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DHIONNE CORRÊIA GOMES 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
PRODUÇÃO DE ESCLEROTIORINA POR 
Penicillium sclerotiorum E OBTENÇÃO DE 
DERIVADOS COM APLICAÇÃO POTENCIAL EM 
ALIMENTOS 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Faculdade de Farmácia da UFMG 
Belo Horizonte, MG 
2011 
 
2 
 
DHIONNE CORRÊIA GOMES 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
PRODUÇÃO DE ESCLEROTIORINA POR 
Penicillium sclerotiorum E OBTENÇÃO DE 
DERIVADOS COM APLICAÇÃO POTENCIAL EM 
ALIMENTOS 
 
 
 
 
 
Dissertação apresentada ao 
Programa de Pós-Graduação em 
Ciência de Alimentos da Faculdade 
de Farmácia da Universidade 
Federal de Minas Gerais, como 
requisito parcial à obtenção do grau 
de Mestre em Ciência de Alimentos 
 
Orientadora: Profª. Drª. Jacqueline 
A. Takahashi 
 
 
 
 
 
 
Faculdade de Farmácia da UFMG 
Belo Horizonte, MG 
2011 
3 
 
 
 
4 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Dedico este trabalho à minha família, 
que mesmo nos momentos mais 
difíceis, deram sempre o impulso 
que eu precisava para pular em 
direção dos meus sonhos 
 
 
 
 
 
 
 
5 
 
AGRADECIMENTOS 
 
 
Primeiramente a Deus, pois sem Ele nada é possível, e somente nEle se encontram as 
respostas. 
À Professora Jacqueline, por ter acreditado e confiado em mim desde quando este 
projeto estava somente no papel. Por ser sempre exemplo de dedicação, de 
inteligência, mas também de respeito, honestidade e fé. 
À minha mãe Helena, por ter me dado não somente o dom da vida, mas também por 
ter instigado em mim a curiosidade, e me transmitido a sabedoria e inteligência. 
Aos meus irmãos Diego e Diogo, meus melhores amigos, meus pilares, meu apoio. 
A meu pai. 
Aos colegas de laboratório, em especial aos mais presentes: Fabiana, Karine, Ana 
Sarah, Adriana, Ana Paula, Willian, Bruna, Erick, Rafael, Camila, Paulo e Isabela pelo 
auxílio e por fazer com que o ambiente de trabalho, e consequentemente a realização 
deste projeto, se tornasse mais agradável. 
Aos meus amigos do CEFET e da graduação por estarem sempre presentes em 
minhas conquistas. 
Ao Philipe, pelo apoio, sensatez e compreensão nos momentos difíceis. 
Aos professores do Programa de Pós-Graduação em Ciência de Alimentos, pela 
contribuição em minha formação científica, em especial à professora Evelyn, presente 
em minha formação desde a época da graduação. 
Aos amigos do laboratório de Microbiologia Industrial, em especial à Raquel e à Ana 
Diolina, que foram parte fundamental na minha caminhada até aqui. 
À Ivana e à Vany, pelo auxílio na obtenção e interpretação dos espectros de RMN e 
dos cromatogramas. 
À Professora Cidinha, pelo auxílio com a identificação de fungos. 
Ao CNPQ e FAPEMIG, por terem fornecido os recursos necessários para a realização 
deste projeto. 
A todos os outros que, de uma maneira ou outra, com menor ou maior intensidade, 
ajudaram-me a construir este sonho. 
 
 
 
6 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
“Só sabemos com exatidão quando 
sabemos pouco. À medida que 
vamos adquirindo conhecimento, 
instala-se a dúvida” 
 
Johann Wolfgang Von Goethe 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
7 
 
SUMÁRIO 
 
LISTA DE TABELAS ................................................................................................ 8 
LISTA DE FIGURAS ................................................................................................. 9 
LISTA DE SIGLAS .................................................................................................... 10 
RESUMO ................................................................................................................... 11 
ABSTRACT ............................................................................................................... 12 
1 INTRODUÇÃO ............................................................................................... 13 
2 REVISÃO DA LITERATURA ......................................................................... 14 
2.1 Biotecnologia ................................................................................................ 14 
2.1.1 Biotecnologia da indústria de alimentos ......................................................... 15 
2.2 Fungos ........................................................................................................... 15 
2.2.1 Metabólitos secundários ................................................................................. 16 
2.2.2 Azafilonas ....................................................................................................... 18 
2.3 Penicillium sclerotiorum .............................................................................. 19 
2.3.1 Esclerotiorina .................................................................................................. 21 
2.4 Corantes naturais ......................................................................................... 23 
2.4.1 Corantes naturais usados em alimentos ........................................................ 24 
2.5 Biotransformações ....................................................................................... 29 
2.5.1 Beauveria bassiana ........................................................................................ 30 
3 MATERIAL ..................................................................................................... 34 
4 MÉTODOS ..................................................................................................... 38 
4.1 Manutenção dos micro-organismos ........................................................... 38 
4.2 Preparo do extrato de Penicillium sclerotiorum ........................................ 38 
4.3 Purificação da esclerotiorina ...................................................................... 39 
4.4 Biotransformação da esclerotiorina pelo Beauveria bassiana ................ 40 
4.4.1 Cultivo do B. bassiana e biotransformação .................................................... 40 
4.4.2 Análise e purificação do biotransformado ...................................................... 41 
4.5 Obtenção de produtos de síntese com diazometano ............................... 42 
4.5.1 Síntese ........................................................................................................... 42 
4.5.2 Análise e purificação ...................................................................................... 42 
4.6 Biotransformação do 1-metil-esclerotiorina pelo Beauveria bassiana ... 42 
4.6.1 Cultivo do B. bassiana e biotransformação .................................................... 42 
4.6.2 Análise e purificação do produto biotransformado ......................................... 42 
4.7 Obtenção de outros derivados da esclerotiorina ...................................... 43 
4.7.1 Triagem de fungos .......................................................................................... 43 
4.7.2 Análise de CLAE ............................................................................................ 44 
4.8 Identificação do Cladosporium sphaerospermum .................................... 45 
5 RESULTADOS E DISCUSSÃO ..................................................................... 47 
5.1 Produção e extração da esclerotiorina de Penicillium sclerotiorum ...... 47 
5.2 Purificação da esclerotiorina ...................................................................... 48 
5.3 Biotransformação da esclerotiorina pelo Beauveria bassiana ................ 50 
5.3.1 Cultivo de Beauveria bassiana ....................................................................... 50 
5.3.2 Obtenção dos produtos biotransformados ..................................................... 52 
5.3.3 Elucidação estrutural do Biotransformado 1 ................................................... 53 
5.3.4 Elucidação estrutural dos outros biotransformados ....................................... 58 
5.4 Síntese da 1-metil-esclerotiorina ................................................................62 
5.4.1 Elucidação estrutural do Produto 1 ................................................................ 63 
5.5 Biotransformação da 1-metil-esclerotiorina pelo Beauveria bassiana ... 65 
5.6 Obtenção de outros derivados da esclerotiorina ...................................... 67 
8 
 
5.6.1 Identificação do Cladosporium sphaerospermum .......................................... 68 
5.6.2 Análise por CLAE ........................................................................................... 69 
5.6.3 Interpretação dos resultados da triagem ........................................................ 70 
5.6.4 Interpretação dos resultados da biotransformação em uma etapa de B. 
bassiana ......................................................................................................... 
 
73 
5.6.5 Extrato de P. sclerotiorum .............................................................................. 74 
5.7 Projeção para uso dos resultados em alimentos ...................................... 75 
6 CONCLUSÕES .............................................................................................. 77 
7 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS .............................................................. 79 
8 APÊNDICES E ANEXOS ............................................................................... 87 
 
 
LISTA DE TABELAS 
 
1 Corantes naturais autorizados e suas principais fontes .................................... 25 
2 Meio de cultura utilizado no crescimento de Penicillium sclerotiorum ............... 36 
3 Meio de cultura utilizado no crescimento de Beauveria bassiana ..................... 36 
4 Eluentes utilizados na coluna cromatográfica de purificação da esclerotiorina . 39 
5 Gradientes de eluição utilizados na análise do HPLC ....................................... 44 
6 Informações obtidas a partir dos espectros de RMN de 1H e de 13C, sub-
espectro DEPT e mapa de contornos HSQC para a esclerotiorina ................... 
 
51 
7 Massas das substâncias isoladas da biotransformação da esclerotiorina por 
B. bassiana e respectivos rendimentos ............................................................. 
 
53 
8 Deslocamentos químicos dos átomos de carbono inseridos na molécula de 
esclerotiorina pela biotransformação ................................................................. 
 
54 
9 Resultado da análise elementar do biotransformado 1, e número de átomos 
correspondentes, levando-se em conta a massa obtida no espectro de 
massas ESI-MS ................................................................................................. 
 
 
55 
10 Propriedades físico-químicas do biotransformado 1 ......................................... 60 
11 Propriedades físico-químicas do biotransformado 4 ......................................... 61 
12 Propriedades físico-químicas do biotransformado 5 ......................................... 61 
13 Propriedades físico-químicas da 1-metil-esclerotiorina ..................................... 66 
14 Algumas referências bibliográficas sobre biotransformações realizadas pelos 
fungos utilizados neste experimento ................................................................. 
 
67 
15 Substâncias detectadas por CLAE em extratos de biotransformação de mais 
de um fungo ....................................................................................................... 
 
73 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
9 
 
LISTA DE FIGURAS 
 
1 Classes de metabólitos secundários fúngicos ................................................... 17 
2 Fruto de Garcinia atroviridis ............................................................................... 20 
3 Metabólitos secundários isolados de P. sclerotiorum ........................................ 20 
4 Dimerização do herbertenediol .......................................................................... 21 
5 Estrutura molecular da esclerotiorina ................................................................ 21 
6 Corantes produzidos por fungos ........................................................................ 24 
7 Possíveis mudanças estruturais das antocioanidinas em meio aquoso em 
função do pH ..................................................................................................... 
 
