2021-dis-jmsalves

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UNIVERSIDADE FEDERAL DO CEARÁ 
FACULDADE DE FARMÁCIA, ODONTOLOGIA E ENFERMAGEM 
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM ODONTOLOGIA 
 
 
 
JOANA MARIA DOS SANTOS ALVES 
 
 
 
AVALIAÇÃO DAS ALTERAÇÕES COMPORTAMENTAIS E NOCICEPTIVAS EM 
UM MODELO EXPERIMENTAL DE CARCINOGÊNESE ORAL EM RATOS 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
FORTALEZA 
2021 
 
 
JOANA MARIA DOS SANTOS ALVES 
 
 
 
 
AVALIAÇÃO DAS ALTERAÇÕES COMPORTAMENTAIS E NOCICEPTIVAS EM UM 
MODELO EXPERIMENTAL DE CARCINOGÊNESE ORAL EM RATOS 
 
 
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-
Graduação em Odontologia da Universidade 
Federal do Ceará, como pré-requisito para 
obtenção de título de mestre em Odontologia. 
Área de concentração: Morfologia Oral. 
 
Orientadora: Profª Drª Delane Viana Gondim 
Co-orientadora: Profª Drª Karuza Maria Alves 
Pereira. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
FORTALEZA 
2021 
 
 
 
 
 
 
 
 
JOANA MARIA DOS SANTOS ALVES 
 
 
AVALIAÇÃO DAS ALTERAÇÕES COMPORTAMENTAIS E NOCICEPTIVAS EM UM 
MODELO EXPERIMENTAL DE CARCINOGÊNESE ORAL EM RATOS 
 
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-
Graduação em Odontologia da Universidade 
Federal do Ceará, como pré-requisito para 
obtenção de título de mestre em Odontologia. 
Área de concentração: Morfologia Oral. 
Orientadora: Profª Drª Delane Viana Gondim 
Co-orientadora: Profª Drª Karuza Maria Alves 
Pereira. 
 
 
Aprovada em:__________ 
 
BANCA EXAMINADORA 
 
__________________________________________ 
Profª. Drª. Delane Viana Gondim (Orientadora) 
Universidade Federal do Ceará (UFC) 
 
__________________________________________ 
Prof. Dr. Roberto César Pereira Lima Júnior 
Universidade Federal do Ceará (UFC) 
 
__________________________________________ 
Prof. Dr. Mario Roberto Pontes Lisboa 
Centro Universitário Christus (UNICHRISTUS) 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
À Deus. 
 À minha família. 
 
 
AGRADECIMENTOS 
Agradeço, primeiramente, a Deus, que sempre guia meus passos para o melhor caminho, 
mesmo que minha mente pequena não compreenda o caminho. Ele opera por meio das pessoas 
e, sem dúvida, por meio da minha família amada (José Ivanisleno, Ana Cristina e Ana Beatriz), 
à qual agradeço de todo coração pelo suporte, compreensão e força, tanto nos momentos felizes, 
quantos nos tristes. 
Além dessas pessoas maravilhosas, demonstro aqui minha gratidão à minha professora 
orientadora Delane Gondim, que além de me proporcionar a oportunidade de progredir no meio 
acadêmico, me guiou e auxiliou nessa jornada, com todo o carinho. 
Agradeço também a imensa ajuda de todos do Laboratório de Farmacologia da 
Inflamação e do Câncer (LAFICA) e do Núcleo de Estudo e Pesquisa em Dor, Inflamação e 
Osteoimunologia (NEPDIO), em especial ao Khalil Viana e ao Prof. Roberto César, dos quais 
a ajuda foi imprescindível para a realização desse estudo. Me sinto profundamente grata pela 
colaboração dos alunos de pós-graduação Anamaria Falcão, Rafael Santana, Carolina 
Figueiredo, Luane Macêdo, Bruno Wesley, Diego Bernarde e de graduação Igor Rocha, Letícia 
Barbosa e Thays Allane. 
Agradeço, também, às Professoras Mariana Vale e Karuza Maria, que contribuíram 
imensamente para essa pesquisa e se fizeram presentes desde os esboços primitivos desta. 
Ademais, agradeço a todos aqueles que auxiliaram, compreenderam e participaram dessa minha 
jornada desde o início. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
RESUMO 
O principal modelo experimental para o estudo do carcinoma de células escamosas oral (CCEO) 
é baseado na diluição do óxido de 4-nitroquinolina (4-NQO) na água de beber dos animais, 
provocando principalmente lesões em língua, entretanto há escassez de estudos voltados para a 
compreensão das alterações que ocorrem ao longo da via trigeminal que contribuem para o 
desenvolvimento da dor no câncer oral. Esse trabalho investigou as alterações nociceptivas e 
histopatológicas envolvidas na progressão da carcinogênese por 4- NQO em um modelo 
modificado, visando maior controle da dose e biossegurança. Para isso, foram utilizados 40 
ratos wistar (100-150g), divididos em grupo controle (C; n=8) e grupos que receberam 4-NQO 
(n=8 cada) por 8,12,16 ou 20 semanas, (T8, T12, T16 e T20, respectivamente). Visando à maior 
segurança no ambiente do biotério e à garantia do recebimento da droga de maneira igualitária 
entre os animais, a administração dessa substância foi realizada por gotejamento tópico (2x/dia) 
da suspensão de 4-NQO (0,6 mg/aplicação) em propilenoglicol. Foram avaliados hiperalgesia 
mecânica, avaliação das expressões faciais e teste de campo aberto, para análise de ansiedade e 
depressão. Após a eutanásia, as línguas dos animais foram removidas para análise macro e 
microscópica. Também foram removidos o gânglio trigeminal e região do subnúcleo caudal do 
trato espinhal do trigêmeo para análise por imunofluorescência para c-FOS. Durante o 
desenvolvimento do modelo experimental, foi observado através das análises histopatológicas 
que o grupo T20 apresentou 50% das amostras com CCE em língua, sendo então o melhor 
tempo para obtenção de lesões cancerosas. Nos demais grupos, foram observadas lesões 
potencialmente malignas, desde hiperceratoses a carcinomas, apresentando alterações epiteliais 
progressivas ao longo do protocolo experimental. Vale ainda ressaltar que esse modelo não 
provocou perdas amostrais ou prejuízos nos ganhos ponderais ao longo do tempo. Na análise 
da hiperalgesia mecânica, pôde ser observado alteração dos limiares nociceptivos ao longo do 
protocolo experimental, no qual, nas suas primeiras 2 semanas, houve redução significativa 
(p<0,001), seguido de períodos intercalados de retorno do limiar aos níveis basais com 
subsequente redução significativa do limiar nociceptivo a partir da 12ª semana até o fim do 
protocolo experimental (p<0,01). Foram observados aumento dos escores para expressões 
faciais somente no T20 (p<0,05) e aumento significativo do grooming e da atividade horizontal 
no tempo de 8 semanas. Em gânglio trigeminal, houve uma redução significativa da 
imunoexpressão de c-FOS em T12 quando comparado ao T8 (p<0,05), bem como um aumento 
dessa expressão no T20 quando comparado aos grupos C (p<0,05) e T12 (p<0,001). Na análise 
da região do subnúcleo caudal, foi observado aumento significativo dessa imunoexpressão nos 
grupos T16 e T20, quando comparados ao C(p<0,05). Desse modo, concluímos que a 
modificação do modelo foi capaz de induzir lesões potencialmente malignas e CCE em língua. 
O processo de desenvolvimento dessas lesões é acompanhado de alterações comportamentais e 
do limiar nociceptivo com aumento da expressão de c-FOS a nível periférico e central, em 
tempos maiores de exposição ao carcinógeno. 
 
Palavras-chave: carcinoma de células escamosas, neoplasias bucais, dor, nervo trigêmeo 
 
 
 
ABSTRACT 
The main experimental model for the study of oral squamous cell carcinoma (OSCC) is based 
on the dilution of the 4-nitroquinoline oxide (4-NQO) in the drinking water of the animals, 
causing lesions specially in the tongue, however there is a lack of studies focused on the changes 
that occur along the trigeminal pathway that contribute to the development of pain in oral 
cancer. This work investigated the nociceptive and morphological changes involved in the 
progression of carcinogenesis by 4-NQO in a modified model. For this, 40 wistar rats (100-
150g) were used, divided into a control group (C; n = 8) and groups that received 4-NQO (n = 
8 each) for 8,12,16 or 20 weeks, (T8, T12, T16 and T20, respectively). Aiming at greater safety 
in the vivarium environment and guaranteeing the receipt of the drug equally among the 
animals, the administration of this substance was performed by topical drip (2x / day) of the 4-
NQO suspension (0.6 mg / day) in propylene glycol. Mechanical hyperalgesia, assessmentof 
facial expressions and open field test were performed to analyze anxiety and depression. After 
euthanasia, the animals' tongues were removed for macro and microscopic analysis. The 
trigeminal ganglion and region of the subnucleus caudalis of the trigeminal spinal tract were 
also removed for analysis by immunofluorescence for c-FOS. During the development of the 
experimental model, it was observed through histopathological analyzes that the T20 group 
presented 50% of the samples with tongue SCC, thus being the best time to obtain cancerous 
lesions. In the other groups, potentially malignant lesions were observed, ranging from 
hyperkeratosis to carcinomas in situ, with progressive epithelial changes throughout the 
experimental protocol. It is also worth mentioning that this model did not cause sample losses 
or losses in weight gains over time. In the analysis of mechanical hyperalgesia, changes in 
nociceptive thresholds could be observed throughout the experimental protocol, in which, in its 
first 2 weeks, there was a significant reduction (p<0.001), followed by interspersed periods of 
threshold return to baseline levels with subsequent significant reduction in the nociceptive 
threshold from the 12th week until the end of the experimental protocol (p<0.01). An increase 
in scores for facial expressions was observed only at T20 (p<0.05) and a significant increase in 
grooming and horizontal activity at 8 weeks. In trigeminal ganglion, there was a significant 
reduction in c-FOS immunoexpression at T12 when compared to T8 (p<0.05), as well as an 
increase in this expression at T20 compared to groups C (p<0.05) and T12 (p<0.001). In the 
analysis of the caudal subnucleus region, a significant increase in this immunoexpression was 
observed in groups T16 and T20, when compared to C (p<0.05). Thus, we concluded that the 
modification of the model was able to induce potentially malignant lesions and OSCC in the 
tongue. The development process of these lesions is accompanied by behavioral and 
nociceptive threshold changes, with increased expression of c-FOS at the peripheral and central 
levels, in longer times of exposure to the carcinogen. 
 
