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BIOATIVIDADE DE EXTRATOS DE PIMENTA-DE-MACACO (Xylopia aromatica) E PEQUI (Caryocar brasiliense) SOBRE C o lle to tr ich u m g lo eo sp o r io id es . W a gner V icen te P ere ira , M arli de F á tim a S trad io to P apa – F itopa to logia - A gron om ia - Departamento de F ito ssan idade , E n genha ria R u ra l e S o los – Faculdade de Engenharia – Campus de Ilha Solteira Embora estudos tenham sido realizados, a composição química de 99,6% das plantas da flora brasileira, estimada entre 40 a 55 mil espécies, ainda é desconhecida (MING, 1996). Os países desenvolvidos com baixa diversidade de espécies vegetais são os maiores produtores de substâncias químicas úteis para as indústrias farmacológicas e de agroquímicos. Mesmo sendo considerado o celeiro para busca de novas sustâncias químicas, o Brasil carece de estudos que integrem as diversas áreas de interesse (farmacológica, médica, química, agronômica) para o conhecimento das propriedades químicas da flora brasileira. O Cerrado é um dos mais importantes biomas do País, ocupando 22% do território nacional e apresentando grande diversidade de espécies. Muito embora apresentem grande biodiversidade, poucos são os relatos das propriedades antifúngicas dessas plantas de Cerrado. O desconhecimento de sua riqueza e possibilidades se agrava quando Ratter et al. (1997) estimam que cerca de 40% do bioma já tenha sido devastado e que o Cerrado possui somente 1,5% de sua extensão protegida por lei, sendo atualmente a vegetação em maior risco no país. Em estudos Gottlieb & Borin (1994) relataram que o Cerrado possui maior diversidade taxonômica que a floresta Amazônica. Isto porque, quanto maior for a diversidade taxonômica em níveis superiores, maior é o distanciamento filogenético entre as espécies e maior é a diferença e diversidade química entre elas. Por isso, a gama e o potencial de compostos bioativos produzidos pelas espécies do Cerrado seriam maiores que as da Floresta Amazônica. Kaplan et al. (1994) verificou em seus estudos que as espécies do Cerrado continham grande número de compostos estreitamente relacionado, mas em quantidades pequenas, diferentemente das espécies da Mata Atlântica que apresentavam pequeno número de compostos em grandes quantidades. Por essas características o bioma Cerrado deveria ser considerado área prioritária de pesquisas com plantas medicinais e conservação de recursos naturais. Dentre as espécies típicas do Cerrado encontram-se a Pimenta-de-macaco (Xylopia aromatica (Lam.) Mart.) e o pequi (Caryocar brasiliense Camb.), as quais foram utilizadas no presente trabalho. O pequi é uma planta pertencente a família Caryocaraceae. É considerada uma espécie de interesse econômico, principalmente devido ao uso de seus frutos na culinária, como fonte de vitaminas e na extração de óleos para a fabricação de cosméticos (ALMEIDA & SILVA, 1994). Na medicina popular, é utilizado para tratamento de problemas respiratórios; como afrodisíaco; e suas folhas são adstringentes, além de estimular a produção da bílis (ALMEIDA & SILVA, 1994; BRANDÃO et al., 2002). Naruzawa (2005) estudando a atividade antifúngica dos extratos hidroetanólico e aquoso de Pequi verificou que, os extratos apresentaram inibição acima de 98% na germinação de esporos de Corynespora cassiicola e C. gloeosporioides isolado de acerola Xylopia aromatica é uma planta pertencente a família Annonaceae, semidecídua, heliófita, pioneira e seletiva xerófita, característica do cerrado e campo cerrado. As sementes são consideradas carminativa, eupética e afrodisíaca. As sementes torradas e moídas e a tintura da casca do caule são também empregadas como excitante, caminativa e afrodisíaca (LORENZI, 1992). Este trabalho objetivou determinar a atividade antifúngica de extratos aquosos e hidroetanólicos de folhas de Xylopia aromatica (Pimenta-de-macaco) e Caryocar brasiliense (Pequi) sobre Colletotrichum gloeosporioides isolado de goiaba, por meio de avaliações das inibições do crescimento micelial e da germinação de esporos. O trabalho foi desenvolvido no Laboratório