2016-tese-alnvarela

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UNIVERSIDADE FEDERAL DO CEARÁ 
CENTRO DE CIÊNCIAS 
DEPARTAMENTO DE BIOQUÍMICA E BIOLOGIA MOLECULAR 
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM BIOQUÍMICA 
 
 
 
 
ANNA LÍDIA NUNES VARELA 
 
 
 
 
PARÂMETROS BIOQUÍMICOS, FISIOLÓGICOS E PROTEÔMICA DO 
FEIJÃO-DE-CORDA [Vigna unguiculata (L) Walp.] INFECTADO PELO VÍRUS 
DO MOSAICO SEVERO DO CAUPI (CPSMV) E A INFLUÊNCIA DO 
ESTRESSE SALINO NESTA INTERAÇÃO INCOMPATÍVEL 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
FORTALEZA 
2016
ANNA LÍDIA NUNES VARELA 
PARÂMETROS BIOQUÍMICOS, FISIOLÓGICOS E PROTEÔMICA DO FEIJÃO-DE-
CORDA [Vigna unguiculata (L) Walp.] INFECTADO PELO VÍRUS DO MOSAICO 
SEVERO DO CAUPI (CPSMV) E A INFLUÊNCIA DO ESTRESSE SALINO NESTA 
INTERAÇÃO INCOMPATÍVEL 
 
 
 
 
 
Tese apresentada ao Programa de Pós-
Graduação em Bioquímica, do Departamento 
de Bioquímica e Biologia Molecular da 
Universidade Federal do Ceará, como 
requisito parcial para obtenção do Título de 
Mestre em Bioquímica. Área de concentração: 
Bioquímica Vegetal. 
 
Orientador: Prof. Dr. José Tadeu Abreu de 
Oliveira. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
FORTALEZA 
2016 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
ANNA LÍDIA NUNES VARELA 
PARÂMETROS BIOQUÍMICOS, FISIOLÓGICOS E PROTEÔMICA DO FEIJÃO-DE-
CORDA [Vigna unguiculata (L) Walp.] INFECTADO PELO VÍRUS DO MOSAICO 
SEVERO DO CAUPI (CPSMV) E A INFLUÊNCIA DO ESTRESSE SALINO NESTA 
INTERAÇÃO INCOMPATÍVEL 
 
Tese apresentada ao Programa de Pós-
Graduação em Bioquímica, do Departamento 
de Bioquímica e Biologia Molecular da 
Universidade Federal do Ceará, como 
requisito parcial para obtenção do Título de 
Mestre em Bioquímica. Área de concentração: 
Bioquímica Vegetal. 
 
Aprovada em: 
BANCA EXAMINADORA 
 
 
Profª. Drª. Vânia Maria Maciel Melo 
Universidade Federal do Ceará (UFC) 
Prof. Dr. Thalles Barbosa Grangeiro 
Universidade Federal do Ceará (UFC) 
 
 
Dr. Fabrício Eulálio Leite Carvalho 
Universidade Federal do Ceará (UFC) 
 
Drª. Emanoella Lima Soares 
Universidade Federal do Ceará (UFC) 
 
 
Prof. Dr. José Tadeu Abreu de Oliveira (Orientador) 
Universidade Federal do Ceará (UFC) 
 
 
 
AGRADECIMENTOS 
 
Ao meu bom Deus, pelo seu infinito amor e bondade. Por sempre guiar meus passos e 
colocar anjos em minha vida que me ajudam a enfrentar todos os obstáculos dessa caminhada. 
Ao meu orientador, Dr. José Tadeu Abreu de Oliveira, pela criteriosa orientação, 
dedicação, confiança, compreensão e, principalmente, pela grande contribuição na minha 
formação científica. 
A todos os doutores membros da banca pela pronta aceitação em participarem da 
avaliação desse trabalho e pelas valiosas contribuições científicas. 
À Professora Dra. Ilka Vasconcelos pelos ensinamentos, apoio, e carinho, sempre 
demonstrados. 
À Dr. Setsuko komatsu (NationalAgricultureand Food Research Organization) e Dr. 
Joaquim Albenísio G. Silveira (UFC) pela parceria científica. 
A todos os professores do Departamento de Bioquímica e Biologia Molecular que 
muito contribuiu para a minha formação intelectual e científica. 
Aos amigos do Laboratório de Proteínas Vegetais de Defesa (Handerson, Thiago, 
Pedro, Ivna, Dhel, Bárbara, Jordânia, Louise, Queilane, Fredy, Raissa, Ana Lu, Rodolpho e 
Handerson) pela companhia, auxílio e momentos de descontração. 
Ao grupo do Laboratório de Proteínas Tóxicas Vegetais (Lucas, Paulo, Bela Gisele, 
Mirella, Helen, Thiago, Xavier, Marina e todos os outros) pelo apoio e companheirismo 
sempre prestados. 
À professora e amiga Dr. Daniele Oliveira, pela amizade, carinho, força e momentos 
de descontração. 
À minha grande amiga Ana Karla Lobo, pela amizade, carinho, companheirismo, e 
momentos de descontração, e a todos os estudantes do LabPlant pela ajuda e apoio na 
realização de várias atividades. 
 Ao meu amigo Pedro Filho, pela grande ajuda na realização desse trabalho, pela 
paciência e amizade em todo esse tempo de caminhada juntos. 
MUITO ESPECIALMENTE, ao meu amigo e companheiro, Rodolpho Glauber 
Guedes Silva, por ser como um “irmão” para mim, tornando-se parte essencial da minha vida.
vi 
 
 
Aos meus grandes amigos, Hermínio Ismael e Hudson Fernando, por estarem 
sempre presentes nas horas que mais precisei, pelos momentos de descontração, carinho 
e incentivo e por serem meus exemplos de inteligência e dedicação. 
À minha família, pelos cuidados, dedicação e companheirismo. 
De forma muito especial, à minha mãe, Ana Lúcia Nunes Varela, e ao meu pai, 
Francisco Gilmar Varela, pelo amor, carinho e dedicação em toda a minha formação, 
que me permitiu chegar até aqui. 
Aos meus tios e tias, que honestamente são grandes exemplos de esforço e vitória. 
Às minhas queridas avós (in memoriam), Alzira e Dasdores, que recentemente 
partiram nossos corações com a partida para outro “plano”, mas que deixaram um legado 
de sabedoria, força e união em uma família. 
À família Chaves Pinho que me acolheram como parte da família, obrigada por 
todo carinho e afeto dedicado a mim. 
Gostaria de dedicar essa tese, DE UMA MANEIRA ESPECIAL, a minha linda 
irmã, Ananda Lívia Nunes Varela, pelo amor, companheirismo, pelas confidências, 
dedicação, apoio, incentivo e valiosa presença em minha vida e a minha amiga, 
companheira e anjo da guarda, Tatiane Chaves Pinho, pela força, dedicação, pelo seu 
amor, apoio, compreensão, carinho, ajuda, por me mostrar o meu potencial, por me 
incentivar para conseguir o melhor, por tornar minha vida mais feliz e completa. 
A todos que direta ou indiretamente contribuíram para a execução deste trabalho. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
vii 
 
AGRADECIMENTOS INSTITUCIONAIS 
 
Este trabalho foi realizado graças ao auxílio das seguintes Instituições: 
 
Departamento de Bioquímica e Biologia Molecular do Centro de Ciências da 
Universidade Federal do Ceará (DBBM-UFC). 
 
Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal e de Ensino Superior (CAPES), pela bolsa 
de Pós-Graduação concedida ao autor, através de convênio com o Programa de Pós-
Graduação em Bioquímica do Departamento de Bioquímica e Biologia Molecular do 
Centro de Ciências da Universidade Federal do Ceará. 
 
Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq), através de 
convênio com o Programa de Pós-Graduação em Bioquímica do Departamento de 
Bioquímica e Biologia Molecular do Centro de Ciências da Universidade Federal do 
Ceará. 
 
