2013-dis-pacavalcante

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UNIVERSIDADE FEDERAL DO CEARÁ 
FACULDADE DE MEDICINA 
DEPARTAMENTO DE PATOLOGIA E MEDICINA LEGAL 
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM MICROBIOLOGIA MÉDICA 
 
 
 
 
 
 
 
REGULAÇÃO DAS GUANOSINA TRIFOSFATASES RHO NA REDUÇÃO DA 
MIGRAÇÃO DE CÉLULAS INTESTINAIS INDUZIDA POR CEPAS SELVAGEM E 
PADRÃO DE Escherichia coli ENTEROPATOGÊNICA 
 
 
 
 
PALOMA ARAÚJO CAVALCANTE 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
FORTALEZA - CEARÁ 
2013 
 
 1 
PALOMA ARAÚJO CAVALCANTE 
 
 
 
 
 
 
 
 
REGULAÇÃO DAS GUANOSINA TRIFOSFATASES RHO NA REDUÇÃO DA 
MIGRAÇÃO DE CÉLULAS INTESTINAIS INDUZIDA POR CEPAS SELVAGEM E 
PADRÃO DE Escherichia coli ENTEROPATOGÊNICA 
 
 
 
 
 
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-
Graduação em Microbiologia Médica da 
Faculdade de Medicina da Universidade 
Federal do Ceará, como requisito parcial para 
obtenção do grau de Mestre em Microbiologia 
Médica. 
Orientador: Prof. Dr. Aldo Ângelo Moreira 
Lima 
 Coorientador: Prof. Dr. Alexandre Havt Bindá 
 
 
 
 
 
FORTALEZA – CEARÁ 
2013 
 
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Dados Internacionais de Catalogação na Publicação 
Universidade Federal do Ceará 
Biblioteca de Ciências da Saúde 
 
 
C364r Cavalcante, Paloma Araújo. 
 Regulação das guanosina trifosfatases rho na redução da migração de células intestinais 
induzida por cepas selvagem e padrão de Escherichia coli enteropatogênica/ Paloma Araújo 
Cavalcante. – 2013. 
 92 f. : il. 
 
 Dissertação (Mestrado) - Universidade Federal do Ceará. Faculdade de Medicina. Programa 
de Pós-Graduação em Microbiologia Médica, Fortaleza, 2013. 
 Orientação: Prof. Dr. Aldo Ângelo Moreira Lima. 
 
 
 1. Escherichia coli. 2. Movimento Celular. 3. Glutamina. 4. Proteínas rho de Ligação ao GTP. 
I. Título. 
 CDD 616.926 
 
 
 
 
 
 
 3 
 
 PALOMA ARAÚJO CAVALCANTE 
 
 
 
 
 
REGULAÇÃO DAS GUANOSINA TRIFOSFATASES RHO NA REDUÇÃO DA 
MIGRAÇÃO DE CÉLULAS INTESTINAIS INDUZIDA POR CEPAS SELVAGEM E 
PADRÃO DE Escherichia coli ENTEROPATOGÊNICA 
 
Dissertação submetida ao Programa de Pós-Graduação em Microbiologia Médica da 
Faculdade de Medicina da Universidade Federal do Ceará, como requisito parcial para 
obtenção do grau de Mestre em Mestre em Microbiologia Médica. Área de concentração: 
Microbiologia. 
 
Aprovada em: 28 /02 /2013. 
 
BANCA EXAMINADORA 
 
 
______________________________________________________ 
Prof. Dr. Aldo Ângelo Moreira Lima (Orientador) 
Universidade Federal do Ceará – UFC 
 
______________________________________________________ 
Prof
a
. Dr.
 
Marcellus Henrique Loiola Pontes de Souza 
Universidade Federal do Ceará – UFC 
 
______________________________________________________ 
Prof. Dr. Roberto César Pereira Lima Júnior 
Universidade Federal do Ceará – UFC 
 
______________________________________________________ 
Dr
a
. Ila Fernanda Nunes Lima 
Universidade Federal do Ceará – UFC 
 
 
 
 
 
 
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A Deus, por seu amor leal e fidelidade eterna; 
Ao meu marido Daniel Dantas, por seu amor, 
apoio e incentivo; 
Aos meus pais, Araújo e Vilma, por todos os 
ensinamentos baseados no amor de Cristo; 
A todos amigos e pessoas que contribuíram 
para esse trabalho. 
 
 
 
 
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AGRADECIMENTOS 
 
Agradeço primeiramente a Deus, por seu imenso amor e bondade que excede todo 
conhecimento, por renovar sobre mim suas misericórdias a cada dia, por sempre estar ao meu 
lado e por nunca desistir de mim. 
 
Ao meu marido maravilhoso, Daniel Dantas, um presente de Deus, que me ajudou e 
acompanhou muito durante essa caminhada. Pelas palavras de amor e atitudes carinhosas e 
solidárias, jamais vou esquecer tudo o que você fez por mim. 
 
A minha filha linda, Bianca Cavalcante, que ainda dentro de mim ficou muito comportada e 
assim possibilitou que sua mãe concluísse seus experimentos. 
 
Aos meus pais, pois são um exemplo de vida e de amor que desejo ter para minha família. 
Agradeço pelos ensinamentos e pelo amor tão grande por mim. Sou muito grata a Deus por tê-
los em minha vida. 
 
Ao prof. Aldo Ângelo Moreira Lima por toda sua sabedoria e ensinamentos, pela sua atenção 
e seu precioso tempo dispensados quando precisei. 
Ao prof. Alexandre Havt Bindá por sua grande ajuda e conhecimento, sua confiança, sua 
disposição e sua dedicação. 
Aos meus companheiros de laboratório, Mara Prata e Vinicios Alves. Muito obrigada por 
serem tão prestativos, atenciosos, cooperativos e alegres. Obrigada pelo prazer da companhia 
de vocês. Enfim vocês foram fundamentais para esse trabalho. 
À doutoranda em farmacologia, Josiane da Silva Quetz, por toda a sua colaboração, 
principalmente na citometria. Obrigada por sua atenção, simpatia e por estar sempre disposta 
a ajudar. 
À Dra. Ila Fernanda Nunes pelos conhecimentos e auxílio na área da microbiologia. 
À Dra. Marjorie Moreira Guedes por sua ajuda, alegria e convivência no laboratório. 
À Dra. Eunice Bobô de Carvalho pelo seu apoio e conhecimento em cultura de células. 
 
 
 6 
A Dra. Rosemayre Freire pelo grande auxílio com a técnica e dicas sobre a microscopia 
confocal fundamentais para o término deste trabalho. 
Aos alunos de iniciação científica, Pedro Henrique Quintela, Tamara Rodrigues e Rafael 
Gonzalez pela companhia, incentivo e apoio principalmente nas extrações de RNA e nas 
reações de PCR em tempo real. 
Ao funcionário José Amadeus por gerenciar o laboratório e resolver todos os problemas 
estruturais e logísticos que ele desempenha com muita qualidade. 
Às técnicas Terezinha de Jesus, Luciana França e Charliene Melo por seu auxilio na 
preparação de soluções, cuidado e organização do laboratório. 
À secretária da pós-graduação em Microbiologia Médica da UFC, Carolinda Vilma Soares de 
Oliveira, por todo carinho, simpatia, ajuda e atenção. 
A todos os professores e alunos da pós-graduação em Microbiologia Médica da UFC pelo 
conhecimento adquirido. 
A todos os alunos do Laboratório de Doenças Infecciosas e a todos os funcionários do 
Instituto de Biomedicina que contribuíram de alguma forma para esse trabalho. 
Aos órgãos financiadores, FUNCAP e CNPq, pois o apoio destas instituições permitiu a 
realização deste trabalho. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
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“Embora ninguém possa voltar e começar do 
zero outra vez, qualquer um pode começar 
agora e ter um final inédito.” 
 (Carl Bard) 
 
 
 
 8 
RESUMO 
Escherichia coli enteropatogênica (EPEC) é um importante patógeno associado às doenças 
diarreicas. Infecções intestinais ocasionam comprometimento da barreira intestinal e um dos 
primeiros mecanismos de resposta à recuperação é a migração das células intestinais. As 
principais proteínas que regulam esse processo são as pequenas GTPases Rho, Rac1, RhoA e 
Cdc42A. A alanil-glutamina (Ala-Gln) estimula este processo migratório, entretanto os 
mecanismos envolvidos nesta resposta ainda são desconhecidos. Desse modo, investigou-se o 
efeito de uma cepa selvagem e padrão (E2348/69) de EPEC, e de uma cepa comensal E. coli 
HS na migração celular intestinal, bem como a regulação da transcrição e expressão gênica 
das GTPases Rho e o papel da suplementação com Ala-Gln no processo de migração na 
presença ou ausência da infecção. A infecção pelas cepas de EPEC e pela cepa comensal 
reduziram significativamente a migração celular intestinal. Entretanto, houve uma maior 
redução desse efeito nas células infectadas pelas cepas de EPEC quando comparado àquelas 
infectadas pela cepa comensal de E. coli HS. Observou-se um alto percentual decélulas 
necróticas, cerca de 30%, induzido pela cepa padrão de EPEC apenas nos tempo de 12 e 24 
horas após infecção. A adição da Ala-Gln em células não infectadas estimulou 
significativamente e de modo dose dependente a migração após 24 horas. Porém, quando esse 
nutriente foi adicionado durante 12 e 24 horas na presença da infecção, não houve uma 
reversão do dano. Em relação à expressão gênica das GTPases Rho, observou-se um aumento 
da transcrição de rac1 nas células que haviam sido infectadas pelas cepas de EPEC e E. coli 
HS, bem como um aumento da transcrição de rhoA nas células infectadas pela cepa padrão de 
EPEC após 2 horas da infecção. Todavia, na análise das proteínas por imunofluorescência, 
RhoA e Cdc42 mostraram-se aumentadas nas células infectadas pela EPEC padrão quando 
comparado ao controle. Enquanto que as células infectadas com a cepa selvagem de EPEC 
observou-se um aumento de Rac1 e redução de RhoA. Esses dados mostraram que a migração 
das células intestinais é reduzida principalmente pelas cepas patogênicas de EPEC, ao regular 
a transcrição e expressão gênicas das proteínas GTPases Rho. A suplementação com Ala-Gln 
em células intestinais promoveu a migração celular apenas na ausência da infecção. 
Palavras-chave: E. coli enteropatogênica, migração intestinal celular, Alanil-Glutamina, 
pequenas GTPases Rho. 
 
