2020-DiogoVieiraTibery

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Universidade de Brasília – UnB 
 
Instituto de Ciências Biológicas – IB 
 
Programa de Pós-Graduação em Biologia Molecular 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Peptídeos isolados da peçonha da aranha caranguejeira 
Acanthoscurria paulensis: caracterização da atividade eletrofisiológica em 
canais iônicos dependentes de voltagem 
 
 
 
 
 
 
 
Autor: Diogo Vieira Tibery 
 
 
Brasília - DF 
Fevereiro, 2020 
2 
 
Agradecimentos 
 
Inicialmente, gostaria de agradecer aos meus pais e minha família que me apoiaram 
todos os dias e me deram condições para me dedicar exclusivamente à pesquisa. 
Agradecer à minha namorada que me deu todo o apoio nessa etapa crucial da minha 
vida e sempre me deu suporte nos momentos mais difíceis. 
Agradecer à minha orientadora Elisabeth Schwartz por ter me dado oportunidade desde 
2013, quando iniciei a pesquisa, oferecendo projetos de iniciação científica. Por toda a 
orientação necessária para a realização desse trabalho e suporte. 
Agradecer à Dra. Caroline Barbosa Mourão por ter me aceitado como seu estagiário e 
compartilhado conhecimentos sobre a toxinologia. 
Agradecer ao Dr. Leandro Ambrósio por ter me ensinado a técnica de Patch Clamp. 
Aos meus colegas de pesquisa que me ajudaram diariamente durante esse projeto ou em 
algum momento dentro da pesquisa Daniel da Mata, Alessa Bembom, Isolda Monteiro, Mariza 
Mendanha, Gabriel Avohay, Luís Felipe Santos Menezes, Harry Morales, Beatriz Sarmiento, 
Adolfo Carlos Barros de Souza, Elias Sabiá e Danilo Gustavo. 
Agradeço ao Professor Lourival Possani por me aceitar em seu laboratório no Instituto 
de Biotecnologia (IBT) da Universidad Autónoma De México - Cuernavaca (UNAM). Ao Dr. 
Ernesto Ortiz e Dra. Rita Restano-Cassulini por terem me oferecido todo o suporte necessário 
para minha estadia no México. 
Agradeço ao programa de Pós-graduação em Biologia Molecular pela oportunidade. 
Agradeço a CAPES, CNPq e FAPDF pelo apoio financeiro dado durante o período deste 
projeto. 
 
 
 
 
3 
 
Resumo 
 
Aranhas são artrópodes da ordem Aranae que possuem em suas peçonhas uma grande 
diversidade de compostos, como sais, ácidos orgânicos, enzimas, proteínas e peptídeos. Dentre 
esses compostos os peptídeos possuem grande interesse farmacológico devido à atividade 
neurotóxica por meia da ação em canais iônicos dependentes de voltagem presentes no sistema 
nervoso central, sistema nervoso periférico, músculo cardíaco e músculo esquelético. Da 
peçonha da aranha caranguejeira encontrada no território brasileiro Acanthoscurria paulensis, 
foram descritos aproximadamente 100 componentes. Dentre esses componentes apenas uma 
toxina peptídica Ap1a foi purificada e caracterizada quanto à sua atividade biológica. Neste 
trabalho foram purificadas cinco novas toxinas peptídicas nomeadas como Ap2, Ap3, Ap4, Ap5 
e Ap6 por RP-HPLC, sequenciadas por In-souce Decay e suas sequências completadas e 
confirmadas pela análise no transcritoma da glândula de peçonha de A. paulensis. Os peptídeos 
Ap2, Ap3, Ap4, Ap5 e Ap6 possuem, respectivamente, com 42, 41, 35, 46 e 31 resíduos de 
aminoácidos, e, massas moleculares experimentais de 4886,3 Da, 4883,7 Da, 3870,76 Da, 
5454,9 Da e 3717,9 Da, sendo que o peptídeo Ap2, apresenta a serina do C-terminal amidada. 
Buscas em bancos de dados públicos de sequências indicaram que peptídeos Ap2, Ap3, Ap4, 
Ap5 e Ap6 possuem similaridades com toxinas peptídicas que apresentam o motivo estrutural 
conhecido como ICK (Inhibitory Cystine Knot) sendo possíveis moduladoras de canais iônicos. 
Desta forma, as toxinas isoladas neste trabalho foram submetidas a ensaios eletrofisiológicos 
em canais de Na+ (NaV) e de Ca2+ (CaV) dependentes de voltagem. Dentre os canais NaV1.1, 
NaV1.5, NaV1.7, CaV1.2, CaV2.1 e CaV2.2 testados, as toxinas Ap2, Ap3, Ap5 e Ap6, 
apresentaram atividade, com inibição entre 10 e 30%, nos canais CaV2.1. Estas quatro toxinas 
são, portanto, caracterizadas como as primeiras ω-toxinas de aranhas caranguejeiras do gênero 
Acanthoscurria com atividade em canais de cálcio descritas. A toxina Ap3 inibiu em 6,6%, 
4,2% e 12,05% os canais NaV1.1, Nav1.5 e Nav1.7 respectivamente. O presente trabalho 
contribui para a ampliação do conhecimento a respeito dos componentes da peçonha de aranhas 
no Brasil, assim como para a descrição de novos compostos bioativos que podem ser utilizados 
como ferramentas farmacológicas para compreensão do mecanismo de funcionamento de 
canais iônicos e da interação com toxinas peptídicas. 
 
 
4 
 
 
Resumo em Inglês – Abstract 
 
Spiders are arthropods from the Aranae order that have in their venoms a great diversity 
of compounds, such as salts, organic acids, enzymes, proteins and peptides. Among these 
compounds, peptides are of pharmacological interest due to their neurotoxic activity, acting on 
voltage-dependent ion channels present in the central nervous system, peripheral nervous 
system, cardiac muscle and skeletal muscle. In the venom of the spider Acanthoscurria 
paulensis found in Brazilian territory, approximately 100 components were described, among 
these components only the peptide toxin Ap1a was purified and had experiments to characterize 
biological activity. In this present work, five new peptide toxins entitled as Ap2, Ap3, Ap4, 
Ap5 and Ap6 were purified by RP-HPLC, sequenced by In-souce Decay and their sequences 
completed and confirmed by analysis in the transcriptome of the venom gland. A. paulensis. 
The Ap2, Ap3, Ap4, Ap5 and Ap6 peptides have, respectively, 42, 41, 35, 46 and 31 amino 
acid residues, and experimental molecular masses of 4886.3, 4883.7, 3870.76, 5454.9 and 
3717.9 Da, with the Ap2 peptide having the amidated C-terminal serine. Searching in sequence 
databases indicated that Ap2, Ap3, Ap4, Ap5 and Ap6 peptides have similarities with peptide 
toxins that present the structural motif known as ICK (Inhibitory Cystine Knot), which have the 
possibility of modulating ion channels. The toxins isolated in the present work were submitted 
to electrophysiological experiments in voltage-dependent Na+ (NaV) and Ca2+ (CaV) 
channels. Among the channels NaV1.1, NaV1.5, NaV1.7, CaV1.2, CaV2.1 and CaV2.2 tested, 
the toxins Ap2, Ap3, Ap5 and Ap6, showed inhibition activity between 10 and 30%, in CaV2.1 
channel. These four toxins are, therefore, characterized as the first ω-toxins of spiders of the 
genus Acanthoscurria that have activity in calcium channels described. The Ap3 toxin inhibited 
the channels NaV1.1, NaV1.5 and NaV1.7 by 6.6%, 4.2% and 12.05% respectively. With these 
results, the present work contributes to the expansion of knowledge about the components of 
the venom of spiders in Brazil, as well as to the description of new bioactive compounds that 
can be used as pharmacological tools to understand the mechanism of functioning of ion 
channels and interaction with peptide toxins. 
 
 
5 
 
Lista de Ilustrações 
 
Figura 1 - Espécime fêmea de Acanthoscurria paulensis. ........................................ 11 
Figura 2 - Representação esquemática do Canal de Sódio Dependente de Voltagem.. 17 
Figura 3 - Ilustração Canal de Cálcio Dependente de Voltagem. ............................... 22 
Figura 4 - Protocolos de estímulo utilizado para o Patch Clamp................................ 33 
Figura 5 - Cromatograma de 5 mg peçonha bruta A. paulensis por RP-HPLC.. ......... 36 
Figura 6 – Cromatograma purificação do peptídeo Ap2.. .......................................... 37 
Figura 7 - Espectro de Massas do peptídeo Ap2. ....................................................... 37 
Figura 8 – Cromatograma Purificação do peptídeo Ap3. ........................................... 38 
Figura 9 - Espectro de Massas do peptídeo Ap3. ....................................................... 39 
Figura 10 – Cromatograma Sub-fracionamento da fração os peptídeos Ap4 e Ap5. ... 40 
Figura 11 – Cromatograma Purificação do peptídeoAp4. ......................................... 41 
Figura 12 - Espectro de Massas do peptídeo Ap4.. .................................................... 41 
Figura 13 – Cromatograma Purificação do peptídeo Ap5. ......................................... 42 
Figura 14 - Espectro de massas do peptídeo Ap5 ...................................................... 43 
Figura 15 – Cromatograma Purificação do peptídeo Ap6. ......................................... 44 
Figura 16 - Espectro de massas do peptídeo Ap6. ..................................................... 44 
Figura 17 - Sequência parcial do peptídeo Ap2 obtida por meio da técnica de 
espectrometria de massas (MS) pelo método de In-Source Decay (ISD). .............................. 45 
Figura 18 - Sequência parcial do peptídeo Ap3 obtida por meio da técnica de 
espectrometria de massas (MS) pelo método de In-Source Decay (ISD). .............................. 46 
Figura 19 - Sequência parcial do peptídeo Ap4 obtida por meio da técnica de 
espectrometria de massas (MS) pelo método de In-Source Decay (ISD).. ............................. 47 
Figura 20 - Sequência parcial do peptídeo Ap5 obtida por meio da técnica de 
espectrometria de massas (MS) pelo método de In-Source Decay (ISD).. ............................. 48 
Figura 21 - Sequência parcial do peptídeo Ap6 obtida por meio da técnica de 
espectrometria de massas (MS) pelo método de In-Source Decay (ISD).. ............................. 49 
Figura 22 - Alinhamento múltiplo das sequências completas obtidas dos peptídeos 
purificados.. ......................................................................................................................... 49 
Figura 23 - Espectro de massas da fração contendo Ap4 e Ap4b. .............................. 50 
Figura 24 - Alinhamento dos peptídeos Ap4 e Ap4b. ................................................ 50 
Figura 25 - Probabilidade de abertura em canais NaV na presença da Ap2 (1µM). ..... 51 
6 
 