Fundação Cearense de Apoio ao Desenvolvimento Científico e Tecnológico (FUNCAP), 
através de convênio com o Programa de Pós-Graduação em Bioquímica do Departamento 
de Bioquímica e Biologia Molecular do Centro de Ciências da Universidade Federal do 
Ceará. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
viii 
 
RESUMO GERAL 
 
O feijão-de-corda (Vigna unguiculata) é um alimento de grande importância comercial, 
infelizmente, está sujeito a vários estresses ambientais, acarretando perdas consideráveis 
em sua produtividade. A salinidade representa um dos fatores abióticos mais importantes, 
além disso os vírus, como o mosaico severo do caupi (CPSMV), destacam-se, pois, 
representam o principal grupo de patógenos que acometem essa cultura. Em condições de 
campo, os estresses mencionados acima podem ocorrer tanto individualmente quanto 
simultaneamente, promovendo impacto negativo no crescimento e desenvolvimento das 
plantas. Portanto, esse trabalho foi realizado a fim de melhorar a nossa compreensão sobre 
os mecanismos complexos envolvidos na interação incompatível do feijão-de-corda 
(genótipo BRS-Marataoã) com o CPSMV, sua resposta frente ao estresse salino e a 
combinação desses dois estresses. Sob essas condições, medidas de trocas gasosas (PN, 
gS, Ci e E), conteúdo de clorofilas (Chla, chlb, chl totais e carotenoides), cinética 
enzimática de proteínas antioxidantes (superóxido dismutase, catalase e ascorbato 
peroxidase) e PR-proteínas (peroxidase, glucanase e quitinase), bem como a dosagem de 
peróxidode hidrogênio, TBARS e a quantificação do CPSMV em folhas de feijão-de-
corda foram realizadas. Além disso, proteínas diferencialmente acumuladas em folhas de 
feijão-de-corda submetidas a esses estresses foram quantificadas e identificadas por nano 
LC-MS/MS e bancos de dados disponíveis. Todas as análises foram realizadas com 2 e 6 
dias após os estresses. Visualmente, por ser um cultivar resistente, BRS-Marataoã não 
apresenta sintomas da doença causada pelo CPSMV, como esperado, também não 
apresentou acúmulo de partículas virais nas folhas que foram infectadas pelo vírus, via 
RT-PCR. Além disso, plantas infectadas (V) mantiveram elevados níveis de fotossíntese 
e clorofilas em relação as plantas controles (MI), observou-se também uma redução em 
atividades CAT e APX e aumento nas atividades de SOD e PAL, o que levou ao aumento 
do H2O2 e acúmulo de compostos fenólicos, favorecendo a resposta antioxidante da 
planta. Curiosamente, a atividade βGLU diminuiu em plantas apenas inoculadas com o 
V, o que pode estar relacionado com o aumento de calose impedindo que o vírus se 
espalhe pela planta. Todos esses resultados nos mostram indícios de alguns fatores 
envolvidos na resistência desse cultivar ao CPSMV. Quando os estresses, sal e vírus, são 
aplicados simultaneamente [SV] notamos acentuada diminuição em parâmetros 
fotossintéticos e conteúdo de clorofilas. Esses resultados são ainda menores quando o 
ix 
 
estresse salino é induzido e, 24 horas após, o CPSMV é inoculado [S(24h)V]. Nesse grupo 
de plantas, por RT-PCR, notamos a presença do RNA das partículas virais, além de um 
grande acúmulo de peróxido e danos de membrana, mostrando que o estresse salino, 
quando aplicado 24 horas antes do estresse viral, debilita a planta favorecendo o ataque 
do patógeno. Contudo, essas plantas não apresentaram sintomas característicos do 
CPSMV. Isso pode estar relacionado com o aumento da atividade de enzimas 
antioxidantes como CAT, SOD, tiorredoxinas, peroxirredoxinas. Além de PR-proteínas 
como CHI e POX, que acionam os mecanismos de defesa e impedem o estabelecimento 
da doença nessas plantas. Foram identificadas, com nano LC-MS/MS, proteínas 
diferencialmente expressas relacionadas com fotossíntese, energia e metabolismo de 
carboidratos, defesa e estresse, estrutura e sinalização, ligantes a nucleotídeos, 
relacionadas com homeostase redox, entre outras. Estes resultados são importantes para 
a compreensão dos mecanismos celulares que atuam no feijão-de-corda, genótipo BRS-
Marataoã, quando submetido à infecção viral, ao estresse salino, e a ambos os estresses 
de forma combinada. 
 
Palavras-chave: Feijão-de-corda, estresse salino, CPSMV, estresses combinados 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
x 
 
ABSTRACT 
 
Cowpea (Vigna unguiculata) is a great commercialy importance food, however its 
productivety is strongly decreased by environmental stresses, biotic or abiotic. In 
semiarid regions, salinity and viruses, such as severe mosaic of cowpea (CPSMV), are 
the most important stresses that limit cowpea yield. Under field conditions, these stresses 
may occur individually or simultaneously increasing the negative effects on plants growth 
and development. Therefore, this study was conducted in order to improve the 
understanding of the mechanisms involved in the incompatible interaction of cowpea 
(BRS-Marataoã genotype) with CPSMV, salt stress and the combination of stresses. 
Under these conditions, were evaluated gas exchange measurements (PN, gS, C and E), 
chlorophyll content (Chla, chlb, total chl and carotenoids), enzyme kinetics of antioxidant 
protein (superoxide dismutase, catalase and ascorbate peroxidase), PR-proteins 
(peroxidase-glucanase and chitinase), the hydrogen peroxide dosage and quantification 
of TBARS. In addition, the differentially accumulated proteins from cowpea leaves 
subjected to combined stress were quantified and identified by nano LC-MS / MS and 
available databases. The analyzes were performed at 2 and 6 days after the stresses 
imposition. Visually, the resistant cultivar BRS-Marataoã did not have symptoms of 
disease caused by CPSMV, as expected, additionaly, plants did not show accumulation 
of virus particles in the infected leaves. Besides that, the infected plants (V) showed high 
levels of photosynthesis and chlorophyll compared to control plants (I). Furthermore, it 
was observed reductions in CAT and APX and increases in SOD and PAL activities, 
leading to increase of H2O2 and phenolic compounds in infected plants compared to 
controls. Interestingly, the βGLU activity decreased only in plants inoculated with V, 
which may have been associated with increase of callose, which prevents the virus 
spreading in the plant. All these results shown support evidences that this cultivar is 
resistant to CPSMV. When the combination of salt stress and viruses are applied 
simultaneously [SV], a remarkable decrease was observed in photosynthetic parameters 
and chlorophyll content. These results are even lower when the salt stress is induced and, 
24 hours later, inoculated CPSMV is [S(24h)V]. The CPSMV resistant cultivar became 
sensible to this virus after 24 h in presence of salt stress. In this group of plants, we noted 
the presence of RNA of viral particles, and a large accumulation of peroxide and 
membrane damage, showing that the salt stress, when applied 24 hours before the viral 
xi 
 
stress, weakens the plant and favors the pathogen attack. However, these plants did not 
show apparent symptoms of CPSMV. This may be related to the increased activity of 
antioxidant enzymes and PR-proteins such as CAT, SOD, thioredoxin, peroxiredoxins 
CHI and POX when compared to the controls. It is known that those enzymes trigger 
defense mechanisms and prevent the establishment of diseases in plants. Differentially 
expressed proteins related to photosynthesis, carbohydrate energy and metabolism, 
defense and stress, structure and signaling, nucleotide ligands, related to redox 
homeostasis, among others, were identified with nano LC-MS/MS. These results are 
important for the understanding of the cellular mechanisms that act in string bean, 
genotype BRS-Marataoã, when subjected to viral infection, to saline stress, and to both 
stresses in a combined manner. 
 
Keywords: Cowpea, salt stress, CPSMV, combined stresses. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
xii 
 
LISTA DE FIGURAS 
 
 
 
FIGURA 1 Ilustração da planta de feijão (V. unguiculata) mostrando folhas, vagens, 
sementes e flores ................................................................................................ 
 
23 
FIGURA 2 Representação esquemática do genoma bipartido (A) e capsídeo CPSMV (B) 
Proteínas virais .................................................................................................. 
 
28 
FIGURA 3 Vírus do Mosaico Severo do Caupi (CPSMV) em folhas de feijão-de-corda .... 30 
FIGURA 4 Visão geral de alguns dos padrões moleculares na interação planta-patógeno 
........................................................................................................................... 
 
32 
FIGURA 5 Esquema modelo de reconhecimento gene-a-gene ............................................ 33 
FIGURA 6 Esquema modelo de reconhecimento “guarda”.................................................. 33 
FIGURA 7 Esquema modelo de reconhecimento decoy”..................................................... 34 
FIGURA 8 Representação esquemática dos principais tipos de resistência contra vírus de 
plantas. (A) A resistência dominante, (B) Resistência recessiva e (C) RNA de 
interferência (RNAi) .......................................................................................... 
 
 
38 
 
 
 
FIGURE 1 Quantification of CPSMV and representative images of leaves ………………. 64 
FIGURE 2 (A) Net photosynthesis, (B) stomatalconductance, transpiration rate (C) and 
(D) internal CO2 partial pressure in cowpea leaves (BRS-Marataoã genotype) 
subjected to CPSMV infection at 2 and 6 days post CPSMV inoculation (DPI) 
……………………………………………………………………………....... 
 
 
 
65 
FIGURE 3 (A) Photochemical quenching, (B) Non-photochemical quenching and (C) 
Electron transport rate in cowpea leaves (BRS-Marataoã genotype) subjected 
to CPSMV infection at 2 and 6 days post inoculation (DPI) ………………… 
 
 
66 
FIGURE 4 Effect of CPSMV inoculation on (A) chlorophyll a, (B) Chlorophyll b, (C) 
Total chlorophyll and (D) carotenoid content in cowpea leaves (BRS-
Marataoã genotype) subjected to CPSMV infection at 2 and 6 days post 
inoculation (DPI) ………………………………………………………........... 
 
 
 
67 
CAPÍTULO I 
CAPÍTULO II 
xiii 
 
FIGURE 5 Activity of (A) PAL and (C) Phenolic compounds content in cowpea leaves 
(BRS-Marataoã genotypes) subjected to CPSMV infection at 2 and 6 after post 
inoculation (DPI) ……………………………………………………………... 
 