27 
8 Estrutura básica do corante Arpink Red e estruturas das Monascusonas A e 
B ........................................................................................................................ 
 
28 
9 Estruturas da Ankaflavina e Monascina ............................................................ 28 
10 Redução assimétrica do naftalenan-6-ona por B. bassiana .............................. 30 
11 Oxidação da benzidrilsulfanil acetamida por B. bassiana ................................. 31 
12 Hidroxilação de um derivado do adamantano por B. bassiana ......................... 31 
13 4´-O-metil-glicosilação do composto CGP-62706 por B. bassiana ................... 32 
14 Hidrólise do composto CGP-291 por B. bassiana ............................................. 32 
15 Acetilação da 3,4-dicloroanilina pelo B. bassiana ............................................. 32 
16 Produtos formados pela desmetilação do Diuron por B. bassiana .................... 33 
17 Montagem das vidrarias na preparação de diazometano .................................. 37 
18 Penicillium sclerotiorum em ágar batata inclinado após 3 dias. Frente (A) e 
verso (B) do tubo ............................................................................................... 
 
47 
19 Estrutura molecular da esclerotiorina ................................................................ 48 
20 Cromatografia em camada delgada comparativa do padrão de esclerotiorina 
(A) e o extrato de Penicillium sclerotiorum (B) .................................................. 
 
49 
21 Coluna cromatográfica de purificação da esclerotiorina em três etapas de 
eluição ............................................................................................................... 
 
49 
22 Beauveria bassiana em ágar batata inclinado após 3 dias. Frente (A) e verso 
(B) do tubo ......................................................................................................... 
 
52 
23 Comparação entre os deslocamentos químicos de RMN de 13C da 
esclerotiorina (em preto) e do biotransformado 1 (em vermelho) ...................... 
 
54 
24 Comparação entre os deslocamentos químicos de RMN de 13C da 
isocromofilona VI (em preto) e do biotransformado 1 (em vermelho) ............... 
 
55 
25 Estruturas da esclerotiorina (1) e da isocromofilona VI (2), mostrando os 
diferentes cromóforos ........................................................................................ 
 
56 
26 Correlações observadas no espectro bidimensional de HMBC para o 
biotransformado 1 .............................................................................................. 
 
57 
27 Correlações observadas no espectro bidimensional de HMBC para o 
biotransformado 1 .............................................................................................. 
 
57 
28 Estrutura molecular proposta para o Biotransformado 1 ................................... 57 
29 Fragmento estrutural comum nos biotransformados 1, 4 e 5 ............................ 58 
30 Provável estrutura do biotransformado 4 ........................................................... 59 
31 Provável estrutura do biotransformado 5 ........................................................... 59 
32 Mecanismo proposto para a reação entre azafilonas e aminas primárias ........ 62 
33 Reação de formação do diazometano ............................................................... 62 
34 Comparação entre os deslocamentos químicos da esclerotiorina (em preto) e 
do Produto 1 (em vermelho) .............................................................................. 
 
64 
35 Correlações observadas no mapa de contornos HMBC para o produto1 ........ 64 
36 Estrutura molecular do Produto 1 (1-metil-esclerotiorina) ................................. 65 
10 
 
37 Microcultivo de Cladosporium sphaerospermum ............................................... 68 
38 Cladosporium sphaerospermum inoculado em tubo inclinado. Frente (A) e 
verso (B) ............................................................................................................ 
 
68 
39 Características microscópicas do Cladosporium sphaerospermum. 
Conidióforos (a), hifas septadas (b), esporos sexuais (c), detalhe da 
reprodução assexuada (d) ................................................................................. 
 
 
69 
40 Cromatograma da biotransformação em duas etapas em contraste com o 
cromatograma dos biotransformados isolados .................................................. 
 
74 
41 Cromatograma do extrato de Penicillium sclerotiorum ...................................... 75 
 
 
LISTA DE SIGLAS 
 
CCD Cromatografia em coluna delgada 
CEPT Proteína de transferência de colesterol esterificado 
CLAE Cromatografia líquida de alta eficiência 
COSY Correlation spectroscopy 
DEPT Distortionless enhancement by polarization transfer 
ESI-MS Espectroscopia de massas por ionização por eletrospray 
FDA Food and Drug Administration 
HDL Lipoproteína de alta densidade 
HIV Vírus da imunodeficiência humana 
HMBC Heteronuclear multiple bond correlation 
HPLC Cromatografia líquida de alta eficiência 
HSQC Heteronuclear single quantum coherence 
IV Infravermelho 
LDL Lipoproteína de baixa densidade 
NADPH Fosfato de dinucleótido de nicotinamida e adenina 
NOESY Nuclear Overhauser effect spectroscopy 
RMN Ressonância magnética nuclear 
TOCSY Total correlation spectroscopy 
UFMG Universidade Federal de Minas Gerais 
USP Universidade de São Paulo 
UV Ultravioleta 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
11 
 
RESUMO 
 
O fungo Penicillium sclerotiorum produz uma grande variedade de metabólitos 
secundários, entre eles, a esclerotiorina, que tem tido aplicações nas indústrias 
alimentícia e farmacêutica. Devido à sua forte coloração alaranjada, sua capacidade 
antioxidante, potencial atividade biológica de redução do colesterol plasmático e no 
tratamento da diabetes, esta substância tem sido alvo de diversos estudos na área de 
alimentos. Neste projeto, foram produzidas substâncias através da biotransformação da 
esclerotiorina com o fungo Beauveria bassiana, obtendo-se cinco produtos de forte 
coloração avermelhada. A mudança na coloração da substância aconteceu devido à 
troca de um heteroátomo de oxigênio ligado ao carbono 1 da molécula de esclerotiorina 
por um átomo de nitrogênio. O experimento de biotransformação foi repetido utilizando, 
como substrato, a 1-metil-esclerotiorina, uma substância semi-sintética, porém os 
mesmos resultados não foram obtidos. Após a obtenção destes resultados, foi feita 
uma triagem com 14 diferentes espécies de fungos, além de Beauveria bassiana, para 
verificar a capacidade destes fungos em biotransformar a esclerotiorina. Os extratos 
foram analisados por CLAE e mostraram que, destes 14 fungos, nove foram capazes 
de biotransformar a molécula de esclerotiorina em uma ou mais substâncias que 
apresentaram coloração avermelhada. 
 
 
 
Palavras-chave: esclerotiorina, biotransformação, corantes, alimentos 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
12 
 
ABSTRACT 
 
The fungus Penicillium sclerotiorum produces a wide variety of secondary 
metabolites, among them the sclerotiorin, which has many uses in food and 
pharmaceutical industries. Due to its strong orange color, its antioxidant activity and 
other functions related to cholesterol reduction and treatment of diabetes, this 
substance has been subject of extensive studies in food science. In this project, 
substances were produced by esclerotiorin biotransformation with the fungus Beauveria 
bassiana. Five new products with strong red color were obtained. The change in 
coloration of the molecule was due to the exchange of the oxygen heteroatom attached 
to sclerotiorin carbon 1 by a nitrogen atom. The biotransformation experiment was 
repeated using, as substrate, 1-methyl-sclerotiorin, a semi-synthetic substance, but the 
same results were not obtained. After these results, it was performed a screening with 
14 different fungi, besides Beauveria bassiana, to evaluate their capacity to 
biotransform sclerotiorin. The extracts were analyzed by HPLC and showed that, from 
these 14 fungi, nine were able to transform sclerotiorin molecule in one or more 
substance with red color. 
 
 
 
Key words: sclerotiorin, biotransformation, colorants, food 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
13 
 
INTRODUÇÃO 
 
Os fungos podem ser utilizados na indústria de duas maneiras: como agentes 
produtores de alguma substância de interesse ou como promotores de reações para a 
produção de importantes substâncias, sendo os dois processos conhecidos como, 
respectivamente, fermentação e biotransformação. Utilizando-se processos 
fermentativos, podem-se obter substâncias de atividades interessantes como anti-
oxidantes, antimicrobianos ou corantes. 
Os corantes naturais, isolados de plantas ou micro-organismos, podem 
apresentar atividades importantes na indústria farmacêutica e de alimentos. Há 
necessidade constante de estudos nessa área, pois grande parte desse potencial 
biotecnológico não é explorado. 
As biotransformações, por serem regio e estereoespecíficas, são pontos 
importantes na produção de variadas substâncias. O uso de micro-organismos para a 
promoção de determinada reação causa redução de tempo e custo, pois dispensa o 
uso de grandes quantidades de reagentes químicos e controle das condições do meio 
reativo. Muitos produtos de biotransformação são utilizados na indústria farmacêutica e 
de alimentos. 
O objetivo geral do trabalho foi produzir derivados do corante natural fúngico 
esclerotiorina que possam posteriormente ser usados como corantes, anti-oxidantes ou 
conservantes alimentares. 
Os objetivos específicos foram: 
 Produzir esclerotiorina a partir do cultivo do fungo Penicillium sclerotiorum por 
meio de fermentação em meio submerso; 
 Extrair e purificar a esclerotiorina do meio de cultivo utilizando técnicas 
cromatográficas; 
 Obter derivados da esclerotiorina em reações de síntese com diazometano; 
 Obter produtos biotransformados da esclerotiorina e de derivados com o 
emprego do fungo Beauveria bassiana, visando a produção de azafilonas inéditas; 
 Avaliar a possibilidade de produção de derivados inéditos da esclerotiorina por 
outros fungos presentes na coleção de fungos do LaBβ. 
 