Figura 26 - Traços Brutos obtidos nos Canais NaV na presença do peptídeo Ap2 1µM.
 ............................................................................................................................................ 51 
Figura 27 - Probabilidade de abertura em canais NaV na presença da Ap3 1µM. ........ 52 
Figura 28 - Traços Brutos obtidos nos Canais NaV na presença da Ap3 1µM. ........... 52 
Figura 29 - Probabilidade de abertura em canais NaV na presença da Ap4 1µM......... 53 
Figura 30 - Traços Brutos obtidos em Canais NaV na presença da Ap4 1µM. ............ 53 
Figura 31 - Probabilidade de abertura em canais NaV na presença de Ap5 1µM. ....... 54 
Figura 32 - Traços Brutos obtidos em Canais NaV na presença de Ap5 1µM. ............ 54 
Figura 33 - Probabilidade de abertura em canais NaV na presença de Ap6 1µM. ....... 55 
Figura 34 - Traços Brutos obtidos em Canais NaV na presença de Ap6. .................... 55 
Figura 35 – Caracterização eletrofisiológica obtida em canais CaV na presença do 
Peptídeo Ap2 ....................................................................................................................... 58 
Figura 36 – Caracterização eletrofisiológica obtida em canais CaV na presença do 
Peptídeo Ap3. ...................................................................................................................... 59 
Figura 37 – Caracterização eletrofisiológica obtida em canais CaV na presença do 
Peptídeo Ap4. ...................................................................................................................... 60 
Figura 38 – Caracterização eletrofisiológica obtida em canais CaV na presença do 
Peptídeo Ap5.. ..................................................................................................................... 61 
Figura 39 – Caracterização eletrofisiológica obtida em canais CaV na presença do 
Peptídeo Ap6. ...................................................................................................................... 62 
Figura 40 - Alinhamento Ap2, Ap3 e Ap5 ................................................................ 65 
Figura 41 – Alinhamento múltiplo com peptídeos que apresentaram similaridade com 
os Peptídeos Ap2, Ap3 e Ap5. .............................................................................................. 68 
Figura 42 - Alinhamento Múltiplo com os peptídeos que apresentaram similaridade com 
o peptídeo Ap4.. ................................................................................................................... 70 
Figura 43 - Alinhamento Múltiplo com os peptídeos que apresentaram similaridade com 
o peptídeo Ap6. .................................................................................................................... 72 
 
 
7 
 
Lista de tabelas 
 
Tabela 1 - Isoformas do Canais NaV humanos. SNC - Sistema Nervoso Central; SNP – 
Sistema Nervoso Periférico .................................................................................................. 18 
Tabela 2 - Isoformas das subunidades α1 dos canais CaV .......................................... 21 
Tabela 3 – Nomenclatura de toxinas baseadas na função farmacológica. Adaptado de 
King et al., 2008................................................................................................................... 23 
Tabela 4 Valores das médias de ΔV1/2 e Fu obtidos para os canais de sódio na presença 
dos peptídeos de aranha. Dados obtidos pelo ajuste na equação de Boltzmann (ΔV1/2), cálculo 
da fração de fração não inibida (Fu) e número de observações (n). Valores de média e erro 
padrão. Valores com (*) são estatisticamente significantes. .................................................. 56 
Tabela 5 – Valores das médias da porcentagem de inibição (%) em canais cálcio. 
Valores com * são estatisticamente significantes. ................................................................. 63 
 
 
8 
 
Lista de Siglas e Abreviaturas 
ABS: Absorbância 
ACN: Acetonitrila 
BLAST: Basic Local Alignment Search Tool 
CaV: Canal de cálcio dependente de voltagem 
CHO: Células de Ovário de hamster chinês 
Da: Daltons 
DDH: Disulfide-directed β-hairpin 
DRG: Gânglios da raiz dorsal 
DUM: Dorsal unpaired median 
gNa: Condutância ao íon sódio 
HEK: Células embrionárias de rim humano 
HVA: High-voltage-activated 
ICK: Inhibitory Cystine Knot 
TFA: Ácido trifluoroacético 
ACN: Acetonitrila 
HCCA: α-Cyano-4-hydroxynnamic acid 
DAN: 1,5 Diaminonaftaleno 
ISD: In-source Decay 
NaV: Canal de sódio dependente de voltagem 
KV: Canal de potássio dependente de voltagem 
VMax: Voltagem que estimula a corrente de maior amplitude 
HnTx: Hainantoxina 
HwTx: Huwentoxina 
PSM: Motivo estrutural principal ICK 
ESM: Motivo estrutural extra ICK 
 
 
 
 
9 
 
Sumário 
Agradecimentos ...................................................................................................... 2 
Resumo .................................................................................................................. 3 
Lista de Ilustrações ................................................................................................. 5 
1 – Introdução ....................................................................................................... 11 
Aranhas caranguejeiras – Generalidades ........................................................... 11 
Acanthoscurria paulensis .................................................................................. 11 
Composição bioquímica da peçonha de aranhas ................................................ 12 
Acilpoliaminas .................................................................................................. 12 
Peptídeos Lineares ............................................................................................ 12 
Motivos estruturais de toxinas peptídicas de aranhas ......................................... 13 
Eletrofisiologia– História ................................................................................. 14 
Canais iônicos e o Potencial de Ação ................................................................ 15 
Canais de Sódio (NaV) ...................................................................................... 16 
Sítios de Ligação nos NaV e as Toxinas ICK ..................................................... 18 
Canais de Cálcio (CaV)...................................................................................... 20 
Nomenclatura para toxinas .................................................................................... 23 
Peçonha de aranha e seus potenciais farmacológicos ......................................... 24 
Estudos da caracterização da peçonha de Acanthoscurria paulensis .................. 25 
2 – Justificativa ..................................................................................................... 26 
3 – Objetivos ........................................................................................................ 27 
3.1 – Objetivo Geral .......................................................................................... 27 
3.2 – Objetivos Específicos ............................................................................... 27 
4 - Metodologia .................................................................................................... 28 
4.1 Extração da Peçonha por eletroestimulação ................................................. 28 
4.2 Cromatografia Líquida de Alta eficiência em Fase Reversa (RP-HPLC) ...... 28 
4.3 Espectrometria de massa (MALDI TOF/TOF) ................................................ 30 
10 
 
4.4 Quantificação dos peptídeos (Colorimetria BCA-Cobre) ................................. 30 
4.5 Sequenciamento (In-source Decay – MALDI TOF-TOF) ................................ 30 
4.6 Busca por similaridade .................................................................................... 30 
4.7: Cultura de células .......................................................................................... 31 
4.8 Plasmídeos – Canais de cálcio dependentes de voltagem ............................. 31 
4.9 Transfecção Transiente canais de Calcio dependentes de voltagem ............. 32 
4.10 Eletrofisiologia – Setup experimental para Patch Clamp ........................... 32 
4.11 Eletrofisiologia – Análise de dados............................................................ 33 
5 – Resultados ...................................................................................................... 36 
5.1 Fracionamento de peçonha Bruta e Purificação dos peptídeos ..................... 36 
5.2 Sequenciamentos......................................................................................... 45 
5.3 Eletrofisiologia em canais de sódio dependentes de voltagem...................... 51 
5.4 Eletrofisiologia em canais de cálcio dependentes de voltagem ..................... 57 
6 – Discussão ........................................................................................................ 64 
5 – Conclusão ....................................................................................................... 75 
6 – Perspectivas .................................................................................................... 76 
Referências Bibliográficas .................................................................................... 77 
 
 
 
11 
 
1 – Introdução 
Aranhas caranguejeiras – Generalidades 
As aranhas são artrópodes, filo que constitui aproximadamente 75-85% das espécies 
conhecidas. Pertencem à ordem Aranae e habitam o ambiente terrestre há mais de 300 milhões 
de anos, pela datação de fósseis. Existindo atualmente catalogadas 48.424 espécies em 120 
famílias e 4154 gêneros (Natural History Museum Bern, 2020). A família das aranhas 
Theraphosidae popularmente conhecidas como tarântulas ou caranguejeiras, possuem 
atualmente 147 gêneros descritos (Escoubas and Rash, 2004; Natural History Museum Bern, 
2020; Rash and Hodgson, 2002). As aranhas possuem glândulas produtoras de peçonha 
localizadas abaixo do segmento queliceral e quelíceras capazes de injetar a peçonha, sendo a 
peçonha utilizada tanto para predação de invertebrados e pequenos vertebrados, como proteção 
contra vertebrados maiores (Escoubas and Rash, 2004). 
Acanthoscurria paulensis 
Dez espécies do gênero Acanthoscurria foram descritas no Brasil por Mello-Leitão em 
1923 (Mello-Leitão, 1923). Dentre essas espécies foi catalogada a Acanthoscurria paulensis a 
partir de um macho encontrado em Pirassununga no Estado de São Paulo. Vellard, em 1924, 
descreveu a espécie Acanthoscurria atrox que posteriormente foi identificada como a mesma 
espécie que A. paulensis por Lucas e colaboradores 2010 e foi mantido o nome dado por Mello-
Leitão (Lucas et al., 2010). 
 
Figura 1 - Espécime fêmea de Acanthoscurria paulensis. Fotos: Diogo Tibery. Esquerda: Vista 
Dorsal de exemplar de Acanthoscurria paulensis fêmea. Direita: Vista ventral de exemplar de 
Acanthoscurria paulensis fêmea 
 
12 
 
Composição bioquímica da peçonha de aranhas 
Os componentes da peçonha de aranha são produzidos pelas glândulas secretoras, sendo 
revestidas por uma camada de músculo que controla a liberação de peçonha e inervada por 
pequenos axônios, sugerindo um controle nervoso sobre as células secretoras (Malli et al., 
2000). São descritos componentes de baixa massa molecular, peptídeos, proteínas e enzimas 
(Langenegger et al., 2019). Os componentes de baixa massa molecular caracterizados são 
aminoácidos livres, íons, acilpoliaminas, ácidos orgânicos, nucleotídeos e nucleosídeos (Kuhn-
Nentwig et al., 2011). 
 
Acilpoliaminas 
As acilpoliaminas são um grupo de compostos estruturados a partir de um grupo 
aromático acil e um esqueleto de poliaminas, podendo estar presente alguns aminoácidos em 
seu esqueleto, com massas moleculares de 350 a 1000 Da (Kuhn-Nentwig et al., 2011; 
Manzoli-Palma et al., 2006). As acilpoliaminas possuem como um dos alvos moleculares os 
canais ionotrópicos, atuando, por exemplo, em receptores de glutamato (GluR) de insetos e de 
mamíferos, despertando interesse como inseticidas, ou como fármacos (Mellor and Usherwood, 
2004). A acilpoliamina AG489 da aranha Agelenopsis aperta apresentou atividade inibitória no 
receptor de capsaicina TRPV1, um canal catiônico não seletivo, mostrando o grande potencial 
farmacológico desses compostos (Manzoli-Palma et al., 2006). 
 