 
68 
FIGURE 6 Activity of (A) POX, (B) βGLU and (C) CHI in cowpea leaves (BRS-
Marataoã genotypes) subjected to CPSMV infection at 2 and 6 after post 
inoculation (DPI) …………………………………………………………… 
 
 
69 
FIGURE 7 (A) H2O2 detection and (B) TBARS content in cowpea leaves (BRS-Marataoã 
genotype) subjected to CPSMV infection at 2 and 6 days post inoculation 
(DPI) ………………………………………………………………………… 
 
 
70 
FIGURE 8 Activity of SOD, CAT, and APX in cowpea leaves (BRS-Marataoã genotype) 
subjected to CPSMV infection at 2 and 6 days post inoculation (DPI) ………... 
 
71 
FIGURE 9 (A) Venn diagrams showing the number of of proteins that increased or 
decreased in and (B) Distribution functions of protein in cowpea plants 
infected to CPSMV (V) comparated to control (MI), at 2 and 6 DPI ………….. 
 
 
73 
FIGURE 10 Functional classification of proteins identified in cowpea plants subjected to 
CPSMV infection at 2 and 6 days post inoculation (DPI) …………………… 
 
80 
FIGURE 11 Schematic proposal of the events that allow CPSMV infection and spreading 
in a resistant cowpea genotype (BRS-Marataoã), based on the present 
knowledge of plant-virus interactions and the observations from this current 
research work ………………………………………………………………… 
 
 
 
98 
 
 
 
FIGURE 1 (A) Representative images, (B) Shoot and Root Dry weight, and (C) CPSMV 
particles detection by RT-PCR of cowpea plants subjected to salt stress and 
viral infection, applied simultaneously [SV group], or when the virus is 
applied only 24 after salt stress [S(24h)V group], at 2 and 6 days post stress 
(DPS) …………………………………………………………………………. 
 
 
 
 
239 
FIGURE 2 (A) and (B) Quantitative and qualitative H2O2 detection, (C) and (D) lipid 
peroxidation (MDA content), (E) and (F) membrane damage in cowpea plants 
subjected to salt stress and viral infection, applied simultaneously [SV group], 
 
 
 
 
CAPÍTULO III 
xiv 
 
or when the virus is applied only 24 after salt stress [S(24h)V group], at 2 and 
6 days post stress (DPS) ………………………………………………………. 
 
244 
FIGURE 3 Activity of (A and B) SOD, (C and D) CAT, and (E and F) APX in cowpea 
plants subjected to salt stress and viral infection, applied simultaneously [SV 
group], or when the virus is applied only 24 after salt stress [S(24h)V group], 
at 2 and 6 days post stress (DPS) ……………………………………………… 
 
 
 
246 
FIGURE 4 Activity of (A and B) PAL and (C and D) Phenolic compounds content in 
cowpea plants subjected to salt stress and viral infection, applied 
simultaneously [SV group], or when the virus is applied only 24 after salt 
stress [S(24h)V group], at 2 and 6 days post stress (DPS) …………………….. 
 
 
 
247 
FIGURE 5 Activity of (A and B) POX, (C and D) βGLU and (E and F) CHI in cowpea 
plants subjected to salt stress and viral infection, applied simultaneously [SV 
group], or when the virus is applied only 24 after salt stress [S(24h)V group], 
at 2 and 6 days post stress (DPS) ……………………………………………… 
 
 
 
249 
FIGURE 6 (A) Venn diagrams showing the number of differentially accumulated proteins 
and (B) Distribution functions of protein in cowpea plants subjected to salt 
stress and viral infection [SV group], at 2 and 6 days post stresses (DPS) …….. 
 
 
251 
FIGURE 7 (A) Venn diagrams showing the number of differentially accumulated proteins 
and (B) Distribution functions of protein in cowpea plants subjected to salt 
stress and, 24 hours after, viral infection, [S(24h)V group], at 2 and 6 days 
post stress (DPS) …………………………………………………………….... 
 
 
 
260 
FIGURE 8 Functional classification of differentially accumulated proteins identified in 
cowpea plants subjected to salt stress and viral infection, applied 
simultaneously [SV group], or when the virus is applied only 24 after salt 
stress [S(24h)V group], at 2 and 6 days post stress (DPS) …………………….. 
 
 
 
261 
FIGURE 9 Schematic proposal of the events that allow increased of susceptibility to 
CPSMV infection and spreading in a resistant cowpea genotype (BRS-
Marataoã) after of 24 hours of salinity stress, based on the present knowledge 
of plant-virus interactions and the observations from this current research 
work …………………………………………………………………………... 
 
 
 
 
281 
 
 
 
xv 
 
LISTA DE TABELAS 
 
 
Table 1 Some of the differentially expressed proteins in cowpea plants subjected to 
viral infection (V) compared to control (MI) at 2 and 6 DPI ………………… 
 
74 
Table 1 Effects of virus (V), salt stress and virus (SV), Salt, 24 hours, injury [S(24h)I]; 
Salt, 24 hours, virus [S(24h)V], at 2 and 6 DPS on net photosynthesis (PN), 
stomatal conductance (gS), transpiration rate (E), intercellular CO2 partial 
pressure (Ci), photochemical quenching (qP) and non-photochemical 
quenching (NPQ) in cowpea secondary leaves ……………………………… 
 
 
 
 
242 
Table 2 Effects of virus (V), salt stress and virus (SV), Salt, 24 hours, injury 
[S(24h)MI]; Salt, 24 hours, virus [S(24h)V], at 2 and 6 DPS on Total 
Chlorophyll (Total Chl), Chlorophyll a (Chl a), Chlorophyll b (Chl b) and 
Carotenoids contents in cowpea secondary leaves ……………………………. 
 
 
 
243 
Table 3 Some of the differentially expressed proteins in in cowpea plants subjected to 
salt stress and viral infection, applied simultaneously [SV group], at 2 and 6 
days post stresses (DPS), compared to only stressed plants with virus (V) to 
evaluate the effect of combined stress ………………………………………… 
 
 
 
254 
Table 4 Some of the differentially expressed proteins in in cowpea plants subjected to 
salt stress and, 24 hours after, viral infection [S(24h)V group], at 2 and 6 days 
post stress (DPS), compared to plants subjected with salt stress and, 24 hour 
after, injury [S(24h)MI), to evaluate the effect of combined stress submitted 
separately …………………………………………………………………… 
 
 
 
 
264 
 
 
 
 
 
 
 
 
CAPÍTULO II 
CAPÍTULO III 
xvi 
 
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS 
 
APX Ascorbato peroxidase 
Avr Avirulencia 
CAT Catalase 
CHI Quitinase 
Ci Concentração interna de CO2 
CMV Vírus do mosaico do pepino 
CPSMV Virus do mosaico severo do caupi 
E Taxa de transpiração 
eEF Fatores de elongação eucariótico 
eIF Fatores de iniciação da tradução eucariótico 
ETI Imunidade desencadeada por efetores 
ETR Taxa de transporte de elétrons 
βGLU Glucanase 
gS Condutância estomática 
HR Resposta hipersensitiva 
HSP Proteína de choque térmico 
LVM Vírus do mosaico do alface 
MAMPS Padrões moleculares associados aos microrganismos 
MAPK MAP quinase 
miRNA MicroRNA 
PAMPS Padrões moleculares associados aos patógenos 
PMMoV Vírus do mosqueado do pimentão 
PN Fotossíntese líquida 
POX Peroxidase do guaiacol 
PPFD Densidade do fluxo de fótons fotossintéticos 
PRR Receptores de reconhecimento de padrões 
Prx Peroxirredoxina 
PSI Fotossistema I 
PSII Fotossistema II 
PTGS Silenciamento gênico pós-transcricional 
PTI Imunidade desencadeada por PAMPsxvii 
 
RISC Complexo de silenciamento induzido por RNA 
RNAi RNA de interferência 
RT-PCR Reações de amplificação semi-quantitativa pela RNA polimerase de 
transcritos reversos 
ROS Espécies reativas de oxigênio 
SAR Resposta sistêmica adquirida 
siRNA Pequeno RNA de interferência 
SOD Superóxido dismutase 
sRNAs Pequenos RNAs 
TBARS Substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico 
TGS Silenciamento gênico transcricional 
TMV Vírus do mosaico do tabaco 
VPg Proteína viral ligada ao genoma 
ΔF/Fm’ Eficiência quântica efetiva do fotossistema II 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
xviii 
 
SUMÁRIO 
RESUMO GERAL ..................................................................................................................... Viii 
ABSTRACT ................................................................................................................................ X 
LISTA DE FIGURAS ................................................................................................................. xii 
LISTA DE TABELAS ................................................................................................................ xv 
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS ................................................................................ xvi 
 
 
1 FUNDAMENTAÇÃO TEÓRICA ........................................................................................... 23 
1.1 Feijão-de-corda ..................................................................................................................... 23 
1.2 Estresse salino em plantas ..................................................................................................... 25 
1.2.1 Respostas das plantas ao estresse salino ............................................................................ 26 
1.3 Feijão-de-corda x vírus ......................................................................................................... 27 
1.3.1 Defesa de plantas contra patógenos ................................................................................... 30 
1.3.2 Defesa de plantas contra vírus ........................................................................................... 35 
1.3.2.1 Resistência dominante .................................................................................................... 35 
1.3.2.2 Resistência recessiva ....................................................................................................... 36 
1.3.2.3 Resistência mediada por RNA de interferência (RNAi) ................................................. 36 
1.4 Estresses combinados ........................................................................................................... 38 
2 Hipótese ................................................................................................................................... 40 
3 Objetivos .................................................................................................................................. 41 
3.1 Objetivo geral ....................................................................................................................... 41 
3.2 Objetivos específicos ............................................................................................................ 41 
REFERÊNCIAS .......................................................................................................................... 42 
 
 
 
 
Gel-free/label-free proteomic, biochemical and photosynthetic analysis of cowpea (Vigna 
unguiculata [L.] Walp.) resistance against Cowpea severe mosaic virus (CPSMV) ............... 
 
