2016-dis-lmgalvao

Prévia do material em texto

UNIVERSIDADE FEDERAL DO CEARÁ 
FACULDADE DE MÉDICINA 
DEPARTAMENTO DE PATOLOGIA E MEDICINA LEGAL 
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM PATOLOGIA 
 
 
 
 
 
LÍVIA MONTEIRO GALVÃO 
 
 
 
 
 
 
ESTUDO DE HAPLÓTIPOS DO GENE DA BETA GLOBINA S, FATOR DE 
CRESCIMENTO ENDOTELIAL VASCULAR-A (VEGF-A), HEMOGLOBINA FETAL 
E MANIFESTAÇÕES CLÍNICAS EM PACIENTES COM ANEMIA FALCIFORME 
 
 
 
 
 
 
 
FORTALEZA 
2016 
LÍVIA MONTEIRO GALVÃO 
 
 
 
 
ESTUDO DE HAPLÓTIPOS DO GENE DA BETA GLOBINA S, FATOR DE 
CRESCIMENTO ENDOTELIAL VASCULAR-A (VEGF-A), HEMOGLOBINA FETAL E 
MANIFESTAÇÕES CLÍNICAS EM PACIENTES COM ANEMIA FALCIFORME 
 
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-
Graduação em Patologia da Universidade 
Federal do Ceará, como requisito parcial à 
obtenção do título de Mestre em Patologia. 
Área de concentração: Medicina II. 
 
Orientador: Profa. Dra. Romélia Pinheiro 
Gonçalves Lemes. 
Co-orientador: Prof. Dr. Max Victor Carioca 
Freitas 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
FORTALEZA 
2016 
 
LÍVIA MONTEIRO GALVÃO 
 
 
 
 
ESTUDO DE HAPLÓTIPOS DO GENE DA BETA GLOBINA S, FATOR DE 
CRESCIMENTO ENDOTELIAL VASCULAR-A (VEGF-A), HEMOGLOBINA FETAL E 
MANIFESTAÇÕES CLÍNICAS EM PACIENTES COM ANEMIA FALCIFORME 
 
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-
Graduação em Patologia da Universidade 
Federal do Ceará, como requisito parcial à 
obtenção do título de mestre em Patologia. 
Área de concentração: Medicina II. 
 
Aprovada em: ___/___/______. 
 
BANCA EXAMINADORA 
 
________________________________________ 
Profa. Dra. Romélia Pinheiro Gonçalves Lemes (Orientadora) 
Universidade Federal do Ceará (UFC) 
 
 
_________________________________________ 
Profa. Dra. Arlândia Cristina Lima Nobre de Morais 
Universidade de Fortaleza (UNIFOR) 
 
 
_________________________________________ 
Prof. Dr. Roberto César Pereira Lima Junior 
Universidade Federal do Ceará (UFC) 
 
 
_________________________________________ 
Profa. Dra. Rosângela Pinheiro Gonçalves Machado 
Centro de Hematologia e Hemoterapia do Ceará (HEMOCE) 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
À Deus. 
À minha avó, meus familiares e amigos. 
AGRADECIMENTOS 
 
À PROAP e a CAPES, pelo apoio financeiro e pela manutenção da bolsa de auxílio, 
respectivamente. 
Ao Profa. Dra. Romélia Pinheiro Gonçalves Lemes por acreditar no meu potencial e 
me oferecer a oportunidade, investimento e orientação. 
Ao Prof. Dr. Max Victor Carioca Freitas pelas generosas contribuições e orientações. 
Aos professores Dr. Roberto César Pereira Lima Junior, Dra. Rosângela Pinheiro 
Gonçalves Machado, Dr. José Ajax Nogueira Queiroz e Dra. Arlândia Cristina Lima 
Nobre de Morais pelo tempo, pelas valiosas colaborações e sugestões. 
Aos voluntários que participaram do estudo cedendo seu tempo e as amostras 
biológicas. 
Aos funcionários do laboratório do HEMOCE e da UFC pela ajuda e o café mautino. 
A Valéria Cordeiro de Oliveira pelos conselhos, organização e ajuda nos momentos 
difíceis. 
Aos colegas da turma de mestrado, pelas reflexões, críticas e sugestões recebidas. 
A Maritza Barbosa, Talytta Santos, Amanda Menezes, Marília Laurentino, Alano 
Pedrosa, Marilena, Tarcisio, Pedro Aurio, Renata Eleutério, André Jhonatan, Iran Davi 
e Monalisa Figueredo pelo suporte científico e emocional e pela alegria compartilhada 
no dia-a-dia.. 
Aos meus amigos, Anália Almeida, Anamaria Falcão, Bruna Vitoriano, Daisy Lima, 
Juliano Casemiro, Liana Sales, Luana David, Pablo Vitoriano e Tamiris Goebel, pelas 
valiosas horas de ócio produtivo, pelas risadas infinitas e por toda comida ofertada. 
A Océlia Monteiro e Fátima Sales por terem me adotado e zelado por mim quando 
precisei. 
A meu avô, Wanderley Neves, e meus irmãos, Lílian Galvão, Wanderley Galvão, 
Larissa Adeodato e Mª Odete Rocha. 
A minha mãe, in memoriam, por ter me ensinado a diferenciar o bem do mal e guiado 
meus passos até aqui. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
“Nada do que você veste, pensa ou diz te define 
tão bem quanto suas prioridades” 
(Domênico Massareto) 
RESUMO 
 
A anemia falciforme (AF) é uma doença hereditária decorrente de uma mutação pontual no 
gene da globina β
S
 gerando uma hemoglobina anormal denominada de hemoglobina S (HbS) , 
que quando desoxigenada sofre polimerização favorecendo o fenômeno de vaso-oclusão, dano 
endotelial vascular e a expressão de fatores angiogênicos. Fatores genéticos como os 
haplótipos da beta globina S são responsáveis pelas diferenças clínicas entre os pacientes. O 
objetivo deste trabalho foi verificar a associação dos haplótipos da globina β
s
 com o fator de 
crescimento endotelial vascular-A (VEGF-A), com hemoglobina fetal (HbF) e manifestações 
clínicas em pacientes com AF. O estudo foi do tipo transversal, analítico e observacional. A 
população em estudo foi constituída por 51 pacientes com diagnóstico molecular de AF, sendo 
39 em uso hidroxiúreia (HU) (617 mg/dia) e 12 sem uso. No total de 61 indivíduos sem 
hemoglobinopatias, considerados sadios, participaram como grupo controle. A análise dos 
haplótipos foi realizada por PCR-RFLP e a dosagem de VEGF-A por ELISA. Os dados 
clínicos e laboratoriais foram obtidos por consulta em prontuários. A análise estatística foi 
realizada mediante a utilização do programa estatístico GraphPad Prism versão 5.0. Os 
pacientes com AF apresentaram parâmetros hematológicos característicos da doença e 
aumento significativo de VEGF-A em relação ao grupo controle, quando se estratificou os 
pacientes pelo uso de HU foi observada concentrações maiores entre os pacientes que não 
estavam em uso de HU. O haplótipo predominante no grupo estudado foi o Bantu, não houve 
diferença nas concentrações de VEGF-A entre os grupos de haplótipos da globina β
s
 e 
manifestações clínicas, excetuando-se as crises vaso-oclusivas (CVO), onde o uso de HU 
influenciou as concentrações de VEGF-A no grupo com maior quantidade de crises por ano. 
Observou-se uma correlação negativa entre as concentrações de VEGF-A e as concentrações 
de HbF e uma correlação positiva com a contagem de reticulócitos. Conclui-se que o aumento 
do VEGF-A nos pacientes sem uso de HU possa ser atribuído a fisiopatologia da doença e que 
provavelmente o uso da HU teve uma ação anti-angiogênica. No entanto mais estudos são 
necessários para avaliar o papel do VEGF-A e da angiogênese na AF. 
 
Palavras-chave: VEGF-A. Haplótipos. Anemia Falciforme. Manifestações clínicas. 
 
ABSTRACT 
 
Sickle cell anemia (SCA) is a hereditary disease caused by a point mutation in βS globin gene 
causing an abnormal hemoglobin called hemoglobin S (HbS), when deoxygenated 
polymerizes favoring the vaso-occlusion phenomenon, vascular endothelial injury and 
expression of angiogenic factors. Genetic factors such as haplotypes beta globin S are 
responsible for the clinical differences among patients. The aim of this study was to 
investigate the association of haplotypes of βs globin with vascular endothelial growth factor-
A (VEGF-A), with fetal hemoglobin (HbF) and clinical manifestations in patients with SCD. 
The study was cross, analytical and observational. The study population consisted of 51 
patients with a molecular diagnosis of SCD, 39 in use hydroxyurea (HU) (617 mg/day) and 12 
unused. A total of 61 individuals without hemoglobinopathies, considered healthy, 
participated as a control group. The haplotype analysis was performed by PCR-RFLP and the 
dosage of VEGF-A by ELISA. Clinical and laboratory data were obtained in consultation 
records. Statistical analysis was performed by using the statistical program GraphPad Prism 
version 5.0. Patients with SCD showed characteristic hematological disease and significant 
increase in VEGF-A in the control group when stratified patients by the useof HU was 
observed higher concentrations among patients who were not in use HU. The predominant 
haplotype in the group studied was the Bantu, there was no difference in VEGF-A 
concentrations between groups of haplotypes of β
S
 globin and clinical manifestations, except 
for the vaso-occlusive crises (CVO), where the use of HU influenced VEGF-a concentrations 
in the group with the largest number of attacks per year. There was a negative correlation 
between VEGF-A concentrations and concentrations of HbF and a positive correlation with 
the reticulocyte count. It is concluded that the increase of VEGF-A in patients without use of 
HU can be attributed to the pathophysiology of disease and probably the use of HU had an 
anti-angiogenic effect. However more studies are needed to evaluate the role of VEGF-A and 
angiogenesis in SCD. 
 
Keywords: VEGF-A. Haplotype. Sickle Cell Anemia. Clinical manifestations. 
 