 
 
 
 
 9 
ABSTRATC 
Enteropathogenic Escherichia coli (EPEC) is an important pathogen associated with diarrheal 
diseases. Intestinal infections cause impairment of the intestinal barrier and one of the earliest 
response mechanisms to recover is migration of the intestinal cells to cover the injured area. 
The key proteins that regulate cell migration are small Rho GTPases, Rac1, Cdc42 and RhoA. 
The alanyl-glutamine (Ala-Gln) increases this migration process, however the mechanisms 
involved in this response are still unknown. Thus, we investigated the effect of a wild type 
strain and standard (E2348/69) of EPEC strain and a commensal E. coli HS on intestinal cell 
migration, as well as transcriptional regulation and gene expression of Rho GTPases and the 
role of supplemental Ala-Gln in the migration process in the presence or absence of infection. 
Infection by EPEC strains and commensal E. coli HS significantly reduced intestinal cell 
migration. However, this effect was more pronounced in cells infected by the strains of EPEC 
compared to those infected by the commensal strain of E. coli HS. We observed a high 
percentage of necrotic cells, about 30%, induced only by EPEC strain pattern 12 and 24 hours 
after infection. The addition of Ala-Gln in uninfected cells significantly stimulated in a dose 
dependent migration after 24 hours. However, when this nutrient was added over 12 and 24 
hours in the presence of infection, there was no reversion of the damage. Regarding the gene 
expression of Rho GTPases, we observed an increase in transcription of rac1 in cells that had 
been infected by the strains of EPEC and E. coli HS as well as an increase in rhoA 
transcription in cells infected with EPEC strain pattern at 2 hours after infection. However, 
the analysis of proteins by immunofluorescence, RhoA and Cdc42 shown to be elevated in 
cells infected with EPEC pattern when compared to the control. Whereas cells infected with 
wild EPEC strain was observed an increase of Rac1 and reduction of RhoA. These data 
showed that cell migration is reduced mainly by the intestinal pathogenic strains of EPEC, in 
regulating gene transcription and expression of the protein Rho GTPases. Supplementation 
with Ala-Gln in intestinal cells only promoted cell migration in the absence of infection. 
Keywords: Enteropathogenic E. coli, intestinal cell migration, Alanyl-Glutamine, small Rho 
GTPases. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 10 
LISTA DE FIGURAS 
 
 
FIGURA 1 - Diferentes tipos de padrão de aderência das cepas de EPEC .............................. 24 
FIGURA 2 - Processo de renovação do epitélio intestinal ....................................................... 29 
FIGURA 3 - Etapas da migração celular .................................................................................. 31 
FIGURA 4 - Ciclo das GTPases Rho e sua regulação pelas proteínas GEF, GAP e GDI ....... 32 
FIGURA 5 - Vias de utilização da glutamina nas células de mamíferos ................................. 34 
FIGURA 6 - Células IEC-6 vistas em microscópio óptico invertido no aumento de 100X .... 41 
FIGURA 7 - Células HEp-2 vistas em microscópio óptico invertido no aumento de 100X .... 42 
FIGURA 8 - Detecção dos genes de diagnóstico de cepas diarreiogênicas de E. coli ............. 53 
FIGURA 9 - Detecção dos genes de virulência das cepas de EPEC ........................................ 54 
FIGURA 10 - Padrão de aderência localizada das cepas de EPEC .......................................... 55 
FIGURA 11 - Curva dose resposta das cepas bacterianas EPEC E2348/69 e E. coli HS na 
migração celular intestinal após 6 horas do término da infecção. ............................................ 56 
FIGURA 12 - Curva tempo efeito das cepas bacterianas EPEC E2348/69, EPEC selvagem e 
HS na dose de 10
6
 UFC/mL na migração das células intestinais ............................................. 57 
FIGURA 13 - Curva tempo efeito das cepas bacterianas EPEC E2348/69, EPEC selvagem e 
HS na concentração 10
6
 UFC/mL no percentual de apoptose em células intestinais............... 58 
FIGURA 14 - Curva tempo efeito das cepas bacterianas EPEC E2348/69, EPEC selvagem e 
HS na concentração 10
6
 UFC/mL no percentual de necrose das células intestinais ................ 59 
FIGURA 15 - Curva dose resposta da suplementação com Ala-Gln na migração intestinal 
celular na ausência de bactérias após 24 h da sua adição ......................................................... 60 
FIGURA 16 - Efeito da adição da Ala-Gln 5 mM nas células intestinais que foram infectadas 
pelas cepas patogênicas de EPEC ............................................................................................. 61 
FIGURA 17 - Histograma do efeito da suplementação com Ala-Gln 5mM quando as células 
intestinais foram infectadas pelas cepas patogênicas de EPEC ................................................ 62 
FIGURA 18 - Efeito da adição da Ala-Gln 5 mM no percentual de necrose celular 12 e 24 
horas após o término da infecção ............................................................................................. 63 
 
 
 11 
FIGURA 19 - Expressão da transcrição do gene rac1 nas células intestinais após 2 horas do 
término da infecção .................................................................................................................. 64 
FIGURA 20 - Expressão da transcrição do gene rhoA nas células intestinais após 2 horas do 
término da infecção. ................................................................................................................. 64 
FIGURA 21 - Imunofluorescência da proteína RhoA observada através da microscopia 
confocal após 2 horas do término da infecção .......................................................................... 66 
FIGURA 22 - Imunofluorescência da proteína Rac1 observada através da microscopia 
confocal após 2 horas do término da infecção .......................................................................... 67 
FIGURA 23 - Imunofluorescência da proteína Cdc42 observada através da microscopia 
confocal após 2 horas do término da infecção .......................................................................... 68 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 12 
LISTA DE QUADROS 
 
QUADRO 1 - Efeitos da glutamina no intestino e vias de sinalizações envolvidas ................ 38 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 13 
 
LISTA DE TABELAS 
 
TABELA 1 - Genes alvo, primers utilizados e tamanhosdos produtos obtidos no diagnóstico 
molecular das cepas de E. coli diarreiogênicas ........................................................................ 46 
TABELA 2 - Genes alvo, primers utilizados e tamanhos dos produtos obtidos dos genes de 
virulência de EPEC. .................................................................................................................. 47 
TABELA 3 - Genes alvo, sequência dos primers utilizados e condições da qPCR ................. 53 
TABELA 4 – Intensidade da fluorescência das proteínas GTPases Rho em relação ao controle 
não infectado após 2 horas do término da infecção .................................................................. 65 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 14 
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS 
 
 
A/E Lesão intestinal denominada attaching and effacing 
AA Padrão de aderência agregativa 
aaiC Gene cromossomial da Escherichia coli enteroagregativa 
aatA Gene codificador da proteína do complexo secretor da dispersina da EAEC 
ADP Adenosina difosfato 
AIEC E. coli aderente e invasiva 
Ala-Gln L-alanil-L-glutamina 
ANOVA Análise de variância 
Arp 2/3 Proteínas relacionadas à actina 2/3 
ATCC American Type Collection Culture 
ATP Adenosina trifosfato 
BFP Bundle-forming pilus 
BLAST Basic Local Alignment Search Tool 
Caco-2 Linhagem celular derivada de carcinoma de cólon humano 
cDNA Ácido desoxirubonucléico complementar 
CE Ceará 
CTRL Controle de células não infectado 
DA Padrão de aderência difusa 
DAEC E. coli difusamente aderente 
DALY Inabilidade ajustada em anos de vida (Disability-adjusted life year) 
DMEM Meio de Eagle modificado por Dulbecco 
DNA Ácido desoxirubonucléico 
dNTPs Deoxinucleotídeos 
eae Gene cromossomial da E. coli enteropatogênica 
EAEC E. coli enteroagregativa 
EAF EPEC adherence factor 
EC50 Concentração necessária para promover 50% do efeito máximo 
EDTA Ácido etilenodiamino tetra-acético 
EHEC E. coli enterohemorrágica 
EIEC E. coli enteroinvasiva 
ELISA Ensaio imunoenzimático (Enzyme-linked immunosorbent assay) 
eltB Gene codificador da toxina termolábio de E. coli enterotoxigênica 
 
 15 
EPEC E. coli enteropatogênica 
ERK1/2 Extracellular signal-related kinase 1/2 
Esp EPEC protein secreted 
estA Gene codificador da toxina termoestável de E. coli enterotoxigênica 
ETEC E. coli enterotoxigênica 
ExPEC E. coli responsáveis por causar doenças extraintestinais 
F Primer senso 
FAS fluorencent actin stain 
FIOCRUZ Fundação Oswaldo Cruz 
FITC Isotiocianato de fluoresceína (fluorescein isothiocyanate) 
GAPs Proteínas ativadoras de GTPases 
GDIs Iinibidores da dissociação de guanina 
GDP Guanosina difosfato 
GEFs Fatores de troca do nucleotídeo guanina 
Gln L-glutamina 
GO Glutationa oxidada 
GR Glutationa reduzida 
GTP Guanosina trifosfato 
GTPases Guanosina trifosfatases 
HeLa Linhagem celular derivada de carcinoma cervical humano 
HEp-2 Linhagem celular derivada de carcinoma laríngeo humano 
IBGE Instituto Brasileiro de Geografia e Estatística 
IEC-6 Linhagem celular epitelial derivada de criptas do jejuno de ratos normais 
IL-10 Interleucina-10 
IL-6 Interleucina-6 
IL-8 Interleucina-8 
ipaH Gene do plasmídeo de invasão da E. coli enteroinvasiva 
JNK c-jun N-terminal kinase 
LA Padrão de aderência localizada 
LAL Padrão de aderência localizada-like 
LEE Locus of enterocyte effacement 
LPS Lipopolissacarídeo 
MAEC E. coli associada a meningite e sepse 
 