51 
1 Introduction .............................................................................................................................. 53 
2 Material and methods ............................................................................................................... 54 
2.1 Plant material and growth conditions ………....................................................................... 54 
CAPÍTULO I 
CAPÍTULO II 
xix 
 
2.2 Experimental and control plantlet groups and CPSMV inoculation ..................................... 54 
2.3 Virus detection by RT-PCR …………….............................................................................. 55 
2.4 Gas exchange, chlorophyll a fluorescence, and total chlorophyll content …………….………. 56 
2.5 Protein extraction ……..…………….……………………………………………………… 57 
2. 6 Determination of phenylalanine ammonia-lyase (PAL EC 4.3.1.5) activity ....................... 57 
2. 7 Determination of phenolic compound content ..................................................................... 58 
2.8 Determination of guaiacol peroxidase (POX; EC 1.11.1.7) activity .................................... 58 
2.9 Determination of β -1,3-glucanase (GLU, EC 3.2.1.39) activity .......................................... 58 
2.10 Determination of chitinase (CHI, EC 3.2.1.14) activity ..................................................... 59 
2.11 Determination of hydrogen peroxide and TBARs contents ................................................ 59 
2.12 Determination of superoxide dismutase (SOD; EC 1.15.1.1) activity ……………..……. 59 
2.13 Determination of catalase (CAT; EC. 1.11.1.6) activity ..................................................... 60 
2.14 Determination of ascorbate peroxidase (APX; EC. 1.11.1.11) activity …………...…..…. 60 
2.15 Protein extraction and digestion for mass spectrometry analysis .……………………….. 60 
2.16 Mass spectrometry analysis …………………….........……………………...…………… 62 
2.17 Protein identification of acquired mass spectrometry data …....……………...…………… 62 
2.18 Differential analysis of the identified proteins ……......………………………………...… 63 
2.19 Statistical analysis ………………………………………………………………………… 63 
3 Results ………………………………………………………………………………..…...…. 64 
3.1. Resistance of the cowpea genotype BRS-Marataoã to CPSMV …….......……………….… 64 
3.2. Changes in gas exchange parameters, fluorescence and carotenoid content ………………. 64 
3.3. PAL activity and phenolic compound contents ………………………………………...….. 67 
3.4. POX and PR-proteins ……………………………………………………………….……... 68 
3.5. Hydrogen peroxide, TBARS and antioxidant enzymes ……………………………….…… 69 
3.6. Identification and biological classification of the differentially represented proteins of 
cowpea challenged with CPSMV ……………………………………………………………… 
 
71 
4. Discussion …………………………………………………………………………..………. 83 
4.1. Absence of mosaic symptoms in the resistant cowpea genotype ……………………….….. 83 
4.2. Changes in gas exchange parameters, fluorescence and carotenoid content ………………. 83 
4.3. PAL, phenolic compounds, and PR-proteins ……………………………………………. 85 
4.4. Hydrogen peroxide, TBARS and Antioxidant enzymes …………………………………... 87 
4.5. Identification and biological classification of the differentially represented proteins of 
cowpea challenged with CPSMV ……………………………………………………………… 
 
88 
xx 
 
4.5.1. Amino acid and protein metabolism …………………………………………………… 89 
4.5.2. Proteins involved in photosynthesis and photorespiration ……………..……………..…. 91 
4.5.3. Cell structure and Signaling ………………………………………………….………….. 92 
4.5.4. Energy and metabolism ………………………………………………………….……… 94 
4.5.5. Nucleotide binding proteins and regulation factors/RNA processing proteins …………... 95 
4.5.6. Cell redox homeostasis ……………………………………………………………….…. 96 
4.5.7. Stress and defense responses …………………………………………………………..… 97 
5. Conclusions ……………………………………………………………………………...….. 97 
Reference ………………………………………………………………………………………. 100 
Apêndice I ……………………………………………………………………………….…….. 110 
Apêndice II …………………………………………………………………………………….. 170 
 
 
 
A resistant cowpea (Vigna unguiculata [L.] Walp.) genotype becomes susceptible to 
Cowpea Severe Mosaic Virus (CPSMV) after exposition to salt stress ……………………. 
 
226 
1 Introduction ..............................................................................................................................228 
2 Material and methods ............................................................................................................... 229 
2.1 Plant material and growth conditions ………....................................................................... 229 
2.2 Salt stress and CPSMV inoculation ...................................................................................... 230 
2.3 Dry weight ............................................................................................................................ 231 
2.4 Virus detection by RT-PCR …………………………………………………..........…….... 231 
2.5 Leaf gas exchange, chlorophyll and carotenoid concentrations ………………………… 232 
2.6 Hydrogen peroxide concentration, lipid peroxidation and electrolyte leakage in leaves ..... 233 
2.7 Protein extract preparation and antioxidant enzymes ……………………………………... 233 
2.8 PAL, Phenolic compounds contents and PR-proteins …………………………………..… 235 
2.9 Protein extraction and purification for mass spectrometry ……………………………..…. 236 
2.10 Protein identification by mass spectrometry ……………………………………………... 237 
2.11 Data acquisition by mass spectrometry analysis …………………………………..……... 238 
2.12 Analysis of differentially abundant proteins using mass spectrometry data ……………... 238 
3 Results ...................................................................................................................................... 239 
3.1 Plant growth and CPSMV symptoms …………………………………………………..…. 239 
CAPÍTULO III 
xxi 
 
3.2 Leaf gas exchange and chlorophyll a fluorescence ……………………………..…………. 241 
3.3 Hydrogen peroxide, TBARS, membrane damage, and antioxidant enzymes …………..…. 244 
3.4 PAL, phenolic compounds and PR-proteins ………………………………………………. 247 
3.5 Proteomic analysis ................................................................................................................ 250 
3.5.1 Comparison of the proteome profiles of the salt stressed plantlets concomitantly 
inoculated with CPSMV (SV) with the proteome profiles of plantlets only inoculated with 
CPSMV (V) ……………………………………………………………………….…………… 
 
 
250 
3.5.2 Comparison of the proteome profiles of plantlets stressed with NaCl prior (24h) 
inoculation with CPSMV [S(24)V] with those that were mock-inoculated [S(24)MI] ……….. 
 
260 
4 Discussion ……………………………………………………………………...……………. 267 
4.1 Plant growth and CPSMV symptoms ……………………………………………..………. 267 
4.2 Leaf gas exchange and chlorophyll a fluorescence …………………………………..……. 268 
4.3 Hydrogen peroxide, TBARS, membrane damage, and antioxidant enzymes …………..…. 270 
4.4 PAL, Phenolic compounds and PR-proteins ………………………………………………. 272 
4.5 Cowpea Proteome Changes in Response to combined stress …………………….………… 273 
4.5.1 Amino acid and proteins metabolism ………………………………………………..….. 274 
4.5.2 Cell structure …………………………………………………………………………….. 274 
4.5.3 Energy metabolism and photosynthesis ……………….………………………………… 275 
4.5.4 Nucleotide binding proteins and regulation factors/RNA processing proteins …………. 276 
4.5.5 Stress and defense response ………………….………………………………………….. 277 
4.5.6 Cell redox homeostasis ……………………………………………………………….…. 278 
5 Conclusion …………………………………………………………..………………………. 279 
Reference ……………………………………………………………………………...………. 282 
Apêndice I ………………………………………………………………...………………..….. 298 
Apêndice II …………………………..……………………………….……………………….. 333 
Apêndice III ….…………………………………………………….………………………….. 389 
Apêndice IV ………………………………………………………………………………….... 403 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
CAPÍTULO I 
Fundamentação teórica 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Anna Lídia Nunes Varela
23 
 
1 Fundamentação teórica 
 
1.1 Feijão-de-corda 
 
O feijão-de-corda (figura 1), é uma dicotiledônea, pertencente a ordem Fabales, 
família Fabacea, subfamília Faboideae, tribo Phaseoleae, subtribo Phaseolinea, gênero 
Vigna, subgênero Vigna, espécie V. unguiculata e subespécie unguiculata (FREIRE 
FILHO et al., 2005a). É também conhecido como feijão miúdo, feijão fradinho, feijão 
frade ou feijão macassar. 
 
FIGURA 1 – Ilustração da planta de feijão (V. unguiculata) mostrando folhas, vagens, 
sementes e flores. 
 