LISTA DE FIGURAS 
 
Figura 1 – Distribuição global da HbS ..................................................................................... 16 
Figura 2 – Alteração da membrana do eritrócito por polímeros de hemoglobina S ................. 19 
Figura 3 – Interações dos eritrócitos falcizados com endotélio................................................ 20 
Figura 4 – Patogênese da vaso-oclusão na AF ......................................................................... 22 
Figura 5 – Isquemia-reperfusão na AF ..................................................................................... 23 
Figura 6 – Distribuição das áreas de origem do gene da HbS .................................................. 32 
Figura 7 – Distribuição global dos haplótipos da globina β
S
 na população com AF. ............... 33 
 
 
LISTA DE GRÁFICOS 
 
Gráfico 1 – Concentrações de VEGF-A entre os pacientes com AF e grupo controle ............. 44 
Gráfico 2 – Concentrações de VEGF-A entre os pacientes com AF em uso de HU, sem uso de 
HU e grupo controle ................................................................................................................. 44 
Gráfico 3 – Concentrações de VEGF-A dos pacientes com AF em uso de HU de acordo com 
os haplótipos do cluster da globina β
S
 ...................................................................................... 46 
Gráfico 4 – Comparação entre as concentrações de VEGF-A e a quantidade de CVO por ano 
em pacientes com AF em uso ou não de HU ............................................................................ 47 
Gráfico 5 – Correlação entre as concentrações de VEGF-A e as concentrações de HbF nos 
pacientes com AF ..................................................................................................................... 47 
Gráfico 6 – Correlação entre as concentrações de VEGF-A e as concentrações de HbS nos 
pacientes com AF ..................................................................................................................... 48 
Gráfico 7 – Correlação entre as concentrações de reticulócitos e as concentrações de VEGF-A 
nos pacientes com AF ............................................................................................................... 48 
 
 
 
 
 
 
LISTA DE TABELAS 
 
Tabela 1 – Enzimas de restrição utilizadas para a detecção de haplótipos do cluster do gene 
β
S
, regiões de sítios polimórficos ............................................................................................. 40 
Tabela 2 – Enzimas de restrição e padrão de polimorfismo para cada haplótipo ..................... 41 
Tabela 3 – Características demográficas e dados hematológicos dos pacientes com AF, em uso 
ou não de HU, e grupo controle ................................................................................................ 43 
Tabela 4 – Distribuição dos genótipos e haplótipos da globina β
S
 da população estudada ...... 45 
Tabela 5 –Concentrações de VEGF-A dos pacientes com AF em uso de HU de acordo com os 
haplótipos do cluster da globina β
S
 .......................................................................................... 45 
Tabela 6 – Padrão das manifestações clínicas de acordo com a concentração de VEGF-A em 
pacientes com AF em uso ou não de HU .................................................................................. 46 
Tabela 7 – Comparação entre as concentrações de VEGF-A e a quantidade de CVO por ano 
em pacientes em uso ou não de HU .......................................................................................... 47 
 
 
 
 
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS 
 
AF Anemia falciforme 
ANOVA Análise de variância 
AVC Acidente vascular cerebral 
BCAM/LU Molécula de adesão basal/Lutheran 
Ca
++ 
Cálcio 
CD36 Cluster of differentiation 36 
CD47 Cluster of diferentiation 47 
CD64 Cluster of diferentiation 64 
CEC Células endotéliais circulantes 
CHCM Concentração da hemoglobina corpuscular média 
CVO Crises vaso-oclusivas 
DNA Ácido desoxirribonucléico 
EDTA Ácido etilenodiamino tetra-acético 
ELISA Enzyme-linked immunosorbent assay 
EPO Eritropoietina 
ET-1 Endotelina-1 
FBS Fibronectina 
FDA Food and Drug Administration 
Fe
3+
 Ferro férrico 
FS Fosfatidilserina 
GLU Ácido glutâmico 
H2O2 Peróxido de hidrogênio 
Hb Hemoglobina 
HbF Hemoglobina fetal 
HbS Hemoglobina S 
HbS/β Heterozigose para HbS e β talassemia 
HbSA Heterozigose da HbS 
HbSC Heterozigose para HbS e C 
HbSD Heterozigose para HbS e D 
HbSS Homozigose para HbS 
HIF-1α Fator induzido por hipóxia-1α 
Ht Hematócrito 
 
HU Hidroxiuréia 
HUWC Hospital universitário Walter Cantídeo 
ICAM-1 Molécula de adesão intercelular - 1 
IL-1β Interleucina-1β 
IL-6 Interleucina-6 
IL-8 Interleucina-8 
K
+
 Potássio 
kDa Quilodalton 
LACT Laboratório de análises clínicas e toxicológicas 
LHGDH Laboratório de pesquisa em hemoglobinopatias e genética das doenças 
hematológicas 
Masc Masculino 
NF-κB Fator nuclear kappa B 
NO Óxido nítrico 
O
2
 Oxigênio 
PAF Fator de ativação plaquetária 
pb Pares de base 
PCR-RLFP Restriction fragment length polymorphism 
PDGF Fator de crescimento derivado das plaquetas 
pH Potencial hidrogeniônico 
PIGF Fator de crescimento placentário 
ROS Espécies reativas de oxigênio 
STA Síndrome torácica aguda 
TCLE Termo de conscentimento livre e esclarecido 
TNF-α Fator de necrose tumoral 
TSP Trombospondina 
UFC Universidade Federal do Ceará 
VAL Valina 
VCAM-1 Molécula de adesão celular e vascular 
VCM Volume corpuscular médio 
VEGF Fator de crescimento endotelial vascular 
α4β1 ou VLA Antígeno de ativação tardia 
αvβ3 Receptor de fibronectina 
 
LISTA DE SÍMBOLOS 
% Porcentagem 
® Marca registrada 
dL Decilitro 
fL Fentolitro 
g Grama 
mL Mililitro 
nm Nanômetro 
ºC Grau Celsius 
pg Picograma 
α Alfa 
β Beta 
γ Gama 
δ Delta 
κ Kappa 
ψ Psi 
 
 
 SUMÁRIO 
 
1. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA ................................................................................ 15 
1.1. Histórico da Anemia Falciforme ............................................................................. 15 
1.2. Definição da AF ......................................................................................................... 16 
1.3. Fisiopatologia ............................................................................................................ 17 
1.3.1. Polimerização da HbS ............................................................................................... 17 
1.3.2. Moléculas de adesão .................................................................................................. 19 
1.3.3. Papel do Óxido nítrico (NO) na homeostase vascular ............................................. 21 
1.4. Inflamação na AF ...................................................................................................... 22 
1.5. Dano endotelial .........................................................................................................24 
1.6. Eventos clínicos na AF .............................................................................................. 25 
1.7. Angiogênese ............................................................................................................... 27 
1.8. Papel do VEGF na AF .............................................................................................. 28 
1.9. Moduladores genéticos da AF .................................................................................. 31 
1.10. Tratamento da AF ..................................................................................................... 34 
1.11. Justificativa ............................................................................................................... 35 
2. OBJETIVOS ............................................................................................................. 36 
2.1. Objetivo geral ............................................................................................................ 36 
2.2. Objetivos específicos ................................................................................................. 36 
3. CASUÍSTICA E MÉTODOS ................................................................................... 37 
3.1. Desenho do estudo .................................................................................................... 37 
3.2. Casuística ................................................................................................................... 37 
3.3. Local do Estudo ........................................................................................................ 37 
3.4. Seleção das amostras ................................................................................................ 38 
3.4.1. Critérios de inclusão .................................................................................................. 38 
3.4.2. Critérios de exclusão .................................................................................................. 38 
3.4.3. Coleta das amostras biológicas.................................................................................. 38 
3.4.4. Coleta dos dados......................................................................................................... 38 
3.4.5. Definição das variáveis avaliadas nos grupos .......................................................... 39 
3.4.5.1. Variáveis demográficas ............................................................................................... 39 
3.4.5.2. Variáveis laboratoriais ............................................................................................... 39 
3.4.5.3. Dados clínicos ............................................................................................................ 39 
 
3.5. Análises laboratoriais ............................................................................................... 39 
3.5.1. Análises moleculares ................................................................................................. 39 
3.5.1.1. Extração do DNA genômico ....................................................................................... 39 
3.5.1.2. PCR-RFLP .................................................................................................................. 40 
3.5.1.3. Análise dos haplótipos da mutação da globina ß
S
 ..................................................... 40 
3.5.2. Dosagem de VEGF-A ................................................................................................ 41 
3.6. Descarte de material biológico ................................................................................. 42 
3.7. Critérios éticos .......................................................................................................... 42 
3.8. Análise estatística ...................................................................................................... 42 
4. RESULTADOS .......................................................................................................... 43 
5. DISCUSSÃO ............................................................................................................. 49 
6. CONCLUSÃO ........................................................................................................... 53 
7. CONSIDERAÇÕES FINAIS ................................................................................... 54 
REFERÊNCIAS ...................................................................................................................... 55 
ANEXO A – PARECER COMITÊ DE ÉTICA EM PESQUISA ....................................... 68 
ANEXO B – PROSPECTO DO KIT DE VEGF-A .............................................................. 71 
APÊNDICE A – TERMO DE CONSENTIMENTO LIVRE E ESCLARECIDO ............ 88 
APÊNDICE B – TABELAS DE DADOS – HbSS ................................................................ 89 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
15 
 
 
1. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA 
1.1. Histórico da Anemia Falciforme 
A anemia falciforme (AF) é uma hemoglobinopatia hereditária causada por uma 
mutação que afeta o DNA e leva à formação da hemoglobina S (HbS). O termo “anemia 
falciforme” foi usado pela primeira vez por Maçom em 1922, quando foram relacionadas 
algumas manifestações clínicas e hematológicas ao defeito genético: pacientes de etnia 
afrodescendente que apresentavam icterícia, fraqueza, úlceras de membros inferiores, anemia 
intensa e hemácias falcizadas no sangue periférico (GONÇALVES et al., 2003; ORLANDO 
et al., 2000). 
O primeiro relato científico da AF foi em 1910, por James B. Herrick, onde 
células em forma de “foice” foram encontradas no sangue de um jovem estudante negro que 
tinha anemia severa. A estrutura falciforme das hemácias, experimentalmente, foi revertida 
pelo fornecimento de oxigênio às células, por Hahn e Gillespie, em 1927, sugerindo que a 
anóxia causa a falcização. Estes pesquisadores também foram os primeiros a associarem a 
falcização das hemácias ao pH ácido do meio. Em 1930 foram registrados os primeiros dados 
clínicos da doença associados a população negra no Brasil (CAVALCANTI; MAIO, 2011). As 
pesquisas experimentais construídas com base na anomalia morfológica das hemácias 
revelaram que as células falciformes são menos flexíveis que os glóbulos vermelhos normais 
e, portanto, teriam dificuldade para passar em capilares (SHERMAN, 1940). 
Apesar de ter origem desconhecida, a AF foi encontrada primeiramente na África, 
onde se verificou posteriormente sua alta frequência na região central e ocidental. Atualmente 
é uma doença de distribuição mundial (Figura 1), tendo importância significativa na 
população brasileira devido à miscigenação da população com grupos africanos trazidos para 
o Brasil nos séculos XV a XIX (BITOUNGUI et al., 2015; REES; WILLIAMS; GLADWIN, 
2010; SALDANHA, 1957; ZAGO, M. A.; FIGUEIREDO; OGO, 1992) 
Por causa da considerável presença da população africana na base de formação 
da nossa população, a AF foi incluída nas ações de política nacional de atenção integral a 
saúde da população negra do Ministério da Saúde, regulada no Sistema Único de Saúde 
(SUS), pela portaria nº 2.048 de 3 de setembro de 2009, artigos 187 e 188. Estes 
instrumentos garantem o diagnóstico precoce pelos serviços de referência de triagem 
neonatal nos estados da Federação (BRASIL, 2012). 
 
