DISCUSSÃO 51 
5.1 ESCOLHA DO MÉTODO DE EXTRAÇÃO PARA AMOSTRAS PROCESSADAS 51 
5. 1. 1 Determinação da concentração de DNA isolado das amostras in natura e 
processadas 53 
5. 2 Análises de bioinformática 55 
5. 2. 1 Desenho dos primers e sua seletividade 55 
5. 2. 2 Especificidade dos primers selecionados 57 
8 
 
5. 3 SENSIBILIDADE E LINEARIDADE 60 
5. 3. 1 Construção da curva padrão 60 
5. 4 ADULTERÇÃO INTENCIONAL EM LABORATÓRIO 63 
5. 4. 1 Curva de estimativa de percentual de adulterantes 63 
5. 5 DETECÇÃO DE ADULTERANTES EM AMOSTRAS COMERCIAIS DE 
CAFÉ 65 
6 CONCLUSÃO 68 
7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 70 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
9 
 
AGRADECIMENTOS 
 
Eu gostaria de agradecer às pessoas na ordem com que apareceram na minha vida! Minha mãe 
Jorgina dos Santos, caçula de uma analfabeta que formou filhos Oficiais da Aeronáutica e 
Exército, professores e funcionários públicos. Exemplo de esforço, dedicação e amor altruísta 
(te amo mãe). À minha família que, apesar de eu não ter tido a oportunidade de escolher, não 
trocaria por nenhuma outra. À vidinha (Jéssica G. V. Ferreira dos Santos) minha esposa, 
obrigado pela paciência, companheirismo e amor. Minha professora Janaína J. V. Cavalcante, 
que com muita paixão me infectou com a Biologia molecular. À Raquel Guerra, que me fez o 
convite para entrar em contato com a responsável do Laboratório de detecção de OGM da 
EMBRAPA e por ser um amparo espiritual. À Dr. Edna Maria Morais Oliveira, minha mãe 
científica, pessoa qualificada e capacitada. Eu te agradeço Edna por nunca ter me deixado sem 
respostas, por ter a capacidade de enxergar o meu potencial quando, nem eu mesmo o 
conhecia, pela ética profissional, pela postura impecável. Palavras realmente são pequenas 
para descrever o que você representa para mim, a ciência brasileira avançaria muito se todos 
os “Ph deuses” e “Ph divas” fossem como você. À Nildinha (Ivanilda Lima), a pessoa que 
simplesmente me ensinou tudo do Lab. Nilda obrigado pela presença, companheirismo,palhaçadas, favores, aventuras e etc... Não poderia deixar de lembrar da 1º estagiária Natália 
Eudes que fez um “intensivão” comigo para o processo seletivo de mestrado. Natália você é 
uma pessoa incrível. À Tatiane Corrêa, por sempre estar disposta a nos ajudar com sua 
simplicidade e carinho (você é demais). Ao futuro Dr. Felipe Vitório “rs” você é o discípulo 
que ultrapassou o mestre. A todos do Lab. de Detecção de OGM da EMBRAPA. Não deixaria 
de fora os sofredores companheiros de mestrado: Adriana M. Miranda, Jeane Rosa, Viviane 
M. Gomes, Karla Leal, Vanessa Rezende, Fabiana Ramos, Ivanilton Nery, Cynthia Annes 
Rubião, Mariana Ramos dos Anjos e Andrea Matos. Foi muito bom rir, chorar e se desesperar 
com vocês! À minha querida orientadora Adriana Farah, muito obrigado por ser o maçarico e 
a lixa que derrete e dá polimento às minhas imperfeições, por me trazer a realidade do que é 
ser um mestre e pela paixão com que você trabalha, é simplesmente deslumbrante. E por 
último, e não menos importante, Deus: o motivo, a razão e a inspiração de tudo. Na verdade 
Deus apareceu na minha vida bem antes de tudo e Ele é a razão do meu viver. Muito obrigado 
Senhor, por mais este degrau alcançado. 
 
10 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
"For God so loved the world, that he gave his only begotten Son, that whosoever believeth in 
him should not perish, but have everlasting life." 
(John 3:16) 
 
“O profundidade das riquezas, tanto da sabedoria, como da ciência de Deus! Quão 
insondáveis são os seus juízos, e quão inescrutáveis os seus caminhos! 
Porque quem compreendeu a mente do Senhor? Ou quem foi seu conselheiro? 
Ou quem lhe deu primeiro a ele, para que lhe seja recompensado? 
Porque dele e por ele, e para ele, são todas as coisas; glória, pois, a ele eternamente. 
Amém.” 
(Romanos 11:33-36) 
 
11 
 
LISTA DE FIGURAS 
 
Figura 1: Corte transversal de um grão de café adaptado de Murthy e Naidu (2012). 
Figura 2: Processo de colheita do café adaptado de Murthy e Naidu (2012). 
Figura 3: Processo de secagem natural dos grãos de café em terreiro. 
Figura 4: Tanque de água para degomagem do café para obtenção de café despolpado. 
Figura 5: Processo de torrefação industrial do café. 
Figura 6: Comparação em porcentagem de bebidas consumidas regularmente. (ABIC, 2012). 
Figura 7: Representação do processo de amplificação da PCR adaptado de HEID et al, 2011. 
Figura 8: Esquematização de um gráfico de PCR em Tempo Real. 
Figura 9: Esquema A: absorção e emissão do fluoróforos SYBR Green ligado 
superficialmente a molécula de DNA. Esquema B: hibridização da sonda ao alvo e hidrólise 
do fluoróforo repoter (VALASEK; REPA, 2005). 
Figura 10: Gráfico da curva de dissociação demonstrando o DNA dupla-fita submetido ao 
aumento de temperatura gerando a Tm. 
Figura 11: Esquematização da função 5’ exonucleásica da Taq polimerase adaptado de Barros 
et al 2008 
Figura 12: Isolado de DNA genômico após extração com os métodos DNeasy/CTAB, 
Dellaporta, DNeasy e CTAB (A, B, C e D respectivamente). 
Figura 13: Isolado de DNA genômico submetido à reação Random Amplification of 
Polymorphic DNA (PCR-RAPD) para análise de amplificabilidade. O gel está disposto da 
seguinte ordem: Métodos de extração Dellaporta, CTAB, DNeasy e DNeasy/CTAB, 
respectivamente. 
Figura 14: PCR in silico e in vitro dos primers Café 1(A) e Cevada 3(B), utilizando DNA 
genômico de café e cevada, respectivamente. P: padrão de bases. 
12 
 
Figura 15: PCR in silico e in vitro dos primers Zeína 2(C) e Arroz 1(D) utilizando DNA 
genômico de milho e arroz, respectivamente. 
Figura 16: Gráfico de curva de dissociação.Primer Café1 e primer Cevada3. 
Figura 17: Primer zeina2 (EF): a letra E corresponde à amplificação específica do primer 
Zeina2 em DNA genômico de milho, F corresponde à amplificação inespecífica do primer 
Zeína2 em DNA genômico de café, cevada, soja arroz e trigo. 
Figura 18: Curvas padrão de café (◊), cevada (□), milho (Δ) e arroz (x), utilizado para 
determinação de LD/LQ. 
Figura 19: Adulteração em laboratório para construção de curva de estimativa em percentual 
de cevada 10%-0,5% de cada adulterante. 
Figura 20: Detecção de cevada em amostras comerciais brasileiras tradicionais utilizando pela 
técnica de PCR em tempo real, utilizando-se o primer cevada3. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
13 
 
 
 
LISTA DE TABELAS 
 
Tabela 1: Classificação filogenética do café. 
Tabela 2: Quantificação de DNA genômico dos alimentos in natura, razão de pureza 
260/280 nm. 
Tabela 3: Quantificação de DNA genômico dos alimentos processados, razão de 
pureza 260/230 nm. 
Tabela 4: Marcadores moleculares de café, cevada, milho e arroz obtidos por 
bioinformática. 
Tabela 5: Média dos Cts das curvas padrão de café, cevada, milho e arroz, com os seus 
respectivos desvios padrão. 
Tabela 6: Eficiência, linearidade e sensibilidade dos primers 
Tabela 7: Detecção e quantificação de cevada em cafés comerciais. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
14 
 
 
 