 16 
MAL-ED Projeto internacional: The Interactions of Malnutrition & Enteric Infections: 
Consequences for Child Health and Development 
Map Proteína efetora da E. coli enteropatogênica Mitochondrion-associated protein 
MAPK Mitogen-activated protein kinase 
MEM Meio de Eagle modificado 
MTOC Centro organizador de microtúbulos 
NADPH Nicotinamide adenine dinucleotide phosphate 
NF-kB Fator nuclear transcripcional kappa B 
N-WASP Proteína neural da síndrome de Wiskott-Aldrich 
OD Densidade óptica 
ODC Ornitina descarboxilase 
PAMPS Padrões moleculares associados a patógenos 
PBS Tampão salina fosfato (phosphate-buffered saline) 
PCR Reação da polimerase em cadeia 
Pi Fosfato inorgânico 
PI Iodeto de propídio 
PI3-K Phosphoinositide 3-kinase 
qPCR Reação da polimerase em cadeia quantitaviva 
R Primer antisenso 
RIE-1 Linhagem celular derivada de células epiteliais do intestino delgado de ratos 
RNA Ácido ribonucléico 
RPM Rotações por minuto 
SGLT1 Cotransportador de sódio/glicose 1 
SptP Salmonella protein tyrosine phosphatase 
SST3 Sistema de secreção do tipo 3 
STEAC E. coli agregativa produtora de Shiga-toxina 
stx Gene que codifica a proteína Shiga-toxina 
T84 Linhagem celular epitelial derivada de adenocarcinoma de cólon humano 
TGI Trato gastrointestinal 
Tir Translocated intimin receptor 
TLR-5 Receptor Toll-like-5 
TRO Terapia de reidratação oral 
UFC Unidade formadora de colônia 
UNICEF The United Nations Children’s Fund 
 
 
 17 
UPEC E. coli uropatogênica 
WHO World Health Organization 
YopE Yersinia outer protein E 
YopO Yersinia outer protein O 
YopT Yersinia outer protein T 
YpkA Yersinia protein kinase A 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 18 
LISTA DE SÍMBOLOS 
 
β beta 
 kappa 
o
C grau Celsius 
cm
2 
centímetros quadrados 
CO2 gás carbônico 
kDa Kilodalton 
mm
2 
milímetros quadrados 
mM milimolar 
mL mililitros 
L microlitros 
g microgramas 
pb pares de base 
O2 oxigênio 
% por cento 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 19 
 
SUMÁRIO 
1 INTRODUÇÃO ................................................................................................................... 21 
1.1 Doenças diarreicas ............................................................................................................ 21 
1.2 Escherichia coli ................................................................................................................. 23 
1.3 Escherichia coli enteropatogênica (EPEC) ..................................................................... 24 
1.3.1 Classificação e diagnóstico ............................................................................................ 24 
1.3.2 Epidemiologia ................................................................................................................. 26 
1.3.2 Fisiopatologia ................................................................................................................. 27 
1.4 Epitélio gastrointestinal ................................................................................................... 29 
1.5 Migração celular ............................................................................................................... 31 
1.6 Glutamina e Alanil-Glutamina ........................................................................................ 35 
2 PERGUNTAS DE PARTIDA ............................................................................................. 39 
3 HIPÓTESES ........................................................................................................................ 39 
4 OBJETIVOS ........................................................................................................................ 40 
4.1 Objetivo geral .................................................................................................................... 40 
4.1 Objetivos específicos ......................................................................................................... 40 
5 MATERIAL E MÉTODOS ................................................................................................ 41 
5.1 Microrganismos ................................................................................................................41 
5.2 Cultivo celular ................................................................................................................... 41 
5.2.1 Linhagens celulares ....................................................................................................... 41 
5.2.2 Preparação e contagem celular .................................................................................... 43 
5.3 Diagnóstico molecular das cepas de EPEC e detecção de genes de virulência ........... 44 
5.4 Protocolo de infecção ........................................................................................................ 47 
5.5 Padrão de aderência bacteriano ...................................................................................... 48 
5.6 Migração celular intestinal .............................................................................................. 48 
5.7 Análise em citometria de fluxo ........................................................................................ 49 
5.8 Avaliação da transcrição dos genes rhoA, rac1 e cdc42 ................................................ 50 
 
 
 20 
5.8.1 Extração do RNA total celular ..................................................................................... 50 
5.8.2 Síntese de cDNA ............................................................................................................. 51 
5.8.3 PCR quantitativo em tempo real (qPCR) ................................................................... 51 
5.9 Avaliação da expressão qualitativa da expressão das proteínas GTPases Rho por 
microscopia confocal .............................................................................................................. 52 
5.10 Análise estatística ............................................................................................................ 53 
6 RESULTADOS .................................................................................................................... 54 
6.1 Diagnóstico molecular das cepas de EPEC e detecção de genes de virulência ........... 54 
6.2 Padrão de aderência bacteriano ...................................................................................... 55 
6.3 Efeito das cepas bacterianas na migração de células intestinais .................................. 56 
6.4 Efeito das cepas bacterianas na apoptose/necrose das células intestinais ................... 58 
6.5 Efeito da suplementação com alanil-glutamina na migração e na apoptose/necrose 
das células intestinais ............................................................................................................. 60 
6.6 Transcrição dos genes rhoA, rac1 e cdc42 ...................................................................... 64 
6.7 Avaliação da expressão qualitativa da expressão das proteínas GTPases Rho por 
microscopia confocal .............................................................................................................. 66 
7 DISCUSSÃO ........................................................................................................................ 70 
8 CONCLUSÃO ...................................................................................................................... 78 
REFERÊNCIAS ..................................................................................................................... 79 
 
 
 
 21 
1 INTRODUÇÃO 
 
1.1 Doenças diarreicas 
As doenças diarreicas representam um dos principais problemas de saúde pública 
acometendo, especialmente, crianças menores de cinco anos nos países em desenvolvimento. 
(BLACK et al., 2010; GUERRANT et al., 2002; KEUSCH et al., 2006). Essas enfermidades 
apresentam-se como a segunda causa de mortalidade na faixa etária de 0-5 anos, sendo 
responsáveis pela morte de 1,5 milhões de crianças todos os anos (World Health 
Organization/The United Nations Children’s Fund – WHO/UNICEF, 2009). A grande 
maioria desses óbitos ocorre em países em desenvolvimento (BLACK et al., 2010). 
Uma medida para avaliar o impacto global das doenças diarreicas foi relatada pela 
WHO denominada DALY (disability-adjusted life years, inabilidade ajustada em anos de 
vida). Sua avaliação é baseada na quantidade de anos de vida vividos em condição inferior de 
saúde plena, sendo uma DALY equivalente à perda de um ano de vida saudável As doenças 
diarreicas atingiu a segunda colocação na lista das enfermidades mais impactantes no mundo, 
perdendo apenas para as doenças respiratórias (WHO, 2004). 
 
Análises recentes demonstram que nas últimas décadas houve um decréscimo 
significativo da mortalidade infantil por diarreia, devido principalmente ao advento da 
Terapia de Reidratação Oral (TRO). Entretanto, a contribuição das doenças diarreicas à taxa 
de morbidade para a saúde infantil ainda se apresenta alta e constante (FISCHER WALKER 
et al., 2012). 
No Brasil o índice da mortalidade infantil ocasionados por diarreia era de 17,3% nos 
anos 80, entretanto houve uma redução desta taxa de aproximadamente quatro vezes nos anos 
de 2003-2005 (FIOCRUZ, 2008). Tal declínio deveu-se principalmente à intervenção com a 
TRO (MUNOS et al., 2010; OLIVEIRA; LATORRE, 2010) e também ao maior investimento 
governamental garantindo o acesso à água encanada e saneamento básico (IBGE, 2011). No 
entanto, a proporção de mortes por diarreia na região Nordeste ainda é alta quando comparada 
à região Sudeste, mostrando assim as desigualdades entre as regiões brasileiras 
principalmente em relação ao acesso e qualidade da atenção à saúde (FIOCRUZ, 2008). 
 22 
O alto índice de episódios diarreicos pode ocasionar danos ao desenvolvimento 
infantil, visto que a absorção de nutrientes durante os primeiros dois anos de vida é 
fundamental para garantir um apropriado desenvolvimento físico, cognitivo e escolar (PETRI 
et al., 2008). 
Além do grande impacto sobre os anos de vida saudáveis perdidos e nas funções 
cognitivas, outro fator que representa grande desafio à saúde pública é o ciclo vicioso 
diarreia-desnutrição (LIMA et al., 2000; PETRI et al., 2008; SANTOS et al., 2008; 
WALKER et al., 2007). Neste ciclo, doenças diarreicas ou infecções entéricas predispõem o 
hospedeiro para um quadro de desnutrição, pois limitam sua capacidade absortiva. Por outro 
lado indivíduos desnutridos são mais gravemente afetados pelas infecções intestinais 
(CAUFIELD et al., 2004; GUERRANT et al., 2008; LIMA et al., 2000; MOORE et al., 2000, 
2010). 
Segundo a WHO/UNICEF (2009) a diarreia é definida pela a presença de três ou mais 
evacuações líquidas/pastosas por dia. A etiologia das doenças diarreicas pode ser de origem 
infecciosa e não infecciosa. Dentre as causas das diarreias não infecciosas, existem aquelas 
relacionadas à intolerância alimentar (SKYPALA, 2011; WADDELL, 2011), as diarreias 
devido ao uso de medicamentos (SHAFI; BRESALIER, 2010; TERAMURA-GRÖNBLAD et 
al., 2010) e as diarreias decorrentes de condições patológicas como a doença de Crohn e a 
colite ulcerativa (VILELA et al., 2012; WILKINS et al., 2011). Uma variedade de 
microorganismos está associada às diarreias de causa infecciosa, como bactérias, vírus e 
protozoários (BRESSE et al., 2012; MANDOMANDO et al., 2007; QU et al., 2012). 
 Os agentes virais possuem uma alta prevalência nos países desenvolvidos, e sua 
incidência é associada a características sazonais, um dos principais agentes etiológicos virais é 
o rotavírus (TATE et al., 2012; WILHELMI DE CAL; MOHEDANO DEL 
POZO; SÁNCHEZ-FAUQUIER, 2008). Nos países em desenvolvimento, os principais 
patógenos associados às doenças diarreicas são as bactérias, seguido por vírus e parasitas 
intestinais. Dentre as bactérias, uma variedade de espécies é descrita como importantes 
causadores de diarreia, como as cepas patogênicas de Escherichia coli, Shigella spp., 
Campylobacter spp. e Salmonella spp., dentre outros (GOMES et al., 1991; MORENO et 
al.,2010; NWEZE, 2010; PODEWILS et al., 2004). 
 