Peptídeos Lineares 
 Os peptídeos lineares da peçonha de aranha não apresentam cisteínas em suas 
sequências primárias, podendo apresentar a formação de α-hélices, e são classificados como 
possíveis peptídeos citolíticos ou antimicrobianos (AMPs), apresentando características 
catiônicas (Kuhn-Nentwig, 2003; Langenegger et al., 2019). Tais toxinas possuem alta 
densidade de aminoácidos com cadeias laterais carregadas positivamente, como Arginina e 
Lisina (Corzo and Escoubas, 2003), que apresentam atração pelos grupos com carga negativa 
presentes nos fosfolipídios de membranas celulares e promovem desestabilização com 
formação de poros (Langenegger et al., 2019). 
13 
 
Motivos estruturais de toxinas peptídicas de aranhas 
Toxinas peptídicas ricas em cisteínas encontradas em peçonhas de aranhas 
caranguejeiras formam ligações dissulfeto entre si, permitindo a formação de estruturas 
compactadas. Três motivos estruturais compreendem tais toxinas peptídicas, o motivo ICK 
(inhibitor cystine-knot), o motivo DDH (disulfide direct β-hairpin) e o motivo Kunitz-like 
(Vassilevski et al., 2009). 
O motivo de ICK é caracterizado por uma folha beta de 3 fitas antiparalelas que são 
estabilizados por 3 ligações dissulfeto (King et al., 2002). O motivo estrutural segue o consenso 
da disposição dos resíduos de cisteínas C1X3-7C2X3-6C3X0-5C4X1-4C5X4-13C6, onde Cn é onúmero da cisteína na estrutura primária e Xn é número de resíduos de aminoácidos entre as 
cisteínas; ocorre um anel de cistina nas ligações C1-C4 e C2-C5 e que são transpassados por uma 
terceira cistina C3-C6 formando um nó entre as cistinas (Norton and Pallaghy, 1998; Pallaghy et 
al., 1994). O “submotivo” PSM (Principal structural Motif) dentro do motivo ICK, restringe as 
quatro primeiras cisteínas C1X3-7C2X3-6C3X0-5C4X1 como a região responsável pela possível 
atividade neurotóxica. Outro “submotivo” foi descrito para toxinas com 7 ou 8 cisteínas que 
seguem o padrão ICK nas 6 primeiras cisteínas mas apresentam cisteínas extras, tal motivo foi 
escrito como ESM (Extra structural motif) e apresenta a adição de resíduos de aminoácidos 
após a C6 com mais duas cisteínas intercaladas por apenas um resíduo de aminoácidos, seguindo 
o consenso C5X4-13 C6XnC7X1C8 (Kozlov et al., 2005) 
No motivo DDH, não existe a formação do nó de cistinas e ocorre a formação de uma 
estrutura β-Hairpin estabilizada por duas ligações dissulfeto obrigatórias (C1-C4 e C2-C5), 
seguindo uma sequência consenso de CX5-19CX2-[G ou P]-X2CX6-19C. Acredita-se que o 
motivo DDH seja a estrutura que deu origem, na evolução molecular, ao motivo ICK (Wang et 
al., 2000; Escoubas and Rash, 2004). 
O motivo do tipo Kunitz apresenta a ligação das cisteínas no consenso C1-C6, C2-C5, 
C3-C5, permitindo a formação de uma folha-β antiparalela (Langenegger et al., 2019). Nas 
aranhas caranguejeiras Ornithoctonus huwena e O. hainana foi descrita uma nova família de 
KTT (Kunitz type toxins) capaz de inibir serinoproteases e que apresenta atividade fraca em 
canais de potássio KV1.1 (Yuan et al., 2008). 
 
14 
 
Eletrofisiologia – História 
O início da eletrofisiologia se dá pelos estudos de Luige Galvani ,em 1771, ao supor 
uma energia elétrica vital em formato de fluido, responsável pela condução nervosa e a 
contração muscular ao observar a contração muscular nas pernas de sapo após contato de um 
equipamento eletricamente carregado (Piccolino, 1998). Allesandro Volta, em 1800, produziu 
a primeira bateria eletroquímica baseada em placas de zinco e cobre, sendo um passo essencial 
para os futuros experimentos de Giovanni Aldini que utilizou a energia proveniente das baterias 
para demonstrar a “reanimação” do corpo de um assassino recém executado. Carlo Matteuci, 
em 1840, após a criação do galvanômetro em 1820 por Hans Oersted, utilizou o galvanômetro 
para detecção de um fluxo de corrente elétrica em músculos intactos e, ao colocar pernas de rã 
em série, a corrente detectada apresentava-se maior com a adição de mais pernas em série, 
mostrando a origem de natureza biológica da corrente elétrica detectada (Piccolino and Wade, 
2012). 
 A eletrofisiologia “moderna” se inicia em 1939 por Alan Hodgkin e Andrew Huxley 
pelo primeiro registro de um potencial de ação da fibra de um axônio gigante de lula (Hodgkin 
and Huxley, 1939). Entre 1947 e 1949, surgiu a ideia de controle da voltagem (Voltagem 
Clamp) das membranas com o uso de dois eletrodos, sendo um para o controle da voltagem e 
outro para o registro da variação de corrente. Dessa forma, permitiu o registro de correntes 
iônicas diretamente, sem a presença dos problemas causados pelos outros métodos de registro, 
sendo tal advento do trabalho de K. S. Cole, G. Marmont, A. Hodgkin e A. Huxley (Hille, 
2001). 
 A. Hodgkin e A. Huxley , em 1952, após diversos estudos com variações de condições 
das soluções de registro descobriram que as correntes iônicas tinham como principais 
componentes os íons Na+ e K+, sendo esses dois componentes separados e descritos como 
correntes de sódio e correntes de potássio. Ao analisar as cinéticas das correntes de sódio e 
potássio foi proposto o modelo “m3h, n4,” em que se supôs que para um canal de potássio abrir 
por uma variação de voltagem necessitaria de partículas carregadas “n”, sendo que n4 
apresentaria a cinética ideal para o ajuste dentro dos dados experimentais, sendo a condutância 
do íon potássio gK = Gkn4 e, para as correntes de sódio, foi proposto a presença partículas m, 
sendo m3 o ajuste ideal para a ativação do canal e h a partícula de inativação, sendo a 
condutância do sódio gNa=gNam3h. Descrição de tal modelo na época impressiona, pois não 
havia conhecimento sobre os sensores de voltagem do canal de sódio, que foi apenas descrito 
15 
 
em 1980 por Beneski e Catterral, sendo o movimento de três sensores associados diretamente 
ao processo de ativação do canal e um sensor relacionado ao processo de inativação do canal 
(Hodgkin and Huxley, 1952; Schwiening, 2012; Beneski and Catterall, 1980; Catterall, 2017). 
 
Canais iônicos e o Potencial de Ação 
Os canais iônicos dependentes de voltagem são proteínas transmembrânicas que 
apresentam seletividade maior para um íon específico dos fluídos intracelulares ou 
extracelulares. A estrutura básica de um canal iônico dependente de voltagem consiste em 
quatro domínios transmembrânicos que se unem formando poro iônico seletivo e uma região 
ao redor do poro responsável por captar as variações de voltagem na membrana e produzir 
alterações conformacionais para a abertura do poro iônico. Tal estrutura básica é conservada 
com modificações específicas para cada um dos canais dependentes de voltagem existentes. 
Os canais iônicos são responsáveis pela excitabilidade elétrica das células em 
organismos, sendo os elementos excitáveis básicos na membrana celular dos nervos, músculos 
e outros tecidos possibilitando a iniciação, propagação e transdução do sinal elétrico (Hille, 
2001; Yu and Catterall, 2003; Yu, 2005). Os canais de sódio dependentes de voltagem são 
ativados com variação de milivolts na membrana que, ao atingir o limiar, permite o influxo 
substancial de íons Na+ para o interior da célula e promove a despolarização da membrana. Ao 
despolarizar a membrana, canais de potássio são ativados e permitem o efluxo de íons K+ para 
a repolarização da membrana em valores negativos. Entre o processo de despolarização total da 
membrana e a repolarização, ocorre a ativação dos canais de cálcio, que apresentam limiar de 
ativação entre os canais de sódio e potássio, gerando o influxo do íon Ca2+ que, além de 
transmitir cargas positivas para dentro da célula, funciona como segundo mensageiro em 
respostas celulares. Tal processo descrito é conhecido como potencial de ação (Catterall et al., 
2017). O potencial de ação foi o mecanismo selecionado pela evolução para a rápida 
transmissão de informações em formato de sinal elétrico a partir do sistema nervoso para 
células, tecidos, músculos, com velocidade de transmissão e amplitudes constantes em 
condições fisiológicas ideais (Raghavan et al., 2019). 
 
16 
 
Canais de Sódio (NaV) 
Os canais de sódio dependentes de voltagem (NaV) são proteínas transmembrânicas 
formadas por duas subunidades (α/β), a subunidade α formadora de poro possui 
aproximadamente 260 kDa e 2000 resíduos de aminoácidos organizados em quatro domínios 
homólogos (DI-DIV), sendo que cada um dos domínios é formado por seis segmentos 
transmembrânicos (S1-S6) (Figura 2). Os domínios são bem conservados entre si, apresentando 
a região conhecida como sensor de voltagem localizada entre os segmentos transmembrânicos 
S1-S4 e a região formadora de poro S5-S6. 
Os segmentos transmembrânicos S4 possuem resíduos de Arg e Lys intercalados por 
outros aminoácidos, caracterizando uma região rica em resíduos com cargas positivas 
conhecidas como Gating charges (Ahern et al., 2016). A condutância ao sódio pelo canal se 
inicia pela despolarização da membrana que altera o campo elétrico em que as Gating charges 
dos resíduos Arg e Lys estão estabilizadas e promove assim o deslocamento dos segmentos 
transmembrânicos S4 para a porção extracelular e o movimento dos segmentos S4 entre 
segmentos hidrofóbicos em que estão alocados promove a movimentação entre as alçasde 
ligação entre segmentos S4-S5 e afasta assim os segmentos S6, iniciando o influxo do íon Na+ 
(Yan et al., 2017; Clairfeuille et al., 2019; Ahern et al., 2016). 
Os sensores de voltagem dos domínios DI, DII e DIII se movimentam mais rápido que 
o sensor de voltagem do DIV e essa assincronia na movimentação é uma característica essencial 
no processo de ativação e inativação do canal, uma vez que a movimentação do sensor de 
voltagem do domínio 4 está associada ao deslocamento de uma alça intracelular entre o DIII e 
DIV que contém um motivo IFM (isoleucina, fenilalanina, metionina) que atua como uma 
comporta de inativação do canal, interrompendo rapidamente a condutância do Na+ e 
caracterizando o processo de inativação rápida, única dos canais NaV (Lacroix et al., 2013; 
Goldschen-Ohm et al., 2013; Capes et al., 2013). 
 
17 
 
 
Figura 2 - Representação esquemática do Canal de Sódio Dependente de Voltagem. Em 
verde a representação da região sensor de voltagem S1-S4. Em vermelho as alças intracelulares 
entre os segmentos S4-S5. Em Azul escuro representação dos segmentos formadores de poro 
S5-S6 (Adaptado de W. A. Catterall and Swanson 2015). 
 
O filtro de seletividade está presente na parte superior do caminho de passagem para o 
íon, sendo formado por 4 cargas negativas oriundas de resíduos de ácido glutâmico na parte 
mais extracelular no canal de bactéria NaVAb, formando a estrutura chamada de HFS (High-
Field-Strength) altamente carregada, também conhecida como DEKA em canais de mamífero, 
formada pelos resíduos Asp373-Glu901-Lys1421-Ala1713, sendo essa estrutura essencial para 
a seletividade ao íon Na+ (Payandeh et al., 2011; Catterall, 2017; Jiang et al., 2020). 
Em humanos, são descritas atualmente 9 isoformas da subunidade α (NaV1.1-NaV1.9) 
com particularidades quanto ao funcionamento e distribuição nos tecidos do sistema nervoso 
central, sistema nervoso periférico, músculo esquelético e músculo cardíaco (Alexander et al., 
2015; Kwong and Carr, 2015) (Tabela1). 
 