LISTA DE SIGLAS 
 
ABIC - Associação Brasileira das Indústrias de Café 
ANVISA - Agência Nacional de Vigilância Sanitária 
BLAST - Basic Local Alignment Search Tool 
CIR - Commissioners of Inland Revenue 
CIRAD - Coopération Internationale em Recherche Agronomique pour le Développement 
CNNPA - Comissão Nacional de Normas e Padrões para Alimentos 
CTAB - brometo de cetiltrimetilamónio 
Ct - Cycle threshold 
DESVPAD - Desvio padrão 
DNA - Ácido desoxirribonucleico 
DRIFTS - Diffuse Reflectance Infrared Fourier Transform Spectroscopy 
EUA - Estados Unidos da América 
FAO - Food and Agriculture Organization 
FDA - Food and Drug Administration 
FSI/USDA - Food Safety and Inspection Service – United States Department of Agriculture 
FUNCAFÉ - Fundo de Defesa da Economia do Café 
HPLC - High-performance liquid chromatography 
ISIC - Intitute for Scientif Information on Coffee 
LANAGROS - Laboratórios Nacionais Agropecuários 
MAPA - Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento 
NCBI - National Center for Biotechnology Information 
OIC - International Coffee Organization 
OGM - Organismo Geneticamente Modificado 
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OMS - Organização Mundial de Saúde 
PCR - Polymerase Chain Reaction 
PQC - Programa de Qualidade do Café 
qPCR - Real-time polymerase chain reaction 
RAPD - Random Amplification of Polymorphic 
SCAA - Specialty Coffee Association of America 
SUASA - Sistema Unificado de Atenção à Sanidade Agropecuária 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
16 
 
INTRODUÇÃO 
 O café brasileiro já foi o maior gerador de riquezas e o produto mais importante da 
história nacional. Embora tenha perdido espaço para outros produtos como o petróleo e a soja 
hoje, este produto continua sendo um importante gerador de divisas (US$ 2 bilhões anuais, ou 
26 milhões de sacas exportadas ao ano), contribuindo com mais de 2% do valor total das 
exportações brasileiras, e respondendo por mais de um terço da produção mundial, que 
movimenta, anualmente, cerca de 91 bilhões de dólares, ficando apenas 9% desse montante 
com os países produtores (MOREIRA et al, 2001; NISHIJIMA et al, 2012). 
Quando se fala em qualidade do café, devem ser considerados todos os processos para 
a garantia da mesma ao longo da cadeia produtiva, ou seja, desde o plantio até o momento em 
que o café é servido na xícara. Basicamente, podem ser citadas cinco etapas críticas na 
produção: uniformidade do grau de maturação dos frutos na colheita, secagem, 
armazenamento dos grãos crus, torrefação e armazenamento do café torrado e moído (TOCI; 
FARAH, 2008). Além do fator da variação na qualidade do próprio café, visando preços 
menores no mercado, este produto também tem sido alvo de misturas fraudulentas com uma 
diversidade de materiais de menor custo, tais como cevada, milho, arroz, entre outros 
(RUBAYIZA; MEURENS, 2005; NOGIUEIRA, 2009). Apesar de muitas vezesnão causar 
prejuízo ao valor nutricional, à adulteração, que geralmente é praticada por torrefadores, leva 
à concorrência desleal, e à ilusão do consumidor, sendo crime previsto na lei. (LAGO, 2009). 
Muitas técnicas têm sido desenvolvidas a fim de determinar parâmetros apropriados e 
marcadores para diferentes tipos de adulteração em café torrado e moído. Os métodos 
convencionais de identificação de adulterantes utilizando técnicas de reconhecimento de 
padrões de cores e imagens características são subjetivos e, consequentemente, dependentes 
da experiência do analista e sujeito a erro humano. Além dos métodos visuais, há os métodos 
baseados na determinação de marcadores químicos tais como alguns carboidratos e compostos 
voláteis, identificados por cromatografia líquida e gasosa (TOCI; FARAH, 2008, LAGO, 
2009; OLIVEIRA et al, 2009; CRAIG et al, 2012). 
Métodos baseados em técnicas estritamente físicas também foram propostos para a 
detecção de adulterantes em café, tais como, espectroscopia fotoacústica proposta por Cesar et 
al. (1984), espectroscopia por infravermelho, por Briandet et al. (1996) e espectrometria com 
lente térmica, por Fontes et al.(2001). No entanto, métodos baseados em tais técnicas não 
17 
 
permitem a identificação dos adulterantes individuais e sua quantificação, sendo também 
sujeitos a efeitos de matriz devido ao processamento. (NOGUEIRA, 2009). 
A tecnologia do DNA recombinante tem sido utilizada para a determinação da 
autenticidade de alimentos processados (GERMINI et al, 2004; ARLORIO et al, 2007; 
PAFUNDO et al, 2009; LAUBE et al, 2010; CASTELLÁ; CABAÑES, 2011; COSTA et al, 
2012). A reação em cadeia da DNA polimerase (PCR-Polymerase Chain Reaction) em tempo 
real permite o controle da reação de amplificação ciclo para ciclo, em um sistema fechado, 
sem interferência externa na evolução da reação. Um sinal fluorescente é detectado por 
fluorescência em proporção ao aumento do teor do produto de amplificação. Esta 
fluorescência é emitida por compostos que podem ser ligados a sondas ou intercalados na 
parte externa, no sulco menor da dupla fita de DNA, como é o caso do SYBR Green 
(BARROS et al, 2008). 
 Desta forma, a técnica de PCR em tempo real vem sendo amplamente utilizada para a 
análise da presença de sequências específicas de DNA em diferentes matrizes alimentares 
como detecção de patógenos e detecção e quantificação de organismos geneticamente 
modificados (OGM). Além disso, já existem análises por esta técnica para a detecção de 
glúten em alimentos destinados a portadores de doença celíaca (OLEXOVÁ et al, 2006; 
PIKNOVÁ et al, 2008). No entanto, esta abordagem analítica ainda não foi utilizada para 
detecção de adulterantes em café, tema que será abordado neste trabalho. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
18 
 
1 REVISÃO BIBLIGRÁFICA 
 
1. 1 O CAFÉ 
 1.1.1. Classificação botânica 
O café pertence à família Rubiaceae e ao gênero Coffea (Tabela 1). Existem 
aproximadamente 100 espécies descritas do gênero Coffea, mas somente as espécies C. 
arabica e a C. canephora, sendo a última conhecida como Robusta ou Conilon, possuem 
importância econômica (ILLY, 2002). 
Tabela 1: Classificação filogenética do café (MURTHY; NAIDU 2012). 
Reino Plantae 
Subreino Tracheobionta 
Filo Magnoliophyta 
Classe Magnoliopsida 
Subclasse Asteridae 
Ordem Rubiales 
Família Rubiaceae 
Genêro Coffea 
 
Denominado cafe em Francês, caffe em Italiano, Kaffee em Alemão, koffie Holandês e 
coffee em Inglês. (SMITH, et al 1985), o café Arábica (Coffea arabica) é nativo da província 
de Kaffa, na Etiópia, já o café Robusta (Coffea canephora) é nativo da África Central e a 
transferência de mudas de café do continente Europeu para a América Central e do Sul 
ocorreu por volta de 1700, chegando ao Brasil em 1727 (YANAGIMOTO et al, 2004; 
SENBETA; MANFRED, 2006 DENICH; MURTHY; NAIDU, 2012). A palavra café 
tem origem na palavra árabe “qahwa” que significa vinho. Por esta razão, quando o café foi 
levado para a Europa, no século XIV, foi chamado de vinho da Arábia. Desde então, seu 
cultivo influenciou diversas culturas no Brasil e no mundo, impulsionando-as 
economicamente e tornando-se principal gerador de riquezas (NISHIJIMA et al, 2012). 
O arbusto da espécie Arábica, oriunda de regiões montanhosas, é delicado, de pequena 
a média produção, porte de até 5 a 6 m de altura e requer clima ameno, sendo considerada 
19 
 
uma espécie que produz um café de alta qualidade. A árvore do café Robusta, por sua vez, é 
caracterizada por ser muito produtiva e resistente a doenças. A planta se desenvolve bem em 
climas quentes e úmidos e pode atingir até 12 m de altura. No entanto, produz um café com 
maior acidez e amargor, e de aroma pobre o que lhe atribui um conceito de café de baixa 
qualidade. (SANGER et al, 2002). 
 
1.1.2 Beneficiamento do café. 
As sementes do fruto do cafeeiro (Figura 1), quando torradas e moídas, são infusas em 
água quente e resultam em uma das bebidas mais consumidas no mundo, representando um 
importante item no comércio internacional. No Brasil, o café constitui um importante produto 
de exportação, sendo depois dos EUA, o maior consumidor desta bebida (MAY et al, 2011). 
 
Figura 1: Corte transversal de um grão de café. Adaptado de Murthy e Naidu (2012). 
 
Para se garantir a produção de uma bebida de boa qualidade e aceitação, deve-se escolher 
uma boa variedade de grãos de café. A lavoura deve estar situada em uma área que apresente 
condições climáticas favoráveis. Além disso, o preparo deve ser feito a contento, para que, ao 
término de todo o processo, possa o produtor obter uma boa produtividade em um grão de 
café de qualidade disponibilizada ao consumidor (MURTHY; NAIDU 2012). 
Basicamente três tipos de colheitas são geralmente utilizados no Brasil: derriça (no 
pano ou no chão), colheita mecânica e colheita a dedo (Figura 2). Como o gênero Coffea 
possui uma florescência irregular durante seu desenvolvimento, gera frutos com diferentes 
20 
 
graus de maturação, fazendo com que durante a colheita, juntamente com os frutos cerejas 
(maduros), sejam colhidos frutos verdes e extremamente maduros (TOCI & FARAH, 2008). 
 