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Wilhelmi%20de%20Cal%20I%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=19100169
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Mohedano%20del%20Pozo%20RB%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=19100169
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Mohedano%20del%20Pozo%20RB%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=19100169
 23 
1.2 Escherichia coli 
 
Escherichia coli é um bacilo móvel, Gram-negativo, anaeróbio facultativo e pertence a 
maior e mais heterogênea família bacteriana, Enterobacteriaceae. As enterobactérias são 
encontradas no solo, água e vegetação, bem como fazem parte da microbiota intestinal de 
muitos animais e dos seres humanos (MURRAY; ROSENTHAL; PFALLER, 2006). E. coli 
tipicamente coloniza o trato gastrointestinal de crianças após poucas horas do nascimento. De 
modo geral esse microrganismo possui uma relação de benefício mútuo com seu hospedeiro. 
As cepas comensais de E. coli concentram-se principalmente na região mucosa do cólon dos 
mamíferos, sendo a principal bactéria que coloniza essa área (KAPER; NATARO; MOBLEY, 
2004). Sugere-se que essa alta taxa de colonização seja por sua capacidade de utilizar como 
fonte nutricional o gliconato de sódio presente no cólon com mais avidez que outros 
microgarnismos (SWEENEY, 1996). 
 
E. coli é um microrganismo altamente versátil e também intensamente estudado. O seu 
genoma possui grande flexibilidade, tendo em vista que diferentes cepas de E. coli podem 
compartilhar somente 60-70% de sua capacidade de codificação (DOBRINDT et al., 2010). 
Essa variação pode ser decorrente de transferência horizontal de genes e própria perda de 
informação genética. Essas diferentes cepas adquiriram fatores de virulência específicos, 
frequentemente localizados em elementos genéticos transmissíveis, como ilhas genômicas, 
bacteriófagos, plasmídeos ou transposons e, assim, podem ser facilmente transferidos para 
outras bactérias (HACKER; HENTSCHEL; DOBRINDT, 2003; JOHNSON; NOLAN, 2009). 
Os fatores de virulência da E. coli possibilitam uma adaptação a novos locais de colonização, 
aumentando o espectro de doenças causadas por este microrganismo. A partir da combinação 
bem sucedida desses fatores de virulência surgiram estirpes de E. coli patogênicas ou também 
denominados de patotipos que são capazes de causar doenças em pessoas saudáveis. 
(KAPER; NATARO; MOBLEY, 2004). 
 
As principais doenças as quais esses patotipos de E. coli estão relacionados são: 
doenças intestinais/diarreicas, infecções do trato urinário, sepse e meningite. As E. coli 
responsáveis por causar doenças extraintestinais são classificadas como ExPEC, como a E. 
coli uropatogênica (UPEC) e E. coli associada a meningite e sepse (MAEC). Em relação as E. 
coli diarreiogênicas, existem seis tipos bem definidos: EPEC – E. coli enteropatogênica, 
EHEC - E. coli enterohemorrágica, EAEC – E. coli enteroagregativa, EIEC - E. coli 
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Hacker%20J%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=12907788
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Hentschel%20U%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=12907788
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Dobrindt%20U%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=12907788
 24 
enteroinvasiva, ETEC - E. coli enterotoxigênica e DAEC - E. coli difusamente aderente 
(KAPER; NATARO; MOBLEY, 2004). Recentemente, Clements e colaboradores (2012) 
sugerem a expansão dessa classificação com mais dois patotipos, AIEC – E. coli aderente e 
invasiva e STEAC – E. coli agregativa produtora de Shiga-toxina. Esta última foi responsável 
por um surto de diarreia associada à síndrome hemolítica urêmica na Europa em 2011. 
 
EPEC foi o primeiro patotipo a ser descrito e continua sendo um importante agente 
etiológico de diarreia infantil em todo mundo, com elevada prevalência em ambientes 
hospitalares e comunidades carentes (WHO, 2002), bem como também é relatado ser uma das 
principais causas de diarreia persistente (ABBA et al., 2009). 
 
1.3 Escherichia coli enteropatogênica (EPEC) 
 
1.3.1 Classificação e diagnóstico 
 
 EPEC foi inicialmente classificada com base na sua identificação por meio de 
sorotipagem dos antígenos O e H. Com um maior conhecimento sobre esse patógeno sua 
classificação e diagnóstico é baseada principalmente através da detecção de dois genes de 
virulência, um cromossomal - eae e um plamidial - bfpA (bundle-forming pilus) por meio de 
métodos moleculares (OCHOA et al., 2008). De acordo com Trabulsi e colaboradores (2002), 
existem dois tipos de EPEC, típica e atípica. A característica principal das cepas típicas é a 
presença dos genes eae e bfpA e ausência do gene stx (shiga toxin) encontrado em EHEC, 
enquanto que a EPEC atípica é marcada pela presença do gene eae e ausência dos genes bfpA 
e stx. 
 
 O diagnóstico de EPEC também pode ser realizado por métodos de fenotipagem, 
utilizando culturas de células e imunofluorescência. EPEC induz um fenótipo A/E (attaching 
and effacing) caracterizado pela destruição das microvilosidades e aderência íntima entre a 
bactéria e o epitélio intestinal com acúmulo de actina polimerizada abaixo do local de 
aderência, formando uma estrutura de pedestal. Esse fenótipo A/E é detectado pelo teste de 
FAS (fluorencent actin stain), no qual o conjugado de faloidina-rodamina se liga as estruturas 
de F-actina, considerado positivo quando se observam manchas puntiformes de intensa 
fluorescência (NATARO; KAPER, 1998). 
 25 
 Outro teste fenotípico para o diagnóstico de EPEC é o padrão de aderência bacteriana 
às células HEp-2 ou HeLa, células humanas de linhagem de carcinoma laríngeo e de colo 
uterino, respectivamente (NATARO; KAPER, 1998). Quatro tipos de padrão de aderência 
foram descritos e relacionados com EPEC típicas e atípicas (FIGURA 1). As cepas típicas 
apresentam principalmente um padrão de aderência localizado (LA – localized adherence), 
sendo este padrão associado com a expressão do gene bfpA. Diferentemente, as cepas atípicas 
apresentam mais de um padrão de aderência: aderência localizada-like - LAL (localized 
adherence-like), aderência difusa - DA e aderência agregativa - AA. O padrão DA também é 
observado em cepas de EHEC e o padrão AA é característico de cepas EAEC (TRABULSI; 
KELLER; GOMES, 2002). 
 
Figura 1 – Diferentes tipos de padrão de aderência das cepas de EPEC. 
 
Fonte: Trabulsi; Keller; Gomes (2002). LA – aderência localizada; DA – aderência difusa; AA – aderência 
agregativa e LAL – aderência localizada-like. 
 
 
 
 26 
1.3.2 Epidemiologia 
 
 Inicialmente, EPEC foi um importante patógeno encontrado em crianças com diarreia 
em países desenvolvidos, entretanto sua prevalência nessa população decaiu com o passar do 
tempo. Em contraste, nos países em desenvolvimento esse patotipo ainda é um dos principais 
causadores de diarreia infantil principalmente em crianças menores de dois anos (OCHOA et 
al., 2008). 
 
 A frequência desse patógeno é dependente de fatores como idade, método de 
diagnóstico utilizado, população e região estudadas. A prevalência média global em 
comunidades é de 8,8%, em ambiente ambulatorial é de 9,1% e no hospitalar de 15,6% 
(WHO, 2002). 
 
No Brasil esses resultados também foram semelhantes. Estudos realizados na Bahia e 
São Paulo revelaram uma frequência de cerca de 10% de EPEC nas fezes de crianças com 
diarreia relacionada, principalmente, com baixo nível socioeconômico (ARAÚJO et al., 2007; 
BUERIS et al., 2007; DE MOURA et al., 2012; FRANZOLIN et al., 2005). A associação 
significativa desse microrganismo em crianças com diarreia quando comparado com controles 
é observada em muitos estudos (ALIKHANI; MIRSALEHIAN; ASLANI, 2006; ARAÚJO et 
al., 2007; BUERIS et al., 2007). Entretanto, outros pesquisadores não encontraram diferença 
na prevalência desse microrganismo entre casos e controles (OCHOA et al., 2011; 
RAJENDRAN et al., 2010). Nos paísesem desenvolvimento a colonização de 
enteropatógenos em crianças é alta. A infecção nesses casos dependerá de fatores como: 
suscetibilidade do hospedeiro, fatores de virulência do microrganismo e fatores ambientais 
(OCHOA; CONTRERAS, 2011). 
 
Recentes estudos mostram uma maior prevalência das cepas atípicas de EPEC tanto 
em países desenvolvidos como em desenvolvimento (ARAÚJO et al., 2007; OCHOA et al., 
2008). Entretanto, ainda há certa controvérsia sobre a patogenicidade desse microrganismo, 
pois alguns trabalhos não encontraram diferença significativa na prevalência desse patógeno 
em crianças com ou sem diarreia (OCHOA; CONTRERAS, 2011; RAJENDRAN et al., 
2010). 
 
 
 27 
1.3.3 Fisiopatologia 
 
 A principal característica do mecanismo fisiopatológico da EPEC reside na 
capacidade de provocar a lesão attaching and effacing – A/E. Este fenótipo é caracterizado 
pela destruição das microvilosidades e aderência íntima entre as bactérias e o epitélio 
intestinal. Mudanças marcantes do citoesqueleto celular são observadas logo abaixo das 
bactérias aderidas, como o acúmulo de actina polimerizada, formando uma estrutura de 
pedestal (NATARO; KAPER, 1998). 
 
 Donnenberg e Kaper (1992) sugeriram didaticamente que a lesão A/E ocorre em três 
estágios: aderência inicial a célula hospedeira, produção de proteínas efetoras e sua 
translocação para o citoplasma celular e a íntima aderência com a formação da estrutura de 
pedestal. 
 
O contato inicial entre EPEC e a célula hospedeira é mediado por fímbrias do tipo IV, 
expressas na superfície bacteriana e denominadas bundle forming pili (BFP). Essas fimbrias 
promovem a formação de microcolônias com aderência localizada em culturas de células 
epiteliais (GIRÓN; HO; SCHOOLNIK, 1991). Os genes que codificam BFP estão localizados 
no plasmídio EAF (EPEC adherence factor) (BALDINI et al., 1983), que contém 14 genes 
(SOHEL et al., 1996; STONE et al., 1996). O gene bfpA codifica a principal subunidade pili 
de BFP (DONNENBERG et al., 1992). 
 