 
Keywords: squamous cell carcinoma, pain, trigeminal nerve 
 
 
 
 
 
LISTA DE FIGURAS 
Figura 1 - Projeção das fibras aferentes primárias nociceptivas em Sp5C. ......................... 17 
Figura 2 - Esquema simplificado da via trigeminal a nível central ..................................... 18 
Figura 3 - Análise macroscópica da língua de ratos exposto à carcinogênese induzida por 
4-NQO ................................................................................................................. 34 
Figura 4 - Alterações epiteliais observadas na língua de ratos expostos à carcinogênese 
induzida por 4-NQO ............................................................................................ 36 
Figura 5 - Fotomicrografia representativas da imunoexpressão de c-FOS em Gânglio 
Trigeminal de ratos submetidos à carcinogênese induzida por 4-NQO .............. 38 
Figura 6 - Fotomicrografia representativa da imunoexpressão de c-FOS em Subnúcleo 
Caudal do Trato Espinhal do nervo trigêmeo de ratos submetidos à 
carcinogênese induzida por 4-NQO .................................................................... 40 
Figura 7 - Fotomicrografias representativas da imunoexpressão de c-FOS em céulas não 
neuronais do subnúcleo caudal do trato espinhal do nervo trigêmeo de ratos 
submetidos à carcinogênese induzida por 4-NQO .............................................. 42 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
LISTA DE GRÁFICOS 
Gráfico 1 - Hiperalgesia mecânica na região de vibrissa de ratos ao longo de 20 semanas de 
indução à carcinogênese com 4-NQO. ................................................................ 30 
Gráfico 2 - Hiperalgesia mecânica na região de vibrissa de ratos induzidos à carcinogênese 
experimental por 4-NQO ..................................................................................... 30 
Gráfico 3 - Análise de grooming sob o teste de campo aberto em ratos induzidos à 
carcinogênese experimental por 4-NQO ............................................................. 31 
Gráfico 4 - Análise da atividade horizontal no teste de campo abertos de ratos induzidos à 
carcinogênese experimental por 4-NQO ............................................................. 32 
Gráfico 5 - Análise da atividade vertical no teste de campo abertos de ratos induzidos à 
carcinogênese experimental por 4-NQO ............................................................. 32 
Gráfico 6 - Análise ponderal de ratos induzidos à carcinogênese experimental por 4-NQO . 33 
Gráfico 7 - Quantificação da área imunofluorescente da expressão de c-Fos em gânglio 
trigeminal de ratos submetidos à carcinogênese experimental por 4-NQO ........ 39 
Gráfico 8 - Quantificação da área imunofluorescente de c-FOS em Subnúcleo Caudal do 
Trato Espinhal do Trigêmeo de ratos submetidos à carcinogênese induzida por 4-
NQO .................................................................................................................... 41 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
LISTA DE TABELAS 
 
Tabela 1 - Análise das expressões faciais em ratos induzidos à carcinogênese experimental 
por 4-NQO ........................................................................................................... 33 
Tabela 2 - Análise macroscópica das lesões observadas por grupo exposto à carcinogênese 
induzida por 4-NQO ............................................................................................ 34 
Tabela 3 - Frequência de lesões observadas por grupo exposto à carcinogênese induzida por 
4-NQO ................................................................................................................. 37 
 
 
 
 
 
 
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS 
4-NQO Óxido De 4-Nitroquinolina 
ANOVA Análise De Variância 
ATP Adenosina Trifosfato 
CCE Carcinoma De Células Escamosas 
CCEO Carcinoma De Células Escamosas Oral 
CCP Câncer De Cabeça E Pescoço 
CEUA Comitê De Ética Em Uso Animal 
DL Displasia Leva 
DM Displasia Moderada 
DNA Ácido Desoxirribonucleico 
DS Displasia Severa 
EBV Vírus Epstein-Barr 
HC Hiperceratose 
HPV Papilomavírus Humano 
IL-18 Interleucina 18 
IL-1 Interleucina 1 Beta 
IL-6 Interleucina 6 
LAFICA Laboratório de Farmacologia da Inflamação e do Câncer 
LPM Lesões Potencialmente Malignas 
NEPDIO Núcleo de Estudo e Pesquisa em Dor, Inflamação e Osteoimunologia 
NEUN Neuronal Nuclei 
NGF Fator De Crescimento Nervoso 
PAG Substância Cinzenta Periaquedutal 
PBN Núcleo Parabraquial 
PFA Paraformaldeído 
Sp5C Subnúcleo Caudal Do Trato Espinhal Do Trigêmeo 
TNF- Fator De Necrose Tumoral Alfa 
TRPV1 Receptores De Potencial Transitório Vaniloide 1 
TRPV2 Receptores De Potencial Transitório Vaniloide 2 
 
 
TTT Trato Trigêmino Talâmico 
UFC Universidade Federal Do Ceará 
VPM Núcleo Ventro Póstero Medial Do Tálamo 
 
 
 
SUMÁRIO 
 
 
 
1. INTRODUÇÃO ............................................................................................................. 9 
1.1. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA ................................................................................... 11 
1.1.1. O câncer de cabeça e pescoço ...................................................................................... 11 
1.1.2. O Carcinoma de Células Escamosas Oral ................................................................... 12 
1.1.3. Lesões Potencialmente Malignas ................................................................................. 14 
1.1.4. A dor no Carcinoma de Células Escamosas Oral ....................................................... 15 
1.1.5. Via nociceptiva trigeminal ............................................................................................17 
1.1.6. Modelos experimentais de Carcinoma de Células Escamosas ................................... 19 
2. JUSTIFICATIVA ........................................................................................................ 21 
3. OBJETIVOS ................................................................................................................ 22 
3.1 Objetivo Geral .................................................................................................................. 22 
3.2 Objetivos Específicos ........................................................................................................ 22 
4. MATERIAIS E MÉTODOS ....................................................................................... 23 
4.1 Animais .............................................................................................................................. 23 
4.2 Grupos experimentais ...................................................................................................... 23 
4.3 Indução de câncer oral ..................................................................................................... 24 
4.4 Hiperalgesia mecânica ...................................................................................................... 24 
4.5 Teste em campo aberto .................................................................................................... 25 
4.6 Avaliação das expressões faciais ...................................................................................... 25 
4.7 Avaliação ponderal ........................................................................................................... 25 
4.8 Análise Macroscópica ....................................................................................................... 26 
4.9 Análise histopatológica ..................................................................................................... 26 
4.10 Análise por imunofluorescência .................................................................................... 26 
4.11 Análise Estatística ............................................................................................................ 27 
5. RESULTADOS ............................................................................................................ 29 
 
 
5.1. Hiperalgesia mecânica ................................................................................................. 29 
5.2 Teste de campo aberto ...................................................................................................... 31 
5.3. Análise das expressões faciais ..................................................................................... 32 
5.4. Análise ponderal .......................................................................................................... 33 
5.5. Análise macroscópica da língua ..................................................................................... 34 
5.6. Análise histopatológica .................................................................................................... 35 
5.7 Análise por imunofluorescência de c-FOS no Gânglio Trigeminal ............................. 37 
5.8 Análise por imunofluorescência de c-FOS no Subnúcleo Caudal do Trato Espinhal 
do Trigêmeo .......................................................................................................... 39 
6. DISCUSSÃO ................................................................................................................ 43 
7. CONCLUSÃO .............................................................................................................. 51 
8. REFERÊNCIAS .......................................................................................................... 52 
9. ANEXO ......................................................................................................................... 59 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
9 
 
1. INTRODUÇÃO 
 
O câncer de cabeça e pescoço (CCP) ocupa a 7ª posição em prevalência mundial e 
é responsável por 3% dos cânceres, afetando cavidade oral, orofaringe, hipofaringe e 
nasofaringe, bem como seios paranasais e região labial (CHOW, 2020; MARUR et al., 2016). 
Devido a essa pletora de sítios acometidos, o fenótipo das lesões e o seu comportamento são 
variados, promovendo, assim, diferentes prognósticos. 
O CCP pode, por si só ou associado ao tratamento, causar múltiplas desordens 
sensitivas, estéticas, funcionais e psicológicas, apresentando indicadores negativos quanto à 
prognose e qualidade de vida (CHOW, 2020) Somam-se a isso os altos índices de mortalidade, 
que se mostraram pouco alterados nas últimas décadas, o que leva o CCP a ser responsável por 
cerca de 1,5% de todas às mortes oriundas de neoplasias malignas no mundo (CHOW, 2020). 
Cerca de 90% desse tipo de câncer são CCE de orofaringe e da cavidade oral, que, 
inerentemente, possuem taxas de sobrevivência após 5 anos de apenas 50% (THOMSON et al., 
2018). O CCE é historicamente associado a maiores frequências e mortalidade no sexo 
masculino, acima de 50 anos e fumantes. Entretanto, essas características vêm sendo alteradas 
devido à redução do consumo de tabaco e seus derivados, resultado das fortes campanhas de 
conscientização mundial do risco do uso desses produtos, gerando redução da incidência de 
lesões associadas a esse fator. 
Conjuntamente, o Papilomavírus Humano (HPV) constitui fator etiológico de 
crescente relevância nas últimas décadas, emergindo como o principal agente causador de CCE 
em jovens do sexo feminino (NG et al., 2016). As lesões malignas HPV-positivas tendem a 
surgir após um período de latência de 10 a 30 anos após à exposição e apresentam melhores 
prognósticos e respostas positivas à quimioterapia e à radioterapia quando comparadas aos 
cânceres negativos para HPV e associados ao consumo de tabaco e álcool (CHATURVERDI 
et al., 2011; CHOW, 2020; MARUR et al., 2016). 
Apesar desse perfil mais responsivo, há uma forte tendência de aumento da 
incidência desse tipo de lesão na população mais jovem. Isso faz com que, atualmente, o CCP 
ainda se mantenha no rol dos 10 cânceres mais comuns mundialmente e que previsões indiquem 
redução estatisticamente significativa na sua incidência apenas em 2060 (GILLISON et al., 
2015). 
Além dos fatores etiológicos, a localização anatômica do CCE o torna um sério 
agravo à saúde dos indivíduos afetados. O CCE oral pode se situar em língua, soalho bucal, 
10 
 