Figura 2: Processo de colheita do café. Adaptado de Murthy e Naidu (2012). 
 
Antes da secagem, os frutos precisam ser beneficiados, o que consiste na sua 
transformação, após a colheita, em grãos (secos) para a torrefação. Esse processo divide-se 
em duas etapas: 
1ª Etapa: Consiste na lavagem dos frutos do café com água, para separação das folhas, pedras 
e outras impurezas. Os frutos também podem ser separados por densidade. Durante a 
21 
 
separação por densidade, os frutos secos e “passados” (do ponto de maturação) boiam, 
enquanto os verdes e os maduros afundam. 
2ª Etapa: Consiste na secagem e no despolpamento dos frutos. Este último pode ser realizado 
de três modos, pelo Processo Natural, Processo Úmido e Processo de despolpamento Natural 
ou Semi-úmido (BANDEIRA et al, 2009). 
Na cafeicultura brasileira, cerca de 90% do café é preparado pelo Processo Natural 
(TOLEDO; BARBOSA, 1998; DUARTE et al, 2009). Neste processamento, os frutos são 
secos em terreiros, ao sol, resultando nos “cafés de terreiro”, ou em grandes secadores (Figura 
3). Neste caso, a qualidade do produto depende das condições climáticas da zona de produção 
(umidade, temperatura e chuvas), especialmente no período da colheita. Chuvas e alta 
umidade no ar favorecem o desenvolvimento de microorganismos (TOCI & FARAH, 2008). 
 
Figura 3: Processo de secagem natural dos grãos de café em terreiro. 
(http://mariarruda50.blogspot.com.br/2011/06/contando-uma-historia.html). 
 O Processo Úmido requer necessariamente frutos maduros e pré-lavagem. Neste 
processo o café é despolpado mecanicamente e fermentado em tanques para a retirada da 
mucilagem (Figura 4). A fermentação pode ser enzimática ou por microorganismos (TOCI & 
FARAH, 2008).Este processo apresenta um maior risco para a qualidade final da bebida, 
pois o ponto final da fermentação deve ser bem controlado. De outro modo, ocorre a produção 
http://mariarruda50.blogspot.com.br/2011/06/contando-uma-historia.html
22 
 
de grãos excessivamente fermentados, conhecidos como defeito stinker (TOCI & FARAH, 
2008). 
 
Figura 4: Tanque de água para degomagem do café para obtenção de café despolpado. 
(http://www.infobibos.com/Artigos/2010_2/CafeCereja/index.htm) 
O Processo de despolpamento Natural, desenvolvido no Brasil, reúne o melhor dos 
dois processos anteriores. Consiste na lavagem e despolpamento mecânico dos frutos e na 
secagem dos grãos despolpados, porém ainda com a mucilagem (TOCI & FARAH, 2008). 
 
1.1.3 Torração do café. 
O café in natura, os grãos torrados e a bebida preparada são misturas complexas 
formadas por várias substâncias de ocorrência natural ou derivadas do processamento, por 
exemplo, sabe-se que o café é o único alimento que produz a vitamina niacina, decorrente da 
torrefação (DAGLIA et al, 2002). 
O processo de torrefação consiste em submeter o grão à elevação rápida de 
temperatura para torrá-lo, fazendo com que a sua umidade interna chegue a cerca de 3% 
(Figura 5). Esta operação consiste em três fases distintas. Na primeira fase, o grão chega até 
100°C. Na segunda fase, toda a água livre é evaporada e a temperatura do café é elevada até a 
temperatura de pirólise, de aproximadamente 180°C. Na terceira fase, o café sofre a pirólise, 
http://www.infobibos.com/Artigos/2010_2/CafeCereja/index.htm
23 
 
ou torração propriamente dita. Na operação de torração, deve-se ter controle adequado do 
peso e tamanho, e uniformidade dos grãos, temperatura interna da câmara, tempo de torração 
e, quando se utiliza ar quente, controle da velocidade do ar. Este controle é necessário para 
que se obtenha o grau de torração adequado, além de uma boa reprodutibilidade (FARAH, 
2012). 
 
Figura 5: Processo de torrefação industrial do café. (http://www.buhlergroup.com/europe/pt/solues-
industriais/alimentos/caf.htm). 
Em torradores com leito fluidizado ou similares, à temperatura acima de 200 °C e uma 
boa agitação dos grãos, dependendo da quantidade de grãos na câmara, o tempo de torração 
pode ser de cerca de 5 a 10 minutos, variando conforme a intensidade de torração desejada. 
Esta intensidade geralmente é avaliada pela coloração dos grãos através da medição 
colorimétrica ou pela determinação da perda de peso durante a torração. Esta perda de peso se 
dá devido à evaporação da água e pirólise dos componentes orgânicos do café, que resulta na 
formação de CO2 e compostos voláteis. (BASSO et al, 1999; WANG; LIM, 2012). 
A torra mais comumente observada no comércio brasileiro é a escura ou extraforte. 
Entretanto, uma torração drástica contribui para a perda de substâncias como ácidos 
clorogênicos e derivados, que contribuem de forma importante para os efeitos fisiológicos 
considerados benéficos a saúde. Ela pode vir a contribuir também para a produção de 
compostos potencialmente prejudicais a saúde como o benzeno(a)pireno entre outros 
24 
 
hidrocarbonetos policíclicos aromáticos (FARAH et al, 2006). É importante ressaltar que este 
tipo de torra também é escolhido pelas indústrias cafeeiras por dificultar a detecção de 
matérias estranhas, pois quando estas são torradas juntamente com o café ocorre a absorção 
do óleo e aderência das partículas mais finas de café torrado e moído às suas superfícies 
tornando difícil o reconhecimento da adulteração sem o auxílio de métodos analíticos 
adequados (TAVARES et al, 2012). 
 
1.1.4 Principais defeitos do café 
A não conformidade nos padrões de qualidade nesses processos gera defeitos no fruto, 
sendo estes considerados defeitos extrínsecos e intrínsecos. Essas classificações advêm dos 
órgãos Federais como o Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento (MAPA) e são 
utilizadas pela Associação Brasileira das Indústrias de Café (ABIC). Os defeitos intrínsecos 
são os grãos provenientes de estágios de maturação inadequadas e/ou de fermentação ou 
oxidação ocorrida na planta, no chão ou após a colheita. Os principais defeitos estão listados a 
seguir: 
Defeito Verde: É originado de fruto imaturo e sabe-se que confere grande 
adstringência à bebida e notas de folhas verdes desagradáveis (TOCI; FARAH, 2008). 
Defeito ardido: pode ser gerado por problemas de irrigação durante o plantio, ou por 
problemas na condução do processo de beneficiamento, que ocasionam fermentação 
indesejável nos grãos maduros e verdes (TOCI; FARAH, 2008). 
 Defeito Preto: É o mais comumente originado por frutos passados do ponto de 
maturação, que podem ocorrer por amadurecimento natural no cafeeiro, pela ação de chuvas 
ou por quedas dos frutos no chão durante a colheita. O contato do fruto com o solo favorece a 
ocorrência de fermentação microbiana indesejável. Grãos pretos podem ser originados por 
deficiência de carboidratos no cafeeiro ou por fermentações microbianas no processo de 
beneficiamento. Estes grãos produzem notas de fumo queimado (TOCI; FARAH, 2008). 
Defeito Preto Verde: O grão preto-verde é originado do grão verde pela ação de altas 
temperaturas, decorrente de processos inadequados de secagem ou possivelmente, por 
fermentação do grão ardido (TOCI; FARAH, 2008). 
25 
 
Defeito Stinker: É aparentemente normal a olho nu. Porém, são provenientes de 
processos inadequados de despolpamento via úmida e que comprometem seriamente a 
qualidade da bebida, podendo ser identificados por fluorimetria. Alguns classificadores 
consideram o grão stinker e o preto-verde os mesmos defeitos (BANDEIRA et al, 2009). 
Defeito Mal-Granado & Concha: O grão elefante é um grão de grande tamanho. 
Porém com má formação. O grão Mal-granado ou concha é parte de um grão elefante, 
geralmente separados pelo processo de descascamento ou despolpamento (BANDEIRA et al, 
2009). 
Defeito Coco: Este tipo de grão é formado por um processo incorreto de 
descascamento, permitindo que frutos secos inteiro passem pela peneira de separação 
(BANDEIRA et al, 2009). 
Defeito Chocho: O grão chocho é enrugado por problemas genéticos ou fisiológicos, 
deficiência nutricional, ou estresse do cafeeiro (BANDEIRA et al, 2009). 
Defeito Brocado: O grão brocado é aquele atacado na lavoura ou no beneficiamento 
por Hypothenemus haempei, conhecido como broca do café (TOCI; FARAH, 2008). 
Defeito Casca: Pedaços de casca oriundos do processo de descascamento que não 
foram separados adequadamente (BANDEIRA et al, 2009). 
A mistura de todos os defeitos é conhecida como PVA, devido aos principais defeitos 
serem os grãos pretos, verdes e ardidos. Atualmente, a realidade do mercado interno é que 
existem blends comercias com mais de 70% de PVA, embora a ABIC recomende a inclusão 
de no máximo 20% destes (BANDEIRA et al, 2009. TOCI ; FARAH, 2008). 
Já os defeitos considerados extrínsecos são classificados pela presença de outras 
matérias como: arroz, trigo, soja, cevada e milho além de sujeira, folha e resíduos de madeira. 
Até 2005, a Agência Nacional de Vigilância Sanitária (ANVISA) não contemplava análises 
relativas à identificação de adulterantes em café. Já na União Europeia, exigia-se 
determinação de glicose total, xilose total e frutose livre, a fim de detectar possíveis fraudes, 
já que os teores desses açúcares são baixos no café e altos em certos grãos (BACHA, E. L. 
2000). 
 