 
 
 
18 
 
Tabela 1 - Isoformas do Canais NaV humanos. SNC - Sistema Nervoso Central; SNP – 
Sistema Nervoso Periférico 
Isoforma Expressão Gene 
 
NaV1.1 SNC, SNP SCN1A 
NaV1.2 SNC, SNP SCN2A 
NaV1.3 SNC, SNP SCN3A 
NaV1.4 Músculo Esquelético SCN4A 
NaV1.5 Músculo Cardíaco SCN5A 
NaV1.6 SNC, SNP SCN8A 
NaV1.7 SNP SCN9A 
NaV1.8 SNP SCN10A 
NaV1.9 SNC SCN11A 
 
Existem dois tipos de subunidades β no canal de sódio β1/β3 e β2/β4, sendo que as 
subunidades β1/β3 não são ligadas covalentemente à subunidade α, já as subunidades β2/β4 
apresentam ligações dissulfeto com a subunidade formadora de poro (Gilchrist et al., 2013). As 
subunidades beta são capazes de modular o funcionamento da subunidade alfa aumentando a 
amplitude das correntes, alterando a dependência de voltagem na ativação e inativação do canal 
(Bouza and Isom, 2018). 
Os canais de sódio dependentes de voltagem em insetos são bastante semelhantes aos 
canais de mamíferos, com pequenas modificações em sequência e sensibilidade aos 
moduladores. Igualmente aos canais de mamífero, são constituídos de 4 domínios homólogos 
e cada domínio possui os seis segmentos transmembrânicos, com a região do sensor de 
voltagem, a região formadora de poro e a de inativação rápida pela presença de um motivo 
MFM, similar ao motivo IFM de mamíferos (Du et al., 2016). Já foram caracterizados diversos 
canais de insetos, como o BgNaV da barata Blattella germanica, Vssc1 da mosca doméstica e 
os canais PaFPC1e NaVpas da barata Periplaneta americana (Du et al., 2016; Shen et al., 2017) 
 
Sítios de Ligação nos NaV e as Toxinas ICK 
Devido à sua grande função como iniciador do potencial de ação em diversos tecidos, o 
canal de sódio é o alvo de diversas toxinas com sítios de ligação ao canal bem definidos (Cestèle 
and Catterall, 2000; Catterall et al., 2007). 
19 
 
São descritos 5 sítios de interação das neurotoxinas ao canal de sódio, o sítio de interação 
1 é o poro iônico, formado pelas alças intracelulares S5-S6 dos quatro domínios, sendo esse o 
sítio de ligação das toxinas tetrodotoxina (TTX) e saxitoxina (STX), que ao ligarem ao canal 
promovem bloqueio da corrente iônica sem alteração na dependência da voltagem. O sítio de 
interação 2 consiste no segmento S6 do domínio I pela porção intracelular, sendo o alvo 
molecular toxinas lipossolúveis e alcaloides, a ligação a esse sítio promove uma inibição do 
processo de inativação rápida do canal de sódio. O sítio de interação 3 é conhecido por ser a 
região de interação das toxinas α de escorpião, constituído da alça extracelular S3-S4 do 
domínio 4, sua interação por toxinas α de escorpião promove um atraso ou inibição do processo 
de inativação rápida, efeito similar ao da ligação pelo sítio 2, mas com interação extracelular. 
O sítio de interação 4 é o sítio de atuação das toxinas β de escorpião, formado pelas alças 
extracelulares do sensor de voltagem do domínio II, a sua ligação por β-toxinas de escorpião 
promove um aumento da excitabilidade do canal em voltagens próximas ao potencial de 
repouso, alterando a dependência de voltagem do canal de sódio junto com a inibição da 
amplitude de corrente. O sítio de interação 5 é composto pelo segmento S6 do domínio I e do 
segmento S5 do domínio 4 pela região intracelular, sua ligação por compostos lipofílicos 
promove efeito parecido com o da ligação ao sitio 2, com inibição da inativação rápida, mas 
com o adicional de deslocamento da voltagem para ativação do canal para potenciais mais 
negativos (Catterall et al., 2007; Cestèle and Catterall, 2000; Cestèle et al., 1998; Zilberberg et 
al., 1997; Lukowski and Narayan, 2019). 
Toxinas de aranha com o motivo ICK são descritas com a capacidade de interagir com 
os sítios 3 e/ou 4 dos canais de sódio, promovendo tanto a inibição do canal por aprisionar o 
sensor de voltagem do domínio II no estado fechado, quanto o aumento da excitabilidade do 
canal por manter o sensor de voltagem do domínio II no estado ativado up e a inibição da 
inativação rápida por manter o sensor de voltagem do domínio 4 aprisionado na posição down 
(Dongol et al., 2019). 
A superfície hidrofóbica rodeada por resíduos carregados formado pelo dobramento das 
toxinas compactadas pelo motivo ICK é uma característica essencial para a interação com 
canais iônicos (Dongol et al., 2019). A presença de resíduos hidrofóbicos e aromáticos entre as 
cisteínas C1 e C2, entre C5 e C6 e na região C-terminal, juntamente com os resíduos com carga 
positiva entre C5 e C6 e no C-terminal são essenciais para a complementariedade da toxina 
(Dongol et al., 2019). Na interação da toxina ProTx-II e o canal Nav1.7, o triptofano na posição 
20 
 
24 forma uma espécie de âncora hidrofóbica com a cavidade hidrofóbica entre os segmentos 
S2 e S3 do canal formada pelos resíduos A766-S2, L770-S2 e L812-S3 (Xu et al., 2019). 
 Na toxina HwTx-IV, a substituição da tirosina por um aminoácido mais hidrofóbico, 
triptofano, Y33W, aumentou a potência da toxina em NaV1.7 (Revell et al., 2013). 
A carga geral do peptídeo afeta a interação com os canais de sódio, tal efeito foi 
mostrado com mutações na toxina HwTx-IV, apresentando uma redução de potência na inibição 
com a substituição de resíduos carregados negativamente de ácido glutâmico para resíduos 
neutros, glicina, nas posições 1 e 4 (Revell et al., 2013). 
 
Canais de Cálcio (CaV) 
Os canais CaV são proteínas de múltiplas subunidades, sendo compostas por uma 
subunidade principal (α1) e quatro subunidades auxiliares (α2, β, γ e δ). A subunidade α1 possui 
uma massa molecular de 190kDa, formada por quatro domínios repetidos (I-IV), cada domínio 
possui seis segmentos transmembrânicos (S1-S6), sendo que entre os segmentos S5-S6 de cada 
domínio existe um loop que é responsável pela formação do poro iônico e o segmentos S1-S4 
responsáveis pelos sensores de voltagem, seguindo omesmo padrão encontrado nos canais de 
sódio dependentes de voltagem (Wu et al., 2015). As subunidades α1 são caracterizadas pelo 
tipo de corrente produzida e pelas características farmacológica em L, P, Q, N, R e T, cada tipo 
dessas correntes é produzida por uma isoforma por uma das dez subunidades α1 existentes ou 
um grupo de isoforma α1 (Catterall, 2011; Catterall and Swanson, 2015). 
As correntes do tipo L são produzidas pelos canais CaV1 e suas isoformas Cav1.1, 
Cav1.2, Cav1.3 e CaV1.4, e são caracterizadas por apresentarem corrente duradoura quando 
utilizado o íon bário como principal íon condutível (Long Lasting) e serem sensíveis a 
dihidropiriminas (Lipscombe, 2004). As correntes produzidas pelos canais CaV2 são conhecidas 
como P-Q, N e R dependendo do subtipo. 
 O subtipo CaV2.1 produz corrente do tipo P nos canais com splicing alternativo 
encontrado nas células de Purkinje e Q para o splicing alternativo encontrado no cerebelo. 
Ambas são correntes que apresentam sensibilidade a toxinas de artrópodes e moluscos do 
gênero Conus (Richards et al., 2007). As correntes produzidas pelo subtipo CaV2.2 são 
caracterizadas como N por sua distribuição em neurônios do sistema nervoso central e 
periférico, relacionado também com o processo de exocitose em terminais pré-sinápticos, 
21 
 
apresentando sensibilidade a uma grande diversidade de toxinas de artrópodes (Catterall, 2011; 
Liu et al., 2006; Dolphin, 2016). O subtipo CaV2.3 é o canal responsável pela corrente do tipo 
R, tendo esse nome por sua característica de resistência a compostos que inibem as correntes 
dos outros representantes CaV2, sendo a toxina SNX-482 caracterizada como seu bloqueador 
mais sensível (Dolphin, 2016; Newcomb et al., 1998). 
As correntes produzidas pelo subtipo CaV3.1, CaV3.2 e CaV3.3 são responsáveis pela 
corrente do tipo T, devido à sua abertura transiente, rápida. São os únicos representantes do 
grupo dos canais de cálcio ativados por pequena variação de voltagem (Low Voltage Activated 
– LVA) (Dolphin, 2016). Estão distribuídos em diversos neurônios e sua função está 
relacionada com a capacidade de disparos repetitivos de potenciais de ação e a atividade de 
marca-passo (Catterall, 2011; Zhao et al., 2019). 
 
Tabela 2 - Isoformas das subunidades α1 dos canais CaV 
Isoforma Tipo de corrente Distribuição Gene 
 
CaV1.1 L Fibras musculares CACNA1S 
CaV1.2 L Musculo Cardíaco CACNA1C 
CaV1.3 L Neural CACNA1D 
CaV1.4 L Retina CACNA1F 
CaV2.1 P - Q Neural CACNA1A 
CaV2.2 N Neural CACNA1B 
CaV2.3 R Neural CACNA1E 
CaV3.1 T Neural CACNA1G 
CaV3.2 T Neural, Cel. Marca passo CACNA1H 
CaV3.3 T Neural CACNA1I 
 
A subunidade β possui 55 kDa, formada por estrutura de α-hélice localizada na porção 
intracelular do canal (Wu et al., 2015). Sua associação à subunidade alfa promove deslocamento 
na dependência de voltagem para valores mais negativos. Em associação ao canal CaV2.1 
diminuiu o efeito da inibição de corrente por estímulos em alta frequência além de proteger o 
canal CaV2.2 de degradação proteossomal (Dolphin, 2003, 2016; Richards et al., 2007; Page et 
al., 2016). 
22 
 
A subunidade γ é uma glicoproteína associada com quatro segmentos transmembrânicos 
e possui massa molecular de 33 kDa. Tal subunidade só foi encontrada em associação ao canal 
CaV1.1 em músculos esqueléticos (Wu et al., 2015; Logan and Iii, 2003). 
As subunidades α2 e δ estão presentes no mesmo gene, sendo a região responsável pela 
subunidade δ alocada no final 3’. Estas duas subunidades são ligadas por ligação dissulfeto, 
muitas vezes sendo reconhecida apenas como subunidade α2δ de 170 kDa (Wu et al., 2015). As 
subunidades α2δ estão presentes apenas nos canais CaV1 e CaV2. Sua atividade está relacionada 
com o aumento da densidade de canais na membrana celular por facilitar a apresentação da 
proteína na membrana e modulação das cinéticas de ativação do canal (Dolphin, 2018). 
 