Ilustração por Marjorie Leggitt, 2010 
 
A área cultivada com caupi no Brasil é de aproximadamente 1 milhão de 
hectares, dos quais cerca de 900 mil (90%) estão situados na região Nordeste. Nessa 
região, a produção de grãos em 2014 foi de 674.659 t e a produtividade alcançou 438 
24 
 
kg/ha. A Bahia (375.311 t), Ceará (109.148 t), Piauí (55.278 t), e Pernambuco (52.787 t) 
são os maiores produtores e apresentam as maiores áreas plantadas (IBGE, 2015). Essa 
cultura apresenta grande importância na alimentação das populações que vivem nessas 
regiões, sobretudo as mais carentes, sendo considerado um dos principais componentes 
da dieta alimentar (LIMA et al. 2007). 
Do ponto de vista nutricional, as sementes desse feijão representam excelentes 
fontes de proteínas (~ 20 a 29 g/100 g de farinha), carboidratos (~ 56 a 74 g/100 g de 
farinha), vitaminas e minerais, além de possuírem grandes quantidades de fibras 
dietéticas, baixa quantidade de lipídeos totais (~ 0,5 a 3 g/100 g de farinha) e não contêm 
colesterol (RIBEIRO, 2002; SOUZA E SILVA et al., 2002). 
Apesar de predominar em algumas regiões, o feijão-de-corda é uma espécie que 
possui boa capacidade de fixação do nitrogênio atmosférico por meio da simbiose com 
Bradyrhizobium japonicun, conferindo-lhe boa adaptação a solos pobres, com pouca água 
e altas temperaturas (20-35 °C) (EHLERS; HALL, 1997). Além disso, é possuidora de 
ampla variabilidade genética, ampla capacidade de adaptação, alto potencial produtivo 
(FREIRE-FILHO et al., 1999), e excelente valor nutritivo, como citado acima. Por todas 
essas qualidades e características, essa cultura é considerada de grande valor estratégico 
no mercado atual. 
No mercado nacional, o feijão-de-corda contribuiu, no período de 2005 a 2009, 
com 42,20% da produtividade nacional de feijões. Além disso, gerou, em média, 
1.113.109 empregos por ano, produziu suprimento alimentar para 28.205.327 pessoas e 
produziu renda anual no valor de R$ 684.825.333 (FREIRE-FILHO, 2011). O Brasil 
produz em média 3 milhões de toneladas de feijão por ano (CONAC, 2012). Além de 
movimentar o mercado nacional, esse feijão tem despertado interesse de muitos outros 
países, devido à alta qualidade dos grãos, valor nutritivo e regularidade da oferta em 
termos de quantidade e padronização do produto (FREIRE-FILHO, 2011). 
Dentre os diversos cultivares da espécie Vigna unguiculata, existe o BRS-
Marataoã, que foi desenvolvido pela Empresa Brasileira de Pesquisa Agropecuária 
(EMBRAPA-Meio Norte) em parceria com outras instituições no ano de 2004, com 
objetivo de implementá-lo em áreas que normalmente não podem ser exploradas por 
outros cultivares. Esse cultivar é considerado tolerante e bem adaptado a diversos 
estresses (FREIRE-FILHO et al., 2005b). 
25 
 
Apesar das condições ambientais favoráveis para seu cultivo e de sua ampla 
adaptação, muitos fatores, sejam eles de origem biótica (pragas e doenças) ou de origem 
abiótica (salinidade, pH do solo, seca, altas temperaturas etc.), ainda limitam a produção 
desses grãos (ROCHA et al., 2007). 
 
1.2 Estresse salino em plantas 
 
A alta concentração de sais, dentre os estresses abióticos, é o que mais afeta a 
produção e a distribuição geográfica de importantes culturas. Solos salinos, 
caracterizados por possuírem condutividade elétrica do extrato de saturação igual ou 
superior a 4 dS/m (USDA-ARS, 2008), equivalente a 40 mM de sal, ocasionam nas 
plantas uma resposta que pode ser dividida em duas fases. 
A primeira fase é o efeito osmótico, onde a alta concentração de sais 
(principalmente dos íons Na+ e Cl-) no ambiente radicular reduz o potencial osmótico da 
solução do solo, restringindo a capacidade das plantas de absorver água. Como 
consequência imediata desse déficit hídrico induzido pelasalinidade, ocorre uma 
diminuição do turgor das células-guarda, provocando o fechamento estomático, redução 
na fixação de CO2 atmosférico e na taxa fotossintética, provocando diminuição da 
biomassa do organismo (KOSOVÁ et al., 2013; ROY et al., 2014; DEINLEIN et al., 
2014). 
Em adição, os sais podem ser absorvidos no fluxo transpiratório e atingir níveis 
tóxicos dentro das plantas, causando uma posterior redução no crescimento devido a 
efeitos iônicos específicos, o que caracteriza a segunda fase da resposta chamada: efeito 
iônico. Assim, o acúmulo de íons nos tecidos por longos períodos pode causar injúrias e, 
eventualmente, a morte da planta. Isto se deve, provavelmente, à capacidade limitada das 
células para compartimentalizar os íons no vacúolo, permitindo que suas concentrações 
no citosol ou em outras organelas aumentem rapidamente e afetem a atividade de várias 
enzimas metabólicas (ZHU, 2003). Alternativamente, estes íons podem ser transportados 
para as paredes celulares e causar a desidratação das células (MUNNS, 2002; 2005). 
Tanto o efeito osmótico quanto o iônico resultam em desbalanços e deficiências 
nutricionais na planta (ZHU, 2003), as quais têm sido frequentemente relacionadas com 
reduções no crescimento, inibição da fotossíntese e desestabilização das membranas 
(CHARTZOULAKIS et al., 2002; REJILI et al., 2007; SALAMA et al., 2007). Além 
26 
 
disso, com o desequilíbrio entre produção de O2 e assimilação de CO2, devido à 
resistência estomática, ocorre o favorecimento da produção de espécies reativas de 
oxigênio (EROs), como superóxido, peróxido de hidrogênio, oxigênio singleto, e radicais 
hidroxila, caracterizando outro estresse na planta conhecido como explosão oxidativa. 
Essas espécies reativas de oxigênio, induzidas pelo estresse salino, podem agir como 
moléculas sinalizadoras e desencadear a expressão de genes envolvidos em mecanismos 
de defesa ou, em altas concentrações, podem danificar o metabolismo celular, rompendo 
a homeostasis celular e oxidando lipídios, proteínas e ácidos nucléicos, provocando 
diversos efeitos negativos na planta (TIMPERIO et al., 2008; DU et al., 2010). 
 
1.2.1 Respostas das plantas ao estresse salino 
 
As respostas das plantas ao estresse salino e o desenvolvimento da tolerância aos 
sais envolve uma variedade de mecanismos extremamente complexos, incluindo 
processos fisiológicos, bioquímicos e moleculares (HASEGAWA et al., 2000; PARIDA, 
DAS, 2005). Os principais mecanismos incluem: 1) homeostasis iônica e 
compartimentalização; 2) Transporte e captação de íons; 3) Biosíntese de osmoprotetores 
e solutos compatíveis; 4) Ativação de enzimas e compostos antioxidantes; 5) Síntese de 
poliaminas; 6) Geração de oxido nítrico (NO), e 7) regulação de hormônios (GUPTA E 
HUANG, 2014). 
No geral, sinais de estresse osmótico, como por exemplo a perda de turgescência 
celular, parecem desencadear cascatas de fosforilação de proteínas que são centrais para 
a adaptação das plantas. Proteínas do tipo quinase (protein kinase - PK), participam nas 
vias de transdução de sinal que respondem a estresses osmóticos, incluindo o estresse 
salino (ZHU, 2001). Os possíveis produtos desta cascata de transdução de sinais incluem 
a expressão gênica e/ou ativação de enzimas envolvidas na biossíntese de solutos 
compatíveis (ex. prolina e glicinabetaina) para o ajustamento osmótico (ZHU, 2002). 
Além de sinais primários, outras respostas podem ser resultado de 
sinais/estresses secundários produzidos no decorrer do estresse salino como, por exemplo, 
a produção de hormônios do estresse (ex. ABA e etileno) e mensageiros secundários (ex. 
fosfolipídios), a desnaturação de proteínas e o aumento da produção de EROs, 
ocasionando o chamado estresse oxidativo (XIONG, ZHU, 2002). 
Em condições de estresse osmótico, as atividades das CDKs (cyclin- dependent 
27 
 
kinases), proteínas que dirigem o ciclo celular, são reduzidas devido à indução de 
inibidores de CDKs por ABA (WANG et al., 1998). Além disso, o ABA produzido nas 
raízes pode subir pelo fluxo transpiratório e causar o fechamento dos estômatos nas 
folhas, reduzindo a fotossíntese e, portanto, o crescimento das plantas (DAVIES; 
ZHANG, 1991). 
Resumindo, as estratégias que as plantas usam para se defenderem desses efeitos 
adversos, são principalmente: o ajustamento osmótico (com a biossíntese de osmólitos de 
pequena massa molecular e proteínas LEA para diminuir a diferença do potencial hídrico 
entre as células das raízes e o solo); mecanismos de compartimentalização e exclusão de 
íons acumulados no citoplasma, evitando a inativação de enzimas importantes no 
metabolismo vegetal; e o uso de sistemas antioxidantes enzimáticos e não enzimáticos 
para remover as EROs acumuladas (KOSOVÁ et al., 2013; ROY et al., 2014). 
Assim, uma vez restabelecida as homeostases iônica e osmótica, e os danos 
celulares prevenidos e reparados, as plantas devem ser capazes de retomar seus 
crescimentos sob condições de estresse, mesmo que a uma velocidade reduzida. 
 