26 
 
1. 1. 5 Dados de consumo 
Segundo a Associação Brasileira das Indústrias de Café (ABIC, 2013), pesquisas 
realizadas desde 2003 até 2010 pelo Fundo de Defesa da Economia do Café (FUNCAFÉ) e 
pela ABIC, mostram que está havendo um aumento no consumo da bebida pela população 
brasileira (Figura 6). 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Figura 6: Comparação em porcentagem de bebidas consumidas regularmente (ABIC, 2012). 
Visando preservar esta situação de mercado,o setor de café brasileiro tenta manter o 
ritmo de “marketing” e modernização da indústria de bebidas, implementando estratégias 
mercadológicas que estimulem o consumo de café e seus derivados. Neste contexto, a 
inovação em tecnologia e produtos e a melhoria contínua constituem elementos decisivos para 
alcançar e sustentar vantagens competitivas e, assim, favorecer o crescimento econômico, a 
geração de riqueza, a qualidade de vida da sociedade e a satisfação dos consumidores 
(ROCHA; FERREIRA, 2001). 
O café também é utilizado em preparações do tipo expresso, “cappuccino”, 
“frappucino”, na produção de balas, e dele ainda pode se extrair um óleo normalmente 
utilizado como aditivo na indústria alimentícia e na indústria cosmética. Entre os fatores que 
podem interferir na composição e qualidade do café estão fatores genéticos, tais como espécie 
e variedade, maturação dos grãos, os processos de torrefação, armazenamento e a adição de 
alimentos com baixo valor agregado, como a cevada, milho, soja, entre outros (MORGANO 
 
27 
 
et al., 2002; ASSAD et al, 2002; PROESTOS et al, 2005; ANDERSEN et al, 2006; ALVES et 
al, 2009; REIS et al, 2012, FARAH, 2012). 
O sabor e o aroma do café são atrativos que justificam e estimulam a grande aceitação 
e consumo desta bebida. Pesquisas recentes apontam efeitos fisiológicos benéficos do 
consumo de café atribuídos a diversos compostos nele presentes entre os quais se encontram a 
cafeína e os compostos fenólicos, especialmente os ácidos clorogênicos, e isso também tem 
contribuído para o aumento de consumo do café (FARAH; DONANGELO, 2006; DUARTE 
et al, 2012). 
 
1. 1. 6 Composição química do café 
Geralmente, cafés crus apresentam na sua composição química, considerando as duas 
espécies mais comuns, teores de 8,6 a 12,6 g/100g de proteínas, 12,3 a 14,0 g/100g de lipídios 
e 3,5 a 4,5 g/100g de minerais. Como parte da composição mineral do café, destacam-se Ca, 
K, Mg, Na, P, Co, Cr, Cu, Fe, Mn, Zn (MORGANO et al, 2002). 
Além destes nutrientes, o café também contém fitoquímicos como os ácidos 
clorogênicos e cafeína, já mencionados, e melanoidinas, entre outros compostos bioativos. A 
composição mais comum dos grãos crus de café Arábica e Robusta corresponde, 
respectivamente, em base seca, de 12-18 g/100g e 9-13 g/100g de lipídios, 3,0-4,2 g/100g e 
4,0-4,5 g/100g de minerais, 5,5 a 8,0 g/100g e 7,0-10,0 g/100g de ácidos clorogênicos, 6-8 
g/100g e 5-7 g/100g de oligossacarídeos, 50-55 g/100g e 37-47 g/100g de polissacarídeos, 
0,9-1,2 g/100g e 1,6-2,4 g/100g de cafeína. A composição de alguns compostos não difere 
entre as espécies consideradas, sendo de 2 g/100g de aminoácidos, 11-13 g/100g de proteína e 
1,5- 2,0 g/100g de ácidos alifáticos (SALDAÑA et al, 1997). 
 
1. 2 AUTENTICIDADE DO CAFÉ 
Segundo o dicionário da língua portuguesa, a palavra adulterar significa: falsificar, 
corromper. A atitude de adulterar caracteriza fraude e, portanto, considera-se adulteração a 
mistura, intencional ou não, de materiais estranhos ao produto, normalmente de baixo custo, 
que alteram a sua qualidade e causam danos ao consumidor, especialmente, os de ordem 
econômica e moral (ASSAD et al, 2001). 
28 
 
A prática de misturar o café com outros alimentos data de pelo menos 1840 na 
Inglaterra, onde eram encontrados até 50% de chicória no café (THE LANCET, 1853). No 
entanto, em 1852, a mistura com chicória pelos comerciantes que inicialmente era permitida 
desde que relatada no rótulo, tornou-se uma preocupação por parte do órgão de fiscalização, 
denominado Commissioners of Inland Revenue (CIR). Apesar da permissão condicional da 
mistura parecer justa, era costume da época os negociantes dobrarem a embalagem de modo a 
ocultar a parte na qual se encontrava a informação da presença de chicória. Isso também não 
garantiria o esclarecimento dos consumidores, tendo em vista que muitos deles não sabiam 
ler. Havia também suspeita de corrupção por parte dos fiscais, já que o governo permitia a 
mistura e o café já era em 1853 uma commodity responsável por 38, 597,000 lbs/ano. 
A falta de fiscalização eficiente e a prática de adulterar, fez com que, em 1897, 
houvesse diminuição no consumo do café na Europa, sendo o mesmo considerado de gosto 
ruim. Mesmo sendo do conhecimento de todos na época que o café puro produzia uma 
excelente bebida, parecia que ninguém era capaz de obtê-la, o que levou a suspeita de um 
novo método de adulteração com adição da serragem. Este novo método consistia na lavagem 
e secagem das bagas (os frutos do café) em máquinas centrífugas com serragem, fazendo com 
que as fendas das bagas ficassem cheias de madeira em pó e mais claras. A coloração clara 
era uma característica do café, considerado de ótima qualidade. Sendo assim, através deste 
novo método de adulteração, o café de baixa qualidade podia ser vendido como de alta 
qualidade, aumentando assim, seu valor de mercado. As autoridades da época acreditavam 
que os cafés adulterados com serragem eram provenientes de cidades como Hamburg, 
Bremen, Antwerp, e Rotterdam (THE LANCET, 1853). 
Segundo Menezes e Bicudo (1958), indícios de adulteração no café brasileiro datam 
desde 1950 e esta prática tornou-se mais comum nos anos 70 durante o período de 
tabelamento de preços. O tabelamento de preços restringiu qualquer possibilidade de 
segmentação de mercado. Com a alta inflação e preços tabelados, muitas empresas passaram a 
sobreviver graças ao retorno do investimento no mercado financeiro. Em termos de estratégia 
de mercado, as torrefadoras entraram em concorrência suicida e passaram a adulterar o café, 
misturando-o com produtos mais baratos. Desde então, muitas técnicas físicas, químicas e 
bioquímicas tem sido propostas para detecção de adulterantes em café. Nos dias atuais, já não 
há, mas tabelamentos de preços no café para justificar a prática de adulterar. (NOGUIERA; 
LAGO, 2009). 
29 
 