 
 
14 
 
REVISÃO DA LITERATURA 
 
2.1 – Biotecnologia 
 
Biodiversidade ou diversidade biológica refere-se à variedade de vida na Terra, 
como o resultado de bilhões de anos de evolução, compreendendo um número 
extraordinário de plantas, animais e micro-organismos. Embora demasiadamente 
afetada pela intervenção humana, a biodiversidade tem fornecido muitos micro-
organismos e moléculas com importantes atividades metabólicas, farmacológicas e 
grande valor de mercado. Quando corretamente explorada por países de rica 
biodiversidade (usualmente países em desenvolvimento ou subdesenvolvidos), o uso 
dos recursos naturais de forma sustentável torna-se ferramenta para a diminuição da 
pobreza, beneficiando também o planeta como um todo (Rouhi, 2003). Da extensa 
biodiversidade brasileira, somente uma pequena fração de espécies de plantas e 
micro-organismos já foi estudada quimicamente (Gottlieb, 1980; Hawksworth, 1991). 
Atualmente, a prospecção da biodiversidade tem sido ativamente direcionada ao 
desenvolvimento de novos fármacos, em processos dinâmicos de monitoramento da 
atividade biológica, bem como para a descoberta de novos micro-organismos para 
serem usados em processos industriais visando à produção de alimentos ou aditivos 
alimentares (Araujo et al., 2006).A biotecnologia industrial atua no desenvolvimento de produtos e processos 
utilizando seres vivos, ou parte deles, sendo uma área de grande importância na 
indústria de alimentos e medicamentos, principalmente quando integrada à prospecção 
da biodiversidade (Butler, 2004). Processos fermentativos são utilizados na indústria 
química para a produção de solventes, ácidos orgânicos, principalmente os ácidos 
cítrico, lático, fumárico e giberélico. Metais diversos, como o cobre, zinco, prata, ouro 
ou urânio podem ser extraídos com o emprego de micro-organismos, a partir de 
minérios de baixo teor (Borzani et al., 2008). 
Os processos biotecnológicos na indústria farmacêutica englobam a produção 
de antibióticos, esteróides, vitaminas, aminoácidos, polissacarídeos e várias proteínas. 
Modificações na estruturas de esteróides e antibióticos são obtidas com o uso de 
micro-organismos que podem proporcionar reações de hidroxilação, hidrogenação, 
desidrogenação, hidrólise, esterificação, isomerização, aminação ou ruptura de cadeias 
(Borzani et al., 2008). 
15 
 
Processos de tratamento biológico dos resíduos (águas residuais, lixo) também 
são processos fermentativos. Há, ainda, os processos que tem por objetivo a produção 
industrial de micro-organismos que podem ser utilizados como fixadores de nitrogênio 
do ar na agricultura (bactérias do gênero Rhizobium), no controle biológico de pragas 
(bactérias do gênero Bacillus), na produção de vacinas (Borzani et al., 2008), ou ainda 
para produção de massa celular como para produção de fermento biológico (levedura 
prensada) ou de levedura forrageira (“single cell protein”). 
 
2.1.1 – Biotecnologia na indústria de alimentos 
A produção de alimentos fermentados, principalmente bebidas, representa o 
maior uso dos micro-organismos na indústria alimentícia. Há pesquisas consolidadas 
onde os melhores parâmetros para este tipo de fermentação são descritos, bem como 
tem sido descrita a utilização de resíduos da indústria de alimentos para a produção 
destas bebidas (Alvarenga, 2006 e Alvarenga et al., 2008). Os leites fermentados tem 
sido alvo de grande número de estudos, devido aos benefícios comprovados destes 
alimentos (Gonzáles-Sánchez et al., 2010). 
Além disso, destaca-se a produção de vinagres, manteigas, queijos, picles, 
chucrute, azeitonas, pão e cacau. Concentrados protéico-vitamínicos são produzidos 
através de algas e leveduras do gênero Candida. O enriquecimento protéico de 
farinhas e farelos pode ser feito pela ação de bolores (Aquarone et. al., 2008). 
Fungos também podem ser utilizados em processos de biorremediação para uso 
de água proveniente de indústria de alimentos (Azab, 2000). 
 
2.2 – Fungos 
 
Os fungos são organismos eucariotas, podendo ser unicelulares, como as 
leveduras, ou pluricelulares, como os cogumelos, sendo diferenciados dos outros 
reinos por possuírem parede celular contendo quitina, e ausência de clorofila (Tortora 
et al., 2002). Os fungos filamentosos e leveduras apresentam a vantagem de 
crescimento relativamente fácil em processos fermentativos, sendo bem adaptáveis à 
produção industrial (Smedsgaard e Nielsen, 2004). 
O grande avanço, intrínseco ao uso de fungos e seus metabólitos secundários, 
advém de múltiplos fatores, como a relativa facilidade de produção do metabólito ativo 
por fermentação; a concomitante pronta possibilidade de um scale up do processo 
16 
 
fermentativo; o fato de que mesmo espécies comuns de fungos, como aquelas dos 
gêneros Penicillium e Aspergillus, conhecidos por sua ubiqüidade, produzem 
metabólitos bioativos (Takahashi e Lucas, 2008). A produção de antibióticos por fungos 
tem algumas características, comuns à produção de outros metabólitos secundários: a 
produção do metabólito é específica da linhagem; há uma instabilidade no processo 
biossintético, com tendência a uma diminuição com repiques sucessivos usados para a 
manutenção das linhagens; a produção de antibióticos segue uma cinética de 
crescimento fúngico associado a um meio de cultura específico (Wijeratne et al., 2004); 
o aumento da produtividade freqüentemente ocorre na etapa de esporulação do micro-
organismo; e a variedade estrutural dos metabólitos biossintetizados pode ser 
aumentada com pequenas variações das condições de cultivo (Takahashi e Lucas, 
2008). 
Fungos do filo Basidiomycota e Ascomycota sempre foram utilizados na 
alimentação humana, principalmente nos países orientais. Estudos sobre o perfil 
nutricional de fungos filamentosos mostram que a biomassa de alguns fungos inferiores 
apresenta alto teor de proteínas, com destaque para Penicillium sclerotiorum, 
Penicillium janthinellum, Syncephalastrum racemosum e Rhizopus stolonifer. Fungos 
da espécie Penicillium sclerotiorum, P. citrinum e P. pinophillum apresentam boa 
relação entre ácidos graxos poliinsaturados e saturados, podendo ser considerados 
alimentos saudáveis (Carvalho, 2009). 
 
2.2.1 – Metabólitos secundários 
Metabólitos secundários são diferenciados dos primários por não participarem 
das reações básicas fundamentais à sobrevivência dos micro-organismos. São 
geralmente bioativos, de baixa massa molecular e são produzidos como famílias de 
compostos em partes restritas do ciclo de vida, geralmente na fase exponencial do 
crescimento fúngico, com a produção geralmente correlacionada a um estado 
específico de diferenciação morfológica (Keller et al., 2005). Além das plantas, 
apresentam metabolismo secundário alguns micro-organismos como as bactérias 
filamentosas, as bactérias formadoras de esporos e os fungos filamentosos. 
Peptídeos, alcalóides, terpenos e policetídeos são grupos representativos de 
metabólitos secundários (Figura 1). 
 
17 
 
 
Figura 1 – Classes de metabólitos secundários fúngicos (adaptado de Keller et al. 
2005) 
18 
 
Considerando os vinte medicamentos mais prescritos atualmente, seis são 
substâncias provenientes do metabolismo secundário de fungos. Levando-se em conta 
que apenas 5% dos fungos estão descritos, há um potencial muito grande a ser 
explorado. A busca de metabólitos secundários deve ser feita levando em conta que 
sua síntese pode corresponder ao nicho ecológico do fungo e que a interação entre 
metabólitos pode induzir um aumento de sua produção (Schulz et al. 2002). 
O primeiro produto cristalino considerado um metabólito bioativo foi o ácido 
micofenólico, isolado de Penicillium glaucoma, em 1896, por Gosio. Alguns produtos do 
metabolismo de fungos tem sido usados na prática de diferentes maneiras como, pela 
aplicação direta do produto na medicina, agricultura ou indiretamente, usando-se o 
produto original como material de partida para subseqüente modificação química ou 
microbiológica (biotransformações), ou utilizando-o como composto principal para 
sínteses químicas de novos análogos (Bérdy, 2005). 
A grande maioria dos metabólitos bioativos produzidos por fungos vem de 
espécies da classe dos ascomicetos e outros fungos filamentosos, além de espécies 
endofíticas (fungos que vivem associados a plantas). Algumas espécies de 
basidiomicetos vem sendo estudadas, como o caso do Mycena leaiana, um fungo 
superior de coloração laranja, cuja substância responsável pela cor apresenta atividade 
antibiótica. O número total de substâncias bioativas conhecidas produzidas por fungos 
é de aproximadamente 8600, representando 38% de todos os produtos microbianos 
(Brizuela et al. 1998; Bérdy, 2005). 
Alguns fungos são capazes de produzir metabólitos secundários, muitos dos 
quais são tóxicos e mesmo cancerígenos tanto para o homem, como para os animais. 
Fungos que crescem nos alimentos, produtores de metabólitos tóxicos, são chamados 
toxigênicos e os metabólitos são denominados micotoxinas (Sabino et al., 1982). 
Entre as micotoxinas de grande interesse para a Saúde Pública e de importância 
agroeconômica estão as aflatoxinas, ocratoxinas, tricotecenos, zearalenona, 
fumonisinase os alcalóides do ergot. Uma única espécie de fungo é capaz de produzir 
uma ou várias micotoxinas, e uma mesma micotoxina pode ser produzida por 
diferentes espécies de fungos (Hussein e Brasel, 2001). 
 