Após a aderência inicial, diversas proteínas efetoras de EPEC (Esp – EPEC protein 
secreted) são secretadas para dentro da célula do hospedeiro por meio do SST3 (Sistema de 
secreção do tipo 3). Existem diversas proteínas efetoras com EspA, EspB, EspD, EspF, dentre 
outras que alteram uma variedade de vias de sinalização celular (KAPER; NATARO, 1998). 
A proteína EspA, um monômero que se polimeriza e forma uma estrutura semelhante a uma 
agulha, na qual moléculas efetoras serão introduzidas para o citoplasma da célula hospedeira 
(KNUTTON et al., 1998); EspB e EspD, formam um poro na membrana celular do 
hospedeiro (IDE et al., 2001) e EspF, atua na mitocôndria, onde desempenha um papel na 
morte celular (NOUGAYREDE; DONNENBERG, 2004). Grande parte dessas proteínas é 
codificada em uma ilha cromossômica de patogenicidade, conhecida como o locus of 
enterocyte effacement - LEE (JARVIS et al., 1995; KENNY; FINLAY, 1995). 
 
 28 
Outro importante fator que participa da adesão íntima de EPEC com as células 
epiteliais é a intimina, produto do gene eae, uma proteína de membrana externa de peso 
molecular igual a 94 kDa (JERSE; KAPER, 1991). Esta proteína liga-se ao receptor Tir 
(translocated intimin receptor), também inserido pelo sistema de secreção do tipo III. O 
domínio citoplasmático de Tir interage com a proteína adaptadora Nck que sinaliza as 
moléculas N-WASP (Proteína neural da síndrome de Wiskott-Aldrich) e o complexo Arp 2/3 
(Proteínas relacionadas à actina 2/3). Assim, o citoesqueleto de actina é reorganizado e resulta 
na formação da estrutura de pedestal e da lesão A/E (GRUENHEID et al., 2001). 
 
EPEC possui diversos fatores de virulência e, nas últimas décadas, a identificação e 
caracterização desses fatores contribuiu para o melhor entendimento de como esse patógeno 
está relacionado com indução da diarreia. A própria lesão A/E na qual há alteração e 
diminuição das microvilosidades ocasiona uma perda na capacidade absortiva das células 
intestinais e consequente diarreia (LAPOINT; CONNOR; BURET, 2009). 
 
A alteração do transporte de eletrólitos e água é outro mecanismo que possivelmente 
desencadeia um início rápido dos sintomas da diarreia causados por EPEC. Muitos estudos 
mostram que EPEC altera diferentes transportadores, ocasionando um desequilíbrio na troca 
de Na
+
/Cl
- 
e
 
redução da absorção de água (LAPOINT; CONNOR; BURET, 2009). Dean e 
colaboradores (2006) observaram que EPEC é capaz de inativar rapidamente o 
cotransportador de sódio/glicose SGLT1, que tem um papel crucial na absorção de fluidos no 
intestino normal. 
 
As proteínas do tipo junções firmes ou do inglês tight junctions são importantes para a 
manutenção do equilíbrio da barreira intestinal epitelial e também são afetadas pela EPEC. 
Este patógeno altera a distribuição dessas proteínas na célula e leva ao aumento da 
permeabilidade celular contribuindo para a doença diarreica (ZHANG et al., 2012). 
 
A resposta imunológica do hospedeiro contra EPEC estaria relacionada com a 
severidade e duração da doença diarreica (LAPOINT; CONNOR; BURET, 2009). EPEC 
possui padrões moleculares associados a patógenos (PAMPS) que se liga a receptores Toll-
like nas células intestinais. Dados recentes mostraram que a flagelina de EPEC ativa essa 
resposta imunológica por meio da ativação do receptor Toll-like-5 (TLR-5) com a produção 
de IL-8, um potente quimiotático de neutrófilos (KHAN et al., 2008). Sharma e 
 29 
colaboradores (2005) observaram que a resposta inflamatória em células intestinais 
desencadeada pela EPEC resulta de um balanço entre vias proinflamatórias e anti-
inflamatórias, e tal controle poderia ser importante para uma maior sobrevivência desse 
patógeno não invasivo. Contudo, o resultado desse equilíbrio é a indução da resposta 
proinflamatória, devido principalmente pela ativação de NF-kB e de MAPK-ERK1/2 
(Mitogen-activated protein kinase- Extracellular signal-related kinase 1/2), com a produção 
de IL-8, que resulta numa importante infiltração de neutrófilos na lâmina própria, nas criptas e 
no lúmen intestinal (SAVKOVIC et al., 2001; SAVKOVIC et al., 2005). 
 
Apesar do conhecimento sobre a diversidade de efeitos no qual a EPEC atua no 
hospedeiro, o mecanismo completo pelo qual esse patógeno induz a diarreia ainda não foi 
totalmente elucidado (LAPOINT; CONNOR; BURET, 2009). 
 
1.4 Epitélio gastrointestinal 
 
O epitélio gastrointestinal é coberto de células epiteliais intestinais que estão dispostas 
em uma monocamada e interligadas na região apical pelas proteínas de tight junctions 
estabelecendo uma barreira física que separa o lúmen intestinal, um ambiente hostil, do meio 
interno do organismo (TURNER, 2009). Além de atuar como uma barreira física, as células 
epiteliais sintetizam enzimas digestivas para absorção de nutrientes, possuem funções 
imunológicas, como reconhecimento e captação de antígenos, secretam moléculas 
antimicrobianas e modulam a resposta imune na mucosa intestinal. Para exercer essas 
atividades existem várias subpopulações de células especializadas, que incluem as células M, 
células caliciformes, células de Paneth, células endócrinas e enterócitos (GOTO, KIYONO, 
2012). 
Esses diferentes tipos celulares constituem a barreira epitelial que está em constante 
renovação celular. Tal processo acontece entre dois a sete dias e compreende diferentes 
etapas, como a proliferação das células-tronco intestinais, migração celular ao longo da região 
das criptas até o topo dos vilos, diferenciação e a morte celular por apoptose (FIGURA 2) 
(CROSNIER; STAMATAKI; LEWIS, 2006). 
 
 
 30 
Figura 2 – Processo de renovação do epitélio intestinal. A – Células tronco na base da cripta 
iniciam a proliferação celular, no qual estas células progenitoras proliferarivas migram em 
direção ao topo do epitélio e se diferenciam. B – Processo de diferenciação das célulastronco. 
 
Fonte: Adaptado de Reya; Clevers (2005). 
A manutenção da barreira intestinal é de responsabilidade primordial da via 
transcelular através da integridade da membrana plasmática das células epiteliais, a qual é 
impermeável a vários produtos hidrossolúveis devido à ausência de transportadores 
específicos. Assim, um dano direto nessas células causa uma perda significativa da função 
barreira epitelial. Entretanto, é igualmente importante que a via paracelular esteja intacta 
(TURNER, 2009). 
O comprometimento da barreira intestinal é observado em várias desordens intestinais, 
como nas doenças inflamatórias intestinais, infecções por enteropatógenos, doença celíaca, 
dentre outros. Esses fatores podem causar desequilíbrio da homeostase intestinal, pois toxinas 
e produtos imunogênicos são absorvidos e ocasionam alterações da resposta imune do 
hospedeiro. Assim, é necessário que o processo de regeneração da barreira intestinal seja 
rápido para garantir a homeostase intestinal (STURM; DIGNASS, 2008). 
O trato gastrointestinal (TGI) possui boa capacidade de regeneração mesmo após dano 
intenso. O processo de recuperação intestinal acontece através de três mecanismos. O 
primeiro é a migração das células viáveis para recobrir a área desnuda do local da lesão sem 
 31 
haver divisão celular, fenômeno denominado de restituição celular. Essas células epiteliais 
formam estruturas semelhantes à pseudópodes com a reorganização do citoesqueleto. O 
segundo mecanismo é a proliferação celular e o terceiro é a maturação e diferenciação celular 
a fim de garantir as diversas funções da mucosa intestinal (DIGNASS, 2001). Este processo 
requer uma quantidade alta de energia e um dos principais nutrientes das células intestinais é a 
glutamina (LABOW; SOUBA, 2000). 
1.5 Migração celular 
Na renovação ou na resposta ao dano celular intestinal um dos primeiros mecanismos 
do organismo é migração celular (BLIKSLAGER et al., 2007). Dois importantes processos 
responsáveis pela migração celular são a polarização da célula e a formação de extensões 
citoplasmáticas na direção da migração (FIGURA 3). A polarização celular é uma resposta a 
um estímulo extracelular no qual a célula reorganiza e redistribui proteínas e organelas de 
maneira assimétrica. As extensões citoplasmáticas podem ser do tipo lamelipódios ou 
filopódios e ocorrem devido à polimerização de actina, sendo estabilizadas ao aderirem a 
matriz extracelular ou a células adjacentes por meio de receptores de transmembrana ligados 
ao citoesqueleto de actina, as integrinas. Esta adesão focal ocorre nas extremidades celulares e 
age como uma tração para que a célula continue a migrar. No lado oposto ao sentido da 
migração a adesão é desfeita e a célula retrai, possibilitando o deslocamento celular (RIDLEY 
et al., 2003). 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 32 
Figura 3 – Etapas da migração celular. Inicialmente é necessária a polarização celular, em 
seguida a formação de extensões citoplasmáticas e adesões focais, por fim a retração celular. 
 
Fonte: Adaptado de Ridley et al. (2003). MTOC – centro organizador de microtúbulos. 
 
