Roteiro Aula Pratica Mecanismos efetores_2022

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Verificação de mecanismos efetores da Imunidade Inata 
 
1. Objetivos: 
a) Verificar a infecção de macrófagos por Trypanosoma cruzi na presença e ausência da 
molécula MYD88, que sinaliza os receptores inatos do tipo Toll. 
b) Verificar a dosagem do óxido nítrico (NO) produzido por esses macrófagos frente à atuação 
de diferentes estímulos. 
 
2. Introdução: 
A imunidade inata é a resposta inicial aos microorganismos que controla ou elimina 
infecções do hospedeiro. Uma das principais células da imunidade natural são os macrófagos 
que estão amplamente distribuídos nos tecidos onde desempenham papel crucial no 
reconhecimento, fagocitose e controle de microorganismos e apresentação de antígenos para os 
linfócitos T, iniciando assim, a resposta imune adaptativa. A imunidade adaptativa, por sua 
vez, utiliza as células acessórias, como os macrófagos para exercer suas funções efetoras. 
Os macrófagos contam com uma grande diversidade de mecanismos efetores para 
controlar infecções. Dentre esses mecanismos há um destaque para a geração de espécies 
reativas de nitrogênio, como o óxido nítrico (NO), importante no controle de parasitas 
intracelulares. 
No caso da infecção de macrófagos com o protozoário intracelular Trypanosoma 
cruzi, agente causador da Doença de Chagas, a produção de NO e a contagem do número das 
formas intracelulares do parasita (amastigota) são dois parâmetros importantes na avaliação 
dos mecanismos efetores. 
 
3. Materiais: 
a) Amostras de sobrenadantes dos seguintes macrófagos* (Ilustradas na Figura 1): 
1 – Macrófagos animal selvagem infectado com T.cruzi* 
2 – Macrófagos animal deficiente em MYD88 infectado com T.cruzi* 
3 – Macrófagos animal selvagem infectado com T.cruzi* e estimulado com rIFN-γ. 
4 – Macrófagos animal deficiente infectado com T.cruzi* e estimulado com rIFN-γ. * 
Sobrenadantes filtrados e testados, portanto livres de parasitas e perigo 
Roteiro da 
Aula Prática de Imunologia 
 
 
b) Meio de cultura RPMI (M). 
c) Placa de 96 well. 
d) Pipeta de 200 µL. 
e) Ponteira. 
f) Tubo eppendorf. 
g) Fotos de macrófagos de diferentes grupos infectados com T. cruzi coradas com DAPI. 
 
4. Procedimentos: 
Dosagem de óxido nítrico pelo Método Griess: 
Para fazer a mensuração de NO é importante destacar que o tempo médio de vida do 
NO é curto, o que significa que a permanência do mesmo no organismo é baixa. Isto torna 
muito difícil alcançar uma monitorização apurada do NO in vivo. Desta forma, a produção de 
NO em cultura de células pode ser estimada através do acúmulo do nitrito (NO2-), que é o 
produto de conversão estável do óxido nítrico. Esta medição pode ser realizada através de um 
ensaio colorimétrico para NO, conhecido como método de Griess. O aspecto visual é imediato. 
Ao colocar o reagente de Griess em presença de nitrito é possível verificar em quais poços 
ocorreu uma alta produção de NO através da coloração rósea que assume. A baixa produção de 
NO proporciona pequena ou nenhuma alteração colorimétrica. A concentração de nitrito (NO2) 
presente na amostra pode ser mensurada comparando-se com a curva padrão. 
 
 
Macrófago 
Selvagem 
Deficiente 
Infectado com o T. cruzi (1) 
Infectado com o T. cruzi e estimulado com o rIFN-γ (3) 
Infectado com o T. cruzi (2) 
 
Infectado com o T. cruzi e estimulado com o rIFN-γ (4) 
 
Figura 1: Esquema ilustrando as 4 amostras. 
Etapas: 
 
I. Colocar 30µL de meio de cultura RPMI (M) nos poços B1 até F1, como ilustrado na Figura 2. 
 
Figura 2: Esquema ilustrado a etapa I. 
 
 
II. Fazer diluição seriada (solução padrão): 
A diluição seriada ocorre da seguinte maneira: Colocar 60 µL de Nitrito 100 µM (P) no poço 
A1 e homogeneizar bem. Passar 30 µL do poço A1 para o poço B1 e assim sucessivamente, 
como ilustrado na Figura 3. 
 
Figura 3: Esquema ilustrando a etapa 2, diluição seriada. 
 
 
 
 
 
III. Colocar 30µL das amostras (1, 2, 3 e 4) do poço A2 até D2 (A2- amostra 1, B2- amostra 
2, C2- amostra 3, D2- amostra 4. Ilustrado na Figura 4. 
 
Figura 4: Esquema ilustrando a etapa III. 
 
 
IV. Adicionar 30 µL da solução de Griess em todos os poços. Como ilustrado na Figura 5. 
 
Figura 5: Esquema ilustrando a etapa IV. 
 
 
Visualização e análise das lâminas e fotos de macrófagos infectados com Trypanosoma 
cruzi 
Aula Prática: Questionário 
 
Nome:____________________________________________________________ 
 
Questão 1) Preencha o esquema com a localização de cada amostra e os resultados obtidos: 
 
 
Questão 2) De acordo com a coloração adquirida pela solução padrão de nitrito, a coloração 
adquirida por cada uma das amostras indica aproximadamente quais concentrações? 
 
Amostra 1: _____________ 
Amostra 2: ______________ 
Amostra 3: ____________ 
Amostra 4: _____________ 
 
Questão 3) De acordo com a concentração de NO encontrada pode-se dizer que: 
 
Amostra 1 corresponde ao sobrenadante de macrófagos dos animais ________________ submetidos 
a______________. 
Amostra 2 corresponde ao sobrenadante de macrófagos dos animais ________________ submetidos 
a______________. 
Amostra 3 corresponde ao sobrenadante de macrófagos dos animais ________________ submetidos 
a______________. 
Amostra 4 corresponde ao sobrenadante de macrófagos dos animais ________________ submetidos 
a______________. 
 
Questão 4) Relacione os dados obtidos com a intensidade de infecção dos macrófagos pelo T. cruzi