 Como considerado anteriormente, sabe-se que o Brasil é o maior produtor de café do 
mundo, e mesmo com os esforços da ABIC para manter um nível de qualidade aceitável no 
comércio interno, certificando o café com o Selo de Pureza ABIC, na literatura é informado 
que grande parte do café torrado e moído vendido no território brasileiro não é considerada de 
boa qualidade (JHAM et al, 2007). Ao longo dos tempos, o café brasileiro tem sido adulterado 
por parte da indústria cafeeira com milho, cevada, arroz, soja e trigo, entre outras substâncias 
decorridas do seu processamento. Por serem considerados alimentos de menor valor agregado 
e também apresentarem muita semelhança ao café quando torrado e moído, dificultam ainda 
mais a detecção por parte dos órgãos fiscalizadores (MENEZES; BICUDO, 1958; LOPEZ, F. 
C. 1974; KAZI, 1978; CEZAR, et al, 1984; , 1986 ASSAD, et al, 2001; JHAM et al, 2007; 
NOGUEIRA; LAGO, 2009; REIS et al, 2012; FERREIRA et al, 2013). 
 Como toda e qualquer atividade produtiva que envolva fabricantes, comerciantes e 
consumidores na produção, na comercialização e no consumo, o café é regulamentado por 
uma legislação específica no Brasil e no mundo. Esta regulamentação objetiva garantir aos 
produtores a correta valorização da qualidade de seu produto. Contudo, as normas 
estabelecidas devem permitir aos consumidores finais a certeza de estar adquirindo um 
produto de qualidade. 
 Inicialmente, observa-se algumas normas que melhor representam a evolução e o 
“status quo” da legislação brasileira a respeito do café nos seguintes documentos: 
 1 – Resolução – CNNPA ( Comissão Nacional de Normas e Padrões para 
Alimentos) nº 12, de 1978, que especifica um item para café torrado e moído no que se 
refere aos padrões de identidade e qualidade para os alimentos (e bebidas), prevalecendo 
sobre as normas técnicas especiais – o café torrado deve ser constituído por grãos torrados 
procedentes de espécimes vegetais genuínos, sãos e limpos, ou o pó proveniente dosmesmos. 
 Nessa resolução, era tolerada a porcentagem de no máximo 1% de impurezas (cascas, 
paus), no café torrado, em grão ou moído. 
 2 – Portaria nº 377, de 26 de abril de 1999, do Ministério de Saúde (M.S), que 
tinha por objetivo fixar a identidade e a qualidade do café torrado em grão e o café torrado e 
moído, sendo desta forma revogada a Resolução descrita acima (nª 12/78). Esta portaria 
continha no que diz respeito à presença de cascas e paus no café torrado e moído, um limite 
de 1% o que significa dizer que as amostras que fossem avaliadas segundo a identidade e 
30 
 
qualidade do café torrado e moído, deveriam respeitar este limite, caso contrário seriam 
julgadas insatisfatórias. 
 3 – Instrução normativa nº 16 de maio de 2010, do Ministério de Estado da 
Agricultura, Pecuária e Abastecimento (MAPA), que segundo esta legislação mais recente, 
o café era considerado “fora do tipo” quando apresentasse umidade acima de 5 % e teor de 
impurezas acima de 1%. O café só seria desclassificado se apresentasse percentual de 
alimentos ou substancias estranhas ao café igual ou superior a 1,3%, sendo que os materiais 
estranhos não poderiam estar em proporção acima de 0,1 %, quando considerados 
isoladamente e nem exalar odores estranhos e impróprios para o consumo. Portanto não, 
seriam apenas cascas e paus, mas sim de todos outros materiais que deveriam obedecer ao 
limite. 
. Exemplos: 0,5% Cascas e Paus + 0,4% Sedimentos + 0,1% Cevada = 1,0% 
impurezas -> Café aprovado; 0,5% Cascas e Paus + 0,6% Sedimentos + 0,1% Cevada = 1,2% 
impurezas -> Café fora do tipo; 0,5% Cascas e Paus + 0,7% Sedimentos + 0,1% Cevada = 
1,3% impurezas -> café desclassificado; 0,2% Cascas e Paus + 0,3% Sedimentos + 0,2% 
Cevada = 0,7% impurezas -> café desclassificado; (pois o percentual de matérias estranhas, 
cevada, é superior a 0,1%). 
 Paralelamente a égide legislativa brasileira que estabelece limites de impurezas, o 
mercado externo do café solicita através de varias organizações e cooperativas, dentre as 
quais se pode citar a CIRAD - Coopération Internationale em Recherche Agronomique pour 
le Développement, o ASIC – Association for Scientific information on Coffee, a OIC – 
International Coffee Organization e a FAO – Food and Agriculture Organization, além do 
FSI/USDA – Food Safety and Inspection Service – United StatesDepartment of Agriculture, a 
revogação de limites de impurezas e adulterantes, visando o direito de escolha do consumidor 
e sua integridade com relação a sujidade. 
 No mesmo escopo, o “Codex Alimentarius”, ligado FAO – Organização para a 
Alimentação e a Agricultura – (Food and Agriculture Organization) e a OMS – Organização 
Mundial de Saúde, órgão que estabelece os padrões genéricos e globais para alimentos, 
conforme CODEX STAN 1-1985, que trata sobre a rotulagem de alimentos, disponibiliza as 
informações completas ao consumidor internacional do conteúdo dos produtos adquiridos, 
bem como averigua se há ou não limitação para matérias estranhas. 
31 
 
 Além disso, pode-se relacionar o esforço internacional pela melhoria dos padrões na 
qualidade dos grãos de café, que se traduzem no aprimoramento, pelos mecanismos de 
ingerência da legislação mundial, a normalização interna existente em vários países 
importantes e grandes consumidores da bebida de café, como é o caso do FDA – Food and 
Drug Administration, através do seu Food Code, nos Estados Unidos da América, bem como 
outras normas, em países como Canadá (HEALTH PROTECTION BRANCH – Guidelines 
For General Cleanliness Of Food, 1999), Comunidade Europeia, Peru (PNTP 209.027, 2001), 
dentre outros, que além de seguirem a legislação internacional específica do café, estabelecem 
a obrigatoriedade da circulação exclusiva de um café puro livre de adulterantes e impurezas. 
 Somente em 2013 na Instrução normativa Nº 7, de 22 de Fevereiro do Ministério 
de Estado da Agricultura, Pecuária e Abastecimento (MAPA) resolve revogar a Instrução 
Normativa nº 16, de 24 de maio de 2010, publicada no Diário Oficial da União do dia 25 de 
maio de 2010, seção 1. Isto significa que não será mais permitido nenhuma concentração de 
adulterantes em café, assim como observado nas legislações de países no exterior. 
 Desse modo, a discrepância de realidade legislativa imposta aos cafés brasileiros que 
frequentam o mercado interno e externo traduzir-se-á, com certeza, nos resultados obtidos 
neste trabalho, a serem posteriormente, discutidos. 
 
1. 2. 1 Método para detecção de adulterantes em café 
Os laboratórios oficiais e credenciados realizam os exames técnicos e científicos 
exigidos para conferir segurança e qualidade alimentar aos produtos do País. São as unidades 
da Rede Nacional de Laboratórios Agropecuários, que pertence ao Sistema Unificado de 
Atenção à Sanidade Agropecuária (SUASA), do Ministério da Agricultura. As unidades do 
governo são coordenadas por seis Laboratórios Nacionais Agropecuários (LANAGROS), com 
centrais no Pará, Rio Grande do Sul, em Pernambuco, Goiás, Minas Gerais e São Paulo. Essas 
unidades realizam de 30% a 40% dos exames requisitados oficialmente, muitos deles com 
exclusividade. A rede de laboratórios credenciados, privados ou vinculados a instituições de 
ensino e fundações, completa o trabalho. O credenciamento desses estabelecimentos ocorre 
por área de atuação mediante o cumprimento dos regulamentos editados pelo ministério. Da 
propriedade rural até o ato de compra do consumidor, passando pelo transporte e as formas de 
32 
 
processamento, em praticamente todas as fases da cadeia produtiva agropecuária são 
requisitados diferentes serviços laboratoriais (MAPA, 2013). 
No Brasil, o primeiro método para detectar e quantificar a adulteração de café 
investigou a adição de cascas de café no pó torrado e foi proposto por Menezes Jr. e Bicudo 
(1958). O método foi baseado na análise microscópica visual de café em pó previamente 
tratado com clorofórmio. As cascas de café foram separadas manualmente através do uso de 
um microscópio estéreo e quantificados com um diagrama de área padrão. Uma evolução 
desta técnica é a utilização de uma balança analítica, em vez de uma área de diagrama 
(MENEZES; BICUDO, 1958). 
O processo convencional atual no Brasil para detecção de fraudes em café torrado e 
moído data de 1983, e caracteriza-se por ser um método subjetivo, extremamente dependente 
de pessoal treinado. Para identificar o material fraudado é necessário realizar uma separação 
manual com o auxílio de uma pinça e de uma lupa eletrônica entre os grânulos de café puro 
dos grânulos de impurezas provenientes da fraude. Em seguida, os dois conjuntos de materiais 
são pesados para se determinar a porcentagem da fraude presente na amostra analisada 
(LOPEZ, F. C. 1983). 
Desde os anos 60, métodos baseados em microscopia eletrônica têm sido utilizado 
pelos órgãos de fiscalização para a detecção de adulterantes e outras sujidades. Estes métodos 
convencionais para identificação de adulterantes utilizando técnicas de reconhecimento de 
padrões de cores, fotografias características e processamento digital de imagens por 
computador, são métodos subjetivos e, consequentemente, a confiabilidade da experiência do 
analista é necessária, sendo assim, sujeito a erro humano. 
Outra metodologia também utilizada para a detecção de adulterantes em café in natura 
e torrado e moído é a Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (HPLC) que, através do 
tempo de retenção da substância química na coluna cromatográfica, permite separar 
marcadores químicos dos adulterantes como, y-tocoferol, xilose, glicose, frutose e etc. 
Entretanto esta metodologia está sujeita a efeito direto de matriz e possui baixa 
especificidade, já que não poderia afirmar de qual alimento específico à substância detectada 
pertence. (BLANC et al 1989; PRODOLLIET et al, 1995; GIRARD, et al 2006; RUIZ-
MATUTE et al, 2007). 
33 
 