A migração celular requer uma interação dinâmica com a formação de adesões ao 
substrato e a sua capacidade de desfazer estas adesões. Em células migratórias estas pequenas 
adesões são denominadas de contatos focais. Estas estruturas agem como âncoras 
proporcionando o desenvolvimento de uma força contrátil que permite o deslocamento 
celular. Esses contatos focais estabilizam a formação de lamelipódios e precedem a formação 
das adesões focais que possuem uma área de contato maior (RIDLEY et al., 2003). Assim, as 
principais forças motrizes do processo da migração celular são a formação das extensões 
citoplasmáticas na parte frontal da célula, o estabelecimento de adesões focais na frente 
celular, contração celular e a adesões desfeitas na área posterior da célula. Todos esses passos 
requerem uma extensiva reorganização do citoesqueleto de actina e estudos têm sugerido que 
a regulação dessa reorganização do citoesqueleto é finamente controlada principalmente por 
proteínas denominadas de pequenas GTPases Rho (RAFTOPOULOU; HALL, 2004; 
RIDLEY, 2012). 
Essas pequenas GTPases participam não apenas da sinalização da migração celular 
bem como da polaridade celular, tráfico de vesículas e citocinese. Atualmente já foram 
descritas em mamíferos 20 moléculas sinalizadores intracelulares dessa família relacionadas 
 33 
com o seu importante papel na regulação do citoesqueleto de actina (HEASMAN; RIDLEY, 
2008). 
Na célula essas proteínas podem estar na sua forma inativa quando ligadas a molécula 
a guanosina difosfato (GDP) e na sua forma ativa quando ligada a molécula de guanosina 
trifosfato (GTP) a qual interage com inúmeras proteínas efetoras. A regulação dessa 
conversão de estado é determinada por três tipos de proteínas: fatores de troca do nucleotídeo 
guanina (GEFs), proteínas ativadoras de GTPases (GAPs) e inibidores da dissociação de 
guanina (GDIs) (FIGURA 4). As GEFs atuam na troca de GDP por GTP na proteína Rho, 
tornando-se ativa. De maneira inversa, as GAPs inibem GTPases Rho ao estimularem a 
hidrólise de GTP, enquanto que GDIs impedem a liberação de GDP, retirando a proteína Rho 
da membrana plasmática para o citoplasma celular (HEASMAN; RIDLEY, 2008). 
Figura 4 – Ciclo das GTPases Rho e sua regulação pelas proteínas GEF, GAP e GDI. As 
pequenas GTPases podem estar ativas quando ligadas a GTP, reação que ocorre devido a 
GEF, e inativa quando ligada a GDI ou GDP, devido a perda hidrólise de GTP por ação de 
GAP. 
 
Fonte: Adaptado de Aktories; Barbieri (2005). GDP – Guanosina difosfato. GTP – Guanosina trifosfato, GEF - 
Fatores de troca do nucleotídeo guanina, GAP - Proteínas ativadoras de GTPases, GDI - Inibidores da 
dissociação de guanina, Pi – fosfato inorgânico. 
 
 
RhoA, Rac1 e Cdc42 são os três membros extensamente caracterizados e bem 
documentados das pequenas GTPases Rho e desempenham importantes funções na regulação 
do citoesqueleto de actina, sendo assim essenciais para a migração celular (RIDLEY, 2012). 
RhoA, a primeira proteína dessa família a ser estudada, regula o processo de formação de 
adesões focais, regiões de ligação da célula com a matriz extracelular, e atua na contratilidade 
celular através de fibras em estresse, feixes paralelos de actina localizados abaixo da 
membrana plasmática da adesão focal (RIDLEY, HALL, 1992). A proteína Rac1 regula a 
polimerização de actina para formação dos lamelipódios principalmente quando estimulada 
 34 
por fatores de crescimento, citocinas e componentes da matriz extracelular (RIDLEY, 2001) 
enquanto Cdc42 está envolvido na formação de filopódios (NOBES, HALL, 1995). Rac1 e 
Cdc42 também regulam a formação de contatos focais (RIDLEY, 2003). 
 
Assim, as pequenas GTPases Rho possuem um papel essencial na regulação celular, 
tanto para a migração como outras atividades celulares. Devido a essa ação regulatória 
diversos estudos mostram que essas pequenas proteínas são alvos de microrganismos que 
através de suas citotoxinas ou proteínas efetoras alteram suas funções (BIELEK, SCHMIDT, 
2012). 
Essas toxinas ou efetores bacterianos podem ativar ou inibir o ciclo das GTPases Rho, 
bem como alterar a estrutura do citoesqueleto de actina. As toxinas A e B e do Clostridium 
difficile e exoenzimas C3 do Clostridium spp. causam uma inibição praticamente irreversível 
dessas proteínas alterando por glicosilação e ribosilação do ADP respectivamente, impedindo 
a ação dos reguladores da GTPases, assim causando alterações intensas na morfologia celular 
(AKTORIES, WILDE, VOGELSGESANG, 2004; JUST et al., 1995a; JUST, et al., 1995b). 
Outra citotoxina, uma protease, que também inibe irreversivelmente GTPases Rho é a YopT 
(Yersinia outer protein T) da Yersinia enterocolitica que é transportada para dentro dacélula 
através de um sistema de secreção do tipo III (SST3) e cliva a proteína RhoA (SHAO et al., 
2002). 
Muitos enteropatógenos, como Yersinia, Salmonella e Escherichia coli, produzem 
proteínas que mimetizam os reguladores das GTPases Rho e assim alteram sua sinalização ao 
inserirem efetores por meio do SST3 (AKTORIES, 2011). Yersinia possui dois efetores que 
inibem GTPases Rho, YopE (Yersinia outer protein E) que atua como um GAP (ANDOR et 
al., 2001) e YpkA (Yersinia protein kinase A)/YopO (Yersinia outer protein O) como GDI 
(PREHNA et al., 2006). Um dos mecanismos de invasão celular da Salmonella enterica 
sorotipo Typhimurium é mediado pelo controle de Rac1 e Cdc42 através da proteína efetora 
SptP (Salmonella protein tyrosine phosphatase) que exibe atividade de GAP e SopE 
(Salmonella outer protein E) de GEF que exercem funções em diferentes momentos da 
infecção (KUBORI; GALÁN, 2003). Diferentes proteínas efetoras foram descritas na 
Escherichia coli enteropatogênica (EPEC) com atividades reguladoras sobre as GTPases Rho. 
A proteína Map (Mitochondrion-associated protein) induz a formação de filopódios de 
maneira dependente de Cdc42, e a proteína Tir estaria envolvida na regulação negativa da 
formação do filopódio atuando como um regulador GAP (KENNY et al., 2002). Wong e 
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Bielek%20H%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=22144267
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Schmidt%20G%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=22144267
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Schmidt%20G%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=22144267
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Schmidt%20G%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=22144267
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Aktories%20K%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=15372308
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Wilde%20C%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=15372308
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Vogelsgesang%20M%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=15372308
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Kubori%20T%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=14636560
 35 
colaboradores (2012) relatam que EPEC introduz um efetor, EspH, capaz de inativar as GEFs 
do hospedeiro e substitui por GEFs bacteriana promovendo a adesão celular e a sobrevivência 
do patógeno. 
 
 
1.6 Glutamina e Alanil-Glutamina 
 
A glutamina (Gln) é o mais abundante aminoácido livre presente nos músculos e na 
corrente sanguínea dos seres humanos, sendo distribuído para diversos órgãos do corpo 
(BERGSTROM et al., 1974; CURI et al., 2007). Embora seja considerado um aminoácido 
não essencial, uma vez que pode ser sintetizado pelas próprias células, desempenha um papel 
fundamental para o crescimento e desenvolvimento de células de mamíferos e de células- 
tronco (EAGLE et al., 1956; HIGUERA et al., 2011). 
Esse aminoácido possui diversas funções fisiológicas e participa de inúmeras vias 
metabólicas (FIGURA 5). Embora a glutamina seja utilizada por diversos órgãos de diferentes 
maneiras, suas funções celulares podem-se dividir em quatro: seu papel no transporte de 
nitrogênio, manutenção do estado redox das células, tem um papel importante para 
metabólitos intermediários e como fonte de energia celular (LABOW; SOUBA, 2000). 
Figura 5 – Vias de utilização da glutamina nas células de mamíferos. Importante para a 
manutenção ácido-base, e para a síntese de aminoácidos, proteínas, nucleotídeos, glicose, 
ureia, lipídios e glutationa. 
 
Fonte: Adaptado de Labow; Souba (2000). 
 