de Microbiologia e Fitopatologia, da Faculdade de Engenharia - FE, Campus de Ilha Solteira, da Universidade Estadual Paulista "Júlio de Mesquita Filho"- UNESP, em Ilha Solteira, SP. Foram coletadas folhas de Pimenta-de-macaco (Xylopia aromatica) e Pequi (Caryocar brasiliense) em área de Cerrado na região de Selvíria, MS. Os materiais coletados foram levados para o laboratório onde foram submetidos à lavagem, secagem, moagem e foram preparados os extratos aquosos e hidroetanólicos (CELOTO, 2003). A partir de frutos de goiaba com sintomas de antracnose foram realizados isolamentos diretos (TUITE,1969) do fitopatógeno para meio de Batata-Dextrose-Ágar (BDA). O isolado obtido foi preservado em tubo de ensaio contendo solução salina (CASTELANI,1939) e mantidos a 12 °C. Utilizaram-se as concentrações de 50, 30, 10 e 0% (testemunha) de extrato no meio de cultura de BDA. O extrato foi incorporado no meio BDA antes da autoclavagem. Cada placa de Petri, contendo BDA mais o extrato, recebeu um disco de BDA com o crescimento micelial de C. gloeosporioides. Após, as placas foram vedadas e mantidas em estufa incubadora a 25 °C no fotoperíodo 12 horas de claro / escuro. A avaliação foi realizada por meio da medição do crescimento micelial do fungo, após 10 dias da instalação do experimento. O delineamento experimental foi inteiramente casualizado, em esquema fatorial constituído de um fungo, dois extratos aquosos, dois extratos hidroetanólicos, três concentrações, testemunha e quatro repetições. Cada repetição foi constituída por uma placa de Petri. Os dados obtidos foram transformados em percentagem de inibição do crescimento micelial (PIC) em relação ao tratamento testemunha. Outro ensaio foi realizado para avaliar o efeito dos extratos sobre a germinação dos esporos de C. gloeosporioides. Foram acrescentados 10mL de água destilada esterilizada em placa de Petri com o crescimento de C. gloeosporioides, liberando-se os esporos para a água, com auxílio de um pincel. A suspensão de esporos do fungo foi filtrada em gaze dupla e a concentração de esporos da suspensão foi determinada, utilizando-se hemacitômetro, e calibrada em 4 x 104 esporos/mL . Em células de placas de ELISA foram pipetados 40µL de suspensão de esporos de C. gloeosporioides e 40µL do extrato em avaliação ou água destilada esterilizada para a testemunha. As placas de ELISA foram acondicionadas em recipiente de plástico e mantidas em estufa incubadora a 25°C, durante 48 horas. Ao término deste período, foi colocada uma gota de lactofenol em cada célula, para interromper a germinação de esporos. Em microscópio ótico foi feita a contagem de 100 esporos em cada célula, determinando-se os esporos germinados e não germinados. Foi considerado como esporo germinado o que apresentou tubo germinativo igual ou maior que a sua largura. O delineamento estatístico utilizado foi semelhante ao utilizado para o crescimento micelial, sendo uma repetição representada por uma célula da placa de ELISA. Os dados dos tratamentos foram comparados com a testemunha, calculando-se o Percentual de Inibição da Germinação de esporos(PIG). Foram determinadas as doses letais e as concentrações efetivas para a inibição de 50% da germinação de esporos (DL50) e crescimento micelial (CE50) respectivamente, por meio de análise de regressão, utilizando o programa SANEST. Os resultados das concentrações efetivas para inibição de 50% do crescimento micelial e as doses letais para inibição de 50% da germinação de esporos, estão apresentados na Tabela 1. Tabela 1. Concentração efetiva dos extratos de folhas de Pequi e Pimenta-de-macaco para inibição de 50% do crescimento micelial (CE50) e dose letal para inibição de 50% da germinação de esporos (DL50) de Colletotrichum gloeosporioides. Ilha Solteira, SP. 2006. Tratamentos Equações de regressão para determinaçãoda CE50 CE50 (%) Equações de regressão para determinação da DL50 DL50 (%) EHPE1 y = 0,568x + 36,35 24 * y = 0,868x + 42,27 9* EAPE2 y = 0,712x + 25,54 34 y = 0,575x + 43,40 11 EHPI3 y = 0,256x + 46,72 13 y = 0,600x + 38,50 19 EAPI4 y = 0,968x + 8,77 43 y = 0,550x + 