1.3 Feijão-de-corda x vírus 
 
Apesar de ser adaptada a diversos tipos de estresses abióticos e bióticos, o feijão-
de-corda é, constantemente, exposto ao ataque de patógenos como vírus, bactérias, 
fungos, nematoides e outros. Esses estresses causam danos à integridade das plantas e 
podem causar perdas irreparáveis, resultando em prejuízos para a economia (NEVES et 
al., 2011). Dentre todos os patógenos citados, os vírus representam o principal grupo de 
patógenos que afetam a produtividade do feijão-de-corda (Lima et al., 2012). 
O feijão-de-corda pode ser infectado por mais de 20 espécies diferentes de vírus, 
dentre eles o vírus do mosaico severo do Caupi (CPSMV), que é um dos mais importantes, 
sendo responsável por grandes perdas na produtividade dessa cultura (LIMA et al., 2005a; 
LIMA et al., 2012). 
O vírus do mosaico severo de feijão-de-corda (CPSMV, do inglês: Cowpea 
Severe Mosaic Virus) é um vírus isométrico (diâmetro entre 28 e 30 nm) pertence à 
família Comoviridae e gênero Comovirus, com capsídeo constituído por 60 cópias de uma 
proteína maior (43 kDa) e 60 cópias de uma proteína menor (23 kDa). Seu genoma possui 
duas moléculas de RNA positivo de fita simples (RNA-1 e RNA-2). Essas moléculas de 
28 
 
RNA possuem uma proteína conhecida como VPg (do Inglês: Viral Protein Genome-
linked), ligada na extremidade 5’ e uma cauda poli(A) na extremidade 3’ (CHEN; 
BRUENING, 1992) (FIGURA 2). A molécula de RNA-1 codifica para proteínas 
necessárias para a replicação viral, enquanto RNA-2 codifica para duas proteínas do 
capsídeo e uma proteína envolvida no movimento célula-a-célula (LOMONOSSOFF; 
GHABRIAL, 2001; LE GALL; IWANAMI; KARASEV, 2005). 
 
FIGURA 2- Representação esquemática do genoma bipartido (A) e capsídeo CPSMV 
(B). 32K – proteinase cofator ; Hel – helicase; VPg – proteína viral ligada ao genoma; 
Pro – proteinase; POL – polimerase; MP – proteína de moviemento; CPL – proteína do 
capsídeo grande; CPS – proteína do capsídeo pequena. 
 
 
A replicação do genoma do CPSMV segue o mesmo padrão de outros vírus de 
RNA de sentido positivo (+). O vírion é infeccioso e penetra na planta por meio de 
inoculações mecânicas ou por insetos-vetores, insetos da família Chrysomelidae), entre 
eles Ceratomia arcuata, o vetor mais importante do Brasil (LIMA et al., 2005b). Logo 
após a infecção da planta, o genoma viral (RNAs) é liberado do capsídeo e replicado em 
uma fita complementar de sentido negativo. Simultaneamente a esse processo, a RNA 
29 
 
polimerase RNA-dependente utiliza a fita complementar (-) como molde para a produção 
de inúmeras outras cópias do RNA (+) (LALIBERTÉ; SANFAÇON, 2010). 
Depois de acumuladas no citoplasma, as novas partículas virais são 
transportadas pelas proteínas de movimento para células vizinhas, diretamente, por meio 
dos plasmodesmas, formando uma estrutura tubular larga o suficientepara passagem dos 
capsídeos, permitindo, assim, eficiente propagação célula-a-célula e uma dispersão do 
vírus para os outros tecidos sadios da planta (LOMONOSSOFF & SHANKS, 1983; VAN 
WEZENBEEK et al., 1983). 
Os principais sintomas da infecção pelo CPSMV são: redução drástica de todas 
as partes da planta, necrose na extremidade superior do caule, morte dos brotos terminais 
e queda prematura das folhas. Nas folhas ocorrem lesões cloróticas que caracterizam a 
formação do mosaico, má formação e desenvolvimento de bolhas e diminuição do 
tamanho em folhas jovens (DE JAGER, 1979) (FIGURA 3). 
O mosaico severo está entre as mais importantes doenças do feijão-de-corda no 
Brasil, pois ocorre em todas as regiões onde existem plantações dessa cultura, causando 
perdas na produtividade. No Brasil, além de Vigna unguiculata, outras espécies de plantas 
são infectadas pelo CPSMV como, Glycine max, Phaseolus vulgaris, Macroptilium 
lathyroides, Canavalia brasiliensis, Canavalia ensiformis, Psophocarpus tetragonologus 
e Crotalaria juncea, Crotalaria paulinea (BRIOSO et al., 1994; BERTACINI et al., 
1998; LIMA et al., 2005b). 
Não existe ainda uma forma de controle eficaz, que previna e/ou combata essa 
doença. Atualmente, o controle do CPSMV é realizado apenas pelo cultivo de genótipos 
de feijão-de-corda que são resistentes ou imunes ao vírus, como, por exemplo, o BRS-
Marataoã que, em 2004, foi desenvolvido pela Empresa Brasileira de Pesquisa 
Agropecuária (EMBRAPA-Meio Norte), e foi identificado como sendo resistente ao 
CPSMV (Lima et al., 2012), e o Macaibo que é originado da coleção de germoplasma do 
Instituto Agronômico de Pernambuco (IPA), e foi identificado como sendo imune ao 
CPSMV (CAMARÇO et al., 2009). Porém, Lima e colaboradores (2012) demonstraram 
a existência de um isolado de CPSMV que é capaz de infectar o genótipo Macaibo, onde 
ele se desenvolve causando os mesmos sintomas severos da doença (FIGURA 3). Isso 
nos mostra que, a utilização de cultivares resistentes para evitar a doença causada pelo 
CPSMV pode, também, não ser uma alternativa viável. 
 
30 
 
FIGURA 3- Vírus do Mosaico Severo do Caupi (CPSMV) em folhas de feijão-de-corda. 
(cv. Macaibo inoculado com uma estirpe CPSMV-MC). 
 
Fonte: LIMA et al., 2012 
 
Nosso grupo de pesquisa desenvolveu um trabalho com a prospecção bioquímica 
e molecular de fatores possivelmente envolvidos na imunidade do cv. Macaibo. 
Descobertas apontam que os mecanismos de defesa não estão relacionados, 
aparentemente, com as respostas bioquímicas clássicas, que envolvem a indução de 
enzimas relacionadas ao estresse oxidativo e à patogênese. Entretanto, foram observadas 
variações na sequência do fator de iniciação da tradução proteica, eIF4E, entre cultivares 
imunes e susceptíveis, sugerindo que a resistência recessiva constitutiva poderia estar 
associada com as mutações detectadas nessas sequências e poderia ser a causa da 
imunidade do cultivar a maioria das estirpes do CPSMV (MAGALHÃES, 2011). 
 
1.3.1 Defesa de Plantas contra patógenos 
 
A interação planta-patógeno pode ser classificada em dois tipos: compatível, na 
qual o patógeno tem sucesso na infecção, e incompatível, na qual o patógeno não é capaz 
31 
 
de se desenvolver no hospedeiro. 
As plantas estão continuamente expostas a condições ambientais desfavoráveis 
e, por serem sésseis, precisam de eficientes mecanismos bioquímicos, morfológicos e 
fisiológicos para sobreviverem a esses estresses e ataque de patógenos como vírus, 
bactérias, fungos e herbívoros. Embora sofram grande pressão ambiental, a maioria das 
plantas consegue se defender eficientemente, de forma que a doença é considerada uma 
exceção e não uma regra. Os mecanismos de defesa contra esses organismos envolvem, 
basicamente, dois tipos de respostas: barreiras constitutivas, químicas e/ou físicas pré-
formadas (cutícula, parede celular e fitoanticipinas) que limitam o acesso dos organismos 
às células vegetais (VLOT et al. 2009; THOMMA et al. 1998) e respostas de defesa 
induzidas, que envolvem o reconhecimento do patógeno pelos hospedeiros e a indução 
de uma série de sinais que resultam em respostas rápidas de defesa (defesa inata ou basal). 
O início das respostas induzidas do sistema imune inato da planta acontece com 
o reconhecimento dos padrões moleculares associados a estes patógenos, PAMPs e 
MAMPs (do inglês, Pathogen/Microbe-Associated Molecular Patterns), DAMPs (do 
inglês, Damage-associated Molecular Patterns) e/ou VAMPs (do ingês, Viral-Associate 
Molecular Patterns) desencadeando a PTI (do inglês: PAMP-Triggered Immunity), que, 
geralmente, possui curta duração, abrange ampla variedade de patógenos e representa um 
menor impacto energético à planta. Porém, possui uma grande importância pois atua 
impedindo a colonização da planta por parte de larga gama de patógenos (GURURANI 
et al., 2012), conforme ilustrado na FIGURA 4. 
Dentre alguns padrões que têm sido identificados nas diversas espécies 
fitopatogênicas, estão: flagelina, lipopolissacarídeos (LPS), quitina e ergosterol etc. A 
percepção desses padrões se dá por meio de receptores de reconhecimento de padrões 
(PRRs) que são proteínas extracelulares bastante conservadas presentes na membrana 
celular (MACHO E ZIPFEL, 2014). 
As plantas reconhecem e se defendem contra um patógeno potencial, eles, por 
sua vez, devem ser capazes de manipular a biologia da planta para criar um ambiente 
adequado para o seu crescimento e reprodução. Dessa forma, uma comparativa “corrida 
armamentista” entre plantas e patógenos tem sido observada (BENT E MACKEY, 2007). 
Para tentar sobrepujar a PTI, ou seja, essa primeira linha de defesa das plantas, os 
patógenos, ao longo da evolução, adquiriram a capacidade de produzir moléculas 
efetoras, supressoras da PTI, denominadas Avr (do inglês, Avirulence proteins). Por sua 
32 
 
vez, as plantas coevoluíram e desenvolveram uma forma de imunidade baseada no 
reconhecimento direto ou indireto dos efetores por meio da interação com proteínas de 
resistência, codificadas pelos genes de resistência (genes R) do hospedeiro (RAFIQI et 
al., 2009). Esse reconhecimento desencadeia uma resposta de resistência mais forte, ainda 
do que a basal, conhecida como ETI (do inglês, Effector-Triggered Immunity) (DANG; 
JONES, 2001). 
 
FIGURA 4 – Visão geral de alguns dos padrões moleculares na interação planta-
patógeno. 
 
Fonte: WIRTHMUELLER et al., 2014. 
 
Esse mecanismo de reconhecimento de proteínas Avr do patógeno por proteínas 
R do hospedeiro foi proposto, pela primeira vez, por Harold Flor (1955), e denominada 
de hipótese gene-a-gene (FIGURA 5). A existência desse modelo explica a condição de 
resistência e incompatibilidade à doença em determinados patossistemas, de modo que, 
plantas que possuem o gene R resistem a determinadas raças de fitopatógenos, que 
expressam seus correspondentes efetores (KEEN, 1990; VAN E JONES, 1998). 
 
33 
 
FIGURA 5 – Esquema modelo de reconhecimento gene-a-gene, um reconhecimento 
específico direto do efetor (proteína Avr) do patógeno pelo receptor do hospedeiro 
(Proteina-R) dando início às respostas de defesa. 
 
 
Fonte: GLOWACKI; MACIOSZEK; KONONOWICZ, 2010. 
 
Outro modelo, chamado hipótese-guarda, que é uma variação da hipótese gene-a-
gene, as proteínas-R da planta funcionam como proteínas guardiãs (do inglês, Guard 
Protein) e interagem com proteínas guardadas (do inglês, Guardee protein), que são as 
proteínas alvo do patógeno (FIGURA 6). A interação de proteínas efetoras do patógeno 
com proteínas guardadas do hospedeiro resulta em uma modificação nesta molécula que 
se liga às proteínas guardiãs. Assim, as proteínas guardiãs sofrem modificações 
estruturais importantes para o desencadeamento da resposta de defesa (VAN DER 
BIEZEN; JONES, 1998; DANGL; JONES, 2001). 
 
FIGURA 6 – Esquema modelo de reconhecimento “guarda”, em que uma proteína guardase liga ao efetor do patógeno auxiliando no reconhecimento para que a resposta de 
resistência seja iniciada. 
 
Fonte: GLOWACKI; MACIOSZEK; KONONOWICZ, 2010. 
34 
 
O modelo decoy de interação é uma segunda variação da hipótese gene-a-gene. 
Nesse modelo, proteínas específicas, que são similares àquelas proteínas alvos dos 
efetores patogênicos, são iscas que mimetizam alvos dos efetores do patógeno e são 
requeridas pelas proteínas-R para ativação das defesas do hospedeiro. Essas proteínas 
então, funcionam como “armadilhas” e induzem os eventos de reconhecimento, 
entretanto, na ausência de proteínas-R, as proteínas iscas não contribuem para o 
desenvolvimento da doença (FIGURA 7) (VAN DER HOORN; KAMOUN, 2009). 
 
FIGURA 7 – Esquema modelo de reconhecimento “decoy”. Uma proteína mimetiza uma 
proteína alvo do efetor patogênico, e após reconhecimento, interage com uma proteína R 
disparando as respostas de defesa. 
 
Fonte: GLOWACKI; MACIOSZEK; KONONOWICZ, 2010. 
 
Após reconhecimento das moléculas efetoras do patógeno, várias respostas 
bioquímicas são induzidas, envolvendo transdução de sinais, resultando em respostas 
locais e sistêmicas. Essas respostas iniciais são baseadas na explosão oxidativa, que 
medeia várias respostas induzidas nas plantas como a resposta hipersensitiva (HR), como 
a morte celular programada (PCD), indução de proteínas quinases ativadas por mitógenos 
(MAPKs) e proteínas quinases dependentes de cálcio (CDPKs), induzindo, assim, 
reprogramação transcricional de genes de defesa, culminando na síntese de proteínas 
relacionadas à patogênese (PR-proteínas) e na indução de compostos antimicrobianos 
35 
 
(HOK et al., 2010; LAZNIEWSKA, 2012; GURURANI et al., 2012; NEWMAN et al., 
2013; SCHELER et al., 2014; SMÉKALOVÁ et al., 2014). Além disso, também ocorre 
regulação hormonal, com a geração de sinais móveis e acúmulo de ácido absísico, ácido 
jasmônico e etileno, que podem atuar na resistência aos estresses biótico e abiótico, 
especificamente o ácido salicílico (AS), que é transportado a partir dos locais infectados 
para tecidos distais, induzindo a resistência sistêmica adquirida (SAR), uma forma de 
imunidade de longa duração para uma ampla variedade de patógenos (AN & MOU, 2011; 
KUMAR, 2014; WASTERNACK, 2014, KACHROO & ROBIN, 2014). 
 
1.3.2 Defesa de plantas contra vírus 
 
Devido à presença de barreiras físicas pré-formadas nas plantas (por exemplo, a 
cutícula e parede celular), a infecção viral ocorre por meio de injúrias na planta 
ocasionadas por vetores como nematoides e insetos (ALEXANDER; CILIA, 2015) e por 
danos físicos nos seus tecidos. 
Uma vez dentro da planta, o vírus pode estabelecer diversas interações possíveis 
com ela (HULL, 2009). Já a planta, reconhece seu invasor e pode desencadear diferentes 
tipos de resistências. Nicaise (2014) discute que a resistência contra vírus, em plantas, 
pode envolver vários mecanismos como: resistência dominante, recessiva e mediada por 
RNAi. 
 
1.3.2.1 Resistência dominante 
 
A resistência dominante é uma forma de defesa das plantas contra vírus que 
ocorre quando há reconhecimento dos produtos de genes de avirulência (Avr) do 
patógeno por produtos de genes de resistência (R) do hospedeiro, promovida pelas 
proteínas NBS-LRR (do inglês, nucleotide binding, siteleucine-rich repeat), iniciando os 
mecanismos de defesa ETI e evitando a infecção viral. Essas proteínas interagem, direta 
ou indiretamente com esses efetores dos patógenos, ou seja, com as proteínas Avr. Além 
desse tipo de reconhecimento, os produtos R e Avr podem interagir como nos modelos 
guarda e “decoy” (VAN DER BIEZEN; JONES, 1998; DE RONDE; BUTTERBACH; 
KORMELINK, 2014). 
 
36 
 
1.3.2.2 Resistência recessiva 
 
A resistência recessiva (imunidade) ocorre devido a mutações ou ausência de 
fatores no hospedeiro que incapacita o vírus de estabelecer a infecção (ROBAGLIA; 
CARANTA, 2006; MOFFETT, 2009). Estudos de identificação e clonagem de genes 
mostram que a maioria dos genes envolvidos na resistência recessiva são codificantes 
para proteínas pertencentes às famílias dos fatores de iniciação da tradução eIF (do inglês, 
eukaryotic initiation factors), pertencentes às famílias 4E (eIFE) e 4G (eIF4G), e suas 
isoformas eIF(iso)4E e eIF(iso)4G, que juntos formam o complexo eIF4F e eIF(iso)4F 
respectivamente. A principal função desse complexo é a ligação ao capacete do mRNA 
(7-metilguanosina) maduro da planta que é fundamental no processo de tradução 
(GALLIE; BROWNING, 2001; REVERS; NICASE, 2014). 
Quando ocorrem mutações nesses fatores, o reconhecimento dos ribossomos por 
proteínas virais (VPg) é impedido, inibindo a síntese de proteínas. Estudos com vírus do 
gênero Potyvirus mostraram que a resistência de plantas pode estar associada com a 
incapacidade da VPg em se ligar ao eIF4E ou eIF(iso)4E das plantas (GRZELA et al., 
2006). Além disso, Nicaise e colaboradores (2003) verificaram que a substituição de um 
único aminoácido (alanina para prolina) na sequência do fator eIF4E resultou na 
resistência do alface contra o LVM (Lettuce Mosaic Virus). 
Esses estudos nos mostram a importância do conhecimento da função desses 
fatores de tradução no mecanismo de resistência pois podem conduzir ao 
desenvolvimento de novas estratégias de controle de doenças virais. 
 
1.3.2.3 Resistência mediada por RNA de interferência (RNAi) 
 
Resistência mediada por RNAi é uma defesa antiviral inata nas plantas que 
envolve a degradação específica da sequência do RNA viral, tendo como alvo os ácidos 
nucléicos virais. Essa resistência corresponde a um processo celular responsável pelo 
silenciamento gênico pós-transcricional (PTGs, do inglês, Post-Transcriptional Gene 
Silencing) ou silenciamento gênico transcricional (TGS, do inlês, Transcricional Gene 
Silencing), desencadeado por sRNAs (do inglês, Small RNAs) (PUMPLIN; VOINNET, 
2013; SHUKLA; DALAL; MALATHI, 2013). 
37 
 
sRNAs são pequenas moléculas de RNA não codificantes (cerca de 20-30 
nucleotídeos de comprimento), que podem ser classificadas em dois grupos: miRNA (do 
inglês, microRNA) e siRNA (do inglês, Small interfering RNA). Os dois grupos diferem 
em seu precursor e via de biogênese. Os miRNAs (21-24 nucleotídeos) são derivados a 
partir dos transcritos de genes de miRNAs gerados pela RNA polimerase II, com 
emparelhamento de bases imperfeitas. Em contraste, siRNAs (23-30 nucleotídeos) são 
derivados de emparelhamento perfeitos de precursores de RNA de cadeia dupla (dsRNA, 
do inglês, double-stranded RNA), e requerem a atividade da enzima RNA polimerase 
RNA-dependente (KATIYAR-AGARWAL; JIN, 2010). 
Tanto miRNA quanto siRNA podem induzir PTGS (do inglês, Post-
Transcriptional Gene Silencing) por meio da clivagem ou inibição da tradução pelo 
complexo ribonucleoproteico de silenciamento denominado de RISC (do inglês, RNA-
induced Silencing Complex), todo complexo RISC possui um membro da família de 
proteínas chamadas Argonauta, que possui como características marcantes um domínio 
de ligação ao RNA e um domínio de atividade nuclease (CARMELL et al., 2002), além 
de diversas ribonucleoproteínas, Dicer, proteína TRBP (do inglês, three double-stranded 
RNA-binding domains proteins). Nesse complexo, uma das fitas do dsRNA é eliminada 
e a fita remanescente guia o reconhecimento para a degradação (ou inibição) da sequência 
específica do RNA mensageiro complementar (MARTINEZ et al., 2002). 
A figura 8 resume os três principais tipos de resistência contra vírus: 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
38 
 
FIGURA 8- Representação esquemática dos principais tipos de resistência contra vírus 
de plantas. (A) A resistência dominante baseia-se na interação entre um fator de virulência 
e um produto do gene R específico, e é eficaz vários dias após a entrada do vírus na planta. 
O fenômeno associado a HR restringe o patógeno nas células infectadas e vizinhas. (B) 
Resistênciarecessiva, que corresponde a ausência de fatores do hospedeiro que são 
necessários para a replicação viral é uma resistência não-induzível, passiva e eficaz ao 
longo da colonização da planta. (C) O RNA de interferência (RNAi) tem como alvo os 
ácidos nucleicos virais. Uma vez configurado, após alguns dias, a eficácia deste 
mecanismo de defesa aumenta e se espalha por toda a planta. 
 
Fonte: NICAISE, 2014. 
 
1.4 Estresses combinados 
 
Como já relatado, na natureza as plantas são constantemente expostas a estresses 
bióticos e abióticos que podem ocorrer isoladamente ou de forma combinada. As 
respostas das plantas a estresses combinados são muito complexas e muitos estudos vem 
39 
 
sendo realizados na busca de genes e proteínas que sejam comuns ou específicos a 
determinados estresses (FUJITA et al., 2006; MANTRIA et al., 2010; XU E HUANG, 
2012; ATKINSON et al., 2013; RASMUSSEN et al., 2013; BADOWIEC E WEIDNER, 
2014; SERGEANT et al., 2014), a fim de compreender a tolerância das plantas a estresses 
combinados. 
Uma das principais respostas de adaptação a condição de combinados estresses 
é a modulação da expressão gênica, que possui a especificidade de sua resposta controlada 
por uma série de vias regulatórias que envolvem fatores de transcrição, EROS, fatores de 
choque térmico e pequenos RNAs que podem interagir uns com os outros (ATKINSON; 
URWIN, 2012). Essas respostas podem ser muito diferentes de quando a planta é 
desafiada pelos mesmos estresses impostos isoladamente. Às vezes, as exposições das 
plantas à combinação dos estresses podem requerer respostas agonísticas ou 
antagonísticas ou, até mesmo, respostas não relacionadas com nenhum dos estresses 
simples (RASMUSSEM et al., 2013). 
Plantas toleram dois ou mais estresses quando ocorrem independentes, mas, não 
necessariamente, toleram esses estresses quando ocorrem simultaneamente (NOSTAR et 
al., 2013; RAMEGOWDA E SENTHIL-KUMAR, 2015). Tamareira quando exposta à 
seca apresentou mais sintomas quando infectado, simultaneamente, com os fungos 
Chalara paradoxa e Chalara radicícola (SULEMAN et al., 2001). Além disso, em tabaco 
(Nicotiana tabacum) e pimenta (Capsicum annuum) quando expostos a altas temperaturas 
suprimiram a resistência ao Tobacco mosaic vírus (TMV) e Tomato spotted wilt vírus 
(TSWV), respectivamente (KIRÁLY et al., 2008; MOURY et al., 1998). Contrariamente, 
estresses abióticos podem conferir resistência a certos patógenos. Wiese et al. (2004) 
mostraram que o estresse salino aumentou a resistência de cevada (Hordeum vulgare) ao 
fungo Blumeria graminis em concentrações dose dependente. 
Apesar de recentes estudos estarem focando na resposta de plantas a estresses 
combinados, a maior parte da pesquisa, em plantas, ainda se baseia na resposta individual 
aos estresses, mostrando a importância de trabalhos com esse enfoque. 
 
 
 
 
 
40 
 
2 HIPÓTESE 
 
O feijão-de-corda (Vigna unguiculata) genótipo BRS-Marataoã, tolerante ao estresse 
salino e resistente ao CPSMV, responde ativamente a esses estresses (individualmente ou 
simultaneamente expostos) por meio de reprogramação gênica que leva a alterações no 
perfil proteômico. Entretanto, as respostas da planta aos estresses individuais são 
diferentes de quando os estresses são simultaneamente impostos e, esta segunda condição, 
afeta a tolerância da planta ao CPSMV. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
41 
 
3 OBJETIVOS 
 
3.1 Objetivo geral 
 
Estudar as respostas fisiológicas e bioquímicas/moleculares do feijão-de-corda (Vigna 
unguiculata, genótipo BRS-Marataoã) quando individualmente ou simultaneamente 
submetido ao estresse salino e infecção pelo CPSMV. 
 
3.2 Objetivos específicos 
 
· Avaliar parâmetros fisiológicos referentes à fotossíntese, conteúdo de clorofila e 
carotenoides nas folhas de feijão-de-corda, genótipo BRS-Marataoã, submetidas ao 
estresse salino e/ou infectadas com o CPSMV (inoculado simultaneamente ou 24 horas 
após o estresse salino); 
· Detectar a presença do CPSMV nas folhas de plantas de feijão-de-corda, genótipo BRS-
Marataoã, submetidas ao estresse salino e/ou infectadas com o CPSMV (inoculado 
simultaneamente ou 24 horas após o estresse salino), via RT-PCR; 
· Determinar a cinética enzimática de proteínas antioxidantes (superóxido dismutase, 
catalase, ascorbato peroxidase e guaiacol peroxidase) e PR-proteínas (glucanase e 
quitinase) em folhas de feijão-de-corda, genótipo BRS-Marataoã, submetidas ao estresse 
salino e/ou infectadas com o CPSMV (inoculado simultaneamente ou 24 horas após o 
estresse salino); 
· Verificar o acúmulo de peróxido de hidrogênio em folhas de feijão-de-corda, genótipo 
BRS-Marataoã, submetidas ao estresse salino e/ou infectadas com o CPSMV (inoculado 
simultaneamente ou 24 horas após o estresse salino); 
· Extrair proteínas de folhas de feijão-de-corda, genótipo BRS-Marataoã, submetidas ao 
estresse salino e/ou infectadas com o CPSMV, e obter, por espectrometria de massas 
(nano LC-MS/MS), perfis com boa reprodutibilidade entre as repetições técnicas e 
biológicas; 
· Analisar os perfis espectrométricos obtidos de proteínas de folhas de feijão-de-corda, 
genótipo BRS-Marataoã; 
· Identificar, classificar e categorizar as proteínas diferencialmente acumuladas em folhas 
de feijão-de-corda, genótipo BRS-Marataoã. 
42 
 
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