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Higuera%20GA%22%5BAuthor%5D
 36 
Com relação ao transporte de nitrogênio foi observado que um terço do nitrogênio 
proveniente do metabolismo protéico é transportado pelo sangue na forma de glutamina. De 
maneira semelhante, o tecido muscular exporta grande parte de nitrogênio por meio da 
glutamina. Nos rins, a glutamina é convertida em amônia e eliminada na urina, participando 
da manutenção do equilíbrio ácido-base do organismo. Assim é possível um transporte não 
tóxico de amônia para seus órgãos-alvo para então ser excretada ou ser utilizada na síntese de 
ureia. (LABOW; SOUBA, 2000). 
 A capacidade da glutamina em manter o estado redox celular está relacionada por ser 
um precursor de glutamato, no qual participa da biossíntese da glutationa, uma importante 
molécula antioxidante. A glutationa está presente na célula em dois estados, reduzido (GR) e 
oxidado (GO). Assim, a razão GR e GO é o principal regulador do potencial redox celular e 
determina a atividade antioxidante da célula (ROTH et al., 2002; WU et al., 2004). Alguns 
estudos com suplementação exógena de glutamina in vitro e in vivo têm mostrado um 
aumento da síntese de glutationa e diminuição do estresse oxidativo (TSAI et al., 2011; 
WHILLIER et al., 2011). 
 A atuação da glutamina em diversas vias metabólicas decorre do fato de tanto ser 
fonte de carbono e nitrogênio para a síntese de diversas macromoléculas. Estudos mostram 
que a glutamina está envolvida no processo de gliconeogênese por meio da doação de carbono 
(DE SOUZA et al., 2001; IWASHITA et al., 2005; NURJHAN et al., 1995), bem como na 
síntese de lipídios, pois a glutamina é convertida em piruvato, produzindo moléculas de 
NADPH e acetil-CoA, que são necessárias para a síntese dessas macromoléculas 
(DEBERARDINIS; CHENG, 2010). O nitrogênio proveniente da glutamina é utilizado na 
síntese de aminoácidos, proteínas e dos nucleotídeos, purinas e pirimidinas, com papel chave 
na proliferação celular (CORY; CORY, 2006; DEBERARDINIS et al., 2007; YAMAUCHI et 
al., 2002). 
Outro papel que a glutamina desempenha é como fonte de energia, pois sua oxidação 
gera adenosina trifosfato (ATP), para as células com rápida proliferação, como as do sistema 
imune e os enterócitos (LABOW; SOUBA, 2000). Tradicionalmente a glutamina é 
denominada um aminoácido não essencial, porém atualmente é considerado um aminoácido 
condicionalmente essencial pela mucosa intestinal devido à relação de maior consumo do que 
produção quando há um alto estado catabólico, como em traumas, infecções e estado pós- 
cirúrgico (ZIEGLER et al., 2003). 
 37 
Diversos estudos mostram que glutamina é essencial para a homeostase intestinal, 
estimulando o crescimento, proliferação e sobrevivência das células intestinais 
(DEBERARDINIS; CHENG, 2010; LARSON et al., 2007; MARC RHOADS; WU, 2009). A 
suplementação com glutamina em animais diminui a permeabilidade intestinal e protege 
contra a translocação bacteriana, garantindo a integridade intestinal (DOS SANTOS et al., 
2010). Um estudo randomizado avaliou o efeito da suplementação com glutamina em crianças 
desnutridas e mostrou uma melhora significativa da função da barreira intestinal nas crianças 
que receberam glutamina em relação as que não receberam (LIMA et al., 2005). 
Muitos pesquisadores relatam que a glutamina exerce atividade anti-inflamatória no 
intestino tanto em experimentos in vitro e in vivo, através da modulação da produção de 
citocinas, Coeffier e colaboradores encontraram níveis reduzidos de IL-6 e IL-8 e níveis 
aumentados da IL-10 em biopsia intestinal (COEFFIER et al., 2001, 2003). A regulação da 
expressão das citocinas pela glutamina ocorre principalmente por meio da inibição do fator de 
transcrição nuclear NF-κB (BRASSE-LAGNEL; LAVOINNE, HUSSON, 2010). 
Apesar dos grandes benefícios observados com a utilização da glutamina, seu uso 
operacional é relativamente difícil, pois esse aminoácido possui pouca solubilidade em 
solução aquosa, principalmente em pH ácido e baixa estabilidade em temperaturas elevadas. 
Essas desvantagens podem ser superadas pela a utilização na forma de dipeptídeo, como a 
alanil-glutamina (Ala-Gln) que tem alta solubilidade e estabilidade (ROTH et al., 1988). 
Muitos estudos têm demonstrado inúmeras vantagens com uso do derivado estável da 
glutamina, a alanil-glutamina. Pesquisadores avaliaram o efeito dessespeptídeos na lesão 
intestinal in vitro induzida por toxinas bacterianas e por agentes quimioterápicos, tem sido 
observado que a suplementação com esses nutrientes melhora o dano intestinal (BRAGA-
NETO et al., 2008; BRITO et al., 2005). Um trabalho recente mostrou que a utilização da 
Ala-Gln estimulou a integridade e homeostase intestinal tanto in vitro e como em um modelo 
de desnutrição em animais (UENO et al., 2011). Lima e colaboradores (2007) observaram que 
a Ala-Gln foi capaz de restaurar a barreira intestinal e promover o crescimento em crianças 
desnutridas. 
Os mecanismos envolvidos no qual a glutamina regula os processos fisiológicos das 
células intestinais ocorre por meio da sinalização de várias vias celulares. O quadro 1 resume 
os efeitos desse aminoácido em células intestinais e as vias de sinalização envolvidas. 
 38 
Quadro 1 – Efeitos da glutamina no intestino e vias de sinalizações envolvidas 
Presença ou 
Ausência de Gln 
Modelo 
experimental 
Efeitos Via de sinalização 
Presença Biopsia de cólon de 
pacientes com 
doença de Crohn 
Redução da 
inflamação 
Inibição de p38 MAPK 
Presença Células de criptas 
de ratos – IEC-6 
Estimulação da 
proliferação 
celular 
Ativação de ERK e JNK 
Presença Células intestinais 
de ratos – RIE-1 
Atenuação da 
apoptose 
Ativação de ERK e 
inativação de Akt 
Presença Cólon de ratos com 
colite 
Diminuição da 
inflamação 
Baixos níveis de Akt 
fosforilada 
Ausência Células de 
adenocarcinoma 
humano – Caco-2 
Redução da 
resistência 
transepitelial e 
aumento da 
permeabilidade 
celular 
Estimulação da PI3-K/Akt 
Fonte: Adaptado de Brasse-Lagnel; Lavoinne; Husson (2010). MAPK – mitogen-activated protein kinase; ERK 
– extracellular signal-related kinase; JNK - c-jun N-terminal kinase; PI3-K – phosphoinositide 3-kinase. 
 
 A glutamina possui um importante papel para a manutenção da barreia intestinal. Um 
processo inicial de renovação intestinal é a migração celular. Ensaios experimentais in vitro 
mostraram que a adição de glutamina estimula significativamente esse processo. Entretanto os 
mecanismos moleculares envolvidos nesse processo ainda precisam ser esclarecidos 
(BRAGA-NETO et al., 2008; BRITO et al., 2005; CARVALHO, 2011). 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 39 
2 PERGUNTAS DE PARTIDA 
 
2.1 E. coli enteropatogênica é capaz de alterar a migração das células intestinais in vitro? 
2.2 A suplementação com alanil-glutamina estimula a migração intestinal tanto na presença 
quanto na ausência bacteriana? 
 
3 HIPÓTESES 
 
3.1 EPEC altera a migração de células intestinais devido a sua capacidade de induzir 
mudanças no citoesqueleto celular. 
3.2 A alanil-glutamina desempenha inúmeras funções nas células intestinais, dentre eles o 
aumento da migração intestinal celular na presença ou ausência da EPEC. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 40 
4 OBJETIVOS 
4.1 Objetivo Geral 
 
Analisar o efeito da infecção por cepas de EPEC na migração de células intestinais, bem 
como verificar o papel da regulação das proteínas GTPases Rho e a modulação com a 
alanil-glutamina. 
 
4.2 Objetivos específicos 
 
1. Verificar o efeito da cepa padrão EPEC E2348/69, EPEC proveniente da comunidade 
e de E. coli não patogênica, E. coli HS, no modelo de migração de células intestinais 
in vitro. 
2. Investigar se a morte celular induzida pelas cepas bacterianas influencia na migração 
celular. 
3. Avaliar o efeito tempo e dose resposta da alanil-glutamina no modelo de migração 
celular in vitro. 
4. Determinar qual o efeito da suplementação com alanil-glutamina na migração celular 
quando as células IEC-6 são infectadas pelas cepas patogênicas de EPEC. 
 
5. Investigar se a transcrição e expressão dos genes rhoA, rac1 e cdc42 seriam alteradas 
pelas bactérias EPEC padrão, EPEC selvagem, E. coli HS na presença ou ausência da 
alanil-glutamina. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 41 
5 MATERIAL E MÉTODOS 
5.1 Microrganismos 
 
Foram utilizadas três cepas de Escherichia coli, uma cepa padrão EPEC cepa 
E2348/69, uma cepa comensal HS e uma EPEC selvagem. Esta cepa foi proveniente de 
amostras fecais de uma criança desnutrida do estudo internacional: The Interactions of 
Malnutrition & Enteric Infections: Consequences for Child Health and Development (MAL-
ED). A cepa selvagem de EPEC foi diagnosticada por meio da técnica de PCR (Polimerase 
chain reaction) (TRABULSI et al., 2002) e por meio do padrão de aderência em células HEp-
2 (CRAVIOTO et al.,1991). Cinco genes de virulência, espA, espB, espD, espF e tir também 
foram pesquisados na cepa selvagem por meio de PCR multiplex. 
A cepa E2348/69 foi utilizada como um controle positivo, tendo em vista sua intensa 
utilização como um protótipo para o estudo de EPEC na biologia, genética e virulência, na 
qual recentemente teve seu genoma completamente descrito (IGUCHI et al., 2009). E. coli 
comensal HS não causa diarreia em humanos, foi utilizada como controle negativo (RASKO 
et al., 2008). Estas cepas controles nos foram fornecidas gentilmente pelo Dr. James Nataro, 
da Universidade de Virgínia, E.U.A. 
5.2 Cultivo celular 
5.2.1 Linhagens celulares 
Umas das linhagens celulares utilizadas foram às células de cripta do jejuno do 
intestino de rato IEC-6 nas passagens de 30-35, obtidas a partir do American Type Culture 
Collection (ATCC, Rockville, MD). Estas foram empregadas nos experimentos de migração 
celular, avaliação da apoptose e necrose e padrão de aderência bacteriano. As células 
intestinais IEC-6 foram inicialmente descritas por Quaroni e colaboradores (1979) como uma 
linhagem não transformada, aderente, com morfologia epitelióide, características típicas de 
células de cripta intestinal e que crescem em monocamadas (FIGURA 6). IEC-6 é 
intensamente utilizada em modelos de recuperação intestinal (BRAGA-NETO et al., 2008; 
BRITO et al., 2005, MCCOMARCK; VIAR; JOHNSON,1992). As células IEC-6 foram 
cultivadas em frascos de 25 ou 75 cm
2
, a depender da quantidade de células necessária para 
cada protocolo, contendo Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM, GIBCO, Grand 
Island, NY) com acréscimo de 5% de soro bovino fetal inativado (GIBCO, Grand Island, 
 42 
NY), 40 µg/mL de insulina (SIGMA, St Louis, MO), 50 U/mL de penicilina (GIBCO, Grand 
Island, NY), 50 µg/mL de estreptomicina (GIBCO, Grand Island, NY) e 1 mM/mL de 
piruvato de sódio (GIBCO, Grand Island, NY). Essas células eram mantidas em estufa nas 
seguintes condições: temperatura de 37 ºC, umidade de 90%, 5% de CO2 e 95% de O2. A 
troca do meio de cultura era realizada a cada dois dias até as células atingirem uma 
confluência de 90-100% para então serem utilizadas nos ensaios experimentais. 
 
Figura 6 – Células IEC-6 vistas em microscópio óptico invertido no aumento de 100X. 
 
Fonte: Carvalho (2011). 
 