16 
 
 
Figura 1 – Distribuição global da HbS 
 
Fonte: Adaptado de Rees e coloaboradores ( 2010). 
 
Em 1948, Linus Pauling observou que a hemoglobina (Hb) das células falciformes 
tinha uma carga elétrica positiva maior que a Hb das células vermelhas normais e que estas 
poderiam ser separadas por eletroforese. A partir desta pesquisa foi introduzido o termo 
“doença molecular” para caracterizar a doença falciforme. No mesmo ano, Janet Watson e 
colaboradores, correlacionaram os sintomas da doençaa diminuição da concentração da 
hemoglobina fetal (HbF) observando que recém-nascidos com elevada concentração de HbF 
permaneciam assintomáticos. Somente em 1956, Ingram avaliou que o efeito molecular 
envolvido na AF é a troca de uma base nitrogenada no DNA codificante da molécula de 
hemoglobina. 
1.2. Definição da AF 
As hemoglobinopatias consistem em um conjunto de alterações na estrutura ou na 
síntese da hemoglobina, resultantes de defeitos genéticos, condicionando um aumento da 
morbidade em condições ambientais normais. A maior parte das alterações ocorre em cadeias 
globínicas β da hemoglobina, mas alterações de cadeias α, γ e δ são também relativamente 
comuns. As mutações nas cadeias globínicas são responsáveis pela produção de uma 
expressiva variedade de hemoglobinas anormais e entre as variantes mais frequentes 
encontram-se as hemoglobinas S, C, D e E (KIMURA et al., 2008; OLD, 2003). 
A doença falciforme é um grupo representado pela presença da hemoglobina S 
(HbS). Estão inclusas neste grupo a AF (HbSS), interações com talassemias β (HbS/β
0
 
talassemia, HbS/β
+
 talassemia), associação com outras variantes da hemoglobina (HbSC, 
17 
 
 
HbSD) e a associação com a HbA (HbSA) denominado traço falcêmico (ORLANDO et al., 
2000). 
Quando a HbS está em heterozigoze (HbSA, HbSC, HbSD) o indivíduo apresenta 
uma forma mais branda da doença, com sintomas mais leves ou ausentes e uma expectativa de 
vida maior que a parcela da população que tem a mutação em homozigose (HbSS), onde as 
hemácias apresentam cerca de 80% de HbS, tornando estes pacientes portadores de anemia 
hemolítica crônica grave (ASHLEY-KOCH; YANG; OLNEY, 2000). 
1.3. Fisiopatologia 
1.3.1. Polimerização da HbS 
A produção da HbS é resultante de uma alteração genética que causa a mutação 
pontual de uma base nitrogenada no DNA, na posição 6 do cromossomo 11, resultando na 
troca do códon do aminoácido ácido glutâmico pela valina (GACGTC) nas cadeias β da 
globina. Esta substituição leva a modificações físico-químicas na molécula da hemoglobina e 
redução da solubilidade da molécula de deoxihemoglobina, fazendo com que os eritrócitos 
assumam uma forma falciforme (INGRAM, 1956; STUART; NAGEL, 2004; WAGENER et 
al., 2001). 
A substituição de um aminoácido hidrofílico (GLU) por um hidrofóbico (VAL) 
causa uma modificação na carga elétrica da hemoglobina promovendo a polimerização da 
HbS quando esta se encontra em um meio com baixa concentração de O2. O polímero que se 
forma possui 7 cadeias duplas de fibras que tem contato axial e lateral permitindo a interação 
entre os aminoácidos valina, fenilalanina e leucina. Esta alteração causa a mudança na forma 
discóide normal das hemácias para forma de foice, chamada drepanócito, e reduz o tempo de 
vida média da hemácia de 120 dias para 7 a 25 dias. Além da concentração de O2 outros 
fatores interferem neste processo, como a concentração de HbS e HbF, a temperatura e o pH 
do meio (FERRONE, FRANK A.; HOFRICHTER; EATON, 1985; IQBAL et al., 2013). 
Quanto mais rígido o polimero formado, menor é a flexibilidade da célula, menor sua 
estabilidade e mais difícil a reversão da polimerização (CHRISTOPH; HOFRICHTER; 
EATON, 2005; FERRONE, FRANK.; HOFRICHTER; EATON, 1985; FERRONE, FRANK, 
2004; YOSMANOVICH et al., 2016). 
O ciclo de formação e reversão do polímero causa um estado de desidratação das 
células por alterar a permeabilidade da membrana (BARABINO; PLATT; KAUL, 2010). 
Estas alterações causam ganho de Ca
++
 intracelular e perda de K
+
 e água, aumentando a 
18 
 
 
viscosidade sanguínea e a densidade no interior celular. Além destes eventos, a hemoglobina 
polimerizada se liga a proteínas de membrana o que pode causar perda do grupo heme e 
liberação do Fe
3+
 promovendo um microambiente oxidativo no interior da célula. Se ocorrer 
algum dano definitivo na estrutura dos eritrócitos durante o ciclo de polimerização as células 
tornam-se irreversivelmente falcizadas, perdendo a capacidade de transporte de oxigênio e 
sofrendo hemólise intravascular. A polimerização da hemoglobina é considerada por muitos o 
evento primário responsável pela fisiopatologia da doença (FRENETTE; ATWEH, 2007; 
LEW; BOOKCHIN, 2005; VANDORPE et al., 2010; ZAGO; PINTO, 2007). Os danos 
causados pela falcização ocorrem de maneira heterogênea no organismo, alguns órgãos têm 
condições mais propícias para o fenômeno que outros, como o baço onde comumente as 
hemácias falcizadas são sequestradas e causam múltiplos infartos podendo gerar 
esplenectomia (ZAGO; PINTO, 2007). 
Os polímeros de HbS alteram a estrutura do citoesqueleto e do citosol causando 
alterações na membrana celular que resulta em desorganização lipídica e na exposição de 
epítopos de proteínas transmembranares ao meio extracelular, em especial a FS, uma 
glicoproteína de membrana de carga negativa normalmente encontrada no interior das 
hemácias (Figura 2) (STATIUS VAN EPS, 1999; WANG; FERRONE, 2013; ZAGO; PINTO, 
2007). A exposição anormal da FS na membrana altera as propriedades adesivas dos glóbulos 
vermelhos e estimula a geração de trombina contribuindo para as alterações hemostáticas e 
predispondo a eventos vaso-oclusivos (DE JONG et al., 2001; SHAH et al., 2012; YAMAJA 
SETTY; KONETI RAO; STUART, 2001; YAMAJA SETTY; KULKARNI; STUART, 2002). 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
19 
 
 
Figura 2 – Alteração da membrana do eritrócito por polímeros de hemoglobina S 
 
Fonte: Adaptada de Statius Van Eps (1999).A formação de polímeros de HbS ocasiona a desorganização 
lipídica e a exposição da fosfatidilserina (FS) que altera as propriedades adesivas dos eritrócitos 
falciformes contribuindo para um estado pró-inflamatório. 
1.3.2. Moléculas de adesão 
Durante períodos em que o paciente apresenta anemia, a medula é estimulada a 
liberar eritrócitos imaturos, os reticulócitos, que apresentam em sua superfície níveis elevados 
de moléculas de adesão, como o CD36 e a integrina α4β1 , que facilitam as interações com o 
endotélio. Pacientes com AF apresentam número aumentado de reticulócitos no sangue 
periférico devido à anemia hemolítica crônica. Os eritrócitos deformados pela polimerização 
da HbS e reticulócitos são mais suscetíveis à adesão, pelo aumento da viscosidade sanguínea e 
aumento da expressão de moléculas na superfície celular. (ATAGA et al., 2008; CONRAN; 
FRANCO-PENTEADO; COSTA, 2009; HEBBEL, 2008). 
Mais de uma dúzia de moléculas têm sido implicadas no processo de adesão das 
células ao endotélio: O antígeno de ativação tardia (VLA) ou integrina α4β1 do eritrócito se 
liga diretamente à molécula de adesão celular e vascular (VCAM-1) no endotélio sem 
20 
 
 
interação com proteínas plasmáticas; O CD36, que é um receptor glicoprotéico, liga a 
trombospondina (TSP) e o fator de Von Willebrand às proteínas endoteliais (HEBBEL, 2008); 
Além destes também é conhecido a atuação do CD47, que é uma glicoproteína de membrana 
que associa a TSP ao endotélio via receptores de vibronectina αvβ3, a proteína produzida pelo 
grupo sanguíneo Lutheran e o BCAM/LU (molécula de adesão basal), que também se liga à 
lamina na matriz extracelular; A FS que está expressa na superfície dos drepanócitos e se liga 
ao receptor da fibronectina (αvβ3) do endotélio (Figura 3) (ELION et al., 2004; KAUL; 
FINNEGAN; BARABINO, 2009; TELEN, 2016). Outra molécula envolvida na ligação dos 
drepanócitos através do αvβ3 é a molécula de adesão intercelular (ICAM-1). Estudos em 
murinos mostraram que esta molécula esta envolvida nas crises vaso-oclusivas (CVO) e no 
aumento de ligação dos leucócitos ao endotélio (ZENNADI et al., 2008, 2007). 
Figura 3 – Interações dos eritrócitos falcizados com endotélio 
 
Fonte: Adaptado de Telen (2016). As moléculas de adesão dos eritrócitos se ligam as proteínas 
plasmáticas, matrix extracelular e ao endotélio. 
 