Figura 3 - Ilustração Canal de Cálcio Dependente de Voltagem. Adaptado de Catterall, 2000 
 
Durante o registro das correntes de cálcio, algumas técnicas são utilizadas para obtenção 
de registros com melhor qualidade e correntes mais estáveis. As correntes de cálcio em canais 
de cálcio dependentes de voltagem apresentam, durante os registros, um fenômeno conhecido 
como Rundown, que consiste na diminuição da amplitude da corrente. Esse efeito tem início 
imediato após o rompimento da membrana e diluição do citosol, que contém fatores que 
regulam o canal de cálcio (Zamponi and Ph, 2005). Diversas técnicas podem ser usadas para 
minimizar esse efeito, desde o uso da técnica de Perforated Patch Clamp que leva à formação 
de pequenos poros na região de contato da pipeta de registro com a membrana celular (pelo uso 
de antimicrobianos formadores de poro ex: Amfotericina B), promovendo menor diluição do 
conteúdo intracelular, quanto à suplementação da solução interna de pipeta com ATP e 
inibidores de protease tipo calpastatina (Zamponi and Ph, 2005; Springer, 2013). 
23 
 
Nomenclatura para toxinas 
Em 2008 King e colaboradores elaboraram uma nomenclatura racional para as toxinas 
peptídicas baseados na sua propriedade farmacológica e a posição taxonômica da espécie (King 
et al., 2008). Foi utilizado um caractere grego para representação da atividade farmacológicas, 
como, por exemplo, α para atividade em receptores de acetilcolina, β para moduladores da 
ativação de canais de Na+ e ω inibidores de canais de Ca2+ (Tabela 3) (King et al., 2008). 
Tabela 3 – Nomenclatura de toxinas baseadas na função farmacológica. Adaptado de King 
et al., 2008 
Caractere Grego Função farmacológica 
 
α(alpha) Receptores de acetilcolina 
β (Beta) Altera Dependência de voltagem para ativação dos canais de Na+ 
γ (gamma) Canais catiônicos não específicos HCN 
δ (Delta) Atrasa inativação dos canais de Na+ 
ε (Episolon) Canais de Cl- 
ζ (Zeta) Canais cíclicos ativados por nucleotídeos 
η (eta) Canais de potássio tipo KIR 
θ (Theta) Canais de Potássio tipo K2P 
ι (Iota) Agonista de canais de Na+ 
κ (Kappa) Bloqueadores de canais de Potássio KV 
λ (Lambda Bloqueadores de canais de Potássio Dependentes de Cálcio Kca 
μ (Mu) Bloqueadores de canais de sódio NaV 
ν (Nu) Receptores de Acetilcolina 
ξ (Xi) Receptores de Endotelina 
ο (Omicron) Receptores de Octopamina 
π (Pi) Canais sensíveis a ácidos ASICs 
ρ (Rho) Adrenoreceptores 
σ (Sigma) Receptores de 5-HT 
τ (Tau) Canais TRP 
 υ (Upsilon) Receptores de vasopressina/Oxitocina 
φ (Phi) Receptores de Rianodina 
χ (Chi) Transportadores de Noradrenalina 
ψ (Psi) Antagonista não-competitivos dos receptores de acetilcolina 
ω (Omega) Bloqueadores de canais de Ca2+ 
Γ (Gamma) Receptores de Glutamato 
Λ (Lambda) Receptores de GABA 
ο (Omicron) Receptores P2X 
Σ (Sigma) Canais CFTR 
Ω (Omega) Receptor do Fator de Crescimento Epitelial 
Δ (Delta) Atividade citolótica 
U (Unknown) Atividade desconhecida 
24 
 
Peçonha de aranha e seus potenciais farmacológicos 
As peçonhas dos animais evoluíram por milhares de anos resultando na formação de 
compostos para proteção e predação, sendo selecionados pela natureza e que apresentam grande 
potencial farmacológico com alvos moleculares específicos (Pennington et al., 2018). 
Compostos peptídicos com o motivo ICK vêm sendo descritos na peçonha de aranhas 
caranguejeiras e apresentam atividades em diversos tipos de canais iônicos dependentes de 
voltagem. Um dos compostos mais bem conhecidos é a toxina PrTx-II da aranha Thrixopelma 
pruriens com atividade inibitória em uma grande gama de canais NaV, com maior 
especificidade ao canal NaV1.7 (IC50 = 0,3 nM) que está diretamente relacionado ao processo 
da dor (Middleton et al., 2002). A sensibilidade do canal Nav1.7 a toxinas de aranhas não está 
restrito à toxina ProTx-II, outras toxinas como a Huwentoxin-IV de Selenocosmia huwena 
possui um IC50 de 26 nM em NaV1.7(Xiao et al., 2008), μ-theraphotoxin-Pn3a de 
Pamphobeteus nigricolor com IC50 de 0,9 nM (Deuis et al., 2017). 
Toxinas isoladas de aranhas e seu potencial uso em doenças cardiovasculares é um tema 
bem discutido, sendo os canais iônicos com maior relevância nesse estudo os canais NaV1.1, 
NaV1.3, NaV1.5, KV1, KV2, KV4, KV11, KATP e o canal sensível a estiramento SAC (Lima, 
2009). As toxinas PaTx1 e PaTx2 isoladas da aranha Paraphysa scrofa apresentam atividade 
nos canais KV4.2 e KV4.3 que possuem alta expressão no tecido cardíaco e modulam a duração 
e o formato do potencial de ação por suas correntes de potássio (Diochot et al., 1999). As toxinas 
JZTX-I/Delta-theraphotoxin-Cg1a e JZTX-III/Beta/kappa-theraphotoxin-Cg1a isoladas da 
aranha Chilobrachys guangxiensis apresentam atividade em diversos canais de NaV. Entretanto, 
tais toxinas apresentam uma maior sensibilidade sobre o canal NaV1.5 que é o canal de sódio 
majoritário nas células cardíacas (Xiao et al., 2004, 2005). 
A utilização de toxinas de aranhas como biopesticidas é uma proposta biotecnológica 
como alto valor agregado no mercado de agrotóxicos para o controle de pragas (Windley et al., 
2012). Toxinas com alvo molecular para canais iônicos de insetos são uma das estratégias 
evolutivas utilizadas pelas aranhas para sua predação efetiva, com a ocorrência de proteínas 
ricas em cisteínas formando muitas delas o motivo ICK (Windley et al., 2012). A toxina x-
HXTX-Hv2a, da aranha Hadronyche versuta, é um dos exemplos de toxinas que convergiram 
para atuação mais seletiva em canais de insetos, apresentando o motivo ICK, tal toxina atua nos 
canais de cálcio de insetos com uma preferência avaliada em 10.000 vezes em comparação a 
canais de cálcio em vertebrados (Wang et al., 2001). A toxina Ap1a, isolada da aranha 
25 
 
Acanthoscurria paulensis, apresentou atividade de paralisia sobre larvas de Spodoptera 
frugiperda, considerada uma das maiores pragas para a agricultura do milho no Brasil (Mourão 
et al., 2013a). 
 
Estudos da caracterização da peçonha de Acanthoscurria paulensis 
No primeiro estudo com a peçonha da aranha Acanthoscurria paulensis em 2012, a 
partir da separação cromatográfica da peçonha bruta, foram identificados 97 distintos 
componentes com massas moleculares entre 601,4 Da e 21.932,3 Da. Adicionalmente foi 
também caracterizada a LD50 da peçonha bruta em camundongos de 25,4 ± 2,4 mg/g (Mourão 
et al., 2013b). 
A primeira toxina isolada da peçonha foi a toxina Ap1a, sendo o peptídeo mais 
abundante na peçonha, com massa molecular monoisotópica de 5457,79 Da. Ao ser testada em 
lagartas Spodoptera frugiperda apresentou efeito dose-dependente de paralisia com uma DE50 
de 13.0±4.2 μg/g (Mourão et al., 2013a). Injeções intra-craniais da toxina Ap1a apresentara 
toxicidades em camundongos na dose de 30 ug por animal promovendo mioclonias, 
hipermotilidade, saltos e convulsões generalizadas. A partir do RNA total da glândula de 
peçonha de Acanthoscurria paulensis foi construída uma biblioteca de cDNA(Mourão et al., 
2013a). Experimentos no circuito de Fibra Gigante de Drosophila melanogaster indicaram 
atividade sobre a junção neuromuscular, sugerindo possível efeito sobre receptores 
glutamatérgicos. Ap1a não apresentou atividade em canais de sódio NaV1.2, NaV1.4, NaV1.5, 
NaV1.6 e no receptor de acetilcolina nAch (Mourão et al., 2013a). Posteriormente, foi 
caracterizada fraca atividade em canais de sódio NaV1.1, NaV1.3 e NaV1.7 com inibição máxima 
de 30 % no canal NaV1.7 (Garcia, 2018). 
 
26 
 
2 – Justificativa 
Estudos de componentes que possam modificar a atividade de canais são de grande 
interesse para os pesquisadores, tanto na descrição de suas estruturas quanto seus alvos 
farmacológicos. Na peçonha das aranhas, diversos componentes são descritos com atividade 
em canais iônicos, mais especificamente os peptídeos. Todavia da grande quantidade de aranhas 
existentes, poucas têm sua peçonha estudada e com isso diversos componentes potencialmente 
úteis para esses estudos farmacológicos não foram ainda descritos. 
Da peçonha da aranha Acanthoscurria paulensis foram identificados inicialmente 97 
componentes com massas de entre 601,4 Da e 21.932,3Da. Desses componentes, apenas o 
peptídeo Ap1a foi descrito quanto à sua atividade biológica em canais iônicos, atividade em 
camundongos e potencial bioinseticida. 
O mal funcionamento de canais iônicos dependentes de voltagem pode levar a doenças 
conhecidas como canalopatias, sendo as mais conhecidas o distúrbio cardíaco intitulado 
síndrome de Brugada, síndromes de paralisia, dores crônicas e alguns tipos de epilepsia. O uso 
de moduladores de canais iônicos dependentes de voltagem, que podem interferir no 
funcionamento do canal e promover uma possível reversão da condição patológica é uma área 
da pesquisa de grande interesse médico. 
O estudo de toxinas da peçonha de aranhas caranguejeiras é importante tanto para a 
caracterização dos componentes existentes na peçonha desse grupo de aranhas quanto para o 
potencial biotecnológico da utilização de suas toxinas como ferramentas farmacológicas para 
estudo de seus alvos. 
 
27 
 
3 – Objetivos 
3.1 – Objetivo Geral 
Caracterização da atividade de toxinas isoladas da peçonha da aranha caranguejeira 
Acanthoscurria paulensis em canais iônicos dependentes de voltagem 
3.2 – Objetivos Específicos 
• Purificar os peptídeos presentes na peçonha da aranha Acanthoscurria paulensis 
• Determinar as sequências primárias dos peptídeos purificados 
• Avaliar ação dos peptídeos isolados por meio de ensaios eletrofisiológicos nos 
canais de Na+ NaV1.1, NaV1.5, Nav1.7 e canais de Ca2+ CaV1.2, CaV2.1 e CaV2.2 
 
28 
 
4 - Metodologia 
4.1 Extração da Peçonha por eletroestimulação 
Espécimes adultos da aranha Acanthoscurria paulensis de ambos os sexos, 
acondicionados vivos no Biotério do Instituto de Biologia da Universidade de Brasília, foram 
estimulados na região basal das quelíceras utilizando eletroestimulador caseiro e suas peçonhas 
foram coletadas diretamente em tubos de polietileno tipo eppendorf de 1,5 ml. Amostras foram 
solubilizadas em água Mili-Q, centrifugadas a 10.000 x g por 15 minutos para a remoção de 
substâncias que possam sedimentar, quantificadas por espectrofotômetro com luz UV a 280 nm 
(NanoVue® GE Healthcare) para proteínas totais, secas a vácuo (SpeedVac) e armazenadas a -
20ºC. O processo de extração é realizado com um intervalo de 40 dias e os animais são 
alimentados após a extração com baratas Nauphoeta cinerea. 
Os espécimes de Acanthoscurria paulensis foram coletados conforme a permissão legal 
24227-1 cedida pelo ICMBio. Espécimes foram coletados na região de cerrado próximo a 
Universidade de Brasília. 
 
4.2 Cromatografia Líquida de Alta eficiência em Fase Reversa (RP-HPLC) 
4.2.1 Fracionamento da Peçonha Bruta 
Alíquotas de 5,0 mg de peçonha bruta foram ressuspendidas em uma solução de 0,12 % 
(v/v) de ácido trifluoracético (TFA) em água. O material foi submetido ao sistema de 
cromatografia liquida de alta eficiência LC10A Shimadzu Co. (Kyoto, Japão) em coluna 
semipreparativa C18 Phenomenex. Para a eluição, utilizou-se gradiente binário de solução 
aquosa de TFA 0,12% (A) e de solução de acetonitrila de TFA 0,1 % (B), com fluxo de 1,5 
mL/min e detecção a 216 e 280 nm de absorbância. O gradiente iniciou-se com 0% de B por 10 
minutos; seguido de 0 a 60 % de B em 60 minutos; 60 a 100 % de B em 10 minutos; e 100 % 
de B mantidos pelos 10 minutos finais, para então equilibrar a coluna novamente na solução A. 
As frações cromatográficas foram manualmente coletadas, secas a vácuo e armazenadas a -20º 
C até seu uso. 
4.2.2 Purificação do peptídeo Ap2 
Após a separação da fração contendo o peptídeo Ap2 na cromatografia de peçonha bruta 
foi realizada uma segunda etapa de cromatografia utilizando coluna Phenomenex Kinetex F5 
Core-shell. O método foi elaborado da seguinteforma: A partir da concentração de 15% ACN 
29 
 
atingida aos 15 min de corrida, um gradiente de 0,375 % de ACN por minuto foi iniciado até 
os 50 minutos de corrida atingindo concentração máxima de 50 % de ACN. 
 
4.2.3 Purificação do peptídeo Ap3 
A etapa final de purificação da fração contendo o peptídeo Ap3 utilizou uma coluna 
Phenomenex Kinetex F5 Core-shell aquecida a 45º C em um forno para coluna. O método 
utilizado foi construído da seguinte forma: A partir de uma concentração de 10 % de ACN 
estabelecida aos 10 minutos, foi iniciado um gradiente de 0,33 % de ACN por minuto até os 70 
minutos de corrida atingindo a concentração final de 30% de ACN. 
4.2.4 Purificação do peptídeo Ap4 
A fração contendo o peptídeo Ap4 foi purificada utilizando coluna Phenomenex Kinetex 
F5 Core-shell. As garrafas contendo as soluções de HPLC foram resfriadas a 4º C por banho 
frio e as soluções foram preparadas utilizando uma concentração de 1 % de TFA. O método foi 
construído da seguinte forma: A partir de uma concentração de 10 % de ACN estabelecida aos 
10 minutos, foi iniciado gradiente de 0,33 % de ACN por minuto até os 70 minutos de corrida 
atingindo a concentração final de 30 % de ACN. 
4.2.5 Purificação do peptídeo Ap5 
A etapa final de purificação da fração contendo o peptídeo Ap3 utilizou coluna 
Phenomenex Kinetex F5 Core-shell aquecida a 45ºC em forno para coluna. O método utilizado 
foi construído da seguinte forma: A partir de uma concentração de 15% de ACN estabelecida 
aos 10 minutos, foi iniciado um gradiente de 0,33 % de ACN por minuto até os 70 minutos de 
corrida atingindo a concentração final de 35 % de ACN. 
4.2.6 Purificação do peptídeo Ap6 
O peptídeo Ap6 após a separação de sua fração na cromatografia de peçonha bruta foi 
submetido a apenas uma etapa adicional de purificação utilizando Coluna Phenomenex Kinetex 
C18 Core-shell. O método foi construído da seguinte forma: A partir de uma concentração de 
20% acetonitrila estabelecido aos 10 minutos, iniciou-se um gradiente de 0,5% ACN por minuto 
até os 50 minutos de corrida atingindo a concentração final de 40% ACN. 
 
30 
 
4.3 Espectrometria de massa (MALDI TOF/TOF) 
Para a avaliação do grau de pureza dos peptídeos de interesse e aferência da massa 
experimental utilizou-se espectrometria de massas em sistema MALDI TOF/TOF Ultraflex III 
(Bruker Daltonics, Alemanha). Os peptídeos foram solubilizados em água Milli-Q e dissolvidos 
em matriz saturada de ácido α-ciano-4-hidroxicinâmico (acetonitrila/água/TFA 3 %; 5:4:1) em 
uma razão de 2 µL de amostra para 2 µL de matriz, depositadas em uma placa de aço inox 
Anchorchip (600 mm) e secas à temperatura ambiente. As análises foram realizadas em modo 
linear para avaliação da massa média e no modo refletido para avaliação das massas 
monoisotópicas utilizando o software FlexAnalysis 3.3 (Bruker Daltonics, Alemanha) 
 
4.4 Quantificação dos peptídeos (Colorimetria BCA-Cobre) 
Os peptídeos puros foram quantificados utilizando o kit para proteína BCA Protein 
Assay Kit® (ThermoFischer) utilizando o protocolo enhanced. Os peptídeos foram diluídos em 
água Milli-Q, misturados com os reagentes do kit na razão 1:1 e incubados a 60º C por 30 
minutos. O produto da reação foi lido na absorbância de 562 nm e quantificado por cálculo em 
curva padrão calibrada com albumina bovina. 
 
4.5 Sequenciamento (In-source Decay – MALDI TOF-TOF) 
O sequenciamento parcial foi realizado em um sistema MALDI TOF-TOF Ultraflex III 
(Bruker Daltonics, Alemanha) com o método de In-source Decay (ISD). Amostras dos 
peptídeos foram solubilizados em água Milli-Q em uma concentração de 1 µg/µl e dissolvidos 
em uma matriz redutora saturada de 1,5-diaminonaptaleno em uma razão de 1,5 µL de amostra 
para 1,5 µL de matriz. 
 
4.6 Busca por similaridade 
As sequências completas obtidas foram submetidas a buscas por similaridade usando o 
programa BlastP, disponível online em https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi. Os 
alinhamentos de sequências foram realizados pelo programa Clustal Omega disponível online 
em https://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/. 
https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi
https://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/
31 
 
4.7: Cultura de células 
4.7.1 Culturas de células expressando canais de sódio dependentes de voltagem 
(NaV1.1-NaV1.7) 
Células HEK (Human Embrionic Kidney 293 cells) expressando canais iônicos Nav1.1, 
e Nav1.5 de forma estável foram cultivadas em meio DMEM suplementado com 4,5 % de 
Glicose, 10 % de Soro Fetal Bovino e 1 % de MEM (Non Essential Aminoacids) e antibiótico 
G418 (0,4 mg/mL). Células CHO (Chinese Hamster Ovary) expressando canais iônicos Nav1.7 
foram cultivadas em meio DMEM suplementado com 4,5 % de Glicose, 10 % de Soro Fetal 
Bovino e antibiótico G418 (0,5 mg/mL). As células foram incubadas em uma atmosfera 
umedecida contendo 5 % de CO2 a 37º C. As culturas estáveis expressando canais de sódio 
dependentes de voltagem foi uma generosa doação da Dra. Rita Restano-Cassulini do Instituto 
de Biotecnologia da Universidade Autônoma do México (IBT-UNAM Cuernavaca – Morelos). 
4.7.2 Célula HEK 293T 
Células HEK 293T (Human Embrionic Kidney SV-40 T-antigen) foram cultivadas em 
meio DMEM suplementado com 4,5 % de Glicose, 10 % de Soro Fetal Bovino e 1 % de 
Antibiotic-Antimycotic® (Gibco). As células foram incubadas em uma atmosfera umedecida 
contendo 5 % de CO2 a 37º C. A cultura de células HEK293T foi obtida comercialmente do 
Banco de Células do Rio de Janeiro – BCRJ. 
 
4.8 Plasmídeos – Canais de cálcio dependentes de voltagem 
Os plasmídeos contendo as sequências para a expressão dos canais de cálcio foram 
obtidos comercialmente do repositório da Addgene (Estados Unidos). Para a expressão das 
subunidades alfas foram utilizados os plasmídeos pcDNA6CaV1.2 (número de catálogo 
#26572) – CaV1.2, pcDNA6-CaV2.1(#26578) – CaV2.1, pcDNA6-CaV2.2 (#26570) – CaV2.2. 
Para a expressão da subunidade Beta foi utilizado o plasmídeo pcDNA3.1-β3 (#26574) - CaVβ3. 
Para a expressão da subunidade α2δ foi utilizado o plasmídeo pcDNA3.1- α2δ1 (#26575). O 
plasmídeo pEGFP-c1(Clontech, EUA) foi utilizado como repórter de transfecção transiente por 
expressar a proteína fluorescente verde enhanced green fluorescent protein EGFP. 
 
32 
 
4.9 Transfecção Transiente canais de Calcio dependentes de voltagem 
Células HEK293T cultivadas em placas de petri de 40x10mm com confluência de 70-
90% foram transfectadas utilizando Lipofectamine3000® (ThermoFischer scientific) em meio 
Opti-MEM® (Gibco) com 4 plasmídeos simultaneamente: pcDNA6-CaVα, pcDNA3.1-CaVβ3, 
pcDNA3.1-α2δ1 e pEGFP-c1 em uma razão 1:1:1:0,1 µg respectivamente. 
 
4.10 Eletrofisiologia – Setup experimental para Patch Clamp 
4.10.1 Ensaios eletrofisiológicos em canais de sódio dependentes de voltagem 
As macrocorrentes dos canais NaV foram estimuladas e registradas com a técnica de 
Patch Clamp utilizando o amplificador HEKA EPC 10 na configuração Whole Cell e o software 
PATCHMASTER (HEKA Elektronik Dr. Schulze GmbH, Germany). Experimentos foram 
realizados a temperatura ambiente (21 a 25º C). Pipetas feitas de vidro borosilicato foram 
fabricadas imediatamente antes do uso no Puller horizontal (Sutter Instruments, USA) e após o 
preenchimento com a solução interna foram detectadas resistências de pipeta entre 1,5 e 2,5 
MΩ. A Resistência em série foi de aproximadamente 10MΩ para todos os experimentos e foi 
compensada em pelo menos 60 %. Correntes capacitivas foram canceladas por protocolo online 
de estímulos p/4 com a voltagem de repouso em -120 mV. As correntes foram ativadas por um 
protocolo duplo de estímulo a partir de uma voltagem de repouso de -100 mV. Na primeira 
parte do protocolo, as correntes foram ativadas por 27 sweeps sequenciais com acréscimos de 
5mV por sweep durante 30 ms, atingindo uma voltagem máxima de 30 mV, para a avaliação da 
ativação do canal. Na segunda parte do protocolo,um estimulo de -10 mV durante 10ms 
imediatamente após a primeira parte foi utilizado para avaliação da Inativação Lenta dos canais 
de sódio. Entre cada sweep do protocolo completo de estímulo foi realizado um intervalo de 2 
s (Figura 5A). As micropipetas foram preenchidas com solução interna contendo (mM): 105 
CsF, 27 CsCl, 5 NaCl, 2 MgCl2, 10 EGTA, 10 HEPES (pH ajustado para 7,3 com CsOH). As 
células foram banhadas em uma solução externa contendo (mM): 130 NaCl, 5 KCl, 2 MgCl2, 2 
CaCl2, 10 HEPES, 10 Glicose (pH ajustado para 7,4 com NaOH). 
4.10.1 Ensaios eletrofisiológicos em canais de cálcio dependentes de voltagem 
As macrocorrentes dos canais CaV foram estimuladas e registradas com a técnica de 
Patch Clamp utilizando o amplificador HEKA EPC 10 na configuração Whole Cell e o software 
PATCHMASTER (HEKA Elektronik Dr. Schulze GmbH, Germany). Experimentos foram 
realizados a temperatura ambiente (21 a 25º C). Pipetas feitas de vidro borosilicato foram 
33 
 
fabricadas imediatamente antes do uso no Puller horizontal (Sutter Instruments, USA) e suas 
pontas foram polidas em uma microforja MF-900 (Narishige, Japão), após o preenchimento 
com a solução interna foram detectadas resistências de pipeta entre 2,5 e 4 MΩ. Correntes 
capacitivas foram canceladas por protocolo online de estímulos p/4 com a voltagem de repouso 
em -100 mV. As correntes foram inicialmente estimuladas em um protocolo I/V, aonde as 
correntes foram estimuladas apartir -50 mV até 30 mV, com acréscimos de 5 mV por sweep 
para determinação da voltagem que promove a corrente com maior amplitude (VMax). Após a 
determinação de VMax foram relizados estimulos com a voltagem estabelecida durante 200ms 
com intervalos de 30s entre cada estímulo (Figura 5B). As micropipetas foram preenchidas com 
solução interna contendo (mM): 126 CsCl2, 10 EGTA, 1 EDTA, 10 HEPES, 4 Mg ATP (pH 
ajustado para 7,3 com CsOH). As células foram banhadas em uma solução externa contendo 
(mM): 5 BaCl2, 135 Colina-Cl, 10 HEPES, 4 MgCl2 (pH ajustado para 7,4 com CsOH). 
 
Figura 4 - Protocolos de estímulo utilizado para o Patch Clamp. A: Representação 
esquemática do protocolo de variação de voltagem utilizado para ativar as correntes de sódio 
dependentes de voltagem. B: Representação esquemática do protocolo de variação de voltagem 
utilizado para ativar as correntes de cálcio dependentes de voltagem. 
 
4.11 Eletrofisiologia – Análise de dados 
4.11.1 Análise de dados – Ensaios em canais de sódio dependentes de voltagem 
A condutância ao sódio (gNa) foi calculada a partir das correntes obtidas na primeira 
parte do protocolo utilizando a lei de Ohm, 
𝑔𝑔𝑔𝑔𝑔𝑔 =
𝐼𝐼𝑔𝑔𝑔𝑔
(𝑉𝑉 − 𝑉𝑉𝑉𝑉𝑉𝑉𝑉𝑉) 
34 
 
 onde V representa o potencial de estímulo que ativou a corrente, INa a corrente do íon 
sódio no dado potencial V, e VRev é o potencial de reversão do íon sódio calculado a partir das 
soluções internas e externa com a equação de Nernst, 
𝑉𝑉𝑉𝑉𝑉𝑉𝑉𝑉 =
𝑉𝑉𝑅𝑅
𝐹𝐹 ln
[𝑔𝑔𝑔𝑔]𝐸𝐸𝐸𝐸𝐸𝐸𝑉𝑉𝑉𝑉𝐸𝐸𝑔𝑔
[𝑔𝑔𝑔𝑔]𝐼𝐼𝐸𝐸𝐸𝐸𝑉𝑉𝑉𝑉𝐸𝐸𝑔𝑔 
onde R é a constante dos gases ideais, T a temperatura em Kelvin, F é a constante de 
Faraday, [Na]Externa é a concentração do íon sódio no meio externo e [Na]Interna é a concentração 
do íon sódio no meio interno. 
Os dados experimentais foram ajustados em uma equação simples de Boltzmann para 
avaliar a probabilidade de abertura dos canais (pO), 
𝑔𝑔 𝑜𝑜𝑜𝑜 𝑝𝑝𝑝𝑝 = 
1
1 + 𝑉𝑉�(𝑉𝑉−𝑉𝑉1/2)/𝑘𝑘�
 
onde V1/2 é a voltagem em que metade dos canais estão no estado aberto, k é slope de 
voltagem. Os valores de ΔV1/2 foram estipulados pela diferença entre o ΔV1/2 na condição 
controle menos ΔV1/2v na presença do composto avaliado. 
 As correntes obtidas da segunda parte do protocolo (Figura 4) foram ajustados em 
equação simples de Boltzmann para avaliação da inativação lenta ou Steady-State Inactivation 
(SSI) 
𝑆𝑆𝑆𝑆𝐼𝐼 = 
1
1 + 𝑉𝑉�(𝑉𝑉−𝑉𝑉1/2)/𝑘𝑘�
 
 
A porcentagem de canais de sódio foi estipulada pela a seguinte fórmula, 
𝑃𝑃𝑜𝑜𝑉𝑉𝑃𝑃𝑉𝑉𝐸𝐸𝐸𝐸𝑔𝑔𝑔𝑔𝑉𝑉𝑃𝑃 𝑑𝑑𝑉𝑉 𝑖𝑖𝐸𝐸𝑖𝑖𝑖𝑖𝑖𝑖çã𝑜𝑜 = �
 100 𝐸𝐸 𝐼𝐼𝑃𝑃𝑔𝑔𝐸𝐸𝑅𝑅𝑜𝑜𝐸𝐸𝑖𝑖𝐸𝐸𝑔𝑔
𝐼𝐼𝑃𝑃𝑔𝑔𝐸𝐸𝐼𝐼𝑜𝑜𝐸𝐸𝐸𝐸𝑉𝑉𝑜𝑜𝐼𝐼𝑉𝑉
� − 100 
 
4.11.2 Análise de dados – Ensaios em canais de cálcio dependentes de voltagem 
As correntes de cálcio em Patch Clamp na configuração Whole Cell apresentam uma 
diminuição da amplitude da corrente conhecido como Rundown. Para que seja possível a 
avaliação da porcentagem de bloqueio de um composto sobre um canal que sofre Rundown é 
35 
 
necessário estimar o valor de corrente controle (IPred) correspondente ao mesmo tempo do valor 
da corrente na presença do composto avaliado, assumindo a tendência linear na ausência da 
toxina, levando em consideração o número de sweep decorridos a partir da aplicação da toxina. 
A corrente controle foi estipulada com a seguinte fórmula: 
𝑰𝑰𝑝𝑝𝑉𝑉𝑉𝑉𝑑𝑑 = 
(𝑰𝑰𝐼𝐼𝑔𝑔𝑉𝑉𝑔𝑔𝑔𝑔𝑉𝑉𝑃𝑃 𝐸𝐸𝑜𝑜𝐸𝐸𝑖𝑖𝐸𝐸𝑔𝑔 − 𝑰𝑰𝑃𝑃𝑜𝑜𝐸𝐸𝐸𝐸𝑉𝑉𝑜𝑜𝐼𝐼𝑉𝑉)
(#𝑺𝑺𝑺𝑺𝐼𝐼𝑔𝑔𝑉𝑉𝑔𝑔𝑔𝑔𝑉𝑉𝑃𝑃𝐸𝐸𝑜𝑜𝐸𝐸𝑖𝑖𝐸𝐸𝑔𝑔 − #𝑺𝑺𝑺𝑺𝑃𝑃𝑜𝑜𝐸𝐸𝐸𝐸𝑉𝑉𝑜𝑜𝐼𝐼𝑉𝑉)(#𝑺𝑺𝑺𝑺𝑺𝑺𝑜𝑜𝐸𝐸𝑖𝑖𝐸𝐸𝑔𝑔 − #𝑺𝑺𝑺𝑺𝑃𝑃𝑜𝑜𝐸𝐸𝐸𝐸𝑉𝑉𝑜𝑜𝐼𝐼𝑉𝑉) + 𝑰𝑰𝑃𝑃𝑜𝑜𝐸𝐸𝐸𝐸𝑉𝑉𝑜𝑜𝐼𝐼𝑉𝑉
 
 
 
Onde, IControle é amplitude da corrente do último sweep antes da aplicação da toxina, IToxina é a 
amplitude corrente avaliada na presença da toxina, ILavagemToxina é a amplitude da corrente do 
último sweep da lavagem da toxina, IPred é a amplitude da corrente controle assumindo o 
comportamento linear Rundown., #SWControle é o número do sweep no qual a IControle foi 
medida, #SWToxina é o número do sweep no qual a IToxina foi medida e #SWLavagemToxina é o 
número do sweep no qual a ILavagem foi medida. 
 
 A porcentagem de inibição (%Inib) foi calculada da seguinte maneira: 
%𝐼𝐼𝐸𝐸𝑖𝑖𝑖𝑖 =
(𝐼𝐼𝑅𝑅𝑜𝑜𝐸𝐸𝑖𝑖𝐸𝐸𝑔𝑔 × 100)
𝐼𝐼𝑝𝑝𝑉𝑉𝑉𝑉𝑑𝑑 − 100 
As diferenças entre as médias foram avaliadas estatisticamente com Teste T pareado e 
foram considerados estatisticamente quando obtido o valor de P<0.05. Análises foram 
realizadas com o software GraphPad prism 5 
 
36 
 
5 – Resultados 
5.1 Fracionamento de peçonha Bruta e Purificação dos peptídeos 
Foram realizadas 20 cromatografias de peçonha bruta de Acanthoscurria paulensis 
utilizando aproximadamente 100 mg de peçonha bruta extraída de espécimes machos e fêmeas. 
As frações de interesse eluíram entre 26 e 33 % de acetonitrila (36 a 43 min), sendo que a fração 
eluída entre 36 e 38 minutos (26-28 %ACN) contém os peptídeos Ap2, Ap3 e Ap6. A fração 
que elui entre 39 e 41 minutos(29-31 % ACN) contém os peptídeos Ap1a, previamente descrito 
em Mourão e colaboradores 2013, e o peptídeo Ap4. A fração que elui aos 43 minutos (33 % 
ACN) contém o peptídeo Ap5 (Figura 5). Para a subsequente purificação dos compostos de 
interesse encontrados nas frações foram realizadas recromatografias utilizando colunas 
analíticas Kinetex C18, Core Shell C18, Core Shell F5 (Phenomenex) seguidos de otimização 
de gradiente de acetonitrila, concentração do agente de emparelhamento de íons TFA e 
temperatura da fase móvel e estacionária. 
 
Figura 5 - Cromatograma de 5 mg peçonha bruta A. paulensis por RP-HPLC. O 
fracionamento foi realizado por meio de uma coluna C18 semipreparativa C18 (Phenomenex) 
com gradiente de acetonitrila conforme representado pela linha vermelha com um fluxo de 
1,5mL/min e absorbância monitorada a 216 nm. 
O peptídeo Ap2 eluiu aos 35,9 minutos com 22,80 % de acetonitrila (Figura 6). A 
avaliação da pureza do peptídeo foi realizada por MALDI TOF/TOF no modo linear e sua 
massa molecular monoisotópica experimental foi de 4886,32 Da (Figura 7). Foi obtido total de 
95,92 µg desse peptídeo puro. 
37 
 
 
Figura 6 – Cromatograma purificação do peptídeo Ap2. A purificação foi realizada por 
meio de uma coluna Analítica C18 (phenomenex) com um gradiente de acetonitrilaconforme 
representado pela linha vermelha , com um fluxo de 1,0 mL/min e absorbância monitorada a 
216 nm. 
 
Figura 7 - Espectro de Massas do peptídeo Ap2. A: Massa molecular média [M+H]+ de 
4888,1 Da do peptídeo Ap2 utilizando a técnica de espectrometria de massas (MS) no modo 
linear. B: Massa molecular monoisotópica de [M+2H]2+ de 2443,6 Da utilizando a 
espectrometria de massas no modo refletido, totalizando massa experimental de 4886,3 Da. 
38 
 
O peptídeo Ap3 eluiu aos 30 minutos na recromatografia apresentada na purificação do 
peptídeo Ap2 (Figura 6) aos 22,62 % de ACN, entretanto não continha o grau de pureza 
necessário para as etapas subsequentes e foi submetido a mais uma etapa de purificação (Figura 
8). A avaliação da pureza do peptídeo foi realizada por MALDI TOF/TOF no modo linear e 
sua massa molecular monoisotópica experimental inferida de 4883,7 Da (Figura 9). Foi obtido 
total de 57,6 µg desse peptídeo puro. 
 
Figura 8 – Cromatograma Purificação do peptídeo Ap3. A purificação foi realizado por 
meio de coluna Analítica Core Shell F5 (Phenomenex) com gradiente de acetonitrila conforme 
representado pela linha vermelha, coluna aquecida a 45º C, fluxo de 1,0 mL/min e absorbância 
monitorada a 216 nm. 
39 
 
 
Figura 9 - Espectro de Massas do peptídeo Ap3. A: Massa molecular média [M+H]+ de 
4883,66 Da do peptídeo Ap3 utilizando a técnica de espectrometria de massas (MS) no modo 
linear. B: Massa molecular monoisotópica de [M+2H]2+ de 2442,36 Da utilizando a 
espectrometria de massas no modo refletido, totalizando massa experimental de 4883,7 Da. 
 
O peptídeo Ap4, Ap5 e Ap1a eluíram juntos no mesmo processo de cromatografia 
(Figura 5). Com isso, foi necessária uma etapa adicional de cromatografia utilizando a coluna 
Core shell F5 para um fracionamento dessa fração com diversos compostos. Essa fração foi 
subfracionada em 5 subfrações, sendo que na subfração 1 (20,50% ACN) foi encontrado um 
composto com a massa molecular média de 5478 Da, na subfração 2(20,60% ACN), o composto 
com massa molecular média de 5443 Da que é, provavelmente, a toxina Ap1b (dados não 
mostrados), na sub-fração 3 (20,70% ACN) foi encontrado o peptídeo Ap1a , em ambas 
subfrações 4 e 5 foram encontrados os peptídeos Ap4 e Ap5 (Figura 10). 
40 
 
 
Figura 10 – Cromatograma Sub-fracionamento da fração os peptídeos Ap4 e Ap5. 
Cromatografia da fração contendo os peptídeos Ap4 e Ap5 utilizando coluna core shell F5 com 
gradiente de acetonitrila. Os peptídeos Ap4 e Ap5 estão presentes em ambas sub-frações 4 e 5. 
As subfrações 4 e 5 foram reunidas e submetidas a cromatografia de fase reversa com a 
coluna Core shell F5, com as soluções contendo 1% de TFA e a 4º C utilizando-se um banho 
resfriado. O peptídeo Ap4 eluiu aos 52,6 minutos com 25,33 % de acetonitrila (Figura 11). A 
avaliação da pureza do peptídeo foi realizada por MALDI TOF/TOF no modo linear e sua 
massa molecular monoisotópica experimental de 3870,7 Da (Figura 12). Foi obtido um total de 
29,36 µg desse peptídeo puro. 
41 
 
 
Figura 11 – Cromatograma Purificação do peptídeo Ap4. O fracionamento foi realizado por 
meio de coluna Analítica Core Shell F5 (Phenomenex) com gradiente de acetonitrila conforme 
representado pela linha vermelha com 1 % de TFA(v/v), fase móvel resfriada a 4º C, fluxo de 
1,0 ml/min e absorbância monitorada a 216 nm. 
 
Figura 12 - Espectro de Massas do peptídeo Ap4. A: Massa molecular média [M+H]+ de 
3871,95 Da do peptídeo Ap4 utilizando a técnica de espectrometria de massas (MS) no modo 
linear. B: Massa molecular monoisotópica de [M+2H]2+ de 1935,88 Da utilizando a 
espectrometria de massas no modo refletido, totalizando massa experimental de 3870,76 Da. 
42 
 
O peptídeo Ap5 eluiu na cromatografia de purificação da Ap4 aos 56,7 minutos com 
26,64 % de acetonitrila (Figura 11); entretanto, por não possuir o grau de pureza necessário, foi 
submetido a mais uma etapa de cromatografia (Figura 13), eluindo aos 41,3 minutos, com 25,11 
% de acetonitrila. A avaliação da pureza do peptídeo foi realizada por MALDI TOF/TOF no 
modo linear e sua massa molecular monoisotópica experimental de 5454,9 Da (Figura 14). Foi 
obtido total de 36,12 µg desse peptídeo puro. 
 
Figura 13 – Cromatograma Purificação do peptídeo Ap5. O fracionamento foi realizado por 
meio de coluna Analítica Core Shell F5 (Phenomenex) com gradiente de acetonitrila conforme 
representado pela linha vermelha com 0,1% de TFA(v/v), a coluna foi aquecida a 45º C, fluxo 
de 1,0 ml/min e absorbância monitorada a 216 nm. 
43 
 
 
Figura 14 - Espectro de massas do peptídeo Ap5.A: Massa molecular média [M+H]+ de 
5458,3 Da do peptídeo Ap5 utilizando a técnica de espectrometria de massa (MS) no modo 
linear. B: Massa molecular monoisotópica de [M+2H]2+ de 2727,96 Da utilizando a 
espectrometria de massa no modo refletido, totalizando uma massa experimental de 5454,9 Da. 
O peptídeo Ap6 foi submetido a apenas uma etapa de purificação adicional após 
fracionamento da peçonha bruta (Figura 15) e eluiu 16,8 minutos com 23,14 % de acetonitrila. 
A avaliação da pureza do peptídeo foi realizada por MALDI TOF/TOF no modo linear e sua 
massa molecular monoisotópica experimental de 3717,9 Da. Foi obtido total de 51,79 µg desse 
peptídeo puro. 
44 
 
 
Figura 15 – Cromatograma Purificação do peptídeo Ap6. O fracionamento foi realizado por 
meio de coluna Analítica C18 (Phenomenex) com gradiente de acetonitrila conforme 
representado pela linha vermelha com 0,1% de TFA (v/v). 
 
Figura 16 - Espectro de massas do peptídeo Ap6. A: Massa molecular média [M+H]+ de 
3720,33 Da do peptídeo Ap6 utilizando a técnica de espectrometria de massas (MS) no modo 
linear. B: Massa molecular monoisotópica de [M+2H]2+ de 1859,45 Da utilizando a 
espectrometria de massas no modo refletido, totalizando massa experimental de 3717,9 Da. 
45 
 
5.2 Sequenciamentos 
 Os peptídeos Ap2, Ap3, Ap4, Ap5, Ap6, após purificados, foram parcialmente 
sequenciados utilizando a espectrometria de massas no equipamento Maldi TOF TOF Ultraflex 
III no método de In-source decay (Figuras 17-21) e as sequências parciais que foram 
posteriormente completadas com a análise do transcritoma da glândula de peçonha de A. 
paulensis. (Figura 22). 
 
 
Figura 17 - Sequência parcial do peptídeo Ap2 obtida por meio da técnica de 
espectrometria de massas (MS) pelo método de In-Source Decay (ISD). Foram obtidos 24 
aminoácidos pela diferença de massa entre os fragmentos. 
46 
 
 
Figura 18 - Sequência parcial do peptídeo Ap3 obtida por meio da técnica de 
espectrometria de massas (MS) pelo método de In-Source Decay (ISD). Foram obtidos 25 
aminoácidos pela diferença de massa entre os fragmentos. 
47 
 
 
Figura 19 - Sequência parcial do peptídeo Ap4 obtida por meio da técnica de 
espectrometria de massas (MS) pelo método de In-Source Decay (ISD). Foram obtidos 21 
aminoácidos pela diferença de massa entre os fragmentos. 
 
 
48 
 
 
Figura 20 - Sequência parcial do peptídeo Ap5 obtida por meio da técnica de 
espectrometria de massas (MS) pelo método de In-Source Decay (ISD). Foram obtidos 32 
aminoácidos pela diferença de massa entre os fragmentos. 
49 
 
 
Figura 21 - Sequência parcial do peptídeo Ap6 obtida por meio da técnica de 
espectrometria de massas (MS) pelo método de In-Source Decay (ISD). Foram obtidos 19 
aminoácidos pela diferença de massa entre os fragmentos. 
 
 
Figura 22 - Alinhamento múltiplo das sequências completas obtidas dos peptídeos 
purificados. Regiões nas sequências em vermelho foram obtidas por sequenciamento ISD e 
completadas pela comparação com as sequências em biblioteca de cDNA. 
Durante o processo de purificação do peptídeo Ap4 (3870,9 Da) foi encontrado um 
composto com 27 Da a mais que a massa molecular do peptídeo Ap4, uma massa monoisotópica 
de 3897,9 Da. Tal informação corrobora com as informações encontradas no transcritoma da 
glândula de peçonha de A. paulensis sobre a existência