mucosa oral, superfície alveolar e palato duro. A região mais acometida é a língua, 
apresentando-se como o pior sítio em termos de prognóstico (NG et al., 2016). Fatores 
intrínsecos a esse sítio, como o prolongamento da fase celular de síntese de DNA do epitélio de 
revestimento, podem estar relacionados ao seu maior acometimento pelo carcinoma 
(THOMSON et al., 2018). A transformação maligna decorre da associação de múltiplos fatores 
genéticos e epigenéticos, como a perda de mecanismos de regulação do ciclo celular e mutações 
cromossômicas, que levam à progressão da doença, desde lesões potencialmente malignas 
(LPM) até CCE oral pobremente diferenciado (THOMSON et al., 2018). 
Nesse cenário, o diagnóstico e o acompanhamento das LPM tornam-se cruciais ao 
combate ao CCE oral. Essas lesões são geralmente assintomáticas, assim como as neoplasias 
malignas nos estágios iniciais, mas já podem trazer consigo as alterações nucleares necessárias 
para o desenvolvimento do câncer (BUGSHAN et al., 2020). Dessa forma, sinais, sintomas e 
alterações locais que indiquem essa transformação de LPM em carcinoma tornam-se 
fundamentais para a tomada de decisão frente a essas lesões. Nesse contexto, a sintomatologia 
dolorosa surge como um forte indicador de prognóstico da doença, sendo vinculada a piores 
índices de sobrevida (YE et al., 2011). 
Isso ocorre devido ao fato de que a sua progressão e o desencadeamentoda dor 
sejam processos concomitantes e interrelacionados: o microambiente do câncer produz 
citocinas pró-inflamatórias, metaloproteinases de matriz e fatores de crescimento, que, em 
geral, também estimulam a ativação das fibras aferentes primárias, gerando nocicepção à 
medida que a doença avança (VIET & SCHIMIDT, 2012). Consequentemente, com a 
progressão do CCE oral, a dor torna-se o sintoma mais debilitante associado, intensificando a 
debilidade e a perda da qualidade de vida dos indivíduos afetados (SHEFF et al., 2017). 
Para o estudo do CCE, modelos baseados na administração de carcinógenos são 
intensamente relatados na literatura, sendo o óxido de 4-nitroquinolina (4-NQO) o mais 
utilizado. Ele simula as alterações moleculares causadas agentes derivados do tabaco, causando 
modificações genéticas e epigenéticas suficientes para o desencadeamento de LPM e CCE e 
suas sintomatologias associadas a depender da dose e do tempo de exposição. Nesse contexto, 
diferentes métodos de diluição e de aplicação foram desenvolvidos, sendo a oferta dessa 
substância através da sua mistura na água de beber dos animais a mais relatada (NAKAHARA 
et al., 1957; ISHIDA, 2017). 
Dessa forma, modificações nos métodos de disponibilização do 4-NQO que 
proporcionem maior eficácia, previsibilidade de resultados e segurança no ambiente 
experimental são válidas para a investigação dessa doença e de seus sintomas associados. 
11 
 
Assim, a compreensão dos mecanismos envolvidos na dor no CCE oral através de 
uma modificação do modelo clássico de indução através do 4-NQO poderia auxiliar não só a 
criação de novos manejos terapêuticos eficazes, mas também o desenvolvimento de novos 
indicadores de progressão da tumorigênese baseados nas alterações nociceptivas e morfológicas 
ao longo da via trigeminal provocadas pelo câncer. 
 
1.1. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA 
 
1.1.1. O câncer de cabeça e pescoço 
 
O CCP afeta principalmente cavidade oral, orofaringe, hipofaringe e laringe 
(KAWAKITA & MATSUO, 2017), correspondendo cerca de 10% das malignidades no sexo 
masculino, apresentando maior gravidade e mortalidade nesse grupo quando comparado ao 
sexo feminino, que apresenta 4% de acometimento (BRESSAN et al., 2016). Em 2018, ele 
correspondeu a mais de 700 000 novos casos relatados e mais de 350 000 mortes em ambos os 
sexos, ficando em 7º e 9º lugar quanto à incidência e à mortalidade mundial, respectivamente 
(FERLAY et al., 2019). 
No Brasil, mais de 19 mil novos casos desse tipo de comorbidade foram 
diagnosticados em 2020, tornando-o o 8º tipo de malignidade mais comum (SUNG et al., 2021). 
Os indivíduos mais afetados em nosso país são os do sexo masculino, apresentando também 
maior gravidade e mortalidade (FERLAY et al., 2019). Nesse contexto, surge, alinhado às 
tendências globais, o aumento dos cânceres de orofaringe associados à infecção pelo HPV, o 
que pode indicar uma tendência de aumento do número de casos e um ponto chave de discussão 
no âmbito da saúde pública (FONSECA et al., 2018). 
Além do HPV, historicamente o CCP está associado a outros fatores etiológicos, 
como o consumo de derivados do tabaco e álcool. Tais elementos/agentes atuam de maneira 
semelhante, ocasionando dano ao DNA e inibição dos seus mecanismos de síntese e de reparo, 
bem como metilação de proteínas e estresse oxidativo (KAEAKITA & MATSUO, 2017). Tais 
alterações comprometem a regulação do ciclo celular, promovendo proliferação exacerbada, 
perda da arquitetura tecidual, bem como de sua função e da diferenciação celular, com 
consequente invasão aos tecidos adjacentes (THOMSON, 2018). 
Ademais, o CCP abrange uma região que possui grande variedade de tecidos 
especializados, podendo apresentar-se, consequentemente, de variadas formas e apresentar 
diferentes comportamentos, a depender do tecido afetado (ANDREASEN et al., 2018; COHEN 
12 
 
et al., 2018). A proximidade com estruturas nobres e de alto valor estético e funcional leva a 
grandes perdas funcionais e deformidades, o que, associado às manobras terapêuticas agressivas 
necessárias, pode provocar desordens de cunho psicológico, como depressão (SIMCOCK et al., 
2016). 
As taxas de sobrevivência após 5 anos são de 35% a 45% e as de recorrência altas, 
com cerca de 50% dos pacientes apresentando nova malignidade na região, tornando, assim, o 
cenário desfavorável, apesar dos avanços científicos (HORTON et al., 2019). Esse prognóstico 
negativo conferido ao CCP é resultado do perfil do principal tipo de lesão dessa categoria: o 
CCE oral. 
 
1.1.2. O Carcinoma de Células Escamosas Oral 
 
Cerca de 90% dos CCP são CCE, apesar da variedade significativa de tecidos da 
região da cabeça e do pescoço (KAJÆR et al., 2021). Em relação à prevalência do CCE oral, 
ela varia a depender do país e dos seus índices de desenvolvimento humano e de 
industrialização (BUGSHAM et al., 2020). Apesar de países desenvolvidos também 
apresentarem incidência alta, são os em desenvolvimento, como China e Índia, que lideram o 
ranking de maior ocorrência desse tipo de câncer mundialmente (SUNG et al., 2021). 
Assim, o continente asiático surpassa o continente europeu, Austrália e América do 
Norte nesse quesito. Vale ainda pontuar, que, quanto à mortalidade, o continente africano 
também se apresenta entre os primeiros colocados, com 2,2 mortes a cada 100 mil habitantes 
somente no sudeste africano no ano de 2020 (SUNG et al., 2021). Isso seria provavelmente 
relacionado a fatores socioeconômicos, como renda e grau de instrução, existindo fortes 
indícios de associação com a privação social (MARTINS et al., 2014). 
Vale ainda ressaltar que o perfil epidemiológico desse agravo vem mudando nas 
últimas décadas, o que se torna evidente, por exemplo, com a sua queda da 6ª (HORTON et al., 
2019) para 7ª posição entre cânceres de maior ocorrência mundial em 2020 (SUNG et al., 2020; 
EL-BAYOUMY et al., 2021). 
Além disso, houve alterações quanto aos grupos mais afetados: enquanto 
tradicionalmente o CCE oral era relacionado a indivíduos do sexo masculino a partir dos 50 
anos, nos últimos anos, um número crescente de jovens do sexo feminino vem sendo acometido 
(EL-BAYOUMY et al., 2021). Isso se deve a diversos fatores, como mudança dos fatores 
etiológicos mais frequentemente associados à doença e da eficácia crescente de métodos de 
13 
 
combate a eles (EL-BAYOUMY et al., 2021; AMÔR et al., 2021; COMBALIA & CARRERA, 
2020). 
No que se refere à etiologia da doença, é importante salientar seu aspecto 
multifatorial, tendo como evento central a ocorrência de alterações genéticas e epigenéticas nas 
células epiteliais da camada basal (THOMSON et al., 2018). Esses danos são gerados de 
maneira endógena - quando processos corriqueiros de transcrição e replicação geram estresse 
genotóxico e comprometem a fidelidade das cópias de DNA geradas – ou exógena – quando 
fontes externas provocam tais agressões através da luz ultravioleta, radiação ionizante, espécies 
reativas de oxigênio, toxinas, agentes metilados ou aldeídos derivados de peroxidação (PSYRRI 
et al, 2021). 
Aliado a isso, os mecanismos de detecção e de reparo de danos celulares devem 
estar prejudicados, pois na normalidade tais modificações são detectadas nos pontos de 
checagem do ciclo celular, que podem levar à correção das sequências de bases, à paralização 
do ciclo celular, à remodelação da cromatina ou à apoptose (KASTAN & BARTEK, 2004; 
PSYRRI et al., 2021). 
O acúmulo de aberrações genômicas e a inércia dos mecanismos de reparo celular 
geram alterações, não somente a nível nuclear, mas também fenotípicas e funcionais. Dessa 
forma, tecidos que apresentam hiperplasia benigna podem evoluir para quadros displásicos, ao 
perder o controle sobre a proliferação celular, a apoptose e a diferenciação epitelial 
(THOMSON et al., 2018). 
O consumo de cigarros não só provoca as alterações supracitadas, como também a 
imunossupressãoe a inativação dos genes supressores tumorais (THOMSON et al., 2018). 
Aliado a isso, há o frequente consumo de álcool, que possui efeitos sinérgicos à 
carcinogenicidade do cigarro ao tornar o epitélio mais permeável, dissolvendo os seus 
componentes e promovendo a sua penetração de maneira mais efetiva (BUGSHAM et al., 
2020). 
Outros hábitos inerentes a algumas culturas também estão associados a essa 
enfermidade, podendo ser citados o costume de mascar fumo, consumir shammah, mastigar 
khat, areca ou betel quid, bem como fumar shisha (narguilé). Soma-se a presença de dietas 
pobres em frutas e vegetais, bem como a deficiência de substâncias quimioprotetoras, como: 
ferro, retinóis, glutationa, beta caroteno, vitamina C, e alguns flavonoides (BUGSHAM et al., 
2020; EL-BAYOUMY et al., 2021). 
Outrossim, pode-se acrescentar a esse rol de fatores etiológicos a microbiota. Como 
já fora citado, a infecção pelo HPV consiste em uma das principais causas para o câncer de 
14 
 
orofaringe, com as variantes 16 e 18 sendo as mais relatadas na literatura. No CCE oral, o papel 
desse vírus ainda é baixo se comparado com outros fatores, mas sabe-se que a sua atuação 
envolve, de maneira precisa, a degradação da proteína p53 e a desregulação do ciclo celular, 
apresentando tropismo pelas regiões de base de língua e orofaringe em modelos experimentais 
em murinos. Além do HPV, o oncovírus Epstein-Barr (EBV) também está associado ao CCE 
oral, apesar de não existir uma associação forte entre ambos (SARKAR et al., 2021; EL-
BAYOUMY et al., 2021). 
Dessa maneira, somando-se a tais alterações a susceptibilidade e os fatores 
genéticos inerentes de cada indivíduo o desenvolvimento do CCE oral geralmente inicia com o 
surgimento de LPM, que podem apresentar características compartilhadas com os carcinomas 
desde a sua formação, como as altas taxas de proliferação celular (THOMSON et al., 2018; 
BUGSHAN et al., 2020). 
 