A ativação das células endoteliais aumenta a produção dos radicais de oxigênio(ROS) pela ativação da transcrição do fator NF-κB. Este fator também regula a transcrição de 
genes para moléculas de adesão na superfície endotelial como E-selectina, VCAM-1 e ICAM-
1 (HEBBEL, 2014). As duas selectinas, P-selectina e E-selectina, estão implicadas no 
fenômeno de vaso-oclusão sendo responsáveis pelo rolamento de leucócitos sobre o endotélio 
(CANALLI et al., 2011). Plaquetas ativadas de pacientes com AF apresentam maior 
quantidade de P-selectina em sua superfície o que facilita sua ligação com o endotélio via αvβ3 
21 
 
 
(GUTSAEVA et al., 2011). CD64, CD36, L-selectinas e P-selectina são também encontrados 
na superfície de neutrófilos ativados e favorecem a adesão ao endotélio, recrutam plaquetas e 
outros neutrófilos para o sítio inflamatório e secretam H2O2 que juntamente com os ROS 
lesionam o endotélio (OKPALA, 2004). 
1.3.3. Papel do Óxido nítrico (NO) na homeostase vascular 
A vaso-oclusão e a hemólise intravascular são os eventos responsáveis pelas 
manifestações clínicas evidenciadas na AF como a anemia crônica, icterícia, sequestro 
esplênico, crises de dor, priapismo, síndrome torácica aguda, acidente vascular cerebral, 
hipertensão pulmonar, úlceras de perna, necrose asséptica do fêmur e maior suscetibilidade a 
infecções (REES; WILLIAMS; GLADWIN, 2010). 
O endotélio regula a homeostase vascular através do controle do tônus vasomotor, 
do fluxo sanguíneo, do crescimento de células do musculo liso e da inflamação local 
(HUANG; VITA, 2006). As células endoteliais produzem vasoconstritores como endotelinas e 
um potente vasodilatador, chamado NO, responsáveis pela regulação do tônus vascular 
(GALLEY; WEBSTER, 2004; WAGENER et al., 2001). A AF é caracterizada por níveis 
baixos de NO principalmente por causa da hemólise intravascular que libera hemoglobina 
livre, heme e arginase no meio extracelular. A arginase tem como substrato a L-arginina, 
precursora do NO, quando consumida reduz as quantidades de NO que deixa de agir no 
musculo liso dos vasos, diminuindo a vasodilatação. Reforçando este efeito as células 
endoteliais e o músculo liso de pacientes falciformes produzem níveis elevados de endotelina-
1 (ET-1), um potente vasoconstritor produzido em resposta ao estímulo inflamatório, hipóxia 
ou estresse (ERGUL et al., 2004). A vasoconstrição desempenha papel importante na 
fisiopatologia da AF, estando envolvida na hipertensão pulmonar, no priapismo e nas crises 
vaso-oclusivas (CVO) (KATO; GLADWIN; STEINBERG, 2007; THAKUR et al., 2014; 
VIGNON-ZELLWEGER, 2009; WOOD; HSU; GLADWIN, 2008). 
A vaso-oclusão é o processo pelo qual o fluxo sanguíneo é interrompido por 
acúmulo de células sanguíneas e outros elementos que interagem com o endotélio vascular 
(CHIANG; FRENETTE, 2005). Esta interrupção da perfusão normal dos vasos resulta em 
hipóxia tecidual com consequente necrose, refletida em lesões em órgãos e intensas crises 
dolorosas (Figura 4) (SMITH et al., 2008). 
 
 
 
22 
 
 
Figura 4 – Patogênese da vaso-oclusão na AF 
 
Fonte: Adaptado de Wagener et al. (2001). Os eritrócitos falcizados quando sofrem hemólise liberam 
hemoglobina e heme livre no meio extracelular. Este fenômeno induz a expressão de moléculas de 
adesão na superfície das células endoteliais, leucócitos e reticulócitos. As células aderidas ao endotélio 
causam ativação dos fatores de coagulação e bloqueio do fluxo. 
 
1.4. Inflamação na AF 
A AF é uma doença caracterizada por um estado inflamatório crônico com 
episódios agudos evidenciados por um aumento da contagem de leucócitos e meia vida 
leucocitária diminuída. A adesão de células ao endotélio causa redução do fluxo sanguíneo, 
falcização das hemácias, hipóxia local, e aumento de moléculas pró-inflamatórias. Ao mesmo 
tempo ocorre a ativação da cascata de coagulação e ativação de leucócitos que são atraídos 
para o foco inflamatório causando obstrução e dano ao endotélio vascular (HEBBEL, 
ROBERT P; OSAROGIAGBON; KAUL, 2009; INWALD et al., 2000; WUN et al., 2002). 
O perfil inflamatório presente em pacientes com AF resulta da adesão do eritrócito 
falcizado juntamente com outras células sanguíneas ao endotélio, de lesões de isquemia-
reperfusão, das hemólises e das infecções (MADIGAN; MALIK, 2006; ZAGO, MARCO 
ANTONIO; PINTO, 2007). O endotélio ativado é responsável pela produção de uma série de 
citocinas e quimiocinas que contribuem para ativação das células e das plaquetas contribuindo 
para a produção aumentada de moléculas inflamatórias (LANARO et al., 2009; PROENÇA-
FERREIRA et al., 2014). 
Níveis elevados do fator de crescimento placentário (PIGF), produzido pelos 
eritroblastos, ativam os monócitos e estimulam a secreção aumentada de TNF-α, IL-1β, IL-6, 
IL-8 e outras citocinas pró-inflamatórias (BANDEIRA et al., 2014; PERELMAN et al., 2003; 
SARRAY et al., 2015). As citocinas IL-1β e TNF-α são ativadores potentes do endotélio, o 
que cria um ciclo vicioso de ativação endotelial perpetuando o ambiente inflamatório 
23 
 
 
(LANARO et al., 2009). A migração das células inflamatórias através da barreira endotelial 
contribui para manifestações da doença como as úlceras de perna (SMITH, PHILIP 
COLERIDGE, 2006). Além disto, as plaquetas, estimuladas pelo fator de ativação plaquetária 
(PAF) produzido pelas células endoteliais ativadas, liberam trombospondina e fibronectina 
(FBS) que participam das interações celulares com o endotélio e contribuem para a oclusão 
dos vasos (GALLEY; WEBSTER, 2004). 
A interação dos leucócitos, hemácias, plaquetas, o aumento dos fatores de 
crescimento e citocinas, o aumento da viscosidade do leito vascular e a adesão ao endotélio 
resultam na oclusão do fluxo nas vênulas pós-capilares e isquemia, vaso-oclusão, que pode ser 
seguida do restabelecimento do fluxo (Figura 5) (FRENETTE, 2002; TURHAN et al., 2002). 
Este evento cíclico chamado de isquemia-reperfusão aumenta o estresse oxidativo no local e 
causa dano ao tecido endotelial também contribuindo para perpetuação do perfil inflamatório 
crônico (HABARA; STEINBERG, 2016; HEBBEL, 2014). 
Figura 5 – Isquemia-reperfusão na AF 
 
Fonte: Adaptada de Habara e Steinberg (2016). A deformação do eritrócito ocorre por conta da 
polimerização da deoxi-HbS que ocorre apenas em condições ideais de concentrações de HbS, pH ácido 
e temperatura. A HbS polimeirzada causa deformações na membrana celular e perda de cátions e água. O 
estresse mecânico e ativação das células resultam em dano endotelial e obstrução do fluxo. Quando a 
obstrução é resolvida e a perfusão vascular restaurada, radicais livres de oxigênio são produzidos 
causando mais dano endotelial e aumentando a adesão das células ao endotélio perpetuando o estímulo 
inflamatório 
24 
 
 
1.5. Dano endotelial 
A disfunção endotelial manifestada pela ativação das células endoteliais é 
comumente caracterizada pelo aumento de moléculas de adesão na superfície das células 
endoteliais e está envolvida no desenvolvimento de patologias vasculares. A lesão de 
reperfusão, a adesão dos leucócitos e o insulto reológico causado pela falcização dos 
eritrócitos podem conduzir a danos endoteliais e descolamento de células do endotélio, como 
relatado em outras doenças isquêmicas (KAUL; HEBBEL, 2000; RUDNICKI et al., 2016; 
STRIJBOS et al., 2009). 
Os radicais livres de oxigênio (ROS) são moléculas ativas contendo átomos de 
oxigênio e persistem fisiologicamente como um produto do metabolismo e como um 
mecanismo de defesa utilizado pelo sistema imunitário para neutralizar ameaças bacterianas. 
No entanto, quando ROS são produzidos em quantidades que sobrecarregam as moléculas 
antioxidantes endógenas, podem resultar em dano celular significativo (LAPLANTE et al., 
2005). Estas moléculas estão implicadas em doenças como hipertensão, doença renal crônica 
e na AF (KUPESIZ et al., 2012). 
Após os eventos de isquemia-reperfusão acontece a re-oxigenação da área que 
sofreu hipóxia e aumentoda geração de ROS. A ocorrência repetida e aleatória destes eventos 
afeta negativamente a função das células do endotélio vascular e contribui para o dano de 
múltiplos órgãos (HABARA; STEINBERG, 2016; HEBBEL, 2014). Foi demonstrado em 
modelos animais que a ET-1, potente vasoconstritor, tem efeitos adversos potentes na AF por 
potencializar a lesão causada pela isquemia-reperfusão estimulando a produção de ROS 
(HEIMLICH et al., 2015; SABAA et al., 2008). 
O endotélio na região da inflamação é ativado gerando um aumento da expressão 
de moléculas de adesão no endotélio, leucócitos e outras células sanguíneas. Isso aumenta o 
risco de oclusão do lúmen, danos isquêmicos aos órgãos, disfunção endotelial e dor por causa 
da vaso-oclusão (HEBBEL, 2014; KAUL; HEBBEL, 2000; REES; WILLIAMS; GLADWIN, 
2010). As células de defesa envolvidas no processo de vaso-oclusão produzem e secretam 
substâncias prejudiciais para os tecidos. Durante reações inflamatórias os neutrófilos, 
basófilos, eosinófilos e monócitos liberam proteínas citotóxicas e substâncias vasoativas, tais 
como leucotrienos e ROS que atraem e recrutam outras células do sangue para o local da 
inflamação (CANALLI et al., 2004; MARÇAL et al., 2008; WAGNER; BURGER, 2003). Os 
neutrófilos são conhecidos por liberarem proteínas citotóxicas para o interstício dos vasos. Os 
leucócitos, no entanto, quando ativados pelas citocinas são guiados para o sítio inflamatório, 
25 
 