Outra linhagem celular utilizada foram as células HEp-2 (passagens de 9-12) 
derivadas da contaminação de células HeLa que, por sua vez, provém de adenocarcinoma de 
cérvix (FIGURA 7), obtidas também da ATCC. Estas células já são comumente empregadas 
no ensaio de padrão de aderência bacteriano (CRAVIOTO et al., 1991). Sua manutenção era 
feita em frascos de 25 cm
2
 contendo Minimal Essencial Medim (MEM, GIBCO, Grand Island, 
NY), acrescido de 10% de soro fetal bovino, 100 U/mL de penicilina e 100 μg/mL de 
estreptomicina. Essas células eram mantidas em estufa nas seguintes condições: temperatura 
de 37 ºC, umidade de 90%, 5% de CO2 e 95% de O2. A troca do meio de cultura era realizada 
a cada dois dias até as células atingirem uma confluência de 90-100% para então serem 
utilizadas nos ensaios experimentais. Todos os procedimentos com de cultivo celular eram 
realizados em cabine de fluxo laminar do tipo 2A. Rotineiramente era realizada assepsia da 
superfície da cabine com uma solução de álcool 70%, em seguida haviaa incidência direta de 
15-20 minutos de luz ultravioleta. 
 
 
 
 43 
 
Figura 7 – Células HEp-2 vistas em microscópio óptico invertido no aumento de 100X. 
 
Fonte: http://www.atcc.org/Attachments/1760.jpg 
 
5.2.2 Preparação e contagem celular 
 
 Como descrito anteriormente, as células foram mantidas em frasco de cultivo celular 
até a realização dos experimentos. Para tanto era necessário retirar as células aderidas aos 
frascos, realizado por meio da adição de tripsina-EDTA. A tripsina digere as proteínas de 
adesão que necessitam de magnésio para sua função, já o EDTA atua ao quelar os cátions 
divalentes (PERES; CURI, 2005). 
 
 Desse modo, o meio de cultura era descartado e adicionado 0,5-1 mL de tripsina-
EDTA (0,05%-0,02%), a solução era homogeneizada por toda a área da superfície celular. Em 
seguida, as células foram incubadas na estufa nas condições já descritas por um período de 5 a 
10 minutos. Após este tempo, as células eram observadas em microscópio óptico invertido 
para verificar se as mesmas estavam ou não aderidas ao frasco. Com o intuito de inativar a 
tripsina-EDTA e evitar que outras proteínas celulares sejam clivadas, adicionou 3-5 mL de 
meio de cultura contendo soro fetal bovino 5%, as proteínas do soro atuam como substrato 
para tripsina. A suspensão de células foi transferido para um tubo Falcon de 15 mL estéril e 
centrifugadas a 1500 rpm por 5 minutos. O sobrenadante foi descartado e ao precipitado de 
células (pellet) foi adicionado 3 mL de meio de cultura e homogeneizado esta suspensão para 
a seguinte contagem celular. Desta suspensão foi retirada 100 µL e adicionado em 900 µL em 
meio de cultura em tubo estéril de 1,5 mL e homogeneizado. Foi retirado 15 µL da diluição e 
realizado a contagem em câmara de Neubauer. 
 
http://www.atcc.org/Attachments/1760.jpg
 44 
 
5.3 Diagnóstico molecular das cepas de EPEC e detecção de genes de virulência 
 
O diagnóstico molecular de EPEC é baseado na pesquisa de dois genes do 
microorganismo, um cromossomal (eae) e um plasmidial (bfpA). O gene eae codifica a 
proteína intimina. Esta proteína apresenta pelo menos 27 subtipos descritos (BLANCO et al., 
2006a, 2006b; GARRIDO et al. 2006). O gene eae também é encontrado em Escherichia coli 
enterohemorrágica, porém apenas este patotipo possui genes da toxina Shiga (stx) (NATARO; 
KAPER, 1998). 
 
 De acordo com Trabulsi e colaboradores (2002), é possível diferenciar os dois tipos de 
EPEC por meio da biologia molecular, devido à presença ou ausência de genes específicos. 
As características principais das cepas típicas é a presença dos genes eaeAe bfpA e ausência 
do gene stx, enquanto que a EPEC atípica é marcada pela presença do gene eaeA e ausência 
dos genes bfpA e stx. Os genes relacionados aos fatores virulência em estudo foram espA, 
espB, espD, espF e tir. 
 
 Como descrito anteriormente, a cepa selvagem de EPEC foi isolada a partir das fezes 
de uma criança, com características sugestivas de E. coli. A confirmação que se tratava de 
uma E. coli foi realizada por meio de teste de identificação de enterobactérias API 20 E 
(bioMérieux, França), tanto a cepa EPEC E2348/69 e E. coli HS foram positivas no teste 
bioquímico. A extração do DNA das colônias foi realizada por método de fervura. Para tanto, 
5 colônias foram incubadas por 20 minutos a 95º em tubo de 1,5 mL contendo 1 mL de água e 
detergente Triton X. Em seguida, o material foi centrifugado por 10 minutos a 10.000 rpm. O 
sobrenadante foi transferido para um novo tubo de microcentrífuga estéril identificado e o 
pellet foi descartado. A solução de DNA bacteriano foi armazenada em temperatura – 20º C. 
Para a pesquisa dos genes utilizamos a técnica de PCR do tipo Multiplex (Multiplex-PCR). 
Esta técnica é uma das variantes do PCR que usa múltiplos pares de iniciadores de DNA 
(primers) para a detecção de vários genes de uma única reação, ocorrendo assim, a 
amplificação simultânea de sequências de DNA de tamanhos diferentes. A fim de garantir de 
ser uma cepa isolada de EPEC, também pesquisamos os genes de diagnóstico para os cinco 
tipos de E. coli diarreiogênica (EPEC, EAEC, EIEC, ETEC e EHEC), os primers utilizados 
estão descritos na Tabela 1, estes iniciadores foram desenvolvidos por pesquisadores do 
projeto internacional MAL-ED. Cada reação continha 12,5 L da solução mastermix (DNA 
 45 
polimerase, tampão salino, deoxinucleotídeos - dNTPs, cloreto de magnésio e estabilizadores) 
do Qiagen multiplex PCR kit (Valencia, CA), 0.2M de cada um dos pares de iniciadores 
específicos para os genes em estudo, o volume de 2L de DNA e um volume de água MiliQ 
autoclavada para volume final de 25L. As reações de PCR incluíram um passo inicial de 
desnaturação (95C) por 5 minutos, seguido por 40 ciclos com as seguintes etapas: 
desnaturação (94 C) por 30 segundos, anelamento (genes pesquisados – 57 C) por 1 minuto 
e extensão (72 C) por 1 minuto e 15 segundos, e por fim uma extensão (72 C) por 10 
minutos. Os primers utilizados nas reações dos genes de virulência de EPEC estão descritos 
na Tabela 2. Estes iniciadores foram desenhados através do OligoPerfect™ Designer 
disponível no site http://tools.invitrogen.com/content.cfm?pageid=9716, e posteriormente 
verificados no banco de dados do BLAST (Basic Local Alingment Search Tool - 
www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST) com o intuito de eliminar potencial reatividade cruzada e 
confirmar regiões exclusivas de identificação dos genes em questão. Os produtos foram 
analisados por eletroforese em gel de agarose 3,0%, marcados com brometo de etídeo e 
fotodocumentados a partir do programa ChemiDoc XRS (BIO-Rad Laboratories, Hercules 
CA). Como a cepa EPEC E2348/69 possui todos os genes em estudo a mesma foi o controle 
positivo da reação e o controle negativo foi E. coli comensal HS. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
http://tools.invitrogen.com/content.cfm?pageid=9716
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST
 46 
TABELA 1 – Genes alvo, primers utilizados e tamanhos dos produtos obtidos no diagnóstico 
molecular das cepas de E. coli diarreiogênicas. 
 
E. coli 
 
Genes de 
diagnóstico 
Sequência do primer (5’3’) 
Produto 
(pb) 
 
 
 
EPEC 
 
eaeA 
 
 
 
bfpA 
 
F: CCCGAATTCGGCACAAGCATAAGC 
R: CCCGGATCCGTCTCGCCAGTATTCG 
 
 
F: GGAAGTCAAATTCATGGGGGTAT 
R: GGAATCAGACGCAGACTGGTAGT 
 
 
881 
 
 
 
300 
 
 
 
 
EAEC 
 
aatA 
 
 
 
aaiC 
 
 
F: CTGGCGAAAGACTGTATCAT 
R:CAATGTATAGAAATCCGCTGTT 
 
 
F:ATTGTCCTCAGGCATTTCAC 
R:ACGACACCCCTGATAAACAA 
 
 
 
650 
 
 
215 
 
EIEC 
 
ipaH 
 
F:TGGAAAACTCAGTGCCTGT 
R:CCAGTCCGTAAATTCATTCT 
 
 
423 
 
 
ETEC 
 
eltB 
 
 
estA 
 
F:CACACGGAGCTCCTCAGTC 
R:CCCCCAGCCTAGCTTAGTTT 
 
F:GCTAAACCAGTARGGTCTTCAAAA 
R:CCCGGTACARGCAGGATTATTACAACA 
 
 
508 
 
 
147 
 
 
 
EHEC 
 
stx1 
 
 
stx2 
 
F:CAGTTAATGTGGTGGCGAAGG 
R:CACCAGACAATGTAACCGCTG 
 
F:ATCCTATTCCCGGGAGTTTACG 
R:GCGTCATCGTATACACAGGAGC 
 
 
348 
 
 
 
584 
F: primer forward; R: primer reverse 
 
 
 
 
 
 47 
TABELA 2 – Genes alvo, primers utilizados e tamanhos dos produtos obtidos dos genes de 
virulência de EPEC. 
Genes de Virulência Sequência do primer (5’3’) 
Produto 
(pb) 
espA 
F: TCAGTTGCTAGTGCGAATTGC 
R: GGGCAGTGGTTGACTCCTTA 
211 
 
espB 
F: ATGGCAGCAAAAGAGCCTAA 
R: ATGGTCACCACATTGCAAGA 
179 
 
espD 
F: TGCCGGGTTAAAAATAGCTG 
R: TGCAAGCTCTGGCTATCCTT 
304 
 
espF 
F: ACCCTTTCTTCGATTGCTCA 
R: AGCAGCCAGGTGACTTCATT 
427 
 
tir 
F: CTGCAGCGACCTCATCATAA 
R: GATGCGAAGGGAAATGCTAT 
535 
 F: primer forward; R: primer reverse 
 
5.4 Protocolo de infecção 
 
Todas as cepas estavam armazenadas em meio líquido de TSB (Trypticase Soy Broth) 
contendo glicerol 10% a temperatura de -20 ºC. Quando necessário para os experimentos às 
cepas foram semeadas em placas de ágar MacConkey. Após 18-24 horas de crescimento 
colônias de E.