1.1.3. Lesões Potencialmente Malignas 
 
As LPM compartilham uma variedade de alterações histopatológicas, podendo, em 
uma mesma lesão, apresentar diferentes graus de comprometimento tecidual. É importante 
salientar que elas surgem a partir de um processo de sucessivas modificações, sendo a primeira 
delas o surgimento de hiperplasia epitelial, seguida de displasias leve, moderada e severa, 
carcinoma in situ e, finalmente, de CCE oral (JOHNSON et al., 2021). 
Para a classificação dessas lesões, parâmetros arquiteturais e citológicos 
microscópicos são utilizados, como a perda de coesão celular, figuras de mitoses aumentadas e 
atípicas, anormalidades de tamanho e forma nucleares e celulares. Dependendo do grau de 
comprometimento em espessura do tecido, essas anormalidades podem caracterizar displasia 
leve - com menos de 1/3 do epitélio afetado -; displasia moderada – entre 1/3 e 2/3 -; ou displasia 
severa – maior que 2/3, mas não por completo. Quando são constatadas irregularidades em toda 
a espessura do epitélio sem invasão do tecido subjacente, tem-se o carcinoma in situ, e, 
consequentemente, é observado o carcinoma quando esta invasão é observada, que pode 
apresentar perda da diferenciação celular e, até metástase (MAYMONE et al., 2018). 
Em geral, tais lesões são assintomáticas, entretanto, estudos mostram que a sua 
transição para carcinoma pode vir acompanhada de alterações de sensibilidade e função, que se 
intensificam com o aumento da gravidade da doença (LAM & SCHMIDT, 2011). Em geral, ao 
serem diagnosticadas, as lesões cancerígenas já interferem nas funções de mastigação e 
fonação, causando dor ou disartria (JOHNSON et al., 2021). Além de a própria progressão do 
15 
 
CCE oral causar a intensificação do déficit funcional, o tratamento também contribui para isso, 
pois afeta o sistema sensorial estomatognático, devido a intervenções diretas aos tecidos orais, 
como em casos de ressecções cirúrgicas ou pela quimioterapia (DZIOBA et al., 2017; 
MAYMONE et al., 2018; EL-BAYOMMI et al., 2021). 
 
1.1.4. A dor no Carcinoma de Células Escamosas Oral 
 
A dor constitui uma das maiores preocupações dos pacientes com câncer, se 
fazendo presente em 75 a 90% dos casos no estágio terminal (CONNELLY & SCHMIDT, 
2004; GUERRERO et al., 2008). Essa sintomatologia pode se tornar excruciante e 
incontrolável, comprometendo as funções e qualidade da sobrevida dos indivíduos afetados. 
Vale ainda pontuar que, no que tange ao CCE oral, o índice de resistência a opioides e a 
prevalência de dor são maiores quando comparados aos de outros cânceres - como os de mama, 
pulmão e pâncreas-, o que torna a eficácia dos cuidados paliativos ainda mais prejudicada, 
podendo levar, inclusive, à caquexia (CONNELLY & SCHMIDT, 2004; SCHEFF et al., 2017; 
YE et al., 2011). Acredita-se que, nesse cenário, a dor poderia indicar prognósticos 
desfavoráveis em relação à sobrevivência, devido a correlação, apontada em diversos estudos, 
entre o grau de invasividade e a presença desse sintoma (HEUSSNER et al., 2021). 
Esse comprometimento não é exclusivo dos estágios avançados, pois estudos 
mostram que o tamanho do tumor não está relacionado à sua severidade e que lesões pequenas, 
em estágios iniciais, frequentemente apresentam essa sintomatologia associada (GUERRERO 
et al., 2008; SCHMIDT, 2015). Dessa maneira, é importante destacar que a dor pode ser oriunda 
do somatório de vários mecanismos celulares no microambiente do câncer. Ela pode ser 
classificada em somática, visceral e neuropática (GUERRERO et al., 2008). 
A dor do câncer apresenta inicialmente um componente somático gerado pela 
invasão nos tecidos subjacentes. Nesse contexto, a liberação de proteases - para a destruição da 
matriz adjacente - e de fatores neurotróficos, como o Fator de Crescimento Nervoso (NGF), 
podem desempenhar papéis centrais não só nos mecanismos da proliferação e invasão tumoral, 
mas também da dor (SCHMIDT, 2015; LAM & SCHMIDT, 2011; YE et al., 2011). 
Com a progressão da doença, esses fenômenos podem ser acompanhados de 
invasão perineural e compressão nervosa, levando à formação de edema, fragmentação, 
granulação, degeneração Walleriana e redução do calibre nervoso, modificando, assim o perfil 
dessa sintomatologia para o estabelecimento de dor neuropática e, dessa forma, desencadear 
alterações de sensibilidade (TANIGUCHI et al., 1995). Ademais, é importante pontuar que a 
16 
 
invasão perineural da lesão cancerosa provoca alterações nociceptivas, que podem ser tomadas 
como indicadores de progressão e prognóstico da doença (YE et al., 2011). 
Soma-se a isso a liberação de mediadores inflamatórios que sensibilizam as 
terminações nervosas adjacentes. Dentre eles destacam-se ATP, bradicininas, citocinas, 
quimiocinas, prostaglandinas, endotelina-1 e fator de crescimento vascular endotelial. Scheff et 
al. (2017) em modelo experimental de CCE oral em ratos com imunodeficiência observaram 
respostas comportamentais relacionadas a dor, mostrando assim que outros mecanismos devem 
contribuir para o estabelecimento e manutenção da dor no câncer. 
Estudos apontam que a dor neuropática prevalece no CCE oral (LAM & 
SCHMIDT, 2011; SALVO et al., 2020; SALWEY et al., 2020). A presença de sintomas 
sugestivos, como dor intratável, comprometimento funcional e dormência, podem indicar que 
os possíveis mecanismos envolvidos são neuropáticos (SALVO et al., 2020). Essa condição se 
dá a partir da sensibilização e alteração fenotípica periférica e central dos nervos, com 
modificação das propriedades da membrana neuronal e, consequentemente, da excitabilidade 
das fibras Aβ e C (XU et al., 2015). 
Estudos experimentais mostram que esse tipo de dor no câncer está relacionado à 
maior duração dos impulsos neuronais e a menores potenciais de ação dos mecanorreceptores, 
acompanhados da proliferação axonal no corno dorsal da medula (ZHU et al., 2018). A ativação 
de células da glia também é relatada na literatura associadaà redução dos limiares de dor e 
ativação de receptores de potencial transitório vaniloide 1 e 2 (TRPV1 e 2) no gânglio 
trigeminal em modelo experimental induzido pela inoculação de células de CCE (HIRONAKA 
et al., 2014). Como resultado desses mecanismos, tem-se a alodinia e a hiperalgesia mecânica, 
sendo esta última pouco responsiva a opioides (GUERRERO et al., 2008). 
Além disso, é importante salientar que estudos indicam que tais componentes 
nociceptivos se fazem presentes não só em estágios avançados, mas na progressão dessas 
neoplasias, desde a transição de LPM ao câncer, sendo esta transição anunciada pela presença 
da dor (LAM & SCHMIDT, 2011; SCHMIDT et al., 2015). Isso indica que, no carcinoma oral, 
as alterações sensitivas estão correlacionadas com a invasão do epitélio nos tecidos 
(CONNELLY & SCHMIDT, 2004; LAM & SCHMIDT, 2011). 
Quanto à sua manifestação, esses sintomas se mostram exacerbados durante a 
função e o componente espontâneo não é muito frequente nos CCE oral (LAM & SCHMIDT, 
2011). Logo, a busca pela maior compreensão desses mecanismos durante o processo de 
carcinogênese poderia auxiliar no estabelecimento de indicadores mais precisos de prognóstico 
e tratamento da dor e do câncer. 
17 
 
1.1.5. Via nociceptiva trigeminal 
 
A condução das informações dolorosas provenientes dos região oral é realizada 
através da via trigeminal. Impulsos aferentes desencadeados através da despolarização de fibras 
nervosas periféricas trigeminais , onde neurônios envolvidos nesse processo são denominados 
pseudounipolares, cujo corpo celular se localiza no gânglio trigeminal, realizando sua primeira 
sinapse no tronco encefálico, na região do subnúcleo caudal do trigêmeo (Sp5C) (GOELLNER 
& ROCHA, 2020). 
 A região Sp5C apresenta, ainda, uma distribuição em camadas, no sentido rostro-
caudal: as áreas periorais são projetadas nas porções mais rostrais do subnúcleo, enquanto 
regiões mais posteriores da face são representadas mais caudalmente. Dessa forma, a projeção 
da nocicepção da face é segmentada, de acordo com o modelo de “casca de cebola” (BONICA, 
1990; GOELLNER & ROCHA, 2020). 
 
Figura 1 - Projeção das fibras aferentes primárias nociceptivas em Sp5C. 
 
Fonte: BONICA, 1990. A: a figura representa a organização somatotópica rostrocaudal do Sp5C. B: a 
figura representa a relação do Sp5C com a entrada de fibras aferentes primárias. 
 