 
com quantidades aumentadas de H2O2 e moléculas de adesão em sua superfície, liberando 
ROS que provocam danos oxidativos (OKPALA, 2004; WUN et al., 2002). Além disso, 
pacientes com AF têm diminuição da capacidade antioxidante, interferindo nos mecanismos 
endógenos de proteção para evitar lesões induzidas pelo estresse oxidativo (ALMEIDA et al., 
2010). 
1.6. Eventos clínicos na AF 
Foram descritos dois modelos de subfenótipos associados ao quadro inflamatório 
dos pacientes com AF: O fenótipo vaso-oclusivo e o fenótipo da disfunção endotelial causada 
por hemólise. No primeiro modelo os pacientes com maior concentração de HbS teriam maior 
capacidade de desenvolver vaso-oclusão devido a da maior adesão endotelial causada pela 
polimerização da HbS. Deste fenótipo resultariam manifestações clínicas como osteonecrose, 
síndrome torácica aguda e maior quantidade de episódios dolorosos. O modelo causado pela 
hemólise, pacientes com menor concentração de HbS e níveis aumentados de marcadores de 
hemólise como contagem aumentada de reticulócitos, desidrogenase lática sérica, 
hemoglobina livre, heme, arginase e diminuição de NO teriam uma anemia mais acentuada, 
complicações clínicas provenientes da hemólise e também disfunção endotelial. Nesses 
pacientes as manifestações clínicas mais comuns são hipertensão pulmonar, acidente vascular 
cerebral, úlceras de perna e priapismo (KATO; GLADWIN; STEINBERG, 2007). 
Dor é a complicação clínica mais frequente nestes pacientes e a elevada 
frequência de crises é uma característica marcante da doença sendo associada a morte precoce 
e maior causa de hospitalizações em pacientes maiores de 20 anos. A dor intensa é uma 
consequência das CVO e costuma ceder ao longo de dias ou semanas. Apesar das CVO serem 
auto limitadas podem resultar em dano permanente aos órgãos. Fatores como hematócrito 
elevado e baixa concentração de HbF estão associados com um aumento na frequência de 
CVO. Outra intercorrência de relevância para as CVO é a elevada suscetibilidade à infecções 
bacterianas, principalmente pneumococos e Haemophilus influenzae (DARBARI et al., 2012; 
PLATT et al., 1991; REES; WILLIAMS; GLADWIN, 2010; SMITH, TERIKA P et al., 2015; 
SMITH, WALLY R, 2014). 
O priapismo é uma ereção dolorosa e indesejada do pênis, uma manifestação 
pouco discutida, que ocorre em 30 a 45% dos pacientes com AF. Se o priapismo persistir por 
4 horas ou mais o paciente corre o risco de sofrer alguma lesão que pode resultar em fibrose 
26 
 
 
peniana e impotência. A presença dos episódios pode estar relacionada ao baixo fluxo venoso 
e isquemia tecidual (BURNETT; BIVALACQUA, 2007; ROGERS, 2005) 
A síndrome torácica aguda (STA) é a segunda maior causa de hospitalizações 
entre os pacientes com AF. É uma forma de lesão pulmonar aguda e é definida como o 
desenvolvimento de infiltrado pulmonar alveolar envolvendo pelo menos um segmento do 
pulmão. Esta síndrome é causada por uma combinação de infecções, embolia e vaso-oclusão 
da vasculatura pulmonar. A gravidade é variável, cerca de 13% dos pacientes necessitam de 
ventilação mecânica e a taxa de mortalidade chega a 3%. O tratamento envolve amplo 
espectro de antibióticos, broncodilatadores e suporte de oxigênio (MILLER; GLADWIN, 
2012; NOVELLI; GLADWIN, 2016). 
A hipertensão pulmonar e a disfunção diastólica do ventrículo esquerdo são 
encontradas em até 18 a 32% dos adultos com AF e estão associadas com tolerância reduzida 
a exercícios físicos e a mortalidade. A pressão pulmonar aumenta durante as CVO e ainda 
mais durante a síndrome torácica aguda. Pacientes com ambas as doenças, hipertensão 
pulmonar e disfunção diastólica, estão em risco particularmente elevado de óbito (DAMY et 
al., 2015; NIU et al., 2009; REES; WILLIAMS; GLADWIN, 2010). 
Osteonecrose da cabeça do fêmur é uma complicação grave da AF. Dependendo 
do genótipo e da gravidade a prevalência da necrose varia de 3 a 50% entre os pacientes. A 
necrose femoral é causada pelo congestionamento de células na medula óssea. A combinação 
de patologias vasculares e ósseas contribui para o desenvolvimento de osteonecrose e leva a 
reparação óssea inadequada que pode evoluir com fraturas ósseas. Outra complicação óssea é 
a dactilite (síndrome de mão-pé), que se apresenta como um processo de necrose e inflamação 
da medula óssea das extremidades dos membros, frequente nos dois primeiros anos de vida, 
desaparecendo com o aumento da idade (DALTRO et al., 2015; ZAGO, MARCO ANTONIO; 
PINTO, 2007). 
As úlceras de perna costumam se desenvolver em pacientes entre 10 e 30 anos de 
idade. Estas úlceras geralmente aparecem na região do tornozelo e são caracterizadas por 
resolução lenta, dor local frequente e um elevado número de recorrências. A fisiopatologia das 
úlceras de perna em pacientes com AF permanece desconhecida, mas uma hipótese é que se 
desenvolvam devido à insuficiência venosa na região que obstrui o fluxo de sangue normal, 
causa hipóxia tecidual e infarte (REES; WILLIAMS; GLADWIN, 2010; SILVA, RAFAEL 
RAMOS et al., 2014). 
27 
 
 
O acidente vascular cerebral (AVC) agudo e a isquemia cerebral crônica estão 
entre as principais causas de incapacitação dos pacientes falciformes. Apesar dos mecanismos 
ainda não serem totalmente conhecidos alguns fatores são associados a este evento como 
anemia, leucocitose, dano endotelial e deficiência de NO. Cerca de 17% dos pacientes com 
AF são afetados por um AVC, podendo até mesmo chegar a 80% no período de 3 anos após o 
primeiro evento. O risco de AVC é maior durante a primeira década de vida, sendo mais 
significativo entre as idades de 2 a 5 anos (MENAA, 2013; NOVELLI; GLADWIN, 2016; 
REES; WILLIAMS; GLADWIN, 2010). 
1.7. Angiogênese 
A angiogênese é um processo dinâmico de diferenciação e proliferação endotelial, 
caracteriza-se pela formação de novos capilares a partir de vasos pré-existentes e é um evento 
essencial para os processos de desenvolvimento, reprodução e reparação. Os estímulos 
fisiológicos importantes para a angiogênese são principalmente a isquemia, hipóxia tecidual e 
inflamação. Alguns fatores específicos são conhecidos por estimularem ou inibirem a 
angiogênese, entre estes estão os fatores de crescimento vasculares, citocinas inflamatórias, 
moléculas de adesão e o óxido nítrico (DUITS; RODRIGUEZ; SCHNOG, 2006a; NIU et al., 
2009). 
O processo de angiogênese envolve interações celulares de diversos tipos e 
mecanismos, onde a organização das células nos vasos sanguíneose a germinação do lúmen 
são impulsionadas pela proliferação e migração das células endoteliais em resposta aos 
mediadores angiogênicos. Alterações na angiogênese têm sido associadas com algumas 
condições patológicas, particularmente doenças inflamatórias crônicas e respostas celulares 
dependentes de oxigênio (COSTA; INCIO; SOARES, 2007; FAM et al., 2003; LOPES et al., 
2015; NILAND; EBLE, 2012). 
A AF é caracterizada pela oclusão microvascular com subsequente isquemia-
reperfusão, resultando em vasculopatia, dano a órgãos e uma expectativa de vida reduzida 
(REES; WILLIAMS; GLADWIN, 2010; STUART; NAGEL, 2004). A hipóxia tecidual 
induzida pela vaso-oclusão pode levar a uma resposta angiogênica (LOPES e al., 2015). Os 
níveis de uma série de mediadores angiogênicos têm sido encontrados elevados na AF, 
incluindo o fator de crescimento endotelial vascular (VEGF), PIGF, angiopoietina-2 e 
eritropoietina (EPO). Além disso, várias manifestações clínicas da AF como retinopatia 
proliferativa, hipertensão pulmonar e úlceras de perna sugerem um envolvimento de 
28 
 
 
processos angiogênicos na patofisiologia da doença (LOPES et al., 2015; NIU et al., 2009; 
SUNDARAM et al., 2010). 
1.8. Papel do VEGF na AF 
Uma baixa tensão de oxigênio afeta a fisiologia celular endotelial estimulando a 
transcrição de fatores que promovem a vasoconstrição como um mecanismo de melhor 
distribuição de oxigênio. Paralelamente, os fibroblastos e a liberação de fatores de 
crescimento para células endoteliais são estimulados com a função de remodelar os vasos e 
promover a angiogênese. Um dos principais fatores de crescimento envolvido na angiogênese 
é o VEGF (FALLER, 1999; LOPES et al., 2015). 
O VEGF é um mitógeno de células endoteliais derivado das artérias, veias e vasos 
linfáticos e liberado por células endoteliais, fibroblastos, células do musculo liso, plaquetas, 
neutrófilos e macrófagos (BAO et al., 2009; FERRARA, 1999). Tem como função a 
quimiotaxia de leucócitos, aumento da permeabilidade vascular e da adesividade de células ao 
endotélio por aumentar a expressão de ICAM-1 e VCAM-1. Este mitógeno também induz a 
produção, pelas células endoteliais, de fatores pró-coagulantes e de NF-κB, conhecido como 
um mediador da inflamação vascular. O VEGF é responsável por regular a angiogênese, a 
embriogênese e a angiogênese patológica associada a tumores e neovascularização intraocular 
(BROCK; DVORAK; SENGER, 1991; KIM, I et al., 2001; NOURSE et al., 2009; 
STANNARD et al., 2007; SULLIVAN; BREKKEN, 2010). 
O VEGF é uma glicoproteína homodimérica de 45kDa que compartilha cerca de 
20% de homologia de aminoácidos com o fator de crescimento derivado das plaquetas 
(PDGF). O VEGF existe em 5 isoformas comumente referidas como VEGF-A, VEGF-B, 
VEGF-C, VEGF-D e PIGF (KECK et al., 1989; MARUYAMA et al., 2007). A 
biodisponibilidade do VEGF depende da sua isoforma, local de secreção e taxa de ligação a 
heparina. O balanço entre o VEGF ligado e livre tem importantes implicações sistêmicas 
(BAO et al., 2009). O VEGF-A é a isoforma mais estudada e desempenha um papel 
importante na proliferação endotelial, migração e sobrevivência. É um dos mediadores mais 
importantes de angiogênese patológica. Esta molécula age nos receptores VEGFR2, que são 
predominantemente expressos por células endoteliais e são cruciais para angiogenese e 
indução da permeabilidade vascular. A produção de VEGF é geneticamente determinada onde 
variantes selecionadas de VEGF-A contribuem para as variações nos níveis de VEGF sérico e 
para alterar a suscetibilidade a doenças ligada às alterações da angiogênese (AL-KHATEEB et 
29 
 