Recentemente, métodosespectroscópicos baseados em leitura de transmitância ou 
refletância têm sido propostos para análise de autenticidade em café torrado e moído. 
Segundo Reis et al (2012) é possível a utilização do método Diffuse Reflectance Infrared 
Fourier Transform Spectroscopy (DRIFTS) para a discriminação entre café, milho e casca 
torrados. Entretanto, a discriminação entre os alimentos depende de extensos cálculos 
estatísticos por apresentarem espectros similares. A quantificação dos alimentos adulterantes 
também seria um fator limitante desta metodologia já que, não é especificada a substância que 
caracteriza o espectro para cada adulterante (OLIVEIRA et al, 2004). 
Ultimamente, tem se utilizado para alimentos, ferramentas da Biologia Molecular, 
mais especificamente, a técnica baseada na reação em cadeia da DNA polimerase baseada nos 
princípios da replicação do DNA fita dupla, o mecanismo responsável pela transmissão da 
informação genética nas células. Trechos de DNA genômico podem ser amplificados in vitro, 
sob condições específicas, nas quais são adicionados ao meio reacional DNA polimerase 
termoestável, deoxinucleotídeos e oligonucleotídeos curtos - primers ou iniciadores, 
(apresentando sequência de bases complementares ao DNA molde). Os ciclos dessa reação 
produzem fragmentos de DNA da sequência-alvo, mesmo a partir de traços de DNA molde 
(em 3 horas, obtém-se aproximadamente 1.000.000.000 cópias). O DNA pode ser isolado a 
partir de inúmeras amostras, inclusive alimentos, utilizando técnicas de extração apropriadas 
para cada material (MEYER, 1995). 
Tipicamente, o programa de PCR consiste de uma etapa de desnaturação, anelamento 
e extensão. Na desnaturação ocorre a separação do DNA dupla-fita através do aumento da 
temperatura a mais ou menos 95°C. Posteriormente, a temperatura diminui a 55 - 65°C para 
que ocorra o anelamento dos oligonucleotídeos ao DNA molde. Depois do anelamento dos 
primers, a temperatura é elevada a 72°C, temperatura ótima de polimerização da Taq 
polimerase. Nesta etapa, ocorre a adição dos nucleotídeos complementares ao DNA molde a 
partir dos primers, e a complementação ocorre ao longo de ambas as cadeias do molde de 
DNA da molécula, sendo assim, exatamente igual à fita molde (mãe), e já no primeiro ciclo o 
DNA é duplicado. Com decorrer dos ciclos (40 ciclos) os primers delimitam uma região 
especifica, sendo esta amplificada exponencialmente (Figura 7) (BARROS et al, 2008). 
A técnica de PCR apresenta rapidez de execução, alto grau de seletividade e 
sensibilidade, critérios estes que fazem com que este método seja o mais empregado na 
maioria dos laboratórios analíticos interessados na detecção de organismos geneticamente 
34 
 
modificados, glúten, microrganismos patogênicos, além da análise de autenticidade de 
diversos alimentos (ARLORIO et al, 2007; CANKAR et al, 2008; LAUBE et al, 2010; 
CASTELLÁ; CABAÑES, 2011). 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Figura 7: Representação do processo de amplificação da PCR, adaptado de HEID et al, 2011. 
 
1. 2. 2 PCR em tempo real 
Um aprimoramento desta técnica é a PCR em tempo real, também conhecida como 
PCR quantitativa (qPCR). A PCR em tempo real permite o monitoramento da reação de 
amplificação ciclo a ciclo, em sistema fechado, sem interferências externas no progresso da 
reação. Isso porque um sinal fluorescente emitido é detectado em proporção ao aumento da 
quantidade de DNA amplificado. Essa fluorescência é emitida por compostos fluoróforos, que 
podem estar ligados a sondas tipo TaqMan ou intercalados na dupla fita do DNA amplificado 
como o SYBR Green (MULLIS et al, 1990; HEID et al, 2011). 
O aumento desse produto nos ciclos iniciais é pouco significativo, mas com o 
progresso da reação, pode-se observar um aumento exponencial do sinal emitido (fase 
35 
 
exponencial ou linear). Nesse momento da reação, a eficiência é máxima, pois os reagentes 
estão todos em concentrações adequadas que permitem o máximo de rendimento da reação. 
Após essa fase, a curva de amplificação começa a perder a linearidade, pois os 
reagentes já não estão totalmente disponíveis, diminuindo a eficiência e o rendimento da 
reação (platô). A faixa linear da curva de amplificação, entre a linha de base (baseline) e a 
mudança de curvatura, é usada para a determinação do parâmetro que permitirá a realização 
dos cálculos para quantificação da sequencia de DNA alvo. É nessa faixa que é traçada a linha 
limite (threshold), e determinado o ciclo da PCR que “cruza” tal linha limite chamado ciclo 
de threshold Ct (Figura: 8 ) (HEID et al, 2011). 
 
Figura 8: Esquematização de um gráfico de PCR em Tempo Real. Quatro fazes podem ser observadas: Baseline: 
representa os ciclos inicias da reação em que não há produto de PCR suficiente para emitir fluorescência. Fase 
exponencial: quando o produto da PCR aumenta exponencialmente. Fase linear: a fase linear é caracterizada por 
um aumento linear no produto de PCR até que os regentes se tornem limitados. Platô: ocorre quando os 
reagentes são consumidos não há mais aumento no produto de PCR. Treshold: linha limite que determina o 
ciclo da PCR Ct. (Adaptado de Barros et al 2008). 
A quantificação pode ser realizada por comparação direta dos valores de fluorescência 
detectada no Ct (método ΔCt), ou por comparação do número de cópias utilizando-se uma 
curva padrão (método da curva padrão) (HEID et al, 2011). 
 
1. 2. 3 Sistemas de detecção por PCR em tempo real 
36 
 
A chave para a PCR em tempo real é a capacidade de controlar o progresso da 
amplificação do DNA, em tempo real. E isto só é possível através de substâncias químicas e 
instrumentação. Geralmente, os sistemas de detecção são corantes especiais ou sondas (Figura 
9) (MARK A. VALASEK1; JOYCE J. REPA, 2005). 
 
 
 
 
 
 
 
 
Figura 9: Esquema A: absorção e emissão do fluoróforos SYBR Green ligado superficialmente à molécula de 
DNA. Esquema B: hibridização da sonda com o alvo e hidrólise do fluoróforo repoter (VALASEK; REPA, 
2005). 
O SYBR Green é um fluoróforo que se liga ao sulco menor da dupla-hélice de DNA 
emitindo maior fluorescência do que quando está em solução (REISCHL et al, 2002). 
Portanto, quanto maior a quantidade de DNA-duplafita presente na reação, maior a 
quantidade de SYBR Green ligado ao DNA e também maior a emissão de fluorescência. 
Assim, qualquer amplificação de DNA é traduzida em um sinal fluorescente. Por isso, este 
sistema de detecção é considerado menos específico quando comparado a sistemas de 
detecção tipo sonda. Para contornar esta limitação, é necessário a adição de uma etapa extra 
na reação conhecida, como curva de dissociação ou Melting Curve (REISCHL et al, 2002). 
Após o término da reação de PCR o produto amplificado é submetido a um aumento 
gradual de temperatura, fazendo com que as moléculas de DNA se desnaturem 
gradativamente. Como a ligação de hidrogênio entre a guanina e a citosina é mais forte do que 
a ligação entre a adenina e timina, as regiões do produto (amplicon) ricas em guanina e 
citosina resistem mais tempo ligadas com o aumento da energia térmica. Como parte da 
molécula ainda está ligada, um sinal fluorescente ainda é emitido, e este sinal luminoso mais 
37 
 
fraco é detectado pelo equipamento de qPCR. Então, a diminuição da fluorescência é plotada 
(como slope negativo) versus à temperatura, o que resulta em um pico acentuado de fusão 
(melting temperature, Tm) para cada produto de PCR (Figura 10). 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Figuara 10: Gráfico da curva de dissociação demonstrando o DNA dupla-fita submetido ao aumento de 
temperatura, gerando a Tm. 
Através da curva de dissociação, é possível descriminar com alta sensibilidade todos 
os produtos amplificados durante a reação, ou seja, qualquer amplificação inespecífica. 
Através da curva de dissociação, é possível verificar também a qualidade dos primers, a 
concentração do DNA moldee a temperatura de anelamento ideais para a condução da reação. 
(VALASEK; REPA, 2005). 
As sondas do tipo TaqMan possuem maior especificidade, pois o seu sinal 
fluorescente só é emitido quando ela está pareada na parte central da região alvo delimitada 
pelos primers (Figura 11). As sondas são marcadas quimicamente nas extremidades 5’-3’em 
uma extremidade a sonda é marcada com um composto com efeito quencher e em outra com 
efeito repórter (VALASEK; REPA, 2005). Quando esses compostos estão próximos, ligados 
na sonda, o quencher através da transferência de energia por ressonância, reduz grandemente 
a emissão fluorescente do repórter. Se a sequência alvo está presente, a sonda se hibridiza na 
região central delimitada pelos primers (Figura 11). 
°C 
Δ
R
N
 
38 
 
 
Figura 11: Esquematização da função 5’ exonucleásica da Taq polimerase. (Adaptado de Yuan et al 
2000). 
Ao reconhecer os primers, a DNA polimerase inicia a extensão da molécula, 
acrescentando os nucleotídeos trifosfatados, mas ao perceber a presença da sonda a sua frente 
à enzima ativa a sua função 5’ exonucleásica e cliva a sonda separando os corantes quencher 
e repórter possibilitando assim o repoter emitir a sua fluorescência (LIFE TECHNOLOGIES, 
2013). 
A cada ciclo da reação, as moléculas de corante reporter adicionais são clivadas a 
partir de suas respectivas sondas, o que resulta em um aumento na intensidade de 
fluorescência proporcional à quantidade de amplicon produzido (LIFE TECHNOLOGIES, 
2013). 
 