Em seguida, o impulso prossegue através do trato trigêmino-talâmico, TTT, (que 
também recebe inputs da porção sensorial dos nervos facial, glossofaríngeo e vago) até o núcleo 
ventro póstero medial (VPM) do tálamo, e ascende, através dos neurônios de 3ª ordem, ao 
córtex de discriminação sensorial. 
18 
 
Através da via medial do TTT, a informação também pode alcançar o tálamo e, 
consequentemente, os cortices insular e cingular, responsáveis pelas dimensões cognitivas, 
comportamentais e emocionais da dor. Além disso, fibras aferentes nociceptivas do núcleo 
caudal do trigêmeo estabelecem conexão direta com o núcleo parabraquial (PBN), que por sua 
vez se conecta com aa medula ventro lateral rostral e à substância cinzenta periaquedutal 
(PAG), de maneira descentente, o que sugere uma modulação da dor paralela à via aferente 
(GOELLNER & ROCHA, 2020). 
 
Figura 2 - Esquema simplificado da via trigeminal a nível central 
 
Fonte: internet. A figura representa o percurso das fibras aferentes oriundas do gânglio trigeminal ao 
núcleo do trato espinhal (1ª sinapse), ascensão ao tálamo ipsilateral ou contralateral pelo Trato 
Trigêmino Talâmico (2ª sinapse) e posterior encaminhamento ao córtex. Disponível em: 
http://depto.icb.ufmg.br/dmor/mof011/neuroanatomia.pdf 
 
http://depto.icb.ufmg.br/dmor/mof011/neuroanatomia.pdf
19 
 
1.1.6. Modelos experimentais de Carcinoma de Células Escamosas 
 
Dentre os modelos de indução experimental de CCE oral mais relatados na 
literatura, o uso do óxido de 4-nitroquinolina (4-NQO) se destaca Ele é um composto 
heterocíclico aromático derivado da quinolina e está da família de poderosos compostos 
carcinogênicos. Inicialmente foi investigado como um agente tumoricida em baixas 
concentrações, levando à morte, in vitro, de células de sarcoma. Entretanto, logo foi observado 
seu grande potencial carcinogênico em estudos com a aplicação tópica em pele de roedores, se 
mostrando mais efetivo que outras substâncias previamente utilizadas para tal fim, como o 
1,2:5,6-dibenzoantraceno e o 20-metilcolantreno (NAKAHARA et al., 1957). 
O seu primeiro uso na região oral foi relatado em 1965, com a sua diluição em 
propilenoglicol, a 0,25%, e pincelamento da região labial diário (NAKAHARA et al., 1957). 
Métodos semelhantes são relatados na literatura, com o seu uso em concentrações maiores, por 
exemplo. No entanto, é observada toxicidade sistêmica associada, com necrose lobular hepática 
focal, degeneração dos túbulos renais e redução da celularidade da polpa branca do baço 
(BARCERSSAT et al., 2014). Soma-se a isso o fato de que a diluição de 4-NQO na água de 
beber dos animais ser a forma mais relatada de indução à carcinogênese oral (ISHIDA et al., 
2017). 
Atualmente, existem outros métodos de indução, destacando-se a utilização de 
animais transgênicos e o transplante de células cancerígenas. Em relação ao primeiro, a 
modificação genética dos espécimes leva a uma maior probabilidade de ativação de oncogenes 
e inativação dos mecanismos de supressão tumoral especificamente da região de epitélio da 
cavidade oral. 
Além disso, a combinação com a administração de carcinógenos também é relatada 
na literatura, trazendo maiores índices de malignização das lesões (ISHIDA et al., 2017). Já no 
modelo xenográfico, há a implantação de linhagens de células humanas ou de outros animais 
em animais imunodeficientes. Entretanto, este tipo de indução da doença impede a avaliação 
do seu surgimento até a formação do carcinoma, prejudicando a obtenção de respostas 
relacionadas ao processo inflamatório (ISHIDA et al., 2017; QIN et al., 2018). 
Apesar do desenvolvimento de métodos mais tecnológicos de indução, o 4-NQO 
ainda se destaca como a principal substância utilizada para estudos de CCE oral (ISHIDA et 
al., 2017). Isso ocorre porque os mecanismos moleculares de ação dessa substância simulam as 
alterações observadas na carcinogênese humana (WALLENIUS & LEKHOLM, 1973; ISHIDA 
et al., 2017). Após a sua conversão em óxido de hidroxiaminoquinolina (4-HAQO), este se liga 
20 
 
covalentemente ao DNA, gerando substituições nos pares de bases, principalmente ao trocar 
guanina por adenina (BAILLEUL et al., 1989). Nesse processo, são geradas alterações 
genéticas e epigenéticas, ativação de proto-oncogenes e estresse oxidativo que, na região oral, 
mimetizando as alterações nucleares geradas pelo cigarro (ISHIDA et al., 2017). 
Além disso, esse modelo se mostra vantajoso ao promover a carcinogênese em 
várias etapas de maneira progressiva, o que é evidenciado pela formação desde lesões 
displásicas leves a carcinomas invasivos à medida que a exposição à substância se intensifica 
(ISHIDA et al., 2017). 
Dessa forma, o modelo de indução à carcinogênese através do 4-NQO se mostra 
como uma das melhores formas de avaliar o processo de desenvolvimento do câncer e, 
inclusive, dos seus sintomas associados, sobretudo a dor. Entretanto, apesar de esse ser o 
modelo mais relatado na literatura, não existem estudos que avaliem, por meio dele, as 
alterações nociceptivas e comportamentais durante o desenvolvimento do CCE oral. 
 
21 
 
2. JUSTIFICATIVA 
 
A dor no CCE oral é mais prevalente do que em outros cânceres e constitui a pior 
sintomatologia associada a essa doença (CONNELLY & SCHMIDT, 2004; HIRONAKA et al., 
2014; SCHEFF et al., 2017). Devido à intensa requisição funcional das estruturas afetadas pelo 
câncer, ela prejudica as funções exercidas pelo aparelho estomatognático, proporcionando 
déficitsalimentares, fonéticos e estéticos. Essas perdas podem levar o paciente a desenvolver 
quadros de caquexia, baixa interação social, ansiedade e depressão, reduzindo a sua qualidade 
de vida, mesmo quando os indicadores de dor encontram-se leves ou moderados (YE et al., 
2011; EPSTEIN & MIASKOWSKI, 2019). 
Os mecanismos envolvidos no desenvolvimento e na manutenção da dor na 
progressão do câncer são pouco elucidados, principalmente quanto as alterações nervosas 
associadas (SCHMIDT, 2015). Esse sintoma está associado às alterações locais do 
microambiente do câncer, como a liberação de mediadores, que levam à sensibilização das 
terminações nervosas periféricas, entretanto outros fatores contribuem para a resposta dolorosa. 
Além disso, inexistem estudos sobre as alterações comportamentais e nociceptivas 
relacionadas à via trigeminal ao longo do processo de desenvolvimento lesões malignas e 
potencialmente malignas em modelos experimentais que utilizam o 4-NQO, de modo a 
evidenciar a cinética dessas modificações à medida que a doença progride. 
Dessa forma, a investigação das alterações nociceptivas e comportamentais ao 
longo desse processo é relevante para o desenvolvimento de novas condutas terapêuticas para 
o manejo da dor no câncer oral e, com isso, melhoria da qualidade de vida dos pacientes 
acometidos por tal enfermidade. 
 
 
 
 
22 
 
3. OBJETIVOS 
 
3.1 Objetivo Geral 
 
Avaliar as alterações nociceptivas e comportamentais em modelo experimental de 
carcinogênese oral induzida por 4-NQO. 
 
3.2 Objetivos Específicos 
 
• Induzir lesões potencialmente malignas e carcinoma de células escamosas em região 
de língua de ratos; 
• Verificar as alterações morfológicas geradas em língua pelo modelo experimental 
através das análises macroscópica e histopatológica; 
• Avaliar a variação do limiar nociceptivo; 
• Avaliar as diferenças de comportamento de ansiedade nos animais ao longo do 
desenvolvimento do carcinoma de células escamosas; 
• Avaliar as alterações das expressões faciais ao longo do desenvolvimento do 
carcinoma de células escamosas oral; 
• Analisar a imunoexpressão de c-FOS no gânglio trigeminal e subnúcleo caudal do 
trato espinhal do trigêmeo. 
 
23 
 
4. MATERIAIS E MÉTODOS 
 
4.1 Animais 
 
Para realização do experimento, foram utilizados 40 ratos (Wistar) pesando entre 
100g e 150g, fornecidos pelo Biotério Central da Universidade Federal do Ceará (UFC). Os 
animais foram acondicionados em gaiolas confeccionadas em polipropileno medindo 44x31x21 
cm (3 animais por gaiola), com comedouro e encaixe para bebedouro, além de cama com 
maravalha irradiada. As tampas possuem filtros microisoladores, mantidos em sala com sistema 
individualizado de exaustão. 
A higienização e a desinfecção das gaiolas foram realizadas duas vezes por semana 
em estação de troca/cabine de biossegurança. Os animais foram mantidos em condições 
controladas de temperatura (25 ± 2°C) com fotoperíodo de 12 horas de claro e 12 horas de 
escuro e umidade relativa de 60%. 
Eles tiveram acesso à água potável proveniente da rede pública de abastecimento e 
alimentação com ração comercial ad libitum. Todos os critérios de alimentação e ambiência 
atenderam às recomendações do National Research Council e do National Institute of Health. 
Além disso, foi realizada a observação diária do estado geral dos animais, para avaliação de 
sofrimento intenso e possível execução de desfecho humanitário. 
O tamanho amostral foi determinado com o objetivo de identificar como 
significante uma diferença de 20% entre os grupos, com um poder estatístico de 80%. O desvio-
padrão foi estabelecido em 15% em um intervalo de confiança de 95%. Foi considerado o 
estudo de Ishida et al., (2017), onde a porcentagem de desenvolvimento de carcinoma em 
modelo induzido por 4-NQO em ratos Wistar foi de 70%. Realizou-se o cálculo na Plataforma 
OpenEpi® por meio da fórmula n = [EDFF*Np(1-p)]/ [(d 2 /Z 2 1?/2 *(N-1)+p*(1-p). 
Os protocolos experimentais foram realizados de acordo com os padrões éticos de 
uso de animais experimentais, obtidos pelo Conselho Nacional de Controle de Experimentação 
Animal (CONCEA). O projeto, submetido ao Comitê de Ética de Uso de Animais (CEUA) da 
UFC, foi aprovado sob numeração 4861280219 (em Anexo). 
 
4.2 Grupos experimentais 
 
Os animais foram divididos nos seguintes grupos experimentais: 
 
24 
 
• Grupo Controle (C): grupo que não recebeu 4-NQO 
• Grupo T8: grupo que recebeu 4-NQO durante 8 semanas. 
• Grupo T12: grupo que recebeu 4-NQO durante 12 semanas. 
• Grupo T16: grupo que recebeu 4-NQO durante 16 semanas. 
• Grupo T20: grupo que recebeu 4-NQO durante 20 semanas. 
 
4.3 Indução de câncer oral 
 
Para garantir a ingestão igualitária da substância por todos os animais, estes foram 
submetidos à administração de 0,25 ml da solução de 4-NQO sob a concentração de 1,2 mg/ml 
pelo pesquisador com o uso de pipeta plástica descartável. Tal procedimento foi realizado duas 
vezes ao dia durante 8, 12, 16 ou 20 semanas. A concentração utilizada foi obtida ao se 
considerar a quantidade de soluto ingerido sob a concentração do estudo de Khiavi et al., (2015) 
e o volume médio de ingestão de água dos animais (NEVES et al., 2013). Ademais, 
condicionamento prévio com o uso da pipeta foi realizado antes do início do protocolo 
experimental durante 7 dias. 
 
4.4 Hiperalgesia mecânica 
 
Os animais foram submetidos a sessões de condicionamento ao teste de hiperalgesia 
mecânica durante os 7 dias em que antecederam a realização do experimento, sob temperatura 
controlada e iluminação reduzida. Semanalmente, o limiar de nocicepção do animal foi obtido 
através do registro da intensidade de força aplicada bilateralmente na região vibrissal 
(HIRONAKA et al., 2014). Para isso, os animais foram acondicionados em gaiolas de 
polissulfona de 30x20x13 cm (1 animal/gaiola) por 15 minutos previamente ao teste. 
De maneira aleatória, o examinador posicionou o aparelho Von Frey eletrônico - 
um analgesímetro que registra limiar nociceptivo do animal em gramas (g)- perpendicularmente 
à região de vibrissa, pressionando-o contra a área. Ao se obter uma resposta reflexa, como 
retirada da cabeça ou sinais sonoros, o estímulo foi descontinuado automaticamente e a 
intensidade foi registrada (NAGAMINE et al., 2006). 
 
 
 
25 
 
4.5 Teste em campo aberto 
 
O teste de caracterização de apatia e ansiedade foi realizado no início do 
experimento e previamente à eutanásia dos animais. Foi realizado em sala ambientalmente 
isolada de odores, ruídos e sob temperatura de 22º C. Os animais ficaram em ambientação no 
espaço de realização do experimento durante 15 minutos. Em seguida foram submetidos a 
análise comportamental individual durante 5 minutos em cubos de acrílico dimensionados em 
50x50x50cm. 
A arena foi dividida em oito zonas quadradas periféricas e uma central. Os animais 
permaneceram isolados na arena durante 5 minutos a fim de se habituarem ao ambiente. Após 
esse período, foram analisados, por 5 minutos, os parâmetros de 1) “self-grooming”, 2) número 
de passagens entre zonas, 3) elevação no centro da arena e nas bordas da arena (PONTE, 2017). 
 
4.6 Avaliação das expressões faciais 
 
Semanalmente, os animais serão colocados em cubos de acrílico medindo 
21x10,5x9 cm e observados por 30 minutos. Foram avaliados os parâmetros de apertamento 
orbital, achatamento do nariz e alterações de orelha e de vibrissas, atribuindo-se escores 
variando de 0 a 2, com 0 para alta confiança do apontador de que a unidade de ação estava 
ausente; 1, alta confiança de uma aparência moderada da unidade de ação ou equívoco em 
relação a sua presença ou ausência; 2, detecção de uma aparência óbvia da unidade de ação, 
com alta confiança (SOTOCINAL et al., 2011). 
 
4.7 Avaliação ponderal 
 
Todos os ratos foram pesados semanalmente em balança digital (Filizola® MF 
4006082)antes e durante o período experimental semanalmente para avaliação da evolução 
ponderal. Os ratos foram pesados de forma aleatória no período da manhã, sempre no mesmo 
horário, em dias não coincidentes com trocas de caixa e cama (maravalha). 
 
 
 
26 
 
 4.8 Análise Macroscópica 
 
Após a remoção dos tecidos linguais, um patologista experiente analisou a mucosa, 
descrevendo as alterações de superfície e cor, bem como o tamanho e o aspecto das lesões. As 
alterações de superfície foram classificadas como lisa, granular, verrucosa, papilomatosa, 
bosselada ou lobulada com base penduculada, séssil, nodular ou em forma de cúpula 
(MORTAZAVI et al., 2017). A cor dos espécimes foi classificada como branco, cinza ou 
castanho (CHI & NEVILLE, 2015) 
 
4.9 Análise histopatológica 
 
Nos dias 56, 84, 112 e 140, os animais foram anestesiados intraperitonealmente 
com ketamina (80 mg/kg) e xilazina (10 mg/kg). Após a avaliação da profundidade do campo 
anestésico com o teste de pinçamento da cauda, os animais foram perfundidos 
intracardiacamente com 60 mL de solução salina tamponada com fosfato (PBS) seguido de 60 
mL de solução de paraformaldeído (PFA) 4%. 
Posteriormente, as lesões linguais foram removidas e fixadas em solução de formol 
tamponado a 10% durante 24 horas, desidratadas com álcool 70% e embebidas em parafina. 
Secções de 5 μm das amostras foram avaliadas através de microscopia de luz (MINICUCCI et 
al., 2011; SILVEIRA, 2017). 
As amostras foram coradas com hematoxilina-eosina (HE) e avaliados por 
patologista experiente e cego ao estudo. As lesões linguais foram classificadas como normal; 
hiperceratose; displasia leve, moderada ou severa; ou carcinoma de células escamosas 
(MINICUCCI et al., 2011). 
 
4.10 Análise por imunofluorescência 
 
O gânglio trigeminal e o subnúcleo caudal do trato espinhal do trigêmeo foram 
removidos, colocados em PFA 4% por 2h e crioprotegidos em solução de sacarose 30% durante 
48 h. Após esse período, os tecidos foram embebidos em Tissue-tek e armazenados a -80°C. 
Secções seriadas (10 μm) dos tecidos nervosos foram obtidas em um criostato (Leica CM1100, 
Wetzlar, Alemanha). 
27 
 
Para os ensaios de imunofluorescência, as secções foram fixadas em metanol e 
recuperação antigênica será realizada em 0.1 M (pH 6.0) de tampão citrato. Em seguida, 
permeabilização da membrana nuclear foi realizada, somente nas reações para marcação 
nuclear, com 0.1% triton X-100. Sítios inespecíficos foram bloqueados com 5% albumina de 
soro bovina e glicina 0.3 M em todas as lâminas. 
As amostras foram incubadas overnight com o anticorpo primário anti-c-Fos anti-
rabbit (1:400) (Invitrogen®, Life Technologies, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, 
EUA). Posteriormente, foi realizada a incubação com o anticorpo secundário feito em cabra 
anti-igG de coelho Alexa Fluor 568 (Invitrogen®, Life Technologies, Thermo Fisher Scientific, 
Waltham, MA, EUA) ou 594 (Invitrogen®, Life Technologies, Thermo Fisher Scientific, 
Waltham, MA, EUA), na diluição de 1: 400. 
Para marcação dos corpos celulares neuronais, as amostras foram incubadas com 
anticorpo para NeuN conjugado com Alexa fluor 488 (Merck Millipore®, Billerica, MA, EUA) 
na diluição de 1:100. O DAPI (Invitrogen®, Life Technologies, Thermo Fisher Scientific, 
Waltham, MA, EUA) foi acrescentado ao final para evidenciar os núcleos celulares. Os 
controles negativos de imunomarcação serão realizados através da omissão dos anticorpos 
primários. Por último, os slides serão montados e fotografados através de microscopia confocal. 
A quantificação da área fluorescente nas fotomicrografias foi realizada pela 
diferenciação dos pixels fluorescentes pela saturação de cor mais alta associada à fluorescência 
(vermelha ou verde) com o software de análise de imagem. Os limites superiores e inferiores 
requeridos para definição de pixels selecionados e não-selecionados foram previamente 
definidos pelo limite de cor. Os resultados de quantificação foram apresentados em 
porcentagem, calculada pela fluorescência positiva em relação à fluorescência de NeuN 
(SILVEIRA, 2017). 
 
 4.11 Análise Estatística 
 
O teste de Shapiro-Wilk foi utilizado para verificar se os dados de cada variável 
analisada se apresentam com distribuição normal (dados paramétricos, com grupos com menos 
de 30 casos). Os valores de outliers foram retirados (quando ocorrerem) por não representarem 
aqueles resultados aos quais o estudo tinha o objetivo de generalizar (p-valor >0.05 para o teste 
de Shapiro-Wilk). 
Os dados paramétricos foram analisados através do teste t de Student, para a 
comparação da média entre dois grupos, e do teste de ANOVA, para a comparação das médias 
28 
 
em variáveis com mais de dois grupos. O pós-teste (post-hoc) para a ANOVA foi definido a 
partir da análise da homogeneidade de variâncias através do teste de Levene. Quanto à 
homogeneidade de variâncias (p-valor ≥ 0,05), foi definido como pós-teste para a ANOVA o 
teste de Tukey. 
Os dados não paramétricos foram analisados pelo teste de Kruskal Wallis, seguido do pós-teste 
(post-hoc) de Dunn's, para média entre mais de dois grupos. O nível de significância foi 
considerado p < 0,05. O software Graph Pad Prism 7.0 foi o utilizado para realizar os testes 
estatísticos. 
 
 
29 
 
5. RESULTADOS 
 
5.1. Hiperalgesia mecânica 
 
Quanto à análise do efeito da indução com o 4-NQO na hiperalgesia mecânica na 
região de vibrissa, tem-se uma redução estatisticamente significativa dos limiares em relação 
ao grupo controle nas primeiras 2 semanas (p < 0,0001 e p<0,05, respectivamente) de 
administração da droga em relação ao grupo controle (Gráfico 1). 
Esses achados são seguidos por um período intermediário de retorno aos níveis 
basais do limiar nociceptivo (3ª, 4ª, 9ª, 10ª, 11ª semanas) intercaladas por períodos de redução 
significativa dos limiares de hiperalgesia, nas 5ª e 12ª semanas (p< 0,05), e 6ª, 7ª e 8ª (p < 0,01). 
Após a 12ª semana até o final do protocolo experimental, se observa a queda dos limiares de 
retirada da cabeça, com a manutenção de limiares mais baixos (p < 0,0001). 
Em relação ao limiar inicial, foi observada uma redução significativa após 1 semana 
(T1) de exposição ao carcinógeno (p <0,001) (Gráfico 2). Os limiares foram restabelecidos em 
8 e 12 semanas, sem diferença estatística quando comparado ao tempo de início do protocolo 
experimental. Após 16 semanas de exposição ao 4-NQO, observou-se redução do limiar em 
relação a T0 (p <0,001), T1 (p <0,001), e T8 (p <0,001) o que também aconteceu após 20 
semanas. Neste período, também foi obtida diferença frente aos limiares de T12 (p <0,001) e 
T16 (p <0,01). 
 
 
30 
 
Gráfico 1 - Hiperalgesia mecânica na região de vibrissa de ratos ao longo de 20 semanas de 
indução à carcinogênese com 4-NQO. 
4 8 12 16 20
0
20
40
60
80
C
4-NQO
*
* **
*
**
***
**
* * *
Semanas
L
im
ia
r 
d
e
 r
e
ti
ra
d
a
 d
a
 c
a
b
e
ç
a
 (
g
)
 
Fonte: Dados da pesquisa. O gráfico representa o desenvolvimento da hiperalgesia mecânica da região 
de vibrissa em ratos submetidos à carcinogênese experimental induzida por 4-NQO (0,6mg/dia). Os 
resultados são expressos como média do limiar de retirada da cabeça em gramas por grupo (n=8) ± erro 
padrão da média (EPM). * p<0,05 versus C (Teste t Student). 
 
Gráfico 2 - Hiperalgesia mecânica na região de vibrissa de ratos induzidos à carcinogênese 
experimental por 4-NQO. 
 
Fonte: Dados da pesquisa. O gráfico representa o desenvolvimento da hiperalgesia mecânica da região 
de vibrissa após 1, 8, 12, 16 e 20 semanas de indução por 4-NQO.Os resultados são expressos como 
média do limiar de retirada da cabeça (n=8) ± erro padrão da média (EPM). a p< 0,001 versus T0; b p< 
0,001 versus T1; c p< 0,001 versus T8; d p < 0,001 versus T12; e p < 0,01 versus T16. (ANOVA de 
uma via, pós-teste de Tukey). Abreviações: T0, tempo inicial; T1,1ª semana; T8, 8ª semana; T12, 12ª 
semana; T16, 16ª semana; T20, 20ª semana. 
31 
 
5.2 Teste de campo aberto 
 
Quanto à avaliação dos comportamentos de ansiedade e depressão por meio do teste 
de campo aberto, foi observado aumento do grooming dos animais no grupo eutanasiado após 
8 semanas de administração do 4-NQO em relação ao grupo C (p < 0,05) (Gráfico 3). Tal 
comportamento voltou a se mostrar alterados no grupo eutanasiado após 20 semanas de 
indução, com redução estatisticamente significativa em relação ao T8 (p <0,05). 
A análise da deambulação dos animais submetidos ao teste de campo aberto 
mostrou significativo aumento no grupo T8 quando comparado ao grupo C (p <0,05) (Gráfico 
4). O mesmo não pode ser observado nos demais grupos. Na análise das atividades de elevação 
corporal no teste de campo aberto, os grupos não apresentaram diferença estatística entre si 
(Gráfico 5). 
 
Gráfico 3 – Análise de grooming sob o teste de campo aberto em ratos induzidos à 
carcinogênese experimental por 4-NQO 
 
C T 8 T 1 2 T 1 6 T 2 0
0
1
2
3
4
5
b
a
Q
U
A
N
T
ID
A
D
E
 D
E
 M
O
V
IM
E
N
T
O
S
 
Fonte: Dados da pesquisa. O gráfico representa as alterações no comportamento de grooming de ratos 
submetidos à carcinogênese experimental induzida por 4-NQO (0,6mg/dia). Os resultados são expressos 
como média da quantidade de movimentos de grooming (n=8) ± erro padrão da média (EPM) a p < 0,05 
versus C, b p< 0,05 versus T8 (ANOVA, pós-teste de Tukey). 
 
 
 
 
32 
 
Gráfico 4 – Análise da atividade horizontal no teste de campo abertos de ratos induzidos à 
carcinogênese experimental por 4-NQO. 
C T 8 T 1 2 T 1 6 T 2 0
0
2 0
4 0
6 0
8 0 a
N
Ú
M
E
R
O
 D
E
 P
A
S
S
A
G
E
N
S
 
Fonte: Dados da pesquisa. O gráfico representa as alterações no comportamento de deambulação de 
ratos submetidos à carcinogênese experimental induzida por 4-NQO (0,6 mg/dia). Os resultados são 
expressos como média do número de passagens entre zonas (n=8) ± erro padrão da média (EPM). A p 
< 0,05 versus C (ANOVA, pós-teste de Tukey). 
 
Gráfico 5 – Análise da atividade vertical no teste de campo abertos de ratos induzidos à 
carcinogênese experimental por 4-NQO 
C T 8 T 1 2 T 1 6 T 2 0
0
1 0
2 0
3 0
4 0
N
Ú
M
E
R
O
 D
E
 E
L
E
V
A
Ç
Õ
E
S
 
Fonte: Dados da pesquisa. O gráfico representa as alterações na atividade vertical de ratos submetidos 
à carcinogênese experimental induzida por 4-NQO (0,6mg/dia). Os resultados são expressos como 
média do número de elevações (n=8) ± erro padrão da média (EPM). (ANOVA, pós-teste de Tukey). 
 
5.3. Análise das expressões faciais 
 
33 
 
Quanto a análise das expressões faciais indicativas de desconforto e dor, os animais 
apresentaram aumento dos escores apenas após 20 semanas de exposição ao carcinógeno 
(Tabela 1), sendo estatisticamente significativo em relação a T0 (p < 0,001), T1(p < 0,001), T8 
(p < 0,001), T12 (p < 0,05) e T16 (p < 0,001). 
 
Tabela 1 - Análise das expressões faciais em ratos induzidos à carcinogênese experimental 
por 4-NQO. 
 
 T0 T1 T8 T12 T16 T20 
Média 0.0 (0 – 0) 0.5 (0– 1) 0.5 (0 – 2) 0 (0 – 1) 1 (0 – 3) 3 (0 – 6) a, 
b, c, d, e 
Fonte: Dados da pesquisa. A tabela representa a evolução das expressões faciais associadas à nocicepção 
de ratos submetidos à carcinogênese experimental induzida por 4-NQO. Os resultados são expressos 
como média, mínimo - máximo. a p < 0,001 versus T0; b p < 0,001 versus T1; c p < 0,001 versus T8; d 
p < 0,05 versus T12; e p < 0,001 versus T16. (Kruskal-Wallis, pós-teste de Dunn). Abreviações: T0, 
semana inicial; T1, 1ª semana; T8, 8ª semana; T12, 12ª semana; T16, 16ª semana; T20, 20ª semana de 
exposição ao 4-NQO. 
 
5.4. Análise ponderal 
 
Na análise das alterações de peso dos animais durante o experimento, nenhuma 
diferença estatisticamente significativa pôde ser observada em relação ao grupo controle 
(Gráfico 6). 
 
Gráfico 6 - Análise ponderal de ratos induzidos à carcinogênese experimental por 4-NQO. 
 
 
34 
 
Fonte: Dados da pesquisa. O gráfico representa as alterações de peso de ratos submetidos à 
carcinogênese experimental induzida por 4-NQO. Os resultados são expressos como média ± desvio 
padrão (DP) (teste t de Student). 
 
5.5. Análise macroscópica da língua 
 
Macroscopicamente, as línguas apresentaram alterações de superfície e de cor de 
forma progressiva. A superfície lisa dessa estrutura foi modificada após 16 semanas, 
apresentando lesões papulares, verrucosas ou nodulares, estas últimas chegando a 0,9 cm em 
seu maior diâmetro (Tabela 2). 
A maioria das lesões foi observada em região posterior de língua, alcançando até a 
região central dessa estrutura. Lesões esbranquiçadas foram obtidas a partir de 8 semanas de 
exposição ao 4-NQO e, após 20 semanas, lesão papilomatosa de coloração branco-pardacenta 
(Figura 3). Em geral, pápulas esbranquiçadas de limites imprecisos foram as lesões mais 
comumente observadas a partir da 16a semana. 
Figura 3 - Análise macroscópica da língua de ratos exposto à carcinogênese induzida por 4-
NQO 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Fonte: dados da pesquisa. Imagens representativas dos achados macroscópicos em língua referentes aos 
grupos T0, T8, T12, T16, T20. A: Controle; B: T8; C: T12; D: T16; E: T20. Seta cheia: Lesão 
esbranquiçada; Ponta de seta: Lesão nodular; Seta interrompida: Lesão verrucosa. 
 
Tabela 2 - Análise macroscópica das lesões observadas por grupo exposto à carcinogênese 
induzida por 4-NQO. 
 
 
 
SUPERFÍCIE COLORAÇÃO TAMANHO DA LESÃO 
 Lisa Branco-pardacenta Não se aplica 
A B C 
D E 
B 
35 
 
T8 Lisa Esbranquiçada ou 
branco acastanhada 
Não se aplica 
T12 Lisa Esbranquiçada ou 
branco acastanhada 
Não se aplica 
T16 Lisa, Irregular ou papular Esbranquiçada ou 
branco acastanhada 
Limites imprecisos 
T20 Rugosa, papular, 
papilomatosa, nodular, 
verrucosa de implantação 
pedunculada 
Branco-pardacenta 0,2 cm a 0,9 cm* 
1/3 a 2/3 posteriores de 
língua 
Fontes: Dados da pesquisa. A tabela representa a apresentação das lesões epiteliais encontradas em 
língua em cada grupo experimental submetido à carcinogênese por 4-NQO. * maior diâmetro da lesão. 
 
5.6. Análise histopatológica 
 
Através da análise histopatológica, LPM puderam ser observadas a partir de 8 
semanas de exposição ao 4-NQO, e CCE foi observado a partir da 16ª semana (Tabela 3). 
Variados graus de displasia puderam ser observados ao longo do protocolo experimental, desde 
hiperceratoses a displasias severas, de forma a mostrarem mais alterações celulares a partir do 
tempo de 16 semanas de aplicação do 4-NQO. 
Nas displasias leves, foram observadas alterações epiteliais, como hiperplasia da 
camada basal e hipercromatismo, enquanto nas displasias moderadas, nucléolos proeminentes 
e projeções em forma de gota (Figura 4). Nas displasias severas, vale destacar o intenso 
pleomorfismo celular em quase toda a espessura do epitélio com perda da sua estratificação 
(Figura 4). 
Essas atipias se fizeram presentes desde a 8ª semana e, no grupo T20, 50% das 
lesões apresentadas foram CCE bem diferenciados, assim como em outros modelos 
experimentais à base de 4-NQO (BUCK et al., 2018; NAIK et al., 2021), apresentando 
alterações displásicas severas associadas à formação de ninhos celulares, invasão do estroma e 
pérolas de queratina (Figura 4). 
 