 
al., 2011; FERRARA; GERBER; LECOUTER, 2003; RUGGIERO et al., 2011; 
SOBOLEWSKI; GACKO, 2011; WATSON et al., 2000). A inativação de apenas um alelo do 
VEGF-A ou a hiperexpressão desta molécula provoca a formação de vasos sanguíneos 
anormais e leva a letalidade embrionária. As concentrações de VEGF-A são rigidamente 
controladas para que ocorra a angiogênese fisiológica (AL-HABBOUBI, HEBA H. et al., 
2011; FERRARA; GERBER; LECOUTER, 2003; MIQUEROL; LANGILLE; NAGY, 2000; 
OLSSON et al., 2006). 
Um dos principais fatores que estimulam a expressão do VEGF é o fator induzido 
por hipóxia (HIF-1α), um fator de transcrição nuclear importante encontrado em células de 
mamíferos. Condições de hipóxia favorecem a ativação do HIF-1α e a consequente 
transcrição de vários genes cujas proteínas estão envolvidas em mecanismos homeostáticos, 
fisiológicos e patológicos, incluindo genes que codificam a eritropoietina, transferrina, 
endotelina e VEGF (WENGER et al., 1997; ZIELLO; JOVIN; HUANG, 2007). 
Para que ocorra a manutenção da homeostase é necessário que exista um 
equilíbrio entre os sinais pró-angiogêncos e anti-angiogênicos. Este equilíbrio não é mantido 
na AF (DUITS; RODRIGUEZ; SCHNOG, 2006a). Um dos antagonistas primários e 
reguladores da função do VEGF in vivo é o sFlt-1, o receptor de VEGF solúvel. Esta molécula 
se liga a VEGF e impede a interação com os receptores, assim, controlando o potencial 
angiogênico do VEGF. Normalmente as concentrações de sFlt-1 acompanham o aumento das 
concentrações de VEGF, mas este aumento de sFlt-1 não é visto na AF, o que pode alterar o 
equilíbrio da angiogênese (MOHAN et al., 2005). 
Níveis anormalmente aumentados de VEGF foram encontrados em várias doenças 
como enfisema pulmonar (KURTAGIC; JEDRYCHOWSKI; NUGENT, 2009), câncer (JAIN; 
MUNN; FUKUMURA, 2002), artrite reumatoide (GUO et al., 2016), retinopatia diabética 
(ABHARY et al., 2009; UCHIDA; HAAS, 2009) e AF (AL-HABBOUBI, HEBAH H et al., 
2012; GÜRKAN; TANRIVERDI; BAŞLAMIŞLI, 2005). 
Distúrbios patológicos característicos de uma angiogênese desequilibrada são 
encontrados na AF como a retinopatia falciforme e a hipertensão pulmonar. Assim, além de 
promover a ativação das células endoteliais e adesão de leucócitos e drepanócitos ao endotélio 
o VEGF também pode estar envolvido nas malformações vasculares observadas na AF 
(BRITTAIN; PARISE, 2007). 
A retinopatia falciforme é caracterizada pela oclusão da vasculatura periférica que 
resulta em isquemia, desenvolvimento de retinopatia e concentrações elevadas de VEGF. As 
30 
 
 
principais complicações da retinopatia falciforme são hemorragia vítrea, descolamento da 
retina e perda visual. O uso de fármacos anti-VEGF, como o bevacizumab e ranibizumab, tem 
mostrado resultados positivo na regressão de neovascularização e resolução de hemorragia 
vítrea em pacientes com AF (ELAGOUZ et al., 2010; MITROPOULOS et al., 2014; 
OLULEYE; BABALOLA, 2014; SHAIKH, 2008; SIQUEIRA et al., 2006). 
O VEGF também desempenha um papel vital para a sobrevivência de células 
endoteliais através da indução de vários fatores anti-apoptóticos como Bcl-2 e a proteína A1 
(FERRARA, 2001). Concentrações alteradas de VEGF foram associadas a um estado anti-
apoptótico do endotélio em pacientes com AF, elevando o tempo de sobrevivência destas 
células. Um estudo conduzido por Bishop e colaboradores, em 1995, mostrou que apenas 30% 
das células endoteliais circulantes (CEC) encontravam-se em apoptose nos pacientes com AF 
contra 60% das CEC em indivíduos saudáveis. A apoptose exerce um papel regulador no 
crescimento de tecidos, alterações nesta regulação podem interferir na angiogênese e na 
remodelação vascular o que pode acarretar em retinopatia (BISHOP; BRIGGS; KELLEHER, 
1995; SOLOVEY et al., 1999). Kim e colaboradores, 2003, observaram a expressão elevada 
de VEGF e análises imuno-histoquímicas de tecido de retina em pacientes com retinopatia 
falciforme (KIM et al., 2003) 
O aumento do VEGF pode resultar em fibrose e hiperplasia da camada íntima dos 
vasos, interferindo nas complicações da AF à medida que se desenvolve trombose destes 
sítios hiperplásicos. O AVC é um exemplo clínico desta interferência (BAO et al., 2009; 
BLANN et al., 2008). Concentrações elevadas de VEGF também foramassociadas a 
disfunção diastólica ventricular em crianças e adolescentes com AF, um grupo de risco para 
desenvolvimento de hipertensão pulmonar (NIU et al., 2009). 
Variantes polimórficas de VEGF-A foram associadas as concentrações alteradas 
de VEGF durante as CVO e a STA (AL-HABBOUBI, HEBAH H et al., 2012; REDHA et al., 
2014). Em um estudo caso-controle retrospectivo foi demonstrado a associação direta entre as 
concentrações reduzidas de VEGF a STA quando comparados com o grupo controle de 
pacientes com AF que não apresentavam manifestações clínicas compatíveis (REDHA et al., 
2014). Estudos também associaram concentrações séricas aumentadas de VEGF e VEGF-A a 
CVO comparando as concentrações do fator de crescimento entre pacientes com AF em crise 
e indivíduos saudáveis (AL-HABBOUBI, HEBAH H et al., 2012; DUITS; RODRIGUEZ; 
SCHNOG, 2006; GÜRKAN; TANRIVERDI; BAŞLAMIŞLI, 2005; TRAMPONT et al., 
2004). 
31 
 
 
1.9. Moduladores genéticos da AF 
Apesar de todos os pacientes possuírem o mesmo defeito genético, a incidência e 
a gravidade das CVO variam entre os pacientes e durante o período de vida destes. Além da 
complicada fisiopatologia que é influenciada geneticamente, os pacientes com AF têm uma 
grande variedade fenotípica. A concentração de HbF, a presença simultânea com talassemias β 
e os haplótipos do cluster da globina β tem papel relevante na gravidade da evolução clínica 
(ASHLEY-KOCH; YANG; OLNEY, 2000; STEINBERG, MARTIN H.; SEBASTIANI, 
2012). 
A HbF compõe cerca de 80 a 90% da hemoglobina total ao nascimento, esta 
porcentagem decresce na infância chegando a 0-2% na vida adulta. Esta hemoglobina tem 
maior avidez pelo oxigênio que a HbA. A manutenção de altos níveis de HbF tem benéficos 
clínicos comprovados e ajuda a reduzir as concentrações de HbS nos eritrócitos falcizados 
inibindo a polimerização da HbS devido à formação de um híbrido com as duas cadeias de 
globina que não se incorpora ao polímero. A característica não é encontrada nas outras 
hemoglobinas variantes (HbC, HbD e HbE) que apenas diluem as concentrações de HbS 
(NGO et al., 2013; STEINBERG, MARTIN H.; SEBASTIANI, 2012). Muitas drogas atuam 
como agentes indutores da expressão de HbF como, hidroxiuréia (HU), agentes demetiladores 
de DNA (5-azacitidina), fatores de crescimento hematopoético como a EPO, ácidos graxos de 
cadeia curta (butiratos e derivados) e os inibidores da histona deacetilase (STEINBERG, 
MARTIN H et al., 2003). 
Outros genótipos da HbS são apresentados por concomitância da doença com β-
talassemias. Com exceção do HbS/β
0
 talassemia, as associações com esta doença apresentam 
manifestações clínicas mais brandas da doença falciforme (STEINBERG, M H et al., 2001). 
As manifestações clínicas mais brandas estão associadas a inibição da formação do polímero 
de HbS e redução de hemólise intravascular resultando em um curso mais brando da doença 
(ASHLEY-KOCH; YANG; OLNEY, 2000; ZAGO, MARCO ANTONIO; PINTO, 2007). 
Os haplótipos do grupamento gênico da β globina localizado no cromossomo 11 
têm sido estudados para análise da variação genética, origem e evolução das populações 
humanas (ASHLEY-KOCH; YANG; OLNEY, 2000). Esta região gênica apresenta muitos 
polimorfismos que produzem variações de sequências no DNA e alteram os sítios de 
reconhecimento das enzimas de restrição dando origem a fragmentos de diferentes tamanhos. 
A combinação destes sítios polimórficos nos cromossomos é chamada de haplótipo 
(ANTONARAKIS; KAZAZIAN; ORKIN, 1985). Os haplótipos do gene da HbS são 
32 
 
 
determinados através da analise dos sítios polimórficos por meio das endonucleases de 
restrição (ε/HindII, Gγ/HindIII, Aγ/HindIII, 3'ψβ/HindII e β/AvaII) (OGEDEGBE, 2007). 
Foram relatados os 5 haplótipos mais comuns do gene da HbS, os quais refletem 
as regiões de origem em diferentes partes da África, Arábia-Saudita e Índia (Figura 6) 
(ZAGO, MARCO ANTONIO; PINTO, 2007). O Haplótipo Bantu ou República Centro 
Africana é originário da África Central, está associado a baixos níveis de HbF e 
desenvolvimento da forma mais grave da doença. O Senegal, de Senegal, esta associado a 
níveis elevados de HbF e curso mais brando da doença juntamente com o haplótipo asiático 
Árabe-indiano, da Arábia-Saúdita e norte da África. O Benin, originário do centro-oeste da 
África, e o Camarões, originário de Camarões, estão associados a níveis intermediários de 
HbF (BHAGAT, 2013; LABIE et al., 1985; MONTH et al., 1990; STUART; NAGEL, 2004). 
Aproximadamente 5% dos cromossomos estão relacionados com haplótipos de 
menor prevalência, que são denominados atípicos. Estes podem ser produzidos por 
substituição de um nucleotídeo em um dos sítios polimórficos de restrição; recombinação 
entre dois haplótipos β
S
 típicos ou conversão não recíproca entre cromossomos de uma 
sequência de DNA, dentre estes, o mecanismo de recombinação parece ser o mais comum 
(ZAGO et al., 2001). 
Figura 6 – Distribuição das áreas de origem do gene da HbS 
 
Fonte: Adaptada de Stuart e Nagel (2004). (A) Mapeamento das principais áreas de origem do gene da 
AF (linhas tracejadas). Número de pacientes identificados com AF em Bantu, Benin e Senegal (linhas 
33 
 
 
contínuas) (B) Haplótipo do gene da globina identificado por sítios polimórficos no DNA de acordo com 
os sítios de clivagens pelas endonucleases de restrição 
 
Em um estudo de 2015, Bitoungui e colaboradores revisaram a frequência dos 
haplótipos da globina β
S
 na população mundial afetada pela AF. Seus estudos concluíram que 
os haplótipos Benin e Camarões são os mais prevalentes. Os resultados encontrados foram 
compatíveis com os conhecimentos históricos da migração da população africana pelo mundo. 
No Ceará, em estudos conduzidos em Fortaleza, foi relatado o haplótipo de maior prevalência 
sendo o Bantu (63%), seguido por Benin (25%) e atípico (12%) (SILVA; GONÇALVES, 
2009). Estes resultados estão em conformidade com a distribuição dos haplótipos observada 
para a população brasileira onde os haplótipos Benin e Bantu são os mais prevalente (Figura 
7) (BITOUNGUI et al., 2015; SILVA, 2009). 
O estudo dos haplótipos de gene β
S
 fornecem importantes indicadores para a 
condução da terapêutica. Diversos estudos foram realizados utilizando a associação dos 
haplótipos da β globina com o perfil oxidativo (SANTOS et al., 2012), com o fator de necrose 
tumoral (TNF-α) (ROCHA et al., 2014), com fator de Von Willebrand (VAN DER LAND et 
al., 2013), com os níveis de HbF (BHAGAT, 2013), com o perfil inflamatório (BANDEIRA et 
al., 2014) e com a STA (BEAN et al., 2014). 
Figura 7 – Distribuição global dos haplótipos da globina β
S
 na população com AF. 
Benin (74%; n=799) e Camarões (19%; n=207) 
 
Fonte: Adaptado de Bitoungui e colaboradores (2015). 
 