 
 
39 
 
2 JUSTIFICATIVA 
Diante do atual cenário de adulterações frequentes no mercado nacional e, 
considerando a importância do café para a economia brasileira, a falta de sensibilidade e 
especificidade dos métodos atualmente empregados para detecção de fraudes, e a necessidade 
de desenvolvimento de métodos seguros e eficazes, capazes de identificar e quantificar a 
presença de adulterantes em café torrado e moído e café solúvel, justifica-se o 
desenvolvimento de um método baseado em qPCR para este fim. 
 
3 OBJETIVOS 
3.1 Objetivo geral: O objetivo geral do presente trabalho foi desenvolver um método capaz de 
detectar e estimar os teores dos adulterantes mais comumente observados no café torrado e 
moído brasileiro, utilizando a técnica qPCR. 
 
3.2 Objetivos específicos: 
- Definir marcadores moleculares através de genes endógenos e desenhar as 
ferramentas para detecção/quantificação das sequências de DNA específicas do café e dos 
adulterantes (cevada, milho, arroz); 
- Determinar parâmetros de desempenho dos sistemas de detecção e quantificação 
definidos (linearidade, seletividade, especificidade, limite de detecção- LD e limite de 
quantificação- LQ); 
- Testar os sistemas de detecção e quantificação de adulterantes em diferentes 
amostras de café do mercado brasileiro. 
 
 
 
 
 
40 
 
4 MATERIAIS E METODOS 
4. 1 FERRAMENTAS DE BIOINFORMÁTICA 
4. 1. 1 Definição dos marcadores moleculares e dos sistemas de detecção para os adulterantes 
As sequências de DNA correspondentes aos genes endógenos para café, cevada, milho 
e arroz, foram pesquisadas no banco de dados de genomas Genbank do National Center for 
Biotechnology Information (NCBI), com os número de acesso EF044213.1, NC_008590.1, 
M60837.1 e NC_008394.4, respectivamente. As sequências escolhidas foram submetidas à 
análise de similaridade com outros genes do banco de genomas, no software online Basic 
Local Alignment Search Tool (BLAST) do próprio NCBI, que permite identificar regiões 
similares entre sequências homólogas de diferentes espécies e calcular a sua significância 
estatística (ZHANG et al, 2000; MORGULIS et al, 2008). Para cada marcador (gene) 
escolhido, foram desenhados os sistemas de detecção. Os oligonucleotídeos iniciadores 
(primers) foram desenhados utilizando-se o software online Genefisher, com um tamanho de 
fragmento amplificado de ±100 pb. Os respectivos marcadores (primers) foram analisados in 
silico, no software online BIOINFX- Free Ferramentas Online, com seus genes alvos 
previamente selecionados. Os oligonucleotídeos iniciadores foram sintetizados por MWG 
Operon Eurofins (Ebersberg, Alemanha) (GIEGERICH et al, 1996; http://bioinfx.net/#info) 
 
4. 2 AMOSTRAGEM E TORREFAÇÃO 
4. 2. 1 Amostras controle 
Quatro amostras de café torrado e moído de uma marca comercial com grau de torra 
escuro foram adquiridas para testar os métodos de extração CTAB, Dellaporta, DNeasy e o 
método híbrido CTAB/DNeasy. 
Dez amostras cruas de café (4 da espécie C. arabica, cultivares Mundo Novo, Catuai 
Amarelo, Catuai Vermelho e Bourbon; e 6 da espécie C. canephora cv. Conillon) foram 
utilizadas como controle de pureza, sendo obtidas diretamente de produtores dos Estados de 
São Paulo, Minas Gerais e Espírito Santo. Amostras in natura de cevada (Hordeum vulgare), 
milho não geneticamente modificado (Zea mayz) e arroz agulhinha (Oryza sativa) foram 
utilizadas como alvo específico. Amostras de soja (Glicine max) e trigo (Triticum aestivum) 
41 
 
foram utilizadas como alvos não específicos. Todas foram adquiridas no mercado livre de 
Santa Cruz, Rio de Janeiro. 
 Duas amostras de café entre as dez utilizadas no estudo (C. arabica), e uma de cada 
um dos alimentos adulterantes (cevada, milho, arroz, soja e trigo), foram torradas,. As 
sementes de café foram torradas em um torrador de leito fluidizado (I-Roast, EUA), a 230 ºC 
para se obter o grau de torra escuro (# 35 Agtrom- SCAA); As amostras de cevada, milho e 
arroz foram torradas em micro-ondas para obter a mesma cor que o café. Todas as amostras 
foram moídas em moinho (IKA A11 basic) e peneiradas em peneira com malha de 500 µm. 
 
4. 2. 2 Amostras comerciais 
Vinte e uma amostras de café comercial (torrado e moído e solúvel) foram adquiridas em 
diferentes mercados do Brasil. Das 21 amostras, 9 foram classificadas como gourmet ou 
superior e 12 tradicionais, sendo 3 do tipo solúvel, comercializadas a preços mais baixos. 
 
4. 3 Adulterações de amostras de café em laboratório 
Para calcular o teor de adulterantes nas amostras comerciais de café, foram construídas 
curvas padrão, através da adulteração de um blend de 80% de Coffea arabica e 20% de Coffea 
canephora, com acréscimo de 10%, 5%, 2%, 1%, 0,5% de cevada e de milho, separadamente. 
As amostras foram pesadas em balança analítica (Bioprecisa FA -2104N, Brasil). 
Para a quantificação, ou seja, determinação do percentual de cada adulterante, a 
seguinte equação da reta foi utilizada: 
y = ax + b 
onde: 
x = log [% de adulterante adicionado intencionalmente]; 
y = média Ct em amostras de café intencionalmente adulterados 
 
 
42 
 
4. 4 Extração de DNA 
4. 4. 1 Extração e quantificação de DNA a partir de amostras in natura 
Para o isolamento e purificação do DNA das amostras de café, cevada, milho, arroz e 
trigo, as mesmas foram acondicionadas em tubo Eppendorf de 1,5 mL (estéril) e pesadas, em 
duplicata, em balança analítica (Bioprecisa FA-2104N, Brasil) até alcançarem 100mg. Em 
seguida, foram adicionados 1.000 µL do tampão CTAB (1.4 M NaCl, 20g/L CTAB, 0.1 M 
Tris-HCl, 20mM Na2EDTA, pH 8.0); e 20 µL de proteinase K (20 mg/mL) (Life 
Technologies; São Paulo, Brasil), sendo homogeneizados a posteriori e incubados em banho 
aquecido a 65 ºC por 1:30 h, com agitação para homogeneização a cada 30 min. Após esta 
etapa, foram adicionados 20 µL de RNAse (10mg/mL) (Life Technologies; São Paulo, Brasil) 
e incubados em temperatura ambiente por 15 min, seguidos de centrifugação por 10 min a 
17,950 x g (Eppendorf Centrifuge 5417R, Eppendorf, Alemanha). Um volume de 500 µL do 
sobrenadante foi transferido para um novo tubo e adicionado 500 µL de clorofórmio absoluto, 
homogeneizado e centrifugado por 10 min a 17,950 x g. Quinhentos microlitros da fase 
aquosa foram transferidos para um novo tubo de 1,5 mL e foram adicionados 2 volumes do 
tampão de precipitação CTAB (5g/L CTAB;0,04M NaCl) sendo incubado por 1:30 h em 
temperatura ambiente. Logo em seguida, a solução foi centrifugada a 17,950 x g por 10 min e 
o sobrenadante foi descartado e o precipitado foi dissolvido com 350 µL de NaCl 1,2M. Foi 
adicionado 350 µL de clorofórmio, agitado em vórtex (Vixar KMC -1300V, Brasil) e 
centrifugado por mais 10 min a 17,950 x g. O filme superior foi transferido para um novo 
tubo e adicionado igual volume de isopropanol e incubado a -20ºC por 24h. O precipitado foi 
centrifugado por 10 min 17,950 x g, lavado com etanol 70% e posto para secagem em fluxo 
laminar. Logo após a secagem, as amostras foram resuspensas em água deionizada tipo Milli-
Q. Todas as reações foram realizadas em duplicatas. 
Após a extração, os isolados de DNA foram preparados para visualização em cuba de 
eletroforese 150 A/ 150V por 100 min em gel de agarose 2% TAE 1× corado com brometo de 
etídio 0,5µg/mg (LifeTechnologies; California, Estados Unidos), visualizados em 
transiluminador UV (Vilber Lourmat ECX-20 – M, Alemanha) e quantificados em 
espectrofotômetro a 260 nm/ 280 nm (Shimadzu UV-1800, Japão). 
 
 
43 
 
4. 4. 2 Extração e quantificação de DNA a partir de amostras processadas 
4. 4. 2. 1 Escolha do método de extração de DNA para as amostras torradas e moídas 
Para a avaliação dos protocolos para extração de DNA das amostras torradas e moídas, 
foram testados 4 métodos, os métodos CTAB, Dellaporta, DNeasy modificado e o método 
hibrído CTAB/DNeasy, desenvolvido no presente trabalho. Os testes foram realizados 
usando o café torrado e moído como matriz. O método CTAB foi conduzido como descrito 
anteriormente. O método Dellaporta está descrito a seguir. 
As amostras de café torrado e moído foram adicionadas ao tubo Eppendorf de 1,5 ml e 
pesadas (50 mg) em balança analítica (Bioprecisa FA-2104N, Brasil). Em seguida, foram 
adicionados 1.000 µL do tampão de extração extraction buffer EB (Tris 100 mM, EDTA 50 
mM, NaCl 500 mM, β-mercaptoetanol 10mM, pH 8,0), e 300 µL de dodecil sulfato de sódio-
SDS 20%. A mistura foi homogeneizada e agitada em vórtex (Vixar KMC -1300V, Brasil). 
Após a homogeneização, a mistura foi incubada em banho aquecido a 65 ºC, por 10min. Em 
seguida, foram adicionados 300 µL de acetato de sódio 3M, seguido de homogeneização em 
vórtex e incubação a 0 ºC por 20 min. Subsequentemente, a mistura foi centrifugada por 20 
min a 17,950 x g (Eppendorf Centrifuge 5417R, Eppendorf, Alemanha), sendo 500 µL do 
sobrenadante transferidos para um novo tubo de 1,5 mL, no qual adicionou-se 500 µL de 
isopropanol, seguido de incubação a -20 ºC por 1 h e centrifugação por 15 min a 17,950 x g. 
O sobrenadante foi descartado. O tubo foi vertido para baixo em papel toalha para a secagem 
do precipitado. O precipitado foi dissolvido em 700 µL tampão TE (Tris 50 mM, EDTA 10 
mM, pH 8,0) e centrifugado por mais 10 min a 17,950 x g rpm. O sobrenadante foi transferido 
para tubo novo de 1,5 mL no qual foram adicionados 75 µL de acetato de sódio 3M e 500 µL 
de isopropanol. Em seguida, a mistura foi incubada por 5 min à temperatura ambiente e 
centrifugado por 5 min a 17,950 x g, sendo o sobrenadante descartado. Um mL de Etanol 70% 
foi adicionado ao tubo e centrifugado por 5 min a 17,950 x g . A posteriori, o DNA 
precipitado foi seco em fluxo laminar, e resuspenso com 50 µL de água deionizada tipo Milli-
Q. Todas as reações foram realizadas em duplicatas. 
Após extração, os isolados de DNA foram preparados para visualização em cuba de 
eletroforese 150 A/ 150 V por 100 min em gel de agarose 2%, como já descrito. 
O método híbrido CTAB/DNeasy foi avaliado por apresentar mais etapas de 
purificação sendo mais rápido do que os métodos de extração tradicionais, que utilizam 
44 
 
incubação overnight. Para tanto, foram pesados 150 mg de amostra na balança analítica e 
acondicionados em tubo de 2 mL estéril Eppendorf. Adicionou-se 300 µL de água deionizada 
tipo Milli-Q, 20 µL de proteinase K (20 mg/ml) (Life Technologies; São Paulo, Brasil) e 
1.000 µL de tampão CTAB modificado (1.4 M NaCl, 20g/L CTAB, 0.1 M Tris-HCl, 20mM 
Na2EDTA, 1% β-mercaptoethanol, 4% Polivinilpirrolidona (v/v), pH 8,0) sendo 
homogeneizado e incubado em banho aquecido a 65 ºC por 1 h com intervalos para 
homogeneização a cada 20 min. Em seguida, adicionou-se 20 µL de RNAse (10 mg/ml) 
(LifeTechnologies; California, Estados Unidos) e incubou-se a mistura por 5 min à 
temperatura ambiente e por 5 min a 65 ºC, seguido de centrifugação por 10 min a 17,950 x g 
(Eppendorf Centrifuge 5417R, Eppendorf, Alemanha). Foram transferidos 800 µL do 
sobrenadante para um novo tubo e mais 800 µL de clorofórmio absoluto foram adicionados, 
seguido de agitação em vortex (Vixar KMC-1300V, Brasil) e centrifugação por mais 10 min a 
17,950 x g. Setecentos microlitros da fase aquosa foram transferidos para um novo tubo e 
mais 700 µL de clorofórmio absoluto foram adicionados, seguido de agitação em vortex e 
centrifugação por mais 10 min a 17,950 x g. Quinhentos microlitros do sobrenadante foram 
transferidos para um novo tubo e 2 volumes do tampão de precipitação CTAB (5 g/L CTAB, 
0,04 M NaCl) foram adicionados. O tubo foi incubado em temperatura ambiente por 1 h. Ao 
término da incubação, a mistura foi centrifugada por 5 min a 20,817 x g. O sobrenadante foi 
descartado e o precipitado, dissolvido com 400 µL de NaCl 1.2 M. Foi também adicionado 
1.5x o volume do tampão AP3 binding com etanol e a mistura foi homogeneizada por meio de 
pipetagem. Logo após a homogeneização, foram adicionados 650 µL do lisado na coluna 
adsorvente DNeasy Mini spin e a mistura foi centrifugada por 1 min a 6,800 x g. A última 
etapa foi repetida novamente até o fim de todo o lisado no tubo. Foi colocado a coluna 
DNeasy Mini spin dentro de em novo tubo de 2 mL para o processo de lavagem com o tampão 
AW wash DNeasy. Quinhentos microlitros do tampão AW foram adicionados na coluna, que 
foi centrifugada por 1 min a 6,800 x g. Mais 500 µL do tampão AW foram adicionados na 
coluna e centrifugados por mais 2 min a 20,817 x g. Após a lavagem, o tampão de eluição AE 
DNeasy foi aquecido, sendo 200 µL deste tampão adicionados à coluna de sílica modificada 
DNeasy para a eluição do DNA. O eluato foi submetido a mais uma etapa de purificação com 
colunas clean DNA Eurofins, (Ebersberg, Alemanha). 
Para conduzir o método DNeasy modificado, foram pesados 100 mg da amostra em 
balança analítica (Bioprecisa FA-2104N, Brasil) e acondicionados em tubo Eppendorf de 2 
mL. Foram adicionados 360 µL da solução de lise AP1 acrescidos de 40 µL de proteinase K 
45 
 
(20 mg/mL) (DNeasy Mini Plant, Alemanha) e homogeneizado. Em seguida, a amostra foi 
incubada em banho aquecido a 65 ºC por 3 h. Após o aquecimento, foram adicionados 4 µL 
de RNase (10 mg/ml) (DNeasy Mini Plant, Alemanha). O tubo foi agitado em vortex e 
incubado a temperatura ambiente por 5 min. Cento e trinta microlitros da solução de 
precipitação AP2 foram adicionados, a mistura foi homogeneizada manualmente e incubada 
no gelo por 5 min. Posteriormente, foi centrifugada a 17,950 x g por 5 min. Quatrocentos 
microlitros do sobrenadante foram aplicados na coluna Mini Spin lilac e centrifugados a 
19,356 x g (Eppendorf Centrifuge 5417R, Eppendorf, Alemanha) por 3 min. O filtrado foi 
transferido para um novo tubo de 2 mL. Foi adicionado ao filtrado 1.5 x volume do tampão 
AP3 binding com etanol DNeasy homogeneizado por pipetagem. Logo em seguida, o 
precipitado foi adicionado na coluna DNeasy Mini spin. White e centrifugado a 6,800 x g por 
1 min para a adsorção do precipitado na coluna. 500 µL do tampão AW foram aplicados na 
coluna e a mistura foi centrifugado a 6,800 x g por 1 min. Mais 500 µL do tampão AW foram 
adicionados para a lavagem final do DNA, sendo a mistura centrifugada a 19,356 x g por 2 
min para que a coluna seque. O tampão AE para eluição do DNA retido na coluna foi 
aquecido previamente a