2.2.2 – Azafilonas 
Os policetídeos fúngicos podem variar de tetracetídeos a octacetídeos, tendo 
entre 4 ou 8 unidades C2 que contribuem para a cadeia policetídica. Alguns são 
produzidos por biosíntese mista, podendo envolver a rota da síntese dos aminoácidos 
19 
 
ou terpenóides. Esta classe inclui as antraquinonas, hidroxiantraquinonas, 
naftoquinonas e azafilonas, cada uma contendo grande variedade de cores (Mapari et 
al. 2010). 
As azafilonas são um grupo de substâncias que geralmente apresentam 
coloração forte. Pertencem a uma classe de metabólitos secundários estruturalmente 
diversa, com uma estrutura pirona-quinona, contendo um anel bicíclico altamente 
oxigenado e um centro quaternário quiral (Osmanova et. al., 2010). 
Azafilonas exibem uma ampla gama de interessantes atividades biológicas, 
como atividade antibacteriana, antiviral, antifúngica, antioxidante, citotóxica, nematicida 
e antiinflamatória. A potente atividade não seletiva das azafilonas pode estar 
relacionada à formação de γ-piridonas (Osmanova et. al., 2010). 
A maioria das espécies produtoras de azafilonas são pertencentes aos gêneros 
Penicillium, Monascus, Chaetomium e Talaromyces (Osmanova et. al., 2010). 
Musso e colaboradores investigaram a capacidade de inibição da proteína 
molecular Hsp90 por azafilonas sintetizadas por Bulgaria inquinans, Monascus 
purpureus e Arpergillus deflectus, assim como seus derivados semi-sintéticos. A 
proteína Hsp90 atua na proliferação celular e sua inibição pode ser benéfica no 
tratamento do câncer (Musso et al. 2010). 
 
2.3 – Penicillium sclerotiorum 
 
Muitas espécies do gênero Penicillium possuem a capacidade de produzir 
substâncias bioativas, como a xestodecalactona, que possui propriedades antifúngicas 
(Edrada et al., 2002) e a metil-acetal-atrovenetinona, substância com atividade anti-HIV 
(Shiomi et al., 2005). 
Penicillium sclerotiorum é um micro-organismo mesófilo, de coloração 
esverdeada, com aspecto cotonoso. Está presente em solos, porém, já foi isolado do 
interior da planta Garnicia atroviridis (Figura 2), podendo, portanto, ser também 
classificado como fungo endofítico. Os extratos isolados com hexano e acetato de etila 
de P. sclerotiorum apresentam atividade antimicrobiana e anti-HIV. 
A investigação química dos extratos de P. esclerotiorum levou à identificação 
das seguintes azafilonas: penicilazafilona A (13) e B (14) e decloroisocromofilona III 
(15), além de outras substâncias: penicilisorina (16), 2,4-di-hidroxi-6-(5,7S-dimetil-2-
oxo-trans-3-trans-5-nonadienil)-3-metilbenzaldeído (17), ácido (2E,4E,6S)-4,6-di-
20 
 
metilocta-2,4-dienóico (18) e (5S,6R)-5,6-di-hidro-3,5,6-trimetilpiran-2-ona (19) 
(Arunpanichlert et al., 2010). Porém, o constituinte em maior concentração nos extratos 
de P. sclerotiorum é a azafilona esclerotiorina (20) (Arunpanichlert et al., 2010). Lucas e 
colaboradores descreveram estudos sobre a atividade antimicrobiana de três 
substâncias isoladas dos extratos de P.sclerotiorum, pencolídeo (21), isocromofilona VI 
(22), além da esclerotiorina (20). As estruturas moleculares se encontram 
representadas na Figura 3 (Lucas et. al., 2007; Arunpanichlert et. al., 2010). 
 
 
 Fonte: The Plant Observatory, 2010 
Figura 2 – Fruto de Garcinia atroviridis 
 
 
 
Figura 3 – Metabólitos secundários isolados de P. sclerotiorum 
21 
 
Espécies do gênero Penicillium, além da produção de metabólitos, possuem um 
longo histórico de uso biotecnológico na produção de enzimas. Knob e Carmona 
descreveram uma β-xilosidase com grande atividade extraída de P. sclerotiorum. Esta 
enzima degrada a xilana, a mais abundante fonte de carbono não-celulósica presente 
em madeira e resíduos agroindustriais. A adição desta enzima a rações animais pode 
aumentar seu valor nutritivo. Outro uso seria na clarificação e maceração de sucos e 
vinho (Knob e Carmona, 2009). 
Penicillium sclerotiorum também é relatado na literatura como útil em alguns 
experimentos de biotransformação, como a dimerização do herbertenediol (23), para 
formar mastigoforenos A (24) e B (25), como é mostrado na Figura 4 (Harinantenaina 
et. al., 2005). 
 
 
Figura 4 – Dimerização do herbertenediol 
 
2.3.1 – Esclerotiorina 
O constituinte químico predominante em P. sclerotiorum é a esclerotiorina (20), 
pigmento contendo um átomo de cloro. A esclerotiorina (20) foi primeiramente isolada 
em 1940 por MacCurtin (MacCurtin e Reilly, 1940). Estudos vêm mostrando que este 
pigmento possui algumas atividades biológicas interessantes, como a indução de 
formação de clamidosporo, célula hifal que se comporta como esporo no fungo, de 
maior resistência térmica (Weng et al., 2004). 
 
O
O
Cl
O
O
O
20
 
Figura 5 – Estrutura molecular da esclerotiorina 
 
22 
 
A esclerotiorina (20) tem tido aplicações importantes na indústria de alimentos, 
como, por exemplo, a inibição da lipoxigenase. Esta enzima catalisa a oxidação regio e 
estereoespecífica de ácidos graxos contendo um sistema cis,cis-1,4-pentadieno, 
formando hidroperóxidos. A peroxidação de ácidos graxos provoca a rancificação de 
alimentos oleoginosos e gorduras de origem vegetal e animal, alterando o sabor, odor, 
coloração e reduzindo seu valor nutritivo. Em mamíferos, os produtos das reações 
catalisadas pela lipoxigenase são responsáveis por uma grande variedade de 
desordens, como aterosclerose, alergias, inflamação, asma e hipersensibilidade. Por 
esse motivo, inibidores da lipoxigenase podem ser usados tanto em indústria de 
alimentos, como antioxidantes; ou em setores de saúde, graças a seus benefícios 
farmacológicos (Chidananda e Sattur, 2007). 
Sabe-se também que a esclerotiorina (20) é capaz de inibir a proteína de 
transferência de colesterol esterificado (CETP). A CETP é conhecida por transferir 
colesterol esterificado entre as lipoproteínas do plasma. Vários fatores indicam a 
importância desta proteína no desenvolvimento da aterosclerose, pois ela diminui a 
concentração do colesterol nas lipoproteínas de alta densidade (HDL). Pessoas com 
deficiência genética de CETP possuem alto HDL, baixos níveis de lipoproteína de baixa 
densidade (LDL) e apresentam baixa incidência de aterosclerose (Tomoda et al., 1999). 
Outra atividade importante da esclerotiorina (20) é a inibição da enzima aldose 
redutase, uma oxiredutase dependente de NADPH que catalisa a conversão de glicose 
em álcool, e promove acúmulo de sorbitol em vários tecidos, quando em condições de 
hiperglicemia, como é o caso da diabetes mellitus. Este nível elevado de sorbitol pode 
levar a várias complicações como retinopatia, catarata, neuropatia e nefropatia. Os 
inibidores da aldose redutase podem reverter essa mudança bioquímica ou até prevenir 
estas complicações (Chidananda et al., 2006). 
Além dos possíveis usos na área de alimentos, estudos mostram várias outras 
atividades farmacológicas interessantes da esclerotiorina (20), como a inibição da 
monoamina oxidase, alvo da ação de antidepressivos; inibição do receptor de 
endotelinas, responsável pela vasoconstrição e fibrose de vasos sanguíneos; ou até 
mesmo sua atividade antibacteriana (Pairet et al., 1995; Weng et al., 2004). Estudos 
mais recentes mostram uma atividade inibidora da protease e invertase do HIV 
(Arunpanichlert et al., 2010). 
 
 
 
23 
 
2.4 – Corantes naturais 
 
Um corante natural é definido como um pigmento que é sintetizado e acumulado 
ou excretado a partir de células vivas. Certos pigmentos, assim como fenóis oxidados e 
outros derivados mais simples de fenóis podem ser formados até mesmo por células 
em processo de morte (Hendry, 1996). 
A presença ou ausência de coloração de uma molécula biológica é determinada 
por sua estrutura,principalmente a estrutura eletrônica, o tamanho da molécula, 
solubilidade e a composição elementar. Algumas alterações na estrutura de molécula 
incolores podem fazer com que ela absorva energia em comprimentos de onda menos 
energéticos, e consequentemente, dão cor à substância. Esta alteração é chamada de 
mudança batocrômica e pode ser causada por seis modificações estruturais: aumento 
do tamanho da cadeia, ramificação da cadeia carbônica, rearranjo em um simples anel, 
adição de nitrogênio ou oxigênio, ligação de dois ou mais anéis e adição de certos 
metais de transição. Moléculas que já possuem coloração, ao sofrerem uma mudança 
batocrômica, podem ter sua coloração alterada (Hendry, 1996). 
Fungos filamentosos, particularmente ascomicetos e basidiomicetos, e liquens 
são conhecidos por sintetizarem e secretarem diversas classes de pigmentos, como 
metabólitos secundários, que possuem uma extraordinária gama de cores. Cogumelos 
e liquens são difíceis de cultivar em laboratório, e, consequentemente, difíceis de 
extrapolar a produção de seus metabólitos para escala industrial. Muitos ascomicetos, 
ao contrário, são adequados à produção industrial pela facilidade de crescimento em 
laboratório. O controle das condições de cultivo em biorreatores minimiza as variações 
entre lotes (Mapari et al. 2010). 
Diferentemente das plantas, fungos não produzem clorofilas e poucas espécies 
são produtoras de carotenos. Algumas espécies fúngicas acumulam substâncias 
pigmentadas que, em geral, estão ausentes ou presentes somente em baixas 
concentrações em espécies de outros reinos, como é o caso da riboflavina (vitamina 
B2), que proporciona a coloração amarela a fungos dos gêneros Russula e Lyophyllum. 
Os únicos pigmentos comuns entre fungos e plantas ou animais são as betalaínas, 
melaninas, um pequeno número de carotenóides e algumas antraquinonas (Hendry, 
1996). 
Os pigmentos policetídeos são encontrados predominantemente nos 
ascomicetos, e em alguns basidiomicetos. Além desses, as terfenilquinonas e outros 
24 
 
derivados fenólicos, como os derivados dos ácidos fenilpropanóico e cinâmicos 
também são responsáveis pela coloração de alguns fungos (Hendry, 1996). 
Os corantes sintetizados por fungos apresentam diversas funções, variando de 
proteção contra foto-oxidantes letais, como os carotenóides, proteção contra o estresse 
ambiental, como as melaninas, ou até agindo como cofatores em catálises enzimáticas, 
como o caso das flavinas (Mapari et al. 2005). 
A Figura 6 apresenta a estrutura de algumas classes de corantes produzidos por 
fungos, o β-caroteno (26), um carotenóide, a monascina (27), um policetídeo e o ácido 
leprarínico (28), uma terfenilquinona. 
 