34 
 
 
1.10. Tratamento da AF 
A maioria das terapias oferecidas para pacientes com AF são de suporte e incluem 
o uso de antibióticos, vitaminas, antioxidantes e analgésicos. Além destas medidas, em casos 
de anemia grave, é utilizada transfusão sanguínea como forma de aumentar a concentração de 
HbA nestes pacientes. O uso de HU é indicado para redução da frequência de crises dolorosas 
em casos de pacientes que tenham manifestações clínicas moderadas ou graves. O único 
tratamento que cura os pacientes com AF é o transplante de células tronco hematopoiética 
(IANNONE et al., 2005; QUINN; ROGERS; BUCHANAN, 2004). 
A HU é um antimetabolito citotóxico e citoredutor, que atua na via da síntese de 
DNA inibindo a ribonucleotídeo redutase, empregado para o tratamento de doenças 
mieloproliferativa como Policitemia vera, Trombocitemia Essencial e Mielofibrose e doenças 
neoplásicas. (FRENETTE; ATWEH, 2007; KOVACIC, 2011; SARACENO; TEOLI; 
CHIMENTI, 2008). Este medicamento tem sido usado com sucesso na terapia da AF e é 
atualmente o único fármaco aprovado pela Food and Drug Administration (FDA) para uso 
nesta doença. No Brasilo uso de HU para pacientes com AF só foi aprovado em novembro de 
2002, através da portaria 872 do Ministério da Saúde (CANÇADO et al., 2009; WONG et al., 
2014). 
As indicações de uso da HU na AF são: pacientes com três ou mais admissões 
hospitalares por crises vaso-oclusivas nos últimos 12 meses; adultos ou crianças com um ou 
mais episódios de STA nos últimos 24 meses e pacientes com disfunções orgânicas graves 
(CANÇADO et al., 2009; DAVIES; GILMORE, 2003; FIGUEREDO, 2007). A administração 
de HU aumenta significativamente a produção de HbF, inibindo a polimerização da HbS, e 
melhora os sintomas clínicos da doença. Esta droga atua na redução da expressão de 
moléculas de adesão, com propriedades anti-inflamatórias e anti-agregantes, reduzindo a 
frequência de STA, das CVO e das hospitalizações. Os dados também sugerem que o 
tratamento HU pode gerar NO e reduzir a contagem de leucócitos em pacientes com AF 
(LANARO et al., 2009; WONG et al., 2014). Além do dito acima, em estudos “in vitro” e “in 
vivo” foram encontradas evidências que sugerem que a HU tem propriedades anti-
angiogênicas (DA GUARDA et al., 2016; LOPES et al., 2014, 2015). 
O tratamento com HU traz como efeitos adversos de curto prazo como 
mielossupressão e o surgimento de citopenias que devem ser monitoradas cuidadosamente nos 
pacientes em tratamento. Outras toxicidades relacionadas com os agentes quimioterápicos, 
como perda de cabelo, erupções cutâneas, distúrbios gastrointestinais e febre também foram 
35 
 
 
relatadas (SIMÕES et al., 2010). Além dos efeitos adversos os pacientes em tratamento 
apresentam uma variabilidade na resposta ao tratamento com HU que provavelmente esta 
ligada aos moduladores genéticos da AF ou variações na metabolização do fármaco 
(IOLASCON; ANDOLFO; RUSSO, 2015). 
1.11. Justificativa 
Estudos recentes buscam associar a participação de mediadores inflamatórios e 
marcadores de dano endotelial aos moduladores genéticos da AF. A hipóxia tecidual causada 
pela vaso-oclusão, principal evento clínico na doença, pode levar a uma resposta angiogênica. 
Na patofisiologia da AF o processo de angiogênese é pouco estudado. O VEGF é considerado 
um promotor de angiogênese e neovascularização em uma variedade de processos fisiológicos 
e patológicos. Concentrações alteradas de moléculas pró-angiogênicas como o VEGF foram 
relatadas em pacientes com AF, mas a associação desta com moduladores genéticos e com o 
uso de HU, principal medicamento utilizado na AF e com possível ação anti-angiogênica, 
ainda precisa de mais esclarecimentos. 
O Laboratório de Pesquisa em Hemoglobinopatias e Genética das Doenças 
Hematológicas (LHGDH) vem promovendo estudos visando melhorar a qualidade de vida e a 
identificação precoce dos eventos clínicos dos pacientes com AF. Estudos vêm sendo 
desenvolvidos na avaliação do papel do estresse oxidativo, dos biomarcadores inflamatórios, 
moduladores genéticos tais como os haplótipos do gene da beta globina S e BCL11A e 
HBSIL-MYB na modulação da HbF. 
Neste contexto o presente estudo tem como proposito avaliar as concentrações de 
VEGF-A nos pacientes do Hospital Universitário Walter Cantídeo (HUWC) no estado do 
Ceará em estado basal em uso e não de HU e associar com eventos clínicos, aos haplótipos da 
globina β
S
 para melhor compreensão sobre a patogênese e identificação de possíveis novos 
alvos terapêuticos. 
 36 
 
2. OBJETIVOS 
 
2.1. Objetivo geral 
Determinar a associação dos haplótipos do gene da globina β
s
 com as 
concentrações plasmáticas do fator de crescimento endotelial vascular-A e com os eventos 
clínicos em pacientes com AF. 
2.2. Objetivos específicos 
 Identificar as características demográficas (Idade e sexo) e laboratoriais (Hb, 
Ht, VCM, CHCM, leucócitos, plaquetas e reticulócitos) dos pacientes com AF 
incluídos no estudo em uso ou não de HU; 
 Avaliar as concentrações plasmáticas do VEGF-A em pacientes com AF, em 
uso ou não de HU, e comparar com um grupo de indivíduos saudáveis; 
 Identificar os haplótipos do cluster da globina βS em pacientes com AF 
incluídos no estudo; 
 Avaliar a associação das concentrações plasmáticas de VEGF-A com as 
manifestações clínicas da AF em pacientes em uso ou não de HU; 
 Avaliar a associação das concentrações plasmáticas de VEGF-A com os 
haplótipos do cluster da globina β
S
 nos pacientes com AF; 
 Avaliar a correlação entre as concentrações de HbF, HbS, reticulócitos e 
VEGF-A nos pacientes com AF. 
 
 
 
 
 37 
 
3. CASUÍSTICA E MÉTODOS 
3.1. Desenho do estudo 
O estudo foi do tipo transversal analítico observacional. 
3.2. Casuística 
Foram convidados a participar da pesquisa, de forma voluntária, pacientes adultos 
de ambos os sexo, com diagnóstico clínico e laboratorial de AF (HbSS), atendidos no 
ambulatório de hematologia do HUWC e indivíduos saudáveis (HbAA), de ambos os sexos, 
doadores de sangue do hemocentro do estado do Ceará (HEMOCE). 
Foram coletadas 112 amostras de sangue periférico, sendo destas 51 de pacientes 
com AF e 61 de indivíduos sem hemoglobinopatias após a obtenção do termo de 
consentimento livre e esclarecido (TCLE) (APÊNDICE A). Ficando assim estratificada a 
amostra. 
Grupo I composto por pacientes com AF em tratamento com HU com dose média 
de 617 mg/dia (8,8 mg/kg/dia admitindo um peso médio de 70kg por pessoa) (Grupo HU), 
grupo II por pacientes com AF sem tratamento com HU (Grupo s/HU) e grupo III com 
indivíduos saudáveis (Grupo Controle). 
As amostras foram estratificadas em relação a concentração de VEGF-A: 
pacientes com concentrações de VEGF ≤ 120,0 pg/mL e pacientes com concentrações de 
VEGF > 120,0 pg/mL de acordo com valores médios encontrados na população saudável que 
constituiu o grupo controle, que corrobora com os valores definidos para indivíduos saudáveis 
(128,9 pg/mL) encontrados no prospecto do kit de VEGF-A utilizado (Human VEGF-A 
platinum ELISA) (ANEXO B) fornecido pela empresa eBioscience®. 
Quanto à quantidade de CVO por ano relatadas na avaliação ambulatorial os 
pacientes foram estratificados em pacientes com CVO < 3 e pacientes com CVO ≥ 3 
(DARBARI et al., 2012; KINNEY et al., 1999; PERELMAN et al., 2003). 
3.3. Local do Estudo 
Os pacientes participantes do estudo estavam em acompanhamento no Hospital 
Universitário Walter Cantídeo (HUWC), da Universidade Federal do Ceará (UFC), em 
Fortaleza (CE), região Nordeste do Brasil. Os experimentos e a análise dos dados foram 
realizados no LHGDH da Faculdade de Farmácia da UFC. 
 38 
 