 
 
 
 
 
 
36 
 
Figura 4 - Alterações epiteliais observadas na língua de ratos expostos à carcinogênese 
induzida por 4-NQO. 
Fonte: dados da pesquisa. As imagens correspondem à região de epitélio lingual de ratos expostos 
ao 4-NQO em aumentos de 100, 200, e 400 x. Coloração H&E. Abreviações: D. Leve: displasia leve; 
D. moderada: displasia moderada; D. severa: displasia severa; Carcinoma: carcinoma de células 
escamosas oral. Setas: hiperplasia basilar; pontas de seta: nucléolos proeminentes; Seta fina: 
projeção em formade gota; asterisco: pleomorfismo celular; cruz: pérolas de ceratina; estela: ninho 
de células. 
N
O
R
M
A
L
 
D
. 
L
E
V
E
 
D
. 
M
O
D
E
R
A
A
D
A
 
D
. 
S
E
V
E
R
A
 
C
A
R
C
IN
O
M
A
 
100X 200X 400X 
* 
* 
* 
37 
 
Tabela 3 - Frequência de lesões observadas por grupo exposto à carcinogênese induzida por 
4-NQO. 
 
 N HC DL DM DS CCE 
C 8(100%) 
T8 1(12,5%) 4(50%) 2(25%) 1(12,5%) 
T12 2(25%) 6(75%) 
T16 1(12,5%) 2(25%) 2(25%) 2(25%) 1(12,5%) 
T20 1(12,5%) 3(37,5%) 4 (50%) 
 
Fonte: Dados da pesquisa. A tabela representa a quantidade de lesões epiteliais em língua observadas 
em cada grupo experimental submetido à carcinogênese por 4-NQO. Abreviações: N, epitélio normal; 
HC, hiperceratose; DL, displasia leve; DM, displasia moderada; DS, displasia severa; CA, carcinoma 
de células escamosas. 
 
5.7 Análise por imunofluorescência de c-FOS no Gânglio Trigeminal 
 
Através da análise de imunofluorescência pôde ser observada redução da 
imunoexpressão de c-FOS no grupo T12 em relação ao T8 (p < 0,05) e aumento desse da 
intensidade de imunoexpressão em T20, quando comparado a C (p<0,05), e T12 (p< 0,001). 
 
38 
 
Figura 5 - Fotomicrografia representativas da imunoexpressão de c-FOS em Gânglio 
Trigeminal de ratos submetidos à carcinogênese induzida por 4-NQO. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Fonte: dados da pesquisa. Verde: NeuN (marcador neuronal); vermelho: c-FOS; azul: DAPI (marcador 
nuclear). Aumento: 200 x. Escala: 50 µm. Os gânglios trigeminais foram coletados na 8ª, 12ª, 16ª e 20ª 
semanas de exposição ao 4-NQO. 
 
 
 
 
 
C-FOS NEUN DAPI MERGE 
C
O
N
TR
O
LE
 
T8
 
T1
2
 
T1
6
 
T2
0
 
39 
 
Gráfico 1 - Quantificação da área imunofluorescente da expressão de c-Fos em gânglio 
trigeminal de ratos submetidos à carcinogênese experimental por 4-NQO. 
C T8 T1
2
T1
6
T2
0
0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
 b
a, c
Á
R
E
A
 I
M
U
N
O
F
L
U
O
R
E
S
C
E
N
T
E
 (
%
)
 
 
Fonte: dados da pesquisa. Os valores são apresentados como média ± desvio padrão (DP) da 
porcentagem da área fluorescente positiva da expressão de c-Fos em comparação com a expressão de 
NeuN após 8, 12, 16 ou 20 semanas de indução. a p < 0,05 versus C, b p < 0,05 versus T8, c p < 0,001 
versus T12 (ANOVA de uma via, pós-teste de Tukey). 
 
5.8 Análise por imunofluorescência de c-FOS no Subnúcleo Caudal do Trato Espinhal 
do Trigêmeo 
 
Através da análise da imunoexpressão de c-FOS em região de subnúcleo caudal do 
trato espinhal do trigêmeo, foi observado aumento significativo a partir de 16 semanas de 
exposição ao 4-NQO quando comparado aos grupos C e T8 (Gráfico 8). Em T20 houve 
diferença significativa quando comparado ao Controle, p < C, T8 e T16 (Gráfico 8). Foi 
observada a imunoexpressão também em células não neuronais dessa estrutura indicadas pelas 
setas em branco (Figura 4). 
 
 
40 
 
Figura 6 - Fotomicrografia representativa da imunoexpressão de c-FOS em Subnúcleo Caudal 
do Trato Espinhal do nervo trigêmeo de ratos submetidos à carcinogênese induzida por 4-
NQO. 
 
C-FOS NEUN MERGE 
C
O
N
TR
O
LE
 
DAPI 
T2
0
 
T1
6
 
T1
2
 
T8
 
Fonte: dados da pesquisa. Verde: NeuN (marcador neuronal); vermelho: c-FOS; azul: DAPI 
(marcador nuclear). Escala: 20 µm. Os tratos espinhais foram coletados na 8ª, 12ª, 16ª e 20ª 
semanas de exposição ao 4-NQO. 
41 
 
Gráfico 2 - Quantificação da área imunofluorescente de c-FOS em Subnúcleo Caudal do Trato 
Espinhal do Trigêmeo de ratos submetidos à carcinogênese induzida por 4-NQO. 
C T8 T1
2
T1
6
T2
0
0
20
40
60
80
a,b,c
a,b
 Á
R
E
A
 I
M
U
N
O
F
L
U
O
R
E
S
C
E
N
T
E
 (
%
)
 
Fonte: dados da pesquisa. Os valores são apresentados como média (n=8) ± erro padrão da média (EPM) 
da porcentagem da área fluorescente positiva da expressão de c-FOS em comparação com a expressão 
de NeuN após 8, 12, 16 ou 20 semanas de indução. a p < 0,05 versus C, b p < 0,05 versus T8, c p < 0,05 
versus T12 (ANOVA, pós teste de Tukey). 
 
 
 
42 
 
Figura 7 - Fotomicrografias representativas da imunoexpressão de c-FOS em células não 
neuronais do subnúcleo caudal do trato espinhal do nervo trigêmeo de ratos submetidos à 
carcinogênese induzida por 4-NQO. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Fonte: dados da pesquisa. Verde: NeuN (marcador neuronal); vermelho: c-FOS; azul: DAPI 
(marcador nuclear). Escala: 20 µm. Os gânglios trigeminais foram coletados na 8ª, 12ª, 16ª e 
20ª semanas de exposição ao 4-NQO. As setas evidenciam a imunoexpressão de c-FOS em 
células não neuronais 
C-FOS NEUN MERGE DAPI 
T2
0
 
T1
6
 
T1
2
 
T8
 
C
O
N
TR
O
LE
 
43 
 
6. DISCUSSÃO 
 
O presente estudo foi baseado em uma modificação do modelo clássico de indução 
por 4-NQO (HIRONAKA et al., 2014; SHEFF et al, 2017; NAIK et al., 2021). A adaptação da 
administração por meio do gotejamento intraoral visou à garantia do recebimento da mesma 
quantidade da droga por animal, eliminando as possíveis interferências geradas pela 
dominância entre os indivíduos e pelas propriedades organolépticas inerentes à suspensão, 
como cor, odor e sabor. Sohrabi et al., (2009) identificou uma redução da ingestão da água em 
que o 4-NQO estava diluído em relação ao grupo controle após 8 semanas de protocolo 
experimental. 
Este estudo se baseou no modelo indicado por Khiavi et al (2015), cuja 
concentração utilizada era de 30 ppm de 4-NQO. Em concentrações menores que esta, o tempo 
de exposição ao carcinógeno para efetivamente gerar lesões malignas variou de 24 a 32 semanas 
(GE et al., 2021; YAMAMOTO et al., 2006). 
Em nosso estudo, foi observado que a modificação proposta foi capaz de obter CCE 
oral de forma mais célere, reduzindo o tempo de exposição à droga e, consequentemente, dos 
riscos associados não só para os animais, mas também para a equipe de pesquisa. Vale ressaltar, 
que essa modificação diminuiu o risco de exposição do carcinógeno aos funcionários do 
biotério, proporcionando também maior segurança aos pesquisadores. 
Tal modificação no modelo experimental não comprometeu o desenvolvimento de 
lesões cancerosas na língua dos animais. Pôde-se constatar a eficácia desse modelo através das 
análises macro e microscópica ao longo do protocolo experimental. Foram encontradas 
alterações celulares displásicas progressivas à medida que a exposição ao carcinógeno 
aumentava, chegando a provocar CCE de língua em 50% dos animais ao final das 20 semanas 
de exposição ao 4-NQO. 
Além disso, é válido pontuar que, apesar de os índices de indução à carcinogênese 
terem se mostrado maiores nos estudos de Khiavi et al (2015) e de Yamamoto et al (2006), 
foram obtidas taxas de mortalidade de 7% e de 2,6% respectivamente, o que não ocorreu em 
nosso estudo. Soma-se a esse achado o fato de que não foram observados comprometimento no 
ganho ponderal ou caquexia, ao contrário do que é relatado em alguns estudos clínicos e 
experimentais (YE et al, 2011; BARCESSAT et al, 2014; RIBEIRO & SALVADORI, 2007). 
Isso, somado ao fato de que, também, não houve perda de animais como relatado em outros 
estudos (DOGAN et al., 2017; DROGUETT et al., 2015), o que nos leva à conclusão de que 
essa modificação no modelo apresentou benefícios ao induzir a lesão cancerígena sem interferir 
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na ingestão alimentar dos animais, gerando, assim, menor morbidade e mortalidade. Vale 
destacar que não foi encontrada relação entre o tamanho ou a aparência das lesões com o grau 
de modificações celulares, o que é corroborado pelos achados da literatura (GUERRERO et al., 
2008; SCHMIDT, 2015). 
 
Apesar do gotejamento da droga ser feito no terço anterior da língua, o principal 
sítio acometido pelas lesões foi o terço posterior. Embora seja um fato comum clinicamente 
(FOSSUM et al., 2016), a replicação desse achado neste estudo consiste em parâmetro 
indicador da qualidade da mimetização