35,83 26 *Valores calculados a partir das equações de regressão e expresso em % do extrato 1 Extrato hidroetanólico de Pequi, 2 Extrato aquoso de Pequi, 3 Extrato hidroetanólico de Pimenta-de-macaco, 4 Extrato aquoso de Pimenta-de-macaco. As concentrações efetivas para a inibição de 50% do crescimento micelial para os extratos hidroetanólico e aquoso de Pequi foram de 24 e 34%, respectivamente, e para os extratos hidroetanólico e aquoso de Pimenta-de-macaco foram de 13 e 43%, respectivamente. Considera-se que estes extratos apresentam substâncias que retardam o crescimento micelial de C. gloeosporioides, mas em baixa concentração. Destes extratos, o extrato hidroetanólico de Pimenta-de-macaco foi o que apresentou mais substâncias antifúngicas. As doses letais para inibição de 50% da germinação dos esporos para os extratos hidroetanólico e aquoso de Pequi foram de 9 e 11% respectivamente, e para os extratos hidroetanólico e aquoso de Pimenta-de-macaco foram de 19 e 26%. Verificou-se que os extratos hidroetanólicos apresentaram maior concentração de substâncias antifúngicas que os extratos aquosos sobre C. gloeosporioides. Entre os extratos das duas plantas, os extratos de Pequi apresentaram maior comportamento antifúngico que os extratos de Pimenta-de-macaco. Foi observado ainda que os esporos de C. gloeosporioides isolado de goiaba, foram mais sensíveis aos extratos que o crescimento micelial para os tratamentos testados. Este comportamento também foi relatado em trabalhos realizados por Celoto (2003) e Naruzawa et al. (2005). Atribui-se isto ao fato de os esporos ficarem imersos na suspensão do extrato, enquanto o micélio cresceu sobre o meio de cultura mais o extrato e parte do crescimento micelial não entrou em contato direto com o extrato vegetal. Desses resultados podemos concluir que os extratos hidroetanólicos apresentam mais substâncias antifúngicas que os extratos aquosos. Os extratos de Pequi apresentam maior concentração de substâncias antifúngicas que os extratos de Pimenta-de-macaco. Bibliografia ALMEIDA, S. P.; SILVA, J. A. Piqui e buriti: importância alimentar para a população dos cerrados. Planaltina: EMBRAPA-CPAC, 1994. 38 p. (Documentos, 54). BRANDÃO, M.; LACA-BUENDÍA, J. P.; MACEDO, J. F. Árvores nativas e exóticas do Estado de Minas Gerais. Belo Horizonte: EPAMIG, 2002. 528 p. CASTELANI, A. Viability of some pathogenic fungi in distilled water. Journal of Tropical Medicine Hygiene, v.42, p.225,1939. CELOTO, M. I. B. Atividade antifúngica de extratos de plantas a Colletotrichum gloeosporioides Penz. (Penz. & Sacc.). 2003. 44p. Trabalho de Conclusão de Curso (Graduação em Agronomia) – Faculdade de Engenharia, Universidade Estadual Paulista “Julio de Mesquita Filho”. Ilha Solteira, 2003. GOTTIEB, O.R.; BORIN, M.R.M.B. The diversity of plants. Where is it? Why is it there? What will it become? Anais da Academia Brasileira de Ciências, v.66, 1994. p.205-210 KAPLAN, M.A.C.; FIGUEIREDO, M.R. & GOTTIEB, O.R. 1994. Chemical diversity of plants from Brazilian Cerrados. Anais da Academia Brasileira de Ciências. v.66, 1994. p.50-55. LORENZI, H. Árvores brasileiras: manual de identificação e cultivo de plantas arbóreas nativas do Brasil. Nova Odessa: Plantarum, 1992. 352p. MING, L. C. Coleta de plantas medicinais. p.69-86. In: L. C. Di Stasi (Ed.). Plantas medicinais: arte e ciência - um guia de estudos multidisciplinar. Universidade Paulista, São Paulo, 1996. 345 p. NARUZAWA, E. S. Atividade antifúngica de extratos de plantas do cerrado sobre Colletotrichum gloeosporioides PENZ. (PENZ. & SACC.) e Corynespora cassiicola (BERK. E CURTIS.) da acerola (Malpighia emarginata D.C.). 2005. 46 f. Dissertação (Graduação) - Faculdade de Engenharia de Ilha Solteira, Universidade Estadual Paulista “Julio de Mesquita Filho”, Ilha Solteira. RATTER, J.A.; RIBEIRO, J.F. e Bridgewater, S. The brazilian cerrado vegetation and threats to its biodiversity. Annals of Botany , v.80, 1997. p.223-230. TUITE, J. Plant pathological methods. Minneapolis: Minn., Burgess Publishing Company, 1969. 239p.
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