 
3.4. Seleção das amostras 
3.4.1. Critérios de inclusão 
Foram convidados a participar do estudo pacientes adultos em acompanhamento 
no ambulatório de Hematologia do HUWC da UFC com diagnóstico clínico e molecular de 
AF (HbSS). Os participantes do estudo se encontravam no estado estacionário da doença, 
segundo os critérios estabelecidos por Ballas (2012): ausência de episódios dolorosos e/ou 
doenças intercorrentes, tais como infecções e inflamações nas quatro semanas anteriores ao 
estudo; não admissões hospitalares nos últimos 2-3 dias antes do estudo e ausência de 
transfusão de sangue nos quatro meses anteriores ao estudo. 
Como grupo controle foram selecionados de forma aleatória doadores regulares de 
sangue do HEMOCE, maiores de 18 anos, com parâmetros hematológicos (Hb, Ht, VCM, 
CHCM, Leucócitos, plaquetas e reticulócitos) normais. 
3.4.2. Critérios de exclusão 
Pacientes em uso de vitaminas antioxidantes; tabagistas e etilistas; gestantes; com 
sorologia positiva para HIV; com diabetes mellitus e/ou com algum quadro de insuficiência 
renal ou hepática. 
No grupo controle foram excluídos os indivíduos em uso de vitaminas 
antioxidantes; tabagistas e elitistas e/ou em uso de medicamentos. 
3.4.3. Coleta das amostras biológicas 
Foram coletados 4mL sangue venoso por indivíduo, em tubos contendo ácido 
etilenodiamino tetra-acético (EDTA) como agente anticoagulante,para extração do DNA 
genômico, determinação dos haplótipos por Restriction Fragment Length Polymorphism 
(PCR-RLFP) e determinação dos níveis de VEGF-A. O DNA genômico foi armazenado a -
20ºC e o plasma a -80ºC para posterior análise. 
3.4.4. Coleta dos dados 
Os dados clínicos, laboratoriais e demográficos foram obtidos através da consulta 
aos prontuários médicos. A coleta dos dados e do material biológico foi realizada 
simultaneamente. 
 39 
 
3.4.5. Definição das variáveis avaliadas nos grupos 
3.4.5.1. Variáveis demográficas 
Idade: intervalo entre a data de nascimento e dezembro de 2015. 
Sexo: duas categorias: masculino/feminino. 
3.4.5.2. Variáveis laboratoriais 
As variáveis laboratoriais Hb (g/dL), Ht (%), VCM (fL), CHCM (g/dL), HbF (%), 
HbS (%), contagem de leucócitos (x10
3
/L), contagem de plaquetas (x10
6
/L) e reticulócitos 
(%) foram variáveis numéricas contínuas obtidas paralelamente a coleta do material 
biológico. As variáveis laboratoriais Hb (g/dL), Ht (%), VCM (fL), CHCM (g/dL), contagem 
de leucócitos (x10
3
/L), contagem de plaquetas (x10
6
/L) e reticulócitos (%) do grupo controle 
foram realizadas no LHGDH. 
3.4.5.3. Dados clínicos 
Os dados clínicos (litíase biliar, priapismo, STA, úlceras de perna, cardiopatia, 
necrose femural, AVC e CVO) foram coletados retrospectivamente no período de 2000 a 2015 
por consulta aos prontuários médicos, excetuando a frequência de CVO que foram avaliadas 
nos últimos 12 meses (DARBARI et al., 2012; KINNEY et al., 1999; PERELMAN et al., 
2003). 
3.5. Análises laboratoriais 
3.5.1. Análises moleculares 
O estudo dos haplótipos da globina β
S
 foi realizado primeiramente através da 
extração do DNA, seguida da técnica de reação em cadeia mediada pela polimerase e PCR-
RFLP. 
3.5.1.1. Extração do DNA genômico 
O DNA foi isolado de leucócitos totais a partir de amostras de sangue total 
colhidas em tubos contendo o anticoagulante EDTA. Para extração do material genômico foi 
utilizado o kit da Axygen®, segundo protocolo fornecido pelo fabricante. Após a realização 
do protocolo de extração as amostras foram armazenadas a -20ºC para posterior utilização. 
 40 
 
3.5.1.2. PCR-RFLP 
 A análise dos haplótipos da globina ß
S
 foi realizada por meio da técnica da reação 
em cadeia mediada pela polimerase e utilização de enzimas de restrição para identificação do 
polimorfismo dos comprimentos nos fragmentos de restrição. A técnica utiliza enzimas de 
restrição para detecção de mutações e polimorfismos genéticos. As enzimas de restrição 
reconhecem sítios específicos na sequência do DNA amplificada, que é clivada somente 
quando o sítio está presente, gerando fragmentos de vários tamanhos que são separados e 
analisados por eletroforese, sendo posteriormente detectados pela coloração com brometo de 
etídio ou outro corante fluorescente (CLARK; THEIN, 2004). 
3.5.1.3. Análise dos haplótipos da mutação da globina ßS 
Foram analisados seis sítios polimórficos de restrição, seguindo a metodologia de 
Sutton, Bouhassi, Nagel (1989): 1. XmnI-5’γ
G
, 2. Hind III-γ
G
, 3. Hind III-γ
A
, 4. Hinc II- ψβ , 
5. Hinc II-3’ψβ 3’, 6. Hinf I-5’ß. As informações sobre as enzimas de restrição utilizadas, as 
regiões de clivagem no DNA, o tamanho dos fragmentos após amplificação e após a clivagem 
com seus respectivos padrões de haplótipos estão representadas na tabela 1. 
 
Tabela 1 – Enzimas de restrição utilizadas para a detecção de haplótipos do cluster do 
gene β
S
, regiões de sítios polimórficos, tamanho dos fragmentos de DNA antes e após a 
clivagem 
Oligonucleotídeos Enzima Região 
Tamanho 
do 
fragmento 
Fragmento 
após clivagem 
H0: 5’AACTGTTGCTTTATAGGATTTT3’ 
Xmn I 5’γ
G
 650pb 450pb+200pb 
H1: 5’AGGAGCTTATTGATAACCTCAG3' 
H2: 5’AAGTGTGGAGTGTGCACATGA3’ 
HindIII γ
G
 780pb 430pb+340pb+10pb 
H3: 5’TGCTGCTAATGCTTCATTACAA3’ 
H3: 5’TGCTGCTAATGCTTCATTACAA3’ 
Hind III γ
A
 760pb 400pb+360pb 
H4: 5’TAAATGAGGAGCATGCACACAC3’ 
H5: 5’GAACAGAAGTTGAGATAGAGA3’ 
Hinc II ψβ 701pb 360pb+340pb+1pb 
H6: 5’ACTCAGTGGTCTTGTGGGCT3’ 
H7: 5’TCTGCATTTGACTCTGTTAGC3’ 
Hinc II 3’ψβ 590pb 470pb+120pb 
H8: 5’GGACCCTAACTGATATAACTA3’ 
H9: 5’CTACGCTGACCTCATAAATG3’ 
Hinf I 5’β 380pb 240pb+140pb 
H10: 5’CTAATCTGCAAGAGTGTCT3’ 
Fonte: Adaptado de Sutton, Bouhassi, Nagel (1989). 
 
 41 
 
O PCR thermo-shaker utilizado nos protocolos foi da empresa VHD® (0,025 de 
Taq DNA Polimerase; 2 mM de MgCl2; 0,2 mM de cada dNTP) e as reações de amplificação 
foram desenvolvidas no termociclador master cycler da Eppendorf®. 
Os resultados da amplificação foram verificados pela corrida eletroforética em gel 
de agarose a 1,5%, sob corrente constante de 80 V por 15 minutos, e visualizados em câmara 
de ultravioleta (UV) após coloração com brometo de etídio. 
Os resultados da digestão enzimática foram verificados pela corrida eletroforética 
em gel de agarose a 1,5%, sob corrente constante de 80 V por 30 minutos, e visualizados em 
câmara de UV após coloração com brometo de etídio. 
Os resultados da digestão enzimática das amostras foram analisados de acordo 
com o padrão de polimorfismos para cada haplótipo que está representado na Tabela 2. 
 
Tabela 2 – Enzimas de restrição e padrão de polimorfismo para cada haplótipo 
Enzima Região 
Haplótipos 
Senegal Benin Bantu Camarões Arabe-Indiano 
Xmn I 5’γ
G
 + - - - + 
HindIII γ
G
 + - + + + 
Hind III γ
A
 - - - + - 
Hinc II Ψβ + - - - + 
Hinc II 3’ψβ + + - + + 
Hinf I 5’β + - - + - 
Fonte: Adaptado de Stuart e Nagel (2004). 
 
3.5.2. Dosagem de VEGF-A 
A dosagem de VEGF-A foi realizada em plasma de pacientes e indivíduos 
saudáveis pela técnica de Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA) especifica para 
moléculas humanas de acordo com o protocolo do kit (Human VEGF-A platinum ELISA) 
(ANEXO C) fornecido pela empresa eBioscience®, seguido por leitura em densidade óptica 
utilizando filtro de 450nm. 
A concentração de VEGF-A para indivíduos saudáveis é 128,9 pg/mL de acordo 
com o prospecto do kit fornecido pelo fabricante. 
 42 
 
A média das concentrações de VEGF-A nos indivíduos saudáveis participantes do 
estudo foi de (120,0 ± 79,11 pg/mL) (média ± desvio padrão). 
3.6. Descarte de material biológico 
O descarte do material biológico foi realizado segundo a resolução da diretoria 
colegiada 306, de 7 de dezembro de 2004 da Agência Nacional de Vigilância Sanitária. 
3.7. Critérios éticos 
Os protocolos desenvolvidos neste trabalho foram submetidos a apreciação ética e 
aprovados pelo Comitê de Ética em Pesquisa da Universidade Federal do Ceará sob parecer 
706.154 na data de 02/06/2014 (ANEXO A). Neste termos a equipe executora comprometeu-
se a cumprir todas as diretrizes e normas reguladoras descritas na Resolução 466 de 
12/12/2012 do Conselho Nacional de Saúde. 
3.8. Análise estatística 
A análise estatística dos dados foi realizada mediante a utilização do programa 
estatístico GraphPad Prism versão 5.0. Utilizou-se o teste D’Agostino e Pearson para verificar 
a normalidade dos dados. Em seguida utilizou-se análise de variância ANOVA com pós-teste 
de Turkey para análises com 3 ou mais grupos. Para as análises com até dois grupos foi 
utilizado os testes estatísticos de Mann Whitney (quando variáveis não paramétricas) e teste T 
não pareado (para variáveis paramétricas). 
Foi utilizada a correlação de Spearman e Pearson para as análises de associações 
entre os parâmetros e para realização do teste de contingência foi utilizado o teste exato de 
Fisher. Foi estabelecida significância estatística quando p ≤ 0,05. 
 
 43 
 
4. RESULTADOS 
A população em estudo foi constituída por 51 pacientes com AF com idade 
variando de 23 a 69 anos, com média de 39,45 anos, sendo destes 39 em uso de HU e 12 sem 
tratamento com HU. Em relação ao sexo, no grupo em uso de HU 23 (58,97%) foram do sexo 
feminino e 16 (41,03%) do sexo masculino, no grupo que não fez uso de HU 5 (41,67%) 
foram