 
Figura 6 – Corantes produzidos por fungos (adaptado de Hendry, 1996) 
 
2.4.1 – Corantes naturais usados em alimentos 
Corantes utilizados em alimentos são chamados aditivos de cor. Segundo o 
FDA, aditivo de cor é qualquer corante, pigmento ou substância que, quando 
adicionado ou aplicado a um alimento, droga ou cosmético, ou até ao corpo humano, é 
capaz de, sozinho, ou através de reações com outras substâncias, transmitir cor (FDA, 
2010). 
Aditivos de cor são utilizados em alimentos por muitas razões: para encobrir a 
perda de cor devido à exposição à luz, ar, temperaturas extremas, umidade e 
condições de estocagem; para corrigir variações naturais na cor; para melhorar cores 
que existem naturalmente e para prover cor a alimentos sem cor. Refrigerantes de cola, 
margarina e balas de menta são exemplos de alimentos que possuem a coloração 
devido ao uso de aditivos (FDA, 2010). 
25 
 
A preferência dos consumidores por corantes extraídos de fontes naturais está 
associada à imagem de serem produtos saudáveis e de boa qualidade. Corantes 
sintéticos tendem a ser julgados como indesejáveis e prejudiciais. Alguns são 
considerados responsáveis por reações alérgicas e intolerâncias (Blenford, 1995). 
Os corantes naturais mais utilizados estão listados na Tabela 1: 
 
Tabela 1 – Corantes naturais autorizados e suas principais fontes (adaptado de 
Mapari et. al., 2005) 
Pigmento Fonte Gama de cor 
Ácido carmínico e carmina Cochonilha fêmea – inseto do 
Peru e Equador 
Laranja a vermelho 
Rosa a vermelho 
Antocianinas Sabugueiro, uva, cenoura roxa, 
repolho 
Rosa/vermelho a 
azul/malva – 
dependente do pH 
Betanina Beterraba Rosa a vermelho 
Caramelo Carboidratos comestíveis Marrom 
Carbo medicinalis Planta Preto 
Carotenóides 
 β-caroteno Óleo de palma Amarelo a laranja 
 Bixina ou norbixina Sementes de urucum (Bixa 
orellana) da América do Sul 
Laranja 
 Capsantina e 
 capsorubina 
Páprica (Capsicum annum L.) Laranja avermelhado 
 Licopeno Tomate (Lycopersicum 
esculentum) 
Vermelho alaranjado 
 Luteína Malmequer (Tagestas erecta) Amarelo dourado 
 Cantaxantina Salmão, camarão e flamingos Rosa alaranjado 
Clorofila Grama, luzerna e urtiga Verde a oliva 
Clorofilina (complexo 
cúprico da clorofila) 
Grama, luzerna e urtiga Verde azulado 
Curcumina Rizoma de planta (Curcuma 
longa) da Índia 
Laranja-amarelo 
Riboflavina Semi-sintética, usando ribose 
produzida por fermentação 
bacteriana 
Amarelo 
 
26 
 
Os corantes naturais que são atualmente autorizados para uso na União 
Européia são derivados de variadas fontes, de plantas a insetos, como o caso do ácido 
carmínico, derivado da cochonilha, um inseto da família Dactylopiidae. A atual 
produção de corantes naturais depende do suprimento externo e sazonal de diversos 
materiais, resultando em variações no perfil do pigmento extraído. Como os corantes 
são extraídos de fontes naturais, eles são, na maioria dos casos, misturas de 
composição variada que dependem do cultivar e das condições climáticas, e são 
difíceis de serem caracterizados no que diz respeito à pureza e presença de 
contaminantes (Mapari et al. 2010). 
Há uma grande variação na estabilidade e funcionalidade de diferentes classes 
de corantes naturais existentes. Problemas de estabilidade perante aquecimento, luz e 
pH limitam a aplicação de certos corantes a certos tipos de produtos. Antocianinas são 
flavonóides e são caracterizadas por uma estrutura catiônica básica. A cor violeta 
básica de antocioaninas é sensível à oxidação, branqueando com dióxido de enxofre, e 
variando com o pH, o que limita a sua aplicação a alimentos ácidos e bebidas. A Figura 
7 representa as mudanças na estrutura de antocionanidinas que resultam na mudança 
da coloração. Betaninas, carotenóides e pigmentos de clorofila são facilmente 
descoloridos por oxidação, sendo sensíveis à luz, ao aquecimento e ao oxigênio. O 
corante curcumina apresenta um problema diferente, pois este pigmento carrega um 
sabor picante, o que limita o seu uso como corante (Mapari et. al., 2005). 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
27 
 
O
OAçúcar
OH
HO
R
R'
OH
O
OAçúcar
OH
O
R
R'
OH
O
OAçúcar
OH
HO
R
R'
OH
OH O
OAçúcar
OH
O
R
R'
O-
O
OAçúcar
O-
O
R
R'
O-
O-
OAçúcar
O-
-O
R
R'
O-
O
H+
OH-
-H 2
O
+H 2
O
H+ OH-
-H2O +H2O
H+ OH-
OH-H+
H+
OH-
pH 1-2
cátion flavílico, vermelho
pH 6,5-8
anidrobase, violeta
anidrobases, azul
pH 9-12
pH<6
carbinol, incolor
pH 13-14
pseudobase chalcona, amarelo
29 30
31
32
33
34
 
Figura 7 – Possíveis mudanças estruturais das antocioanidinas em meio aquoso 
em função do pH (Terci e Rossi, 2002) 
 
Estudos sobre corantes produzidos por fungos visam a sua utilização em 
alimentos. Na República Checa, um novo corante de alimentos chamado Arpink RedTM 
(35), uma antraquinona produzida por Penicillium oxalicum, foi liberado para 
comercialização entre 2004 e 2006. Fungos do gênero Monascus são utilizados no sul 
da China, Japão e sudeste da Ásia para produzir vinho vermelho de arroz, queijo de 
soja vermelho e Anka (arroz vermelho). Estes fungos são conhecidos por produzirem 
pigmentos quevariam do laranja ao violeta, além das monascusonas A (36) e B (37), 
pigmentos amarelos descobertos recentemente. Estes pigmentos, além do corante de 
alimentos Arpink RedTM (35) estão representados na Figura 8. Entretanto, algumas 
cepas de Monascus também produzem citrinina, uma micotoxina, o que limita o seu 
28 
 
uso na área de alimentos. No Japão, apenas a espécie Monascus purpureus é 
autorizada para uso em alimentos (Mapari et. al., 2005 e Mapari et. al., 2010). 
 
 
Figura 8 – Estrutura básica do corante Arpink Red e estruturas das 
Monascusonas A e B 
 
A toxicidade de outros policetídeos produzidos por fungos, principalmente do 
gênero Monascus, têm sido pesquisada. O pigmento amarelo ankaflavina (38) e seu 
análogo estrutural, monascina (39) (representados na Figura 9), apresentam baixa ou 
nenhuma citotoxidade para células, o que indica que são substâncias seguras, se 
consumidas em doses apropriadas (Mapari et. al., 2010). 
 
 
Figura 9 – Estruturas da Ankaflavina e Monascina 
 
Corantes vermelhos e amarelos tem sido amplamente usados em alimentos, 
porém ainda há uma demanda de corantes azuis. Os ascomicetos são capazes de 
produzir policetídeos que variam do vermelho ao amarelo, e até mesmo verde e azul. 
29 
 
Muitos destes corantes apresentam atividade anti-oxidante e anti-aterogênica, e alguns 
já possuem estudos sobre sua toxicidade. Além de alguns policetídeos produzidos por 
Monascus, corantes laranjas extraídos de P. aculeatum e corantes amarelos extraídos 
de E. nigrum são potencialmente seguros. Porém, grande parte dos corantes 
estudados são instáveis à luz, o que pode degradar a coloração apresentada (Mapari 
et. al., 2010). 
 
