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História da reacção em cadeia da
polimerase (PCR)
A revelação da reacção em cadeia da polimerase (PCR) foi uma descoberta
principal no mundo científico. Ao longo do tempo, a técnica evoluiu além dos
confins de seu projecto inicial simples e abriu avenidas incríveis para
pesquisadores.
Dentro de 20 anos de sua descoberta, esta técnica sensacional transformou-se
a base para diversos protocolos da biologia molecular e formou-se a fundação
do projecto de genoma humano.
A história da tecnologia do PCR, como todas as revelações principais na ciência,
é estragada por controvérsias, por reivindicações, e por contra argumento,
alguns deles ainda não resolvidos. Este artigo procura cronicar as revelações
chaves que conduzem e após à invenção do PCR.
Revelações na estrutura do ADN
No ano 1953, Watson e o Crick descobriram a estrutura da dobro-hélice do
ADN, mostrando que o ADN tem duas costas com corredor de bases
complementar em sentidos opostos. Mais importante, seu relatório ferventado
com especiarias sobre a possibilidade de um mecanismo de copi para o ADN.
Sua estrutura de hélice dobro ganhou-os o prémio nobel em 1962.
O ADN repara e repetiu a actividade da
polimerase
A primeira polimerase de ADN foi identificada por Arthur Kornberg em 1957
durante seus estudos no mecanismo da réplica do ADN. Esta enzima necessário
uma primeira demão para começar copiar o molde e podia criar o ADN somente
em um sentido.
Em 1971, Gobind Khorana, um vencedor de prémio nobel para sua parte na
descoberta do código genético, e em sua equipe dos pesquisadores começou
trabalhar na síntese do reparo do ADN. Esta técnica procurou simplificar a
síntese do gene usando as primeiras demão e os moldes artificiais que ajudam
By Susha Cheriyedath, M.Sc.
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a polimerase de ADN a copiar os segmentos desejados do gene.
Embora esta técnica usasse a polimerase de ADN repetidamente, similar a PCR,
empregou somente um único complexo do molde da primeira demão, e a
amplificação exponencial não era possível usando esta técnica. Em torno do
mesmo tempo, Kjell Kleppe do laboratório de Khorana previu o uso de um
sistema da dois-primeira demão que pudesse ajudar na réplica desejada do
segmento do ADN, formando um precursor adiantado ao PCR.
Pesquisa em Cetus Corporaçõ
Cetus Corporaçõ, uma empresa de biotecnologia que se tornasse home à
maioria da pesquisa que conduz ao PCR, foi fundado em 1971. Kary Mullis de
Cetus trabalhou na síntese dos oligonucleotides para o uso como pontas de
prova, primeiras demão, e blocos de apartamentos para várias técnicas da
biologia molecular. Embora sintetizasse estes oligos manualmente, avaliou
alguns protótipos automatizados do sintetizador mais tarde.
Arranjar em seqüência do ADN e o advento do
PCR
No ano 1977, Frederick Sanger identificou um ADN que arranja em seqüência o
método que envolve uma polimerase de ADN, uma primeira demão, e os
precursores do nucleotide, para que era ele concederam o prémio nobel em
1980. Assim no ano 1980, todos os componentes para a amplificação do PCR
estavam prontos.
Contudo, não era até 1983 que, em um esforço para fixar algumas edições em
seu trabalho de pesquisa, Mullis usou o ADN de Sanger que arranja em
seqüência o método como base para planejar uma técnica nova. Adicionou uma
segunda primeira demão à costa oposta e realizou que o uso repetido da
polimerase de ADN provocará uma reacção em cadeia que amplificasse um
segmento específico do ADN, assim descobrindo a tecnologia do PCR.
Análise de produtos do PCR - mancha do sul
Mullis continuou a testar sua ideia, inicialmente sem ciclismo térmico mas mais
tarde com ciclismo térmico repetido. Em 1984, Mullis junto com a equipe
genética do ensaio da mutação em Cetus começou trabalhar nas experiências
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que mostram a capacidade do PCR para amplificar o ADN genomic. Embora o
produto da amplificação não fosse evidente na electroforese do gel do agarose
inicialmente, a mancha do sul confirmou o aumento na quantidade dos
segmentos desejados do ADN.
O ADN amplificado do PCR com sucesso foi clonado e arranjado em seqüência
pelos pesquisadores, que se aplicaram para a patente no PCR e nas suas
aplicações e se obtiveram a patente aprovada em 1987. Entrementes, a equipe
usou o PCR para outras aplicações projetando as primeiras demão e as pontas
de prova novas, que fizeram a reacção mais específica até que os resultados
estiveram evidentes na electroforese do gel do agarose.
Polimerase de ADN de Taq
Uma descoberta principal na polimerase de ADN veio avante no ano 1969,
quando Thomas Brock relatou o isolamento do aquaticus de Thermus, uma
espécie nova de bactéria thermophilic encontrada no Hot Springs do parque
nacional de Yellowstone. A polimerase de ADN desta bactéria, chamada a
polimerase de Taq, podia suportar muito altas temperaturas, ao contrário de
outras polimerases disponíveis nesse ponto do tempo.
Depois que um par tentativas falidas de isolar a polimerase de ADN de Taq, a
Susanne Stoffel e o David Gelfand de Cetus isolaram finalmente o na queda de
1985, e experiências de Randy Saiki logo após mostrado que a polimerase de
Taq é ideal para o processo do PCR. Foi sobre relatar que o trajecto que quebra
a técnica do PCR ao mundo científico em outubro de 1985 e Mullis e seu grupo
publicou papéis no PCR e nas suas aplicações em jornais principais da ciência.
Uma patente para o PCR que usa a polimerase de Taq foi emitida em outubro de
1990.
Perkin-Elmer e Cetus desenvolvem máquinas
do PCR
Durante o fim de 1985, Perkin-Elmer e Cetus formaram um empreendimento
misto para desenvolver reagentes e instrumentos para a técnica do PCR. A
fabricação de PCR Taq-baseado faz à máquina seguido e de “a polimerase de
ADN AmpliTaq” era disponível no comércio em novembro de 1987.
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PCR aplicado às arenas novas
O PCR foi usado para determinar na primavera o VIH no sangue de 1985. Em
meados de 1987, um teste viável estava disponível e o PCR foi usado para
estudar o impacto de drogas antivirosas e para seleccionar igualmente as
amostras de sangue fornecedoras para o VIH.
Em outubro de 1985, o PCR foi usado para analisar a anemia da célula
falciforme, em sua primeira aplicação clínica.
Cientista do forense, mãos juntadas Blake de Edward com o FBI e
pesquisadores de Cetus em 1986 para usar com sucesso o PCR para a análise
da evidência criminosa. Mas não era até 1989 que os testes altamente sensíveis
do fingerprinting de ADN estiveram planejados basearam na técnica do PCR,
fazendo lhe uma parte integrante das investigações penais.
Em 1987, o ADN de uma costa do cabelo humano foi amplificado usando o PCR
e este confirmou a capacidade do PCR para amplificar o ADN actual na peça
degradada das amostras da evidência judicial.
O Mutiplex-PCR foi descrito para analisar os produtos meiotic da recombinação
em 1989. Estas amplificações da único-cópia provaram mais tarde crucial para
o estudo do ADN e de genotyping.
Prémio nobel para Kary Mullis
Kary Mullis foi concedido o prémio nobel na química em outubro de 1993,
menos de 10 anos após o advento do PCR.
Em dezembro de 1989, a polimerase de Taq foi nomeada “molécula do ano”
pela ciência do jornal.O papel do PCR de Taq transformou-se mais tarde a
publicação a mais mencionada na biologia e o PCR esclarece sobre 3% de todas
as citações em PubMed.
Sumário
A técnica do PCR como nós sabemos hoje foi conceituada e desenvolvida nos
anos 80 por Kary Mullis e por seus colegas em Cetus Corporaçõ. O isolamento e
a purificação das polimerases thermostable de Taq conduzidas à automatização
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da técnica inicialmente lenta e laboriosa do PCR e a revelação de cyclers
térmicos programáveis do PCR fizeram-lhe uma técnica amplamente utilizada a
muitos níveis de biologia e de química.
Embora Mullis invente o PCR, suas aplicações bem sucedidas em diversos
campos são um resultado de muito trabalho duro por outros pesquisadores de
Cetus tais como Henry Erlich. Também, há uns desafios às patentes do PCR
guardaradas por Mullis baseou nos trabalhos de pesquisa adiantados
executados por Khorana e outros nos anos 60 e nos anos 70.
Os agradecimentos a sua versatilidade extraordinária, hoje, PCR estão sendo
usados em campos diversos tais como a ciência forense, estudos ambientais,
tecnologia de alimento, e a medicina diagnóstica. O avanço maciço ao longo dos
anos em nossa compreensão do genoma dos seres humanos e das diversas
outras espécies não seria possível sem o notável contudo a técnica simples
chamou o PCR.
Referências
http://ergo.berkeley.edu/be115/Lab09/PCRhistory.pdf
http://www.springerprotocols.com/Abstract/doi/10.1385/1-59259-384-4:3
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/12958470
https://classes.soe.ucsc.edu/bme215/Spring10/Reading%20Mater
ials/Polymerase%20chain%20reaction.pdf
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Last Updated: Aug 23, 2018
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https://www.news-medical.net/?tag=/Polymerase-Chain-Reaction
https://www.news-medical.net/life-sciences/The-Polymerase-Chain-Reaction.aspx
https://www.news-medical.net/life-sciences/Polymerase-Chain-Reaction-Applications.aspx
https://www.news-medical.net/life-sciences/Digital-PCR-and-Traditional-PCR-Whats-the-Difference.aspx
https://www.news-medical.net/life-sciences/What-is-Real-Time-Quantitative-PCR-(qPCR).aspx
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Written by
Susha Cheriyedath
Susha has a Bachelor of Science (B.Sc.) degree in Chemistry and Master of Science
(M.Sc) degree in Biochemistry from the University of Calicut, India. She always had a
keen interest in medical and health science. As part of her masters degree, she
specialized in Biochemistry, with an emphasis on Microbiology, Physiology,
Biotechnology, and Nutrition. In her spare time, she loves to cook up a storm in the
kitchen with her super-messy baking experiments.
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