Projeto_Rafaella_FAPESP_07_06_16-_IC

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Projeto de Pesquisa 
Iniciação Científica 
 
 
 
 
Estudo funcional de uma desintegrina da peçonha de 
Crotalus durissus collilineatus 
 
 
 
Functional study of a disintegrin from Crotalus durissus 
collilineatus venom 
 
 
Graduanda: Rafaella Varzoni Manzini 
Orientadora: Profª. Drª. Eliane Candiani Arantes 
 
 
 
 
Ribeirão Preto 
2016 
 
UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO 
Faculdade de Ciências Farmacêuticas de Ribeirão Preto 
Laboratório de Toxinas Animais 
 
 
 
 
RESUMO 
 
 Acidentes com serpentes peçonhentas são um problema para a saúde 
pública nacional devido a sua frequência e gravidade. Os casos envolvendo 
serpentes do gênero Crotalus são mais graves, apresentando maior taxa de 
letalidade. A peçonha de serpente Crotalus durissus collilineatus é uma complexa 
mistura de vários componentes, entre eles, as desintegrinas. Essas proteínas atuam 
como um inibidor da integrina, uma proteína de adesão celular, desencadeando 
respostas transducionais, que podem levar as células à apoptose. Os objetivos 
deste trabalho são o isolamento e a caracterização estrutural e funcional de uma 
desintegrina da peçonha de serpente Crotalus durissus collilineatus. Para isto, a 
peçonha será fracionada por cromatografia de fase reversa em coluna C-18 e fração 
contendo a desintegrina será submetida a processos cromatográficos adicionais 
para isolar a desintegrina. A caracterização estrutural da molécula será realizada por 
sequenciamento amino-terminal e determinação da massa molecular por 
espectrometria de massas. Os ensaios de adesão celular e o de migração celular 
(cicatrização celular) serão realizados em linhagens de células HepG2, visando a 
caracterização funcional da desintegrina. Devido à possível ação das desintegrinas 
em tromboses, angiogêneses, mestástases, inflamação e outras doenças 
relacionadas com integrinas, este projeto é de grande relevância, já que visa 
esclarecer a ação da desintegrina da peçonha de C. d. Collilineatus em células 
cancerosas. 
 
Palavras-chave: Crotalus durissus collilineatus, desintegrina, adesão celular, 
migração celular, câncer. 
 
 
 
 
 
ABSTRACT 
 
 Snakebite envenomings are a problem to national public health because of its 
frequency and severity. Cases involving snakes of genus Crotalus are more severe, 
showing higher mortality rate. The venom of Crotalus durissus collilineatus is a 
complex mixture of several compounds, among them, the disintegrins. These 
proteins act as integrin inhibitor, a cell adhesion protein, triggering translational 
responses that can lead the cells to apoptosis. The objectives of this project are the 
isolation and structural and functional characterization of a disintegrin from Crotalus 
durissus collilineatus venom. The snake venom will be fractionated on reversed-
phase chromatography on a C-18 column and the fraction containing the disintegrin 
will be submitted to additional chromatographic processes to isolate the disintegrin. 
The structural characterization of the molecule will be performed by amino-terminal 
sequencing and molecular mass determination by mass spectrometry. The cell 
adhesion and cell migration (a wound healing assay) assays will be performed in 
HepG2 cell lines, aiming the functional characterization of the disintegrin. Due to the 
possible action of disintegrins in thrombosis, angiogenesis, metastases, inflammation 
and other diseases related to integrins, this project is of great relevance, since it 
seeks to unravel the action of disintegrin C. d. Collilineatus in cancer Due to the 
possible action of the disintegrins in thrombosis, angiogenesis, metastases, 
inflammation and others diseases related to integrins, this project is of great 
relevance, since aims to clarify the action of the disintegrin from C. d. collilineatus 
venom in cancer cells. 
 
Key words: Crotalus durissus collilineatus, disintegrin, cell adhesion, cell migration, 
cancer. 
 
 
 
 
 
SUMÁRIO 
 
 
1. Introdução e revisão bibliográfica ......................................................................... 1 
1.1. Serpentes .......................................................................................................... 1 
1.2. Distribuição geográfica no Brasil ....................................................................... 1 
1.3. Envenenamento ................................................................................................ 2 
1.4. Componentes da peçonha crotálica. ................................................................. 2 
1.5. Desintegrinas .................................................................................................... 3 
1.5.1. Estrutura ..................................................................................................... 4 
1.5.2. Ação funcional ............................................................................................ 4 
2. Justificativa ........................................................................................................... 6 
3. Objetivos ............................................................................................................... 7 
3.1.Objetivo Geral .................................................................................................... 7 
4.1. Obtenção das peçonhas ................................................................................... 7 
4.2. Fracionamento das peçonhas Crotalus durissus collilineatus ........................... 7 
4.3. Determinação quantitativa de proteínas ............................................................ 8 
4.4. Eletroforese em gel de poliacrilamida (PAGE) .................................................. 8 
4.5. Identifiação de proteínas ................................................................................... 8 
4.5.1. Determinação da massa molecular por MALDI-TOF .................................. 8 
4.5.2. Sequenciamento N-terminal ....................................................................... 8 
4.5.3. Sequenciamento de novo de peptídeos ...................................................... 8 
4.5.4. Análise in silico das sequências.................................................................. 9 
4.6. Ensaio fundional ................................................................................................ 9 
4.6.1. Cultivo das células HepG2 .......................................................................... 9 
4.6.2. Ensaio de adesão celular ............................................................................ 9 
4.6.3. Ensaio de migração celular ....................................................................... 10 
5. Cronograma de execução ................................................................................... 10 
6. Referências bibliográficas .................................................................................. 11 
 
 
1 
 
 
 
1. INTRODUÇÃO 
 
 1.1. Serpentes 
 Dentre as famílias ofídicas existentes no mundo, as serpentes peçonhentas 
pertencem às famílias Atractaspididae, Colubridae, Elapidae e Viperidae 
(WARRELL, 2012). No Brasil são encontradas somente as famílias Elapidae e 
Viperidae (MELGAREJO, 2003). 
A família Viperidae pode ser facilmente identificada, pois as serpentes 
dessa família possuem uma cabeça triangular que é recoberta por pequenas 
escamas de aspecto parecido às escamas do restante de seu corpo. Essas 
serpentes possuem um aparelho inoculador solenóglifo, ou seja, cada maxila 
possui apenas um dente funcional, sendo este caracterizado como agudo, grande 
e oco (MELGAREJO, 2003). A peçonha é injetada na presa por compressão dos 
músculos acessórios das glândulas localizadas na região pós-orbital (JACKSON, 
2007; VONK et al., 2008; FRY et al., 2008). A subfamília Crotalinae, pertencente à 
família Viperidae, apresenta a fosseta loreal,um órgão termorreceptor, que se 
localiza entre o olho e a narina da serpente, capaz de detectar pequenas 
flutuações de radiação termal, tornando-a capaz de detectar a presença de presas 
endotérmicas e a direção que estas podem estar (BULLOCK; COWKES, 1952; 
BAKKEN; KROCHMAL, 2007). 
A subfamília Crotalinae é composta pelos gêneros Bothrops (FENWICK et 
al., 2009), Crotalus (WUSTER; BERNILS, 2011), Lachesis (MELGAREJO, 2003), 
sendo estes diferenciados pela cauda. O gênero Bothrops tem uma cauda 
simples, sem modificações, apenas com escamas subcaudais em pares 
(MELGAREJO, 2003); o gênero Crotalus, possui uma estrutura denominada 
chocalho ou guizo, na terminação da cauda, que gera um ruído quando a serpente 
se encontra pronta para o ataque ou irritada (BRASIL, 1911; HOGE; ROMANO-
HOGE, 1978/1979; JORGE; RIBEIRO; 1990); e, o gênero Lachesis apresenta as 
últimas escamas subcaudais eriçadas e modificadas, que terminam num espinho 
(MELGAREJO, 2003). 
 
 1.2. Distribuição geográfica no Brasil 
No território brasileiro, relativo ao gênero Crotalus, existe somente a 
espécie Crotalus durissus subdividida nas subespécies C. d. collilineatus, que é 
2 
 
 
 
encontrada no Centro-Oeste, Minas Gerais e São Paulo; C. d. terrificus, na região 
sul meridional e oriental, em zonas altas e secas; C. d. marajoensis, na região da 
Ilha de Marajó; C. d. ruruima, encontrada no norte do país; e C. d. cascavella, em 
regiões da caatinga do nordeste do país (CAMPBELL; LAMAR, 1989; PINHO; 
PEREIRA, 2001). E alguns autores consideram uma sexta subespécie, a C. d. 
trigonicus, encontrada em algumas regiões de Roraima (AUTO, 1999; CAMILLO, 
1998). 
 
 1.3. Ofidismo 
 De acordo com os dados publicados pelo SINAN (Sistema de Informações 
de Agravos de Notificação), em 2014 foram registrados 21.818 casos de 
envenenamento por serpentes pertencentes aos gêneros da subfamília Crotalinae. 
O maior número de acidentes foi causado pelo gênero Bothrops, com 19.115 
casos registrados. Seguido pelo gênero Crotalus, com 1.880 acidentes e, por 
último, o gênero Lachesis, com 823 casos (Fig. 1). 
 
 
Figura 1. Incidência e porcentagem dos casos de envenenamento ofídico 
registrados por gênero em 2014 pelo Sistema de Informações de Agravos de 
Notificação (SINAN). 
 
1.4. Componentes da peçonha crotálica 
As peçonhas ofídicas possuem uma mistura complexa de centenas de 
moléculas, tais como: componentes orgânicos e minerais (histaminas e outros 
alérgenos, poliaminas, alcalóides, entre outros), pequenos peptídeos e proteínas 
com atividades farmacológicas (MARKLAND, 1998; MÉNEZ, 2002). 
0 
5,000 
10,000 
15,000 
20,000 
Acidentes Ofídicos 
87% 
4% 
9% 
Acidentes Ofídicos 
Bothrops Lachesis Crotalus 
2 
 
 
 
Dentre os compostos inorgânicos, foram identificados cálcio, cobre, ferro, 
potássio, magnésio, manganês, sódio, fósforo, cobalto e zinco. Além de outros 
componentes como: carboidratos (em glicoproteínas), lipídeos (fosfolipídeos), 
aminas biogênicas, aminoácidos e nucleotídeos (BJARNASON et al, 1994). 
Porém, majoritariamente, a peçonha é formada por proteínas, correspondendo 
entre 90-95% do peso seco da peçonha (MARKLAND, 1998). Entre as proteínas, 
encontram-se as proteases, sendo os principais exemplos as metaloproteases e 
as serinoproteases, havendo também outras enzimas, sendo elas: fosfolipases, 
fosfodiesterasas, colinesterases, aminotransferases, L-aminoácido oxidases, 
catalases, ATPases, hialuronidases, NAD nucleosidases e L-glicosaminidases 
(MATSUI et al., 2000). A peçonha crotálica é considerada mais tóxica do que a do 
gênero Bothrops (BELLUOMINI, 1984; BRASIL, 1911). 
A peçonha de Crotalus durissus é rica em crotoxina (SLOTTA; FRAENKEL-
CONRAT, 1938), uma proteína que corresponde a cerca de 65% da peçonha 
crotálica (DOBRACHINSK, 2012; CLISSA, 1997) e é a fração mais tóxica da 
peçonha (HENDON; FRAENKEL-CONRAT, 1971). Duas substâncias são 
necessárias para formar a crotoxina, a fosfolipase A2 e a crotapotina, que 
interagem através de uma ligação fraca. A crotoxina possui atividade miotóxica e 
sua fisiopatologia consiste na ação da fosfolipase A2, que hidrolisa fosfolipídeos da 
membrana plasmática e sua ação é potencializada com auxílio da crotapotina 
(FORTES-DIAS et al., 1994). Sua ação sistêmica pode levar à rabdomiólise, com 
liberação de mioglobina no sangue e sistema linfático e aumento nos níveis de 
creatinofosfoquinase (CPK), desidrogenase láctica (DHL) e aspartato amino 
transferase (TGP) (SILVEIRA et al., 1992). A crotoxina também possui atividade 
neurotóxica, bloqueando a ação do neurotransmissor acetilcolina na pré-sinapse, 
que resulta em alterações neuromusculares, convulsões, perturbações 
respiratórias e circulatórias (Clark et al., 1997). 
A crotamina (GONÇALVES; VIEIRA, 1950) é outra proteína com ação 
miotóxica, que atua nas membranas das fibras musculares, despolarizando as 
células (OGUIURA et al., 2005). 
A proteína giroxina presente na peçonha crotálica, curiosamente, leva o 
animal envenenado a girar em torno do seu próprio eixo (BARRIO, 1961); 
(BARRABIN et al., 1978) e também age sobre proteínas plasmáticas, 
desencadeando distúrbios hematológicos (SERRANO; MAROUN, 2005). 
3 
 
 
 
A ação hepatotóxica da peçonha é evidenciada por alterações enzimáticas 
das alaninas, alaninatransferase e aminotransferase encontradas nos hepatócitos 
(MOHAMED et al. 1981). Como a peçonha é excretada predominantemente pelos 
rins há um aumento na sua concentração neste órgão e ocorrência de toxicidade 
celular direta. A fisiopatologia da atividade nefrotóxica consiste principalmente em 
alterações glomerulares, na ultra-estrutura das células dos túbulos proximais e 
obstrução da luz tubular. Sua principal causa esta ligada à rabdomiólise (ZAGER, 
1996; SCHMIDT et al., 1976). 
Também existem componentes com atividades farmacológicas já 
conhecidas, como a crotalfina, um peptídeo analgésico potente (KONNO et al., 
2008), a enzima trombina-símile, utilizada como “selante de fibrina” (BARROS et 
al., 2009) e a hialuronidase (BORDON et al., 2012). Contudo, esses componentes 
foram pouco estudados, mas também contribuem para a patogenia do acidente 
crotálico. 
Na peçonha ainda existem outros componentes como: peptídeos 
natriuréticos (EVANGELISTA et al., 2008), convulxina (EVANGELISTA et al., 2008; 
PRADO-FRANCESCHI, VITAL-BRAZIL, 1981), proteínas semelhantes a lectina 
tipo-C (FRANCISCHETTI et al., 1997; TOYAMA et al., 2001; HAMAKO et al., 2007; 
WELLNER, 1960), L-aminoácido oxidases (TORII; NAITO, M.; TSURUO,1997; 
TOYAMA et al., 2006; VARGAS et al., 2012) e peptídeos potencializadores de 
bradicinina (HIGUCHI et al., 2006; GOMES et al., 2007). 
 
 1.5. Desintegrinas 
As peçonhas ofídicas também são compostas por desintegrinas. A primeira 
desintegrina foi descoberta por Stefan Niewiarowski e Tur-Fu Huang em 1987. Os 
autores isolaram uma proteína pequena e de baixa massa molecular da peçonha 
de uma serpente exótica da Indonésia, Trimeresurus gramineus, e através de um 
ensaio funcional com essa proteína, observaram a inibição da agregação 
plaquetária pelo bloqueio da ligação do fibrinogênio com o ADP estimulado por 
plaquetas. O termo “desintegrina” foi proposto por Gould et al. (1990) e sua 
ocorrência natural inspirou muitos pesquisadores pela interação molecular com 
integrinas IIb 3, v 3 e 5 1. Essa interação conduziu à descoberta de um 
agente com potencial terapêutico para tromboses, angiogenêses, mestástases, 
4 
 
 
 
inflamação e outras doenças relacionadas com integrinas (HUANG, 2010). A 
desintegrina da serpente Crotalus durissus collilineatus foi identificada por Boldrini-
França et al. (2009; 2010) através de técnicas transcriptômicas e proteômicas. 
 
 1.5.1. Estrutura 
ADAM (“A disintegrin and metalloproteases”) são metaloproteases 
ancoradas na membrana e estas possuem um domínio extracelular que contém 
umdomínio N-terminal de metaloproteases e um domínio de desintegrina do tipo 
RGD, KGD, MLD, ECD, VGD, MGD e WGD o qual reconhece integrinas ou 
receptores celulares (MOURA-DA-SILVA et al., 1996; CALVETE et al., 2009; 
CALVETE, 2010). 
As SVMP (Snake Venom Metalloproteases) são proteínas ricas em resíduos 
de cisteínas e são divididas em subgrupos de acordo com o tamanho da cadeia e 
o número de ligações de dissulfeto (CALVETE, 2005). Uma das primeiras 
atividades das metaloproteases descoberta foi a inibição da agregação plaquetária 
e estas enzimas foram as primeiras a serem isoladas como os menores e solúveis 
inibidores da agregação presentes na peçonha (WESKAMP, 1994). 
 A desintegrina é liberada na peçonha da serpente por um processo 
proteolítico de precursores de metaloproteases do tipo PII (SVMPs) (KINI; EVANS, 
1992). É uma proteína pequena (40-100 aminoácidos) e pode ser classificada de 
acordo com o número de resíduos de cisteínas e o tamanho da sua cadeia, ou 
seja, são consideradas desintegrinas curtas quando apresentam oito cisteínas, 
média com doze cisteínas e longas com quatorze cisteínas. As desintegrinas 
também podem ser classificadas de acordo com sua função, por conta da 
presença de um motivo tripeptídico no sítio de ativação, sendo denominadas como 
sequências RGD-, MLD- e KTS- (MARCINKIEWICZ, 2005). 
 
 1.5.2. Ação funcional 
 As integrinas em estado funcional são glicoproteínas heterodiméricas 
composta por alfa e beta subunidades e são os receptores mais importantes para 
interação célula-matriz (HYNES, 2002). Estas determinam funções celulares em 
tecidos normais que formam um órgão particular, por exemplo, células envolvidas 
na construção de um tecido expressam receptores para proteínas da matriz 
extracelular enquanto células imunes expressam receptores responsáveis pela 
5 
 
 
 
interação célula-célula. Muitas respostas celulares requerem a ativação de 
integrinas. Esta ativação gera mudança conformacional do domínio extracelular, o 
qual é iniciado por estimulação da cauda citoplasmática da integrina. Esse tipo de 
sinal é denominado “ao avesso” e estimula os receptores a se ligarem aos 
ligantes. Por exemplo, a integrina IIb 3 depende desse sinal para ligar-se ao 
fibrinogênio, quando ocorre a estimulação plaquetária. Outro sinal conhecido como 
“de fora para dentro”, gera sinais transducionais pela ligação do ligante à integrina 
(HARBURGER, 2009). A ligação de integrinas com componentes endógenos 
estabiliza o meio celular e gera sinais de sobrevivência, mas, em certas condições, 
as integrinas estão envolvidas no desencadeamento de sinais apoptóticos, 
quando, por exemplo, ocorre a falha da ligação das integrinas com a matriz 
extracelular (CHERESH, 2008). 
 Portanto, as integrinas são mediadores de adesão celular e a ligação da 
célula à matriz extracelular via integrina resulta em uma cascata de sinalização 
intracelular que pode alterar significativamente o padrão de expressão gênica 
daquela célula (HYNES, 1992). 
A adesão de uma célula a outra, ou de uma célula à matriz extracelular, é 
fundamental para diversos processos fisiológicos e patológicos, ou seja, o 
desenvolvimento, diferenciação, transdução de sinais, resposta imunológica, 
manutenção da estrutura tecidual, metástases tumorais e cicatrização de 
ferimentos são processos dependentes das integrinas expressas pelas células 
(WAGNER et al., 1994). 
 Há muitas proteínas que interferem na adesão celular, dentre elas, a 
desintegrina presente na peçonha que atua como ligante antagonista de integrinas 
(GOULD et al., 1990). Além disso, as desintegrinas também atuam inibindo a 
migração e a proliferação celular. O primeiro trabalho demonstrando essas ações 
foi publicado por Soszka et al. (1991). Esses autores empregaram a desintegrina 
albolabrin, uma desintegria RGD monomérica de tamanho médio, que inibiu a 
adesão de células de melanoma B16F10 pela fibronectina e laminina, bem como, 
bloqueou metástase destas células em ratos experimentais. 
 Estudos recentes demonstram a ação de desintegrinas de serpentes 
Crotalus com ação anticancerígena. Saviola et al. (2016) avaliaram ação da 
desintegrina Tzabcanin, isolada da peçonha de Crotalus simus tzabcan, em ensaio 
com linhagens de células de melanoma A-375 e câncer de pulmão A-549 que 
6 
 
 
 
expressam a integrina v 3. Essa integrina é importante na mobilidade e invasão 
do tumor e também é o maior receptor da matriz extracelular da proteína 
vitronectina. Os resultados demonstraram que a desintegrina inibiu a adesão 
celular com a proteína vitronectina e inibiu a migração celular em ambas as 
linhagens. Além disso, a desintegrina exibiu fraca citotoxicidade para as células A-
375 e não afetou a viabilidade das células A-549. 
 Outros estudos sugerem a ação biológica das peçonhas de C. d. 
collilineatus e C. d. terrificus apresentam componentes pró-inflamotórios e anti-
inflamatórios que atuam na modulação do sistema imune (RIBEIRO et al., 2014). 
 Dentre os estudos da peçonha de C. d. collilineatus, há também a 
investigação de um inibidor de fosfolipases A2 presente em sua peçonha com 
grande potencial no tratamento em casos de picadas de serpentes ou em doenças 
inflamatórias no qual PLA2s estão envolvidas (GIMENES et al., 2014). 
 Portanto, o estudo dos componentes presentes na peçonha de serpentes 
do gênero Crotalus é relevante para o desenvolvimento de futuros fármacos, já 
que diversos componentes de sua peçonha apresentam grande potencial 
terapêutico. 
 
2. JUSTIFICATIVA 
 
 As integrinas são mediadores de adesão celular e estão envolvidas em 
diversos processos fisiológicos e patológicos, entre eles, metástases tumorais. As 
desintegrinas presentes em peçonhas ofídicas atuam como ligantes antagonistas 
de integrinas, inibindo a migração e a proliferação celular. Nesse sentido, as 
desintegrinas têm grande potencial terapêutico. Portanto, o conhecimento da 
estrutura e função de desintegrinas poderá contribuir para o desenvolvimento de 
novos fármacos, e para o tratamento de envenenamento ofídico. 
 Convém ressaltar ainda que esse projeto contribuirá grandemente para a 
formação acadêmica e profissional da graduanda, visto que ela ficará apta a 
realizar ensaios funcionais com células em cultura, técnicas cromatográficas e 
ensaios de eletroforese. Aprenderá a utilizar pipetas automáticas, 
espectrofotômetros, liofilizador e também será capaz de realizar outras técnicas 
necessárias para a purificação de substâncias. 
 
7 
 
 
 
3. OBJETIVOS 
 
3.1. Objetivo Geral 
Este projeto visa o isolamento e a caracterização estrutural e funcional de 
uma desintegrina da peçonha de serpente Crotalus durissus collilineatus. 
Para isto, serão realizadas as seguintes etapas: 
- A peçonha de serpente C. d. collilineatus será fracionada por 
cromatografia de fase reversa, segundo metodologia descrita por Boldrini-França 
et al. (2010). 
- A fração proteica contendo a desintegrina será recromatografada na 
tentativa de isolar a proteína. 
- Sequenciamento amino-terminal por degradação de Edman. 
- Determinação da massa molecular por espectrometria de massas. 
- Caracterização funcional utilizando a linhagem de células HepG2. 
 
4. MATERIAL E MÉTODOS 
 
4.1. Obtenção das peçonhas 
 As serpentes estudadas são da região de Catalão - GO e são mantidas no 
serpentário do Biotério Central da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto 
(FMRP/USP). A peçonha bruta será extraída e fornecida pelo serpentário, 
dessecada a vácuo, em temperatura ambiente, e conservada a -20 ˚C. O Anexo A 
apresenta o Certificado de Regularidade do Biotério Central emitido pelo IBAMA. 
 
4.2. Fracionamento da peçonha de Crotalus durissus collilineatus 
A peçonha será fracionada através do método descrito por Boldrini-França 
et al. (2010). O fracionamento será realizado em uma coluna de fase reversa C-18 
Semipreparativa (250 x10 mm, Phenomenex, 5 m, 300 Å, USA), sob vazão de 
5,0 mL/min, no sistema Äkta Purifier UPC10 (GE Healthcare – UK) de 
Cromatografia Líquida Rápida de Proteínas (FPLC - Fast Protein Liquid 
Chromatography). A eluição das frações será realizada com gradiente segmentado 
de TFA 0,1% (solução A) e ACN 80% + TFA 0,1% (solução B), com 
monitoramento automático da absorbância em 214 nm. As frações coletadas serão 
liofilizadas para posterior análise. 
8 
 
 
 
 
4.3. Determinação quantitativa de proteínas 
A concentração proteica das frações purificadas será estimada pelo método 
de Scopes (1974). 
 
4.4. Eletroforese em gel de poliacrilamida com agente desnaturante 
(SDS-PAGE) 
A eletroforese em gel de poliacrilamida com dodecil sulfato de sódio (SDS) 
das frações obtidas será realizada como descrito por Laemmli (1970). Os géis 
serão corados com Coomassie Phastgel Blue R-350 0,2% (GE Healthcare) por 
cerca de 2 horas e descorados com solução de ácido acético 10% (V/V). 
 
4.5. Identificação de proteínas 
 
4.5.1. Determinação da massa molecular por MALDI-TOF 
A massa molar da desintegrina será determinada pela técnica de Ionização 
e Dessorção a Laser Assistida por Matriz e analisada em analisador do tipo TOF 
(time of flight) (MALDI-TOF), modelo Ultraflex II (Bruker Daltonics - DE), equipado 
com uma fonte de laser do tipo Nd-YAG Smartbeam laser (MLN 202, LTB). O 
ácido sinapínico será a matriz utilizada e o aparelho será operado no modo 
refletido. Estes ensaios serão realizados na Central de Espectrometria de Massas 
da FCFRP-USP. 
 
4.5.2. Sequenciamento N-terminal 
A sequência amino-terminal da desintegrina será obtida por degradação de 
Edman (EDMAN; BEGG, 1967), em um sequenciador automático de proteínas 
(PPSQ-33A – Shimadzu), conforme instruções do fabricante. A sequência obtida 
será comparada com sequências já conhecidas em banco de dados (BLAST), em 
busca de similaridade. 
 
4.5.3. Sequenciamento de novo de peptídeos 
A desintegrina purificada será reduzida com ditiotreitol (DTT), alquilada com 
iodoacetamida e digerida com tripsina (Promega) (CELEDON et al., 2007). Os 
9 
 
 
 
peptídeos tripsínicos resultantes serão dessalinizados por fase reversa em Zip Tip 
C18 (Millipore), para que possam ser analisados por espectrometria de massas. 
 
4.5.4. Análise in silico das sequências 
As sequências encontradas serão analisadas in silico para encontrar 
identidade sequencial com proteínas depositadas em bancos de dados, como 
BLAST (NCBI), MASCOT e UniProt. 
 
4.6. Ensaios funcionais 
 Os ensaios funcionais serão realizados em colaboração com a Dra. Lusânia 
Maria Greggi Antunes da Faculdade de Ciências Farmacêuticas de Ribeirão Preto 
– USP. 
 
 4.6.1. Cultivo das células HepG2 
A linhagem celular HepG2, células de hepatocarcinoma humano, obtida da 
ATCC (American Type Culture Collection), será cedida pelo Hemocentro do 
Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto – USP e 
mantida em estufa com 5% de CO2, a 37ºC e 96% de umidade. Para realização 
dos experimentos, as células HepG2 serão mantidas de acordo com os 
procedimentos para manutenção de linhagens celulares propostos por Bal-Price e 
Coecke (2011). 
 
4.6.2. Ensaio de adesão celular 
O método MTT, originalmente descrito por Mosmann (1993), com 
modificações, será utilizado para verificar a citotoxicidade das toxinas em 
diferentes concentrações e tempos de tratamento. A sigla MTT se refere ao 
reagente utilizado na avaliação final, ou seja, o 3-(4,5-dimetiltiazol-2il)-2-5-difenil-
2H tetrazolato de bromo. Após o tratamento das células com as toxinas, a leitura 
das absorbâncias em 570 nm será realizada em um leitor de microplacas. Os 
experimentos serão realizados em triplicata e a analise estatística será feita por 
ANOVA. 
 
10 
 
 
 
4.6.3. Ensaio de migração celular 
 A migração celular será determinada através do método proposto por 
Valster et al. (2005), denominado ensaio de cicatrização (a wound healing assay). 
As células HepG2 serão cultivadas a uma densidade de 5 x 105 células/poço em 
placas de seis poços e incubadas a 37°C durante 24 horas. Posteriormente, será 
realizada uma lesão, cortando ao meio a cultura de células, utilizando-se a ponta 
da pipeta padrão de 1 mL. As células serão lavadas com PBS para remover os 
restos celulares e cultivadas em meio com DMEM isento de soro e expostos a 
SNP (0, 0.5, 1.0 ou 1.5 mM) durante 24 horas. O espaço entre as duas metades 
será fotografado por um microscópio invertido, modelo CK31. A cicatrização da 
ferida será analisada usando o programa Image-Pro Plus Software, versão 6.0 
(Media Cybernetics, Inc., Rockville, MD, EUA) e de acordo com a seguinte fórmula: 
 
Os experimentos serão realizados em triplicata e a analise estatística será feita por 
ANOVA. 
 
5. CRONOGRAMA DE EXECUÇÃO 
 
Atividades a serem desenvolvidas 
Semestre 
1˚ 2˚ 
Levantamento bibliográfico X X 
Fracionamento da peçonha de Crotalus durissus collilineatus X 
Determinação quantitativa de proteínas e SDS-PAGE X 
Determinação da massa molecular por MALDI-TOF X 
Sequenciamento N-terminal X 
Ensaio de adesão celular X 
Ensaio de migração celular X 
Análise dos dados X X 
Redação dos relatórios de pesquisa X X 
Redação do artigo X 
 
11 
 
 
 
6. PLANO DE TRABALHO PARA CADA INTEGRANTE DA EQUIPE 
 
Profª. Drª Eliane Candiani Arantes Braga (orientadora) – Professora Titular do 
Departamento de Física e Química da Faculdade de Ciências Farmacêuticas de 
Ribeirão Preto – USP. Possui grande experiência com purificação de peçonhas 
animais, com ênfase em caracterização de toxinas e enzimas. Responsável pela 
orientação da aluna durante todo o período da iniciação científica. 
 
Profª. Drª Lusânia Maria Greggi Antunes (colaboradora) – Professora associada da 
Faculdade de Ciências Farmacêuticas de Ribeirão Preto – USP. Possui 
experiência na área de Genética e Bioquímica da Nutrição, atuando principalmente 
nos seguintes temas: análise genotóxica e antigenotóxica de antioxidantes da 
dieta, análise de alterações do DNA induzida por agentes mutagênicos e mais 
recentemente, epigenética e nutrigenômica. Auxiliará a aluna nos ensaios 
funcionais de adesão celular e migração celular. 
 
Drª. Karla de Castro Figueiredo Bordon (colaboradora) – Especialista no 
Laboratório no Laboratório de Toxinas Animais da Faculdade de Ciências 
Farmacêuticas de Ribeirão Preto – USP. Doutora em Ciências (área de 
concentração: Toxicologia). Atua na área de Bioquímica e Toxicologia, em especial 
em purificação e caracterização de biológica e enzimática de proteínas, bem como 
proteômica aplicada ao estudo de toxinas animais. Auxiliará a aluna no 
sequenciamento e fracionamento das toxinas da peçonha. 
 
Iara Aimê Cardoso (colaboradora) – Técnica no Laboratório de Toxinas Animais da 
Faculdade de Ciências Farmacêuticas de Ribeirão Preto – USP. Auxiliará nos 
experimentos com apoio técnico, quando necessário. 
 
Isadora Sousa de Oliveira (colaboradora) – Graduada em Biomedicina pela 
Universidade Federal do Triângulo Mineiro – UFTM. Auxiliará a aluna no apoio 
científico e na análise de dados. 
 
Isabela Gobbo Ferreira (colaboradora) – Graduada em Ciências Farmacêuticas 
pela Universidade de Ribeirão Preto – UNAERP. Auxiliará a aluna no apoio 
científico e na análise de dados. 
 
Rafaella Varzoni Manzini (responsável) - Responsável pela realização de todos os 
experimentos propostos neste projeto, assim como, a redação de relatórios e do 
artigo, sob a supervisão direta da orientadora e das colaboradoras. 
 
 
12 
 
 
 
7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 
 
AUTO, H. J. F. Animais peçonhentos. Maceió: EdUFAL, 1999. 114 p. 
BAKKEN, G. S.; KROCHMAL, A. R. The imaging properties and sensitivity of the 
facial pit of pitvipers as determined by optical and heat-transfer analysis. J. Exp. 
Biol. v. 210, p. 2801 – 2810,2007. 
BARRABIN, H. et al. Isolation and characterization of gyroxin from Crotalus 
durissus terrificus venom. In Toxins: Animal, Plants and Microbial. (ROSENBERG, 
P. Ed.), Pergamon Press: New York, 133p., 1978. 
BARRIO, A. Gyroxin, a new neurotoxin of Crotalus durissus terrificus venom. Acta 
Physiol. Latinoamer. v. 11, p. 224, 1961. 
BARROS, L. C. et al. A new fibrin sealant from Crotalus durissus terrificus venom: 
applications in medicine. Jour Toxicology Environm Healt, Part B, v. 12, n. 8, p. 
553-571, 2009. 
BELLUOMINI, H. E. Conhecimentos sobre as serpentes brasileiras e medidas de 
prevenção de acidentes. Rev. bras. Saúde ocup, v. 12, p. 82 – 96, 1984. 
BJARNASON, J. B.; Fox, J. W. Hemorrhagic metalloproteinases from snake 
venoms. Pharmac. Ther, n. 62, pp. 325-372, 1994. 
BOLDRINI-FRANÇA, J.; et al. Snake venomics and antivenomics of Crotalus 
durissus subspecies from Brazil: Assessment of geographic variation and its 
implication on snakebite management. Journal Proteomics. 73 (2010) 1758-1776. 
BOLDRINI-FRANÇA, J., et al. Crotalus durissus collilineatus venom gland 
transcriptome: Analysis of gene expression profile. Biochimie 91 (2009) 586–595. 
BORDON, K. C. F. et al. Isolation, enzymatic characterization and 
antiedematogenic activity of the first reported rattlesnake hyaluronidase from 
Crotalus durissus terrificus venom. Biochim, v. 94, n. 12, p. 2740 – 2748, 2012. 
BRADFORD, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram 
quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analytical 
biochemistry, v. 72, n. 1, p. 248 – 254, 1976. 
BRASIL, V. A defesa contra ophidismo. São Paulo, Pocai & Weiss, 152 p., 1911. 
BULLOCK, T. H.; COWLES, R. B. Physiology of an infrared receptor: the facial pit 
of pit vipers. Science, v. 115, p. 541 – 543, 1952. 
CALVETE, J.J., et al. Snake venom disintegrins: evolution of structure and 
function. Toxicon 2005;45:1063–74. 
CALVETE, J. J.; JUÁREZ, P.; SANZ, L.. Snake venomics. Strategy and 
applications. J. Mass Spectrometry, v. 42, n. 11, p. 1405 – 1414, 2007. 
CALVETE, J.J., 2010. Brief history and molecular determinants of snake venom 
disintegrin evolution. In: Kini, R.M., Markland, F., McLane, M. A., Morita, T. (Eds.), 
Toxins and Hemostasis: From Bench to Bedside. Springer, Amsterdam, pp. 285–
300 (Chapter 18). 
CALVETE, J.J., Juárez, P., Sanz, L., 2009. Snake venomics and disintegrins. 
Portrait and evolution of a family of snake venom integrin antagonists. In: 
13 
 
 
 
Mackessy, S.P. (Ed.), Handbook of Venoms and Toxins of Reptiles. CRC Press, 
Taylor & Francis, Boca Ratón, pp. 337–357 (Chapter 17). 
CAMILLO, M. A. P. Contribuição ao estudo das giroxinas (enzimas semelhantes à 
trombina) dos venenos das serpentes brasileiras Lachesis muta muta e Crotalus 
durissus terrificus. 1998. 75 f. Tese (Doutorado) – Instituto de Pesquisas 
Energéticas e Nucleares, São Paulo, São Paulo, 1998. 
CAMPBELL, J. A.; LAMAR, W. W. The Venomous Reptiles of Latin America. 
Cornell University Press: Ithaca, NY. 1989. 
CELEDON, P. A. F. et al. Proteomic analysis of the cambial region in juvenile 
Eucalyptus grandis at three ages. Proteomics, v. 7, n. 13, p. 2258 – 2274, 2007. 
CHERESH, D.A., Stupack, D.G. Regulation of angiogenesis: apoptotic cues from 
the ECM. Oncogene 2008;27:6285–98. 
CLARK, R.F.; Williams, S.R.; Nordt, S.P.; Boyer-Hassen, L.V. Successful treatment 
of crotalid-induced neurotoxicity with a new polyspecific crotalid Fab antivenom. 
Ann Emerg Med 1997 Jul;30(1):54-7. 
CLISSA, P. B. Otimização da atenuação da toxicidade do veneno crotálico 
irradiado e estudo de suas propriedades imunológicas. 79p. Dissertação de 
Mestrado – Instituto de pesquisas energéticas e nucleares, Universidade de São 
Paulo, São Paulo, 1997. 
DOBRACHINSK, L. Avaliação da potencial atividade citotóxica da peçonha de 
Caudissona durissa terrificus em células mononucleares do sangue periférico 
humano. 127f. Dissertação de Mestrado – Pontifícia Universidade Católica de 
Goiás, Goiás, 2012. 
EDMAN, P.; BEGG, G. A protein sequenator. Europ. Journ. Biochem., v. 1, n. 1, 
p. 80 – 91, 1967. 
EVANGELISTA, J. S. et al. Renal and vascular effects of the natriuretic peptide 
isolated from Crotalus durissus cascavella venom. Toxicon, v. 52, p. 737 – 744, 
2008. 
FENWICK, A. et al. Morphological and molecular evidence for phylogeny and 
classification of South American pitvipers, genera Bothrops, Bothriopsis, and 
Bothrocophias (Serpentes: Viperidae). Zoological Jour. Linnean Society, London, 
v. 156, n. 3, p. 617 – 640, 2009. 
FORTES-DIAS, C.L; Lin, Y.; Ewell, J.; Diniz, C.R.; Liu, T.Y. A phospholipase A2 
inhibitor from the plasma of the South American rattlesnake (Crotalus durissus 
terrificus). Protein structure, genomic structure, and mechanism of action. J Biol 
Chem 1994 Jun 3;269(22):15646-51. 
FRANCISCHETTI, I. M. et al. Convulxin, a potent platelet-aggregating protein from 
Crotalus durissus terrificus venom, specifically binds to platelets. Toxicon. v. 35, p. 
1217 – 1228, 1997. 
FRY, B. G. et al. A. Evolution of an arsenal. Mol. Cell. Proteomics v. 7, p. 215 – 
246, 2008. 
GIMENES, S. N. C.; et al. Isolation and biochemical characterization of a g-type 
phospholipase A2 inhibitor from Crotalus durissus collilineatus snake serum. 
Toxicon 81 (2014) 58–66. 
14 
 
 
 
GOMES, C. L. et al. Identification of novel bradykinin-potentiating peptides (BPPs) 
in the venom gland of a rattlesnake allowed the evaluation of the structure-function 
relationship of BPPs. Biochem. Pharmacol. v. 74, p. 1350 – 1360, 2007. 
GONÇALVES, J. M.; VIEIRA, L. G. Estudos sobre venenos de serpentes 
brasileiras. I. Análise eletroforética. An. Acad. Bras. Cienc, v. 22, p. 141 – 150, 
1950. 
Gould, R.J., Polokoff, M.A., Friedman, P.A., Huang, T.-F., Holt, J.C., Cook, J.J., 
Niewiarowaki, S., 1990. Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 195, 168–171 
HAMAKO, J. et al. Amino acid sequence and characterization of C-type lectin 
purified from the snake venom of Crotalus ruber. Comp. Biochem. Physiol. B. 
Biochem. Mol. Biol. v. 146, p. 299 – 306, 2007. 
HARBURGER, D.S., Calderwood, D.A. Integrin signaling at a glance. Journal of 
Cell Science. 2009;122:159–63. 
HENDON, R. A.; FRAENKEL-CONRAT, H. Biological roles of two components of 
crotoxin. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United 
States of America, v. 68, n. 7, p. 1560 – 1563, 1971. 
HIGUCHI, S. et al. A novel peptide from the ACEI/BPP-CNP precursor in the 
venom of Crotalus durissus collilineatus. Comp. Biochem. Physiol. C. Toxicol. 
Pharmacol. v. 144, p. 107 – 121, 2006. 
HOGE, A. R.; ROMANO-HOGE, S. A. R. W. L. Sinopse das serpentes 
peçonhentas do Brasil. Mem. Inst. Butantan, v. 42/43, p. 373 – 496, 1978/1979. 
HUANG, T.-F., 2010. The discovery of disintegrins. In: Kini, R.M., Markland, F., 
McLane, M.A., Morita, T. (Eds.), Toxins and Hemostasis: From Bench to Bedside. 
Springer, Amsterdam, pp. 269–284 (Chapter 17). 
HYNES RO. Integrins: bidirectional, allosteric signaling machines. Cell 
2002;110:673–87. 
HYNES, R. O. Integrins: versatility, modulation, and signaling in cell adhesion. Cell, 
n. 3, pp. 11-25, 1992. 
JACKSON, K. The evolution of venom-conducting fangs: Insights from 
developmental biology. Toxicon, v. 49, p. 975 – 981, 2007. 
JORGE, M. T.; RIBEIRO, L. A. Acidentes por serpentes peçonhentas do Brasil. 
AMB rev. Assoc. Med. Bras, v. 36, n. 2, p. 66 – 77, 1990. 
KINI, R., EVANS, H.J., 1992. Structural domains in venom proteins: evidence that 
metalloproteinases and nonenzymatic platelet aggregation inhibitors (disintegrins) 
from snake venoms are derived by proteolysis from a common precursor. Toxicon 
30, 265–293. 
KONNO, K. et al. Crotalphine, a novel potent analgesic peptide from the venom of 
the South American rattlesnake Crotalus durissus terrificus. Peptides, v. 29, n. 8, 
p. 1293-1304, 2008. 
LAEMMLI, U. K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of 
bacteriophage T4. Nature, v. 227, n. 5259,p. 680 – 685, 1970. 
15 
 
 
 
MARCINKIEWICZ C. Functional characteristic of snake venom disintegrins: 
potentialtherapeutic implication. Current Pharmaceutical Design 2005;11:815–
27. 
MARKLAND, F. S. Snake venoms and the homostatic system. Toxicon, n. 36, pp. 
1749-1800, 1998. 
MATSUI, T.; Fujimura, Y.; Titani, K. Snake venom proteases ajecting hemostasis 
and thrombosis. Biochim. Biophys. Acta, n. 1477, pp. 146-156, 2000. 
MELGAREJO, A. R. Serpentes peçonhentas do Brasil. In: (Ed) Animais 
peçonhentos do Brasil – biologia, clínica e terapêutica dos acidentes. 1, Sarvier, 
São Paulo, 2003, cap. 4, p. 33 – 61. 
MÉNEZ, A. (Ed.), 2002. Perspectives in Molecular Toxicology. Wiley, Chichester, 
UK. 
MOHAMED, A.H; et al. Effects of several snake venoms on serum and tissue 
transaminases, alkaline phosphatase and lactate dehydrogenase. Toxicon 
1981;19(5):605-9. 
MOSMANN T: Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival: application 
to proliferation and cytotoxicity assays. J lmmunol Methods 1993, 65:55–63. 
MOURA-DA-SILVA, A.M., Theakston, R.D., Crampton, J.M., 1996. Evolution of 
disintegrin cysteine-rich and mammalian matrix-degrading metalloproteinases: 
gene duplication and divergence of a common ancestor rather than convergent 
evolution. J. Mol. Evol. 43, 263–269. 
OGUIURA, N.; Boni-Mitake, M.; Rádis-Baptista, G. New view on crotamine, a small 
basic polypeptide myotoxin from South American rattlesnake venom. Toxicon., v. 
46, p. 363 – 370, 2005. 
PINHO, F. M. O.; Pereira, I. D. Ofidismo. Rev. Ass. Med. Brasil., São Paulo, v. 47, 
n. 1, p. 6, 2001. 
PRADO-FRANCESCHI, J.,Vital-Brazil, O., 1981. Convulxin, a new toxin from the 
venom of South American rattlesnake (Crotalus durissus terrificus). Toxicon, v. 19, 
p. 661–666, 1981. 
RIBEIRO, C. B.; et al. “Crotalus durissus collilineatus Venom Induces TNF-α and 
IL-10 Production in Human Peripheral Blood Mononuclear Cells”. ISRN 
Inflammation, vol. 2014. 
SAVIOLA, A.J., Burnsa, P. D., Mukherje, A. K., Mackessya, S. P. The disintegrin 
tzabcanin inhibits adhesion and migration inmelanoma and lung cancer cells. 
International Journal of Biological Macromolecules 88 (2016) 457–464. 
SCHMIDT, M.E.; Abdelbaki, Y.Z.; Tu, A.T. Nephrotoxic action of rattlesnake and 
sea snake venoms: an electron-microscopic study. J Pathol 1976 Feb;118(2):75-
81. 
SCOPES, R. K. Measurement of protein by spectrophotometry at 205 nm. 
Analytical biochemistry, v. 59, n. 1, p. 277-282, 1974. 
SERRANO, S. M. T.; MAROUN, R. C. Snake venom serine proteinases: sequence 
homology vs. substrate specificity, a paradox to be solved. Toxicon v.45, p.1115 – 
1132, 2005. 
16 
 
 
 
SILVEIRA, P.V.P.; Nishioka, A.S. Soutl America ratlesnake bite in Brazilian 
teaching hospital. Clinical and epidemiological studyof 87 cases, with analysis of 
factors predictive of renal failure. Trans R Trop Med Hyg 1992;86:562-4. 
SLOTTA, K.; FRAENKEL-CONRAT, H. Schlangengifte III. Mitteilung: Reinigung 
und Kristallisation des Klapperschlangengiftes. Bericht Deutsche Chemische 
Gesellschaft, v. 71, p. 1076 – 1081, 1938. 
SOSZKA T, Knudsen KA, Beviglia L, Rossi C, Poggi A, Niewiarowski S. Inhibition 
ofmurine melanoma cell–matrix adhesion and experimental metastasis by albo-
labrin, an RGD-containing peptide isolated from the venom of Trimeresurus 
albolabris. Experimental Cell Research 1991;196:6–12. 
TORII, S.; NAITO, M.; TSURUO, T. Apoxin I, a novel apoptosis-inducing factor with 
L-amino acid oxidase activity purified from Western diamondback rattlesnake 
venom. J. Biol. Chem. v. 272, p. 9539 – 9542, 1997. 
TOYAMA, M. H. et al. Isolation and characterization of a convulxin-like protein from 
Crotalus durissus collilineatus venom. J Protein Chem. v. 20, p. 585 – 591, 2001. 
TOYAMA, M. H. et al. Isolation of a new L-amino acid oxidase from Crotalus 
durissus cascavella venom. Toxicon v. 47, p. 47 – 57, 2006. 
VALSTER, Tran, A, B. L., Nakada, M., Berens, M. E., Chan, A. Y., Symons, M. 
Cell migration and invasion assays. A. Methods 37 (2005) 208–215. 
VARGAS, L. J. et al. Cloning and characterization of an antibacterial l-amino acid 
oxidase from Crotalus durissus cumanensis venom. Toxicon v. 64, p. 1 – 11, 
2012. 
VONK, F. J. et al. Evolutionary origin and development of snake fangs. Nature, v. 
454, p. 630 – 633, 2008. 
WAGNER, G.; Wiss, D. F. Cell surface adhesion receptors. Curr. Op. Struct. 
Biol., n. 4, pp. 841-851, 1994. 
WARRELL, D. A. Venomous bites, stings, and poisoning. Infectious Disease 
Clinics of North America, Philadelphia, v. 26, n. 2, p. 207-223, 2012. 
WELLNER, D.; MEISTER, A. Crystalline L-amino acid oxidase of Crotalus 
adamanteus. J. Biol. Chem. v. 235, p. 2013 – 2018, 1960. 
WESKAMP, G.; Blobel, C.P. A family of cellular proteins related to snake venom 
disintegrins. ProcNatl Acad Sci U S A 1994;91:2748–51. 
WUSTER, W.; BERNILS, R. On the generic classification of the rattlesnakes, with 
special reference to the Neotropical Crotalus durissus complex (Squamata: 
Viperidae). Zoologia, Curitiba, v. 28, n. 4, p. 417 – 419, 2011. 
ZAGER, R.A. Rhabdomyolysis and myohemoglobinuric ARF. Kidney 1996;49:314-
26. 
 
17 
 
 
 
ANEXO A – Certificado de Regularidade do Biotério Central emitido pelo IBAMA 
para utilização de diferentes venenos animais.