2.5 – Biotransformações 
 
 Transformações microbianas ou biotransformações representam uma série de 
reações biológicas, geralmente de xenobióticos, substâncias estranhas para o 
organismo, catalisadas por células íntegras ou enzimas isoladas. Devido à sua alta 
regio e estereosseletividade, transformações microbianas complementam sínteses 
orgânicas e tem sido muito aplicadas na indústria farmacêutica e de alimentos. As 
reações de biotransformação, especialmente aquelas que utilizam fungos, também tem 
sido usadas como modelos in vitro do metabolismo mamífero de uma variedade de 
compostos bioativos e drogas (Rai, 2009). 
 As biotransformações podem ser realizadas por bactérias, fungos, leveduras e 
plantas, e podem envolver diferentes enzimas, como oxigenases, redutases e 
hidratases (Duetz et al., 2003; Palmqvist et al., 2006). 
 Biotransformações tem sido usadas na indústria de alimentos para diversos fins. 
Por exemplo, as catequinas do chá são naturalmente convertidas em teaflavinas 
durante o seu processamento, através da enzima polifenol oxidase. As teaflavinas são 
substâncias bioativas, com alta atividade antioxidante, além de propriedades 
antimutagênicas e antiinflamatórias, e aumentam a qualidade da bebida. Esta 
conversão acontece naturalmente, porém, pode ser feita com maiores rendimentos 
utilizando extratos de planta contendo a enzima ou até mesmo utilizando a enzima 
purificada (Sharma et al., 2009). 
 Outro exemplo é a obtenção de compostos de aroma a partir de carotenóides. A 
clivagem da molécula de carotenóides é obtida através de degradação térmica, 
fotoxigenação ou autoxidação, o que gera a formação de compostos de aroma. Esta 
clivagem também pode ser obtida através do sistema enzimático de dioxigenases de 
micro-organismos ou plantas (Uenojo et al., 2007). 
 
30 
 
2.5.1 – Beauveria bassiana 
 Beauveria bassiana é um fungo filamentoso de ocorrência global em solos. 
Como um agressivo fungo entomopatogênio e parasita, ele é causador da doença 
muscardina em insetos. O fungo prolifera no corpo do inseto, produzindo toxinas, como 
a beauvericina, que enfraquece o sistema imune do hospedeiro, eventualmente 
matando-o (Rai, 2009). 
Beauveria bassiana tem sido frequentemente empregado em estudos de 
biotransformação devido a seu eficiente sistema enzimático, ampla aceitabilidade de 
substratos e sua capacidade de realizar diferentes tipos de reação. Tem sido relatado 
que este fungo é capaz de biotransformar mais de 300 tipos diferentes de substratos 
(Rai, 2009). 
Beauveria bassiana é um importante catalisador microbiano, o segundo micro-
organismo mais frequentemente usado como biocatalisador, atrás somente do 
Aspergillus niger, e suas aplicações são superadas somente por A. niger, 
Pseudomonas putida e Saccharomyces cerevisiae (Rai, 2009). 
As principais reações catalisadas por Beauveria bassiana são descritas a seguir. 
Os exemplos também representam as principais reações de biotransformação 
realizadas por fungos (Rai, 2009). 
 
Redução 
Uma variedade de reduções catalisadas por fungos é conhecida, sendo que a 
mais comum é a redução do grupo carbonila. A Figura 10 representa a redução 
assimétrica do naftalenan-6-ona (40) por B. bassiana (Rai, 2009). 
 
O
O
O O
O
OH O
O
OH
40 41 42
 
Figura 10 – Redução assimétrica do naftalenan-6-ona por B. bassiana 
 
Oxidação 
 Alguns estudos sobre oxidação biocatalítica tem sido focados em reações de 
sulfoxidação. A Figura 11 representa a oxidação da benzidrilsulfanil acetamida (43) 
levando ao isômero R do modafinil (44), catalisada por Beauveria bassiana. Modafinil é 
31 
 
um fármaco neurotrópico autorizado para uso nos Estados Unidos para o tratamento da 
narcolepsia e apnéia do sono (Rai, 2009). 
 
S
NH2
O
S
NH2
OO
43 44
 
Figura 11 – Oxidação da benzidrilsulfanil acetamida por B. bassiana 
 
Hidroxilação 
 Hidroxilação microbiana é uma das reações de biotransformação mais comuns e 
importantes. Baseia-se na introdução regio e estereosseletiva de um grupo hidroxila em 
um carbono não ativado, o que é difícil de se obter pelos métodos químicos 
tradicionais. A Figura 12 representa a hidroxilação de um derivado éster do 
adamantano (45) por Beauveria bassiana (Rai, 2009). 
 
O
O
O
O
OH
45 46
 
Figura 12 - Hidroxilação de um derivado do adamantano por B. bassiana 
 
Glicosilação 
A inserção de uma molécula de glicose e, principalmente, a inserção de um 
grupo 4’-O-metil-glicose é uma típica reação catalizada por B. bassiana. A Figura 13 
mostra a glicosilação do composto CGP-62706 (47) por este fungo. Este composto é 
um potente inibidor da tirosina quinase, enzima que transfere um grupo fosfato a um 
resíduo de tirosina de uma proteína, e deste modo, regulando importantes funções no 
corpo, como a abertura de canais iônicos e a expressão gênica (Rai, 2009). 
 
32 
 
N N
HN H
N Cl
N N
HN H
N Cl
4'-O-Metil-glicose
O
47
48
 
Figura 13 – 4´-O-metil-glicosilação do composto CGP-62706 por B. bassiana 
 
Hidrólise 
 Hidrólise de ésteres e epóxidos são relatadas para Beauveria bassiana. A Figura 
14 representa a desacetilação do composto CGP-291 (49), um agente antiprotozoário 
(Rai, 2009). 
 
N N
N
N
O2N
O O
N NH
N
N
O2N
O
49 50
 
Figura 14 – Hidrólise do composto CGP-291 por B. bassiana 
 
Acetilação 
 A Figura 15 representa a biotransformação da 3,4-dicloroanilina (51) pelo B. 
bassiana (Rai, 2009). 
 
Cl
Cl
NH2 Cl
Cl
H
N
O
51 52
 
Figura 15 - Acetilação da 3,4-dicloroanilina pelo B. bassiana 
 
 
 
 
 
 
33 
 
Desmetilação 
 A Figura 16 representa a degradação do herbicida Diuron (53), através de 
desmetilações. Os produtos formados são menos tóxicos do que o herbicida e, por esta 
razão, o B. bassiana pode ser utilizado para recuperação de solos contendo este 
produto tóxico (Rai, 2009). 
 
Cl
Cl
H
N N
O
Cl
Cl
H
N
H
N
O
Cl
Cl
H
N NH2
O
53 54 55
 
Figura 16 – Produtos formados pela desmetilação do Diuron por B. bassiana 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
34 
 
MATERIAL 
 
A maior parte dos materiais utilizados no desenvolvimento do projeto se 
encontra no LaβB, Laboratório de Biotecnologia e Bioensaios, do Departamentode 
Química da UFMG. 
 As análises de RMN, CLAE e as análises elementares foram feitas no 
Departamento de Química da UFMG. A identificação do fungo foi feita no Laboratório 
de Micologia, do Instituto de Ciências Biológicas. As análises por espectrometria de 
massas foram feitas na Central Analítica, USP. Os fungos utilizados fazem parte da 
coleção de fungos do LaβB. 
 
 Equipamentos: 
 Espectrômetro Bruker Avance DRX400 e DPX200 – foram utilizados para 
registrar espectros de RMN 
 PE 2400 CHN Elemental Analyzer – foi utilizado para análise elementar 
 HPLC Shimadzu prominence LC-20AT 
 Espectometro de massas Burker Daltonics modelo MicroTOF lc 
 Espectômetro de massas MicroMass Waters Q-TOF-Micro 
 Infravermelho Perkin Elmer Spectrum BX 
 Ultravioleta B-380 Micronal 
 Ponto de fusão Gehaka modelo PF 1000, série 0530/06001020 
 Autoclave vertical Fanen, modelo 415/3, série J03610 
 Balança analítica Quimis, modelo Q-ILA2104, 210g/ 0,1mg 
 Balança eletrônica Digimed KN1000C, classe de exatidão II, série 04G6 
 Bomba de vácuo e pressão Tecnal TE-0581 
 Estufa de secagem Fanen Ltda Modelo 002 CB 
 Estufa para placa cromatográfica Quimis G-317 8122 
 Evaporador rotativo Fisatom Modelo 803 
 Capela VECO, modelo JLF 912, série FL 5799 
 Refrigerador Nuaire -86ºC Ultralow Freezer 
 Câmera fotográfica Sony Cyber-shot 7.2 mega pixels 
 Microondas Master Cooking CCE M-500 
 Mili-Q Plus Milipore Qpak 1 CPMQ004R1 
35 
 
 Micropipeta automática Digipet 1-5 mL 
 Micropipeta automática Digipet 20-200 µL 
 Incubadora de bancada Cientec CT-712 
 Microscópio eletrônico Olympus CX 40 
 Coluna cromatográfica de vidro de 5cm de diâmetro e 100cm de altura 
 Coluna cromatográfica de vidro de 1,5cm de diâmetro e 100cm de altura 
 
Reagentes e meios de cultura: 
 D-glicose 
 Peptona bacteriológica 
 Fosfato de potássio dibásico 
 Cloreto de sódio 
 Ágar batata dextrosado 
 Extrato de levedura 
 Sulfato de magnésio hepta-hidratado 
 Hidróxido de sódio 
 N-methyl-N-nitroso-p-toluenosulfonamida – Diazald 
 Acetato de etila 
 Diclorometano 
 Hexano 
 Álcool metílico 
 d-clorofórmio 
 Metanol grau HPLC 
 Acetonitrila grau HPLC 
 Termômetro Incoterm, série 313675 
 Sílica gel 60G (Vetec) para cromatografia em camada delgada 
 Sílica gel (Vetec 70-230 mesh) pra cromatografia em coluna 
 Sílica gel (Sigma 230-400 mesh) para cromatografia em coluna flash 
 
Preparo de meios de cultura: 
Meio base 1 (Lucas et al., 2007) 
Os ingredientes listados na Tabela 2 foram dissolvidos em quantidade suficiente de 
água para alcançar a concentração desejada. A solução obtida foi transferida para 
recipiente adequado e esterilizado em autoclave vertical a 121 ºC por 15 min. 
36 
 
Tabela 2 – Meio de cultura utilizado no crescimento de Penicillium sclerotiorum 
Ingrediente Concentração (g.L-1) 
Glicose 20 
Peptona de carne bacteriológica 5 
Fosfato de potássio monobásico 1 
Cloreto de sódio 5 
Sulfato de magnésio hepta-hidratado 0,5 
 
Meio base 2 
 O meio base 2 foi preparado conforme descrito para o meio base 1, porém, 
utilizando 50% da concentração dos ingredientes. A solução obtida foi transferida para 
recipiente adequado e esterilizado em autoclave vertical a 121 ºC por 15 min. 
 
Meio base 3 (Martins, 2009) 
Os ingredientes listados na Tabela 3 foram dissolvidos em quantidade suficiente de 
água para alcançar a concentração desejada. A solução obtida foi transferida para 
recipiente adequado e esterilizado em autoclave vertical a 121 ºC por 15 min. 
 
Tabela 3 – Meio de cultura utilizado no crescimento de Beauveria bassiana 
Ingrediente Concentração (g.L-1) 
Glicose 20 
Peptona de carne bacteriológica 10 
Extrato de levedura 0,5 
 
Ágar batata dextrosado 
 Foi preparado segundo instruções do fabricante. Em um béquer foram 
adicionadas quantidades de ágar batata dextrosado e água suficientes para alcançar a 
concentração de 39 g.L-1. Este béquer foi aquecido em forno de microondas até fusão 
do ágar. A preparação obtida foi transferida para recipiente adequado e esterilizada em 
autoclave vertical a 121 ºC por 15 min. 
 
Ágar Sabouraud 
 Foi preparado segundo instruções do fabricante. Em um béquer foram 
adicionados ágar sabouraud e água para alcançar a concentração de 65 g.L-1. Este 
béquer foi aquecido em microondas até garantir total fusão do ágar. A preparação 
37 
 
obtida foi transferida para recipiente adequado e esterilizada em autoclave vertical a 
121 ºC por 15 min. 
 
Preparo de diazometano (Hudlicky, 1980) 
 Em um balão de fundo redondo, foram adicionados 200 mL de etanol P.A. e 100 
mL de hidróxido de sódio a 10%. Em um funil de separação foram adicionados 10,4 g 
de Diazald diluídos em 80 mL de éter etílico P.A.. Conforme a montagem (Figura 17), a 
solução etérea foi gotejada no balão lentamente, devido ao risco de explosão, em 
temperatura controlada de 60 ºC. O diazometano, diluído em éter etílico, foi recolhido 
em um erlenmeyer. 
 
 
Figura 17 – Montagem das vidrarias na preparação de diazometano 
 
Preparo de solução de esclerotiorina 20 mg.mL-1: 
Em uma proveta de 10 mL, foram dissolvidos 200 mg de esclerotiorina em 10 mL 
de acetato de etila. 
 
 
 
38 
 
MÉTODOS 
 
4.1 – Manutenção dos micro-organismos 
 
Os fungos da coleção do LaβB são armazenados como uma suspensão de 
esporos em glicerol 12% a -86 ºC. Os fungos a serem utilizados foram retirados do 
armazenamento, transferidos para geladeira (a 8 ºC) onde permaneceram por dois 
dias. Em seguida, retirou-se uma alíquota desta suspensão e inoculou-se em uma 
placa de Petri contendo ágar batata dextrosado (Takahashi et al., 2008). 
 
4.2 – Preparo do extrato de Penicillium sclerotiorum 
 
 Um pedaço do cultivo do Penicillium sclerotiorum no ágar em placa de petri foi 
recortado e transferido para um tubo contendo ágar batata dextrosado inclinado. Após 
três dias, a biomassa do fungo foi retirada do meio inclinado por meio de raspagem 
com alça de platina, utilizando água esterilizada e inoculado em erlenmeyer de 250 mL 
contendo 100 mL de meio base 1. 
Este erlenmeyer foi mantido sob agitação em agitador rotatório a 100rpm, a 
temperatura ambiente durante 3 dias, e após crescimento, o conteúdo foi transferido 
para erlenmeyers de maior capacidade, totalizando 7 litros de meio base 2. O 
crescimento ocorreu durante 21 dias, à temperatura ambiente, sem agitação. 
Após o crescimento e consequente produção de esclerotiorina, o micélio foi 
separado do meio de cultura através de filtração a vácuo em funil de Buchner, 
utilizando filtros com poros de 14 µm. Foi adicionado acetato de etila nas duas partes: 
no micélio, quantidade suficiente para cobrir o fungo e emergi-lo em todo o solvente e, 
na parte líquida, quantidade relativa a 30% do volume de meio de cultura. O micélio foi 
deixado em contato com o acetato de etila por 15 min, para extrair a esclerotiorina que 
também estava presente nesta parte. A parte líquida foi transferida para um funil de 
decantação, sendo separada a fase aquosa da fase orgânica, esta última contendo os 
metabólitos secundários desejados. A fase orgânica foi reservada e procedeu-se a 
extração da fase aquosa com acetato de etila por mais duas vezes. 
39 
 
Todas as frações orgânicas obtidas, juntamente com o solvente que havia sido 
deixado em contato com o micélio, foram reunidas e concentradas em evaporador 
rotativo, a 65 ºC, utilizando vácuo. 
 
4.3 – Purificação da esclerotiorina 
 
A presença de esclerotiorina (20) no extrato foi comprovada por cromatografia 
em camada delgada (CCD), sendo purificada por cromatografia em coluna de sílica. O 
extrato foi solubilizado em diclorometano, e a esta solução foi incorporada uma 
quantidade de sílica que ocupasse aproximadamente o mesmo volume de extrato 
utilizado. Após a evaporação do solvente, feita em evaporador rotativo a 50 ºC, a sílica 
contendo o extrato e foi adicionadalentamente ao topo da coluna. 
A partir daí, foi dado início ao processo de eluição, retirando-se frações de 250 
mL. A ordem dos eluentes utilizados encontra-se listada na Tabela 4. Cada fração 
retirada da coluna foi evaporada em evaporador rotativo a 65 º C, utilizando vácuo. 
 
Tabela 4 – Eluentes utilizados na coluna cromatográfica de purificação da 
esclerotiorina 
Fração Eluente 
1 Hexano 
2 a 3 Hexano + Diclorometano 85:15 
4 a 5 Hexano + Diclorometano 50:50 
6 a 7 Hexano + Diclorometano 25:75 
8 a 14 Diclorometano 
15 a 16 Diclorometano + Acetato de etila 97:3 
17 a 20 Diclorometano + Acetato de etila 95:5 
21 a 22 Metanol 
 
Procedeu-se à análise de cada fração por cromatografia em camada delgada 
comparativa, constatando-se que as frações 11 a 16 continham esclerotiorina (20) em 
boa quantidade, porém a amostra resultante da combinação destas frações ainda não 
estava pura. Deste modo, procedeu-se a uma cromatografia em coluna flash. Esta 
técnica é feita utilizando pressão na coluna e a eluição é isocrática (Still et al., 1978). O 
eluente escolhido foi diclorometano/acetato de etila 99:1, sendo retiradas 19 frações de 
40 
 
50 mL. Cada fração foi analisada por CCD, constatando-se que as frações 4 a 15 
estavam aparentemente puras. Desta forma, elas foram combinadas, analisadas por 
CCD e uma pequena parte desta amostra foi submetida à análise de ponto de fusão. 
Parte desta amostra (20mg) foi enviada para análise por RMN. Como solvente 
foi utilizado clorofórmio deuterado (CDCl3). 
 
4.4 – Biotransformação da esclerotiorina pelo Beauveria bassiana 
 
4.4.1 – Cultivo de B. bassiana e biotransformação 
 Um frasco de armazenamento contendo o fungo Beauveria bassiana foi retirado 
do ultra-freezer, transferido para um tubo de ensaio contendo meio ágar batata 
inclinado, onde ficou por quatro dias, à temperatura ambiente. Após crescimento, a 
biomassa foi transferida, por meio de raspagem com alça de platina, para erlenmeyer 
de 250 mL, contendo 100 mL de meio base 1. 
 Foi feita uma biotransformação em duas etapas, procedimento que consiste em 
se cultivar o fungo em meio de cultura apropriado e, posteriormente, transferir sua 
biomassa para um recipiente contendo somente água destilada adicionada do 
composto a ser biotransformado. Isso permite que as duas etapas sejam otimizadas 
separadamente. 
Em ensaios de biotransformação em duas etapas, na etapa de obtenção de 
massa celular (fase de cultivo) o meio de cultura pode ser enriquecido de nutrientes, o 
que permite o desenvolvimento mais rápido do micro-organismo. O meio usado na 
biotransformação propriamente dita, ao contrário, deve ser bem simples, contendo 
basicamente um tampão, solução fisiológica, ou apenas água destilada, como foi 
utilizado no experimento realizado. Nessas condições, não são disponibilizados 
nutrientes para o micro-organismo, impedindo sua multiplicação (crescimento), mas 
sua massa celular continua viável por um período, biotransformando compostos que 
sejam adicionados ao cultivo. Algumas vantagens deste processo em relação ao 
processo de uma única etapa são: menor tempo de transformação, maior concentração 
de substrato, controle mais fácil de reações e facilidade na extração e purificação do 
produto (Medeiros, 2002). 
Foram utilizados onze erlenmeyers de 500 mL contendo, cada um deles, 200 mL 
de meio base 3. O inoculo do fungo B.bassiana, previamente preparado, foi transferido 
para os onze erlenmeyers contendo o meio de cultura 3. Após dez dias de cultivo sem 
41 
 
agitação, à temperatura ambiente, o conteúdo de cada erlenmeyer foi filtrado a vácuo, 
em funil de Buchner, e o micélio foi transferido para um outro erlenmeyer de 500 mL 
contendo apenas 200 mL de água destilada esterilizada. 
 Dos onze erlenmeyers contendo o micélio do fungo imerso em água destilada, 
um foi utilizado como controle do fungo e dez foram utilizados para a realização da 
biotransformação, sendo que nesses, foi adicionado 1 mL de solução de esclerotiorina 
(20) em acetato de etila na concentração de 20 mg.mL-1. Também foi adicionado 1 mL 
desta solução em outro erlenmeyer de 500 mL contendo 200 mL água destilada estéril, 
de modo a servir como controle do substrato. Todos os erlenmeyers utilizados, os dez 
do experimento da biotransformação e os dois controles foram incubados sob agitação 
a 100 rpm durante 14 dias, à temperatura ambiente. 
 Após este período, em cada erlenmeyer o micélio foi separado por filtração a 
vácuo em funil de Buchner. O filtrado foi transferido para um funil de separação e 
extraído 3 vezes utilizando 60 mL de acetato de etila. O solvente foi removido em 
evaporador rotativo a 65 ºC a vácuo 
 
4.4.2 – Análise e purificação de biotransformado 
 O extrato foi analisado por CCD, primeiramente utilizando como solvente 
diclorometano e, depois, diclorometano/acetato de etila 98:2. Nenhum produto com Rf 
próximo ao da esclerotiorina (20) foi observado, porém, observou-se uma mancha 
vermelha mais polar, perto do ponto de aplicação da amostra. Desta forma, foi feita 
outra CCD, utilizando como solvente acetato de etila e como eluente 
diclorometano/acetato de etila 75:25, sendo observadas cinco manchas vermelhas. 
Estas manchas não foram encontradas no perfil cromatográfico dos dois controles, e 
foram classificadas como produtos novos, provavelmente, produtos de 
biotransformação. 
 Os produtos biotransformados foram submetidos a cromatografia em coluna e 
cromatografia em placa preparativa. Os produtos 1, 4 e 5 estavam presentes em maior 
quantidade e foram enviados para análise por RMN. Como solvente foi utilizado o 
clorofórmio deuterado (CDCl3). 
 
 
 
 
 
42 
 
4.5 – Obtenção de produtos de síntese com diazometano 
 
4.5.1 – Síntese 
 Foram adicionados 900 mg de esclerotiorina (20) em um balão de fundo 
redondo, e 100 mL de éter etílico. Após a dissolução total da amostra, o diazometano 
previamente preparado foi adicionado lentamente até se verificar o desaparecimento 
total das bolhas. A amostra foi deixada em repouso por 10 min e, em seguida, levada 
ao evaporador rotativo para evaporação do solvente e, consequentemente, o término 
da reação (Hudlicky, 1980). 
 
4.5.2 – Análise e purificação 
 O produto da reação foi analisado por CCD, utilizando diclorometano como 
solvente e diclorometano/acetato de etila 98:2 como eluente, em comparação com um 
padrão de esclerotiorina (20). Estas condições evidenciaram a formação de dois novos 
compostos com o RF próximo ao da esclerotiorina (20), um mais polar e outro menos 
polar, sendo que este último estava em maior quantidade. 
 O derivado sintético mais polar que a esclerotiorina (20) foi separado através de 
cromatografia em coluna. Foram retiradas 18 frações, sendo que o derivado foi eluído 
com diclorometano. Análises de CCD mostraram que o derivado estava puro. Desta 
forma, uma parte foi separada para análise do ponto de fusão. O material foi enviado 
para análise por RMN, utilizando clorofórmio deuterado (CDCl3) como solvente. O 
produto teve sua estrutura determinada como sendo o 1-metil-esclerotiorina (64). 
 
4.6 – Biotransformação do 1-metil-esclerotiorina pelo Beauveria bassiana 
 
4.6.1 – Cultivo do B. bassiana e biotransformação 
O procedimento utilizado para a biotransformação do 1-metil-esclerotiorina (64) 
foi o mesmo utilizado no item 4.4.1. 
 
4.6.2 – Análise e purificação do produto biotransformado 
 Análises por CCD, utilizando acetato de etila como solvente e 
diclorometano/acetato de etila (75:25) como eluente evidenciaram a presença de um 
único ponto vermelho, ausente no perfil cromatográfico dos controles. 
43 
 
 Através de cromatografia em coluna de sílica flash (230-400 mesh), foi possível 
isolar o produto vizualizado por CCD nas frações coletadas com diclorometano/acetato 
de etila 80:20. 
 
4.7 – Obtenção de outros derivados da esclerotiorina 
 
4.7.1 – Triagem de fungos 
 Paraverificar outras possibilidades de produção de novos biotransformados, 
foram selecionadas 14 espécies de fungos da coleção do LaBβ, e, juntamente com o 
Beauveria bassiana, foi feita uma triagem. Os fungos utilizados foram: 
 Absidia cylindrospora 
 Aspergillus parasiticus 
 Beauveria bassiana 
 Cladosporium sphaerospermum 
 Clonostachys rosea f catenulata 
 Microsporum gypseum 
 Mucor plumbeus 
 Paecilomyces lilacinus 
 Paecilomyces varioti 
 Penicillium janthinellum 
 Pestalotiopsis palustris 
 Rhizopus oryzae 
 Rhizopus stolonifer 
 Syncephalastrum racemosum 
 Thamnostylum sp. 
As biotransformações foram feitas em uma única etapa. Neste processo não há 
a separação do meio de cultivo, e a substância de interesse é adicionada diretamente 
ao fungo, após o crescimento deste (Sato, 2001). Os fungos, após serem retirados do 
armazenamento, foram repicados para tubos de ensaio contendo ágar batata 
dextrosado inclinado e incubados por três dias a temperatura ambiente. Após este 
período, cada fungo foi transferido através de raspagem com alça de platina e água 
esterilizada para dois erlenmeyers de 250 mL, contendo cada um 100 mL de meio base 
2 e deixados a temperatura ambiente, sob agitação a 100 rpm. Após três dias, os 
fungos apresentaram bom crescimento, e a esclerotiorina (20) foi adicionada em um 
44 
 
dos erlenmeyers contendo cada fungo. O segundo erlenmeyer não recebeu a 
substância e foi utilizado como controle. Foi adicionado 0,5 mL de solução de 
esclerotiorina (20) em acetato de etila (20 mg.mL-1). Os erlenmeyes foram deixados 
sob as mesmas condições de agitação e temperatura durante 14 dias. 
 Após este período, o conteúdo de cada frasco foi filtrado a vácuo com funil de 
Buchner, o micélio foi separado, e o meio foi transferido para um funil de separação. 
Procedeu-se uma extração com três volumes de 30 mL de acetato de etila, que foi 
posteriormente evaporado, dando origem aos extratos. O extrato de cada fungo, assim 
como seus respectivos controles, foram analisados por CLAE. 
 O extrato da biotransformação da esclerotiorina (20) pelo Beauveria bassiana 
em duas etapas obtido no item 4.4.1 também foi analisado por CLAE. Este resultado foi 
comparado com o resultado do ensaio do B. bassiana descrito neste tópico para 
estimar qual dos experimentos (o primeiro, em duas etapas, ou o segundo, em uma 
etapa) alcançou maior rendimento. Um extrato do Penicillium sclerotiorum (item 4.2) 
também foi analisado por CLAE para obter o tempo de retenção dos metabólitos deste 
fungo, inclusive o tempo de retenção da esclerotiorina (20). 
 
4.7.2 – Análise por CLAE 
 Cada extrato em metanol (1 mg.mL-1) foi filtrado com uma membrana com poros 
de 0,45 µm de tamanho e transferido para frasco devidamente identificado. Foram 
injetados 20 µL de cada amostra no cromatógrafo. Como fase estacionária foi utilizada 
uma coluna de polaridade inversa (C18). Como fase móvel, foi utilizado um gradiente 
de misturas de acetonitrila e água deionizada, contendo 0,05% de ácido fórmico 
(conforme Tabela 5), com um fluxo constante de 1 mL/min. Foram utilizados solventes 
de grau HPLC para a eluição e preparo das amostras. Os solventes, assim como a 
água, passaram por processo de desgaseificação anterior ao seu uso. 
 
Tabela 5 – Gradientes de eluição utilizados na análise do HPLC 
Tempo de análise (min) Acetonitrila (%) Água (%) 
0 50 50 
30 100 0 
40 100 0 
 
45 
 
 O detector foi ajustado para os comprimentos de onda 470 e 530 nm. Entre uma 
análise e outra, a coluna foi lavada por 15 min com acetonitrila/água (1:1) (Castro, 
2008). 
 Para comparação dos tempos de retenção entre diferentes amostras, foi 
calculado o intervalo de confiança da média dos tempos de retenção da esclerotiorina 
(20) nas diferentes amostras, e este foi extrapolado como o intervalo de confiança do 
método. O intervalo de confiança é calculado pela fórmula: 
 
 
Equação 1 – Intervalo de confiança 
 
onde é a média dos tempos de retenção da esclerotiorina (20), t é o coeficiente de t 
student e EPM é o erro padrão da média. O erro padrão da média pode ser calculado 
pela fórmula a seguir, onde é o desvio padrão populacional e n é o número de 
amostras. 
 
 
 
 
 
Equação 2 – Erro padrão da média 
 
O coeficiente t é obtido da tabela de distribuição de t student (Anexo 1), levando-se em 
conta a confiabilidade e o número de graus de liberdade, obtido por GL = n-1. 
(Pimentel-Gomes, 2000) 
 
4.8 – Identificação do Cladosporium sphaerospermum 
 
 No início deste trabalho, o fungo C. sphaerospermum era o único que ainda não 
tinha tido sua taxonomia determinada. Sua identificação foi realizada no Instituto de 
Ciências Biológicas da UFMG, sob a supervisão da Profª Drª Maria Aparecida de 
Resende, como descrito a seguir, a partir de seu microcultivo em ágar sabouraud. 
O micro-organismo foi inoculado em uma lâmina de microcultivo para que 
pudesse ser feita a sua identificação. Um pequeno bloco de ágar sabouraud foi cortado 
e colocado na superfície de uma lâmina microscópica estéril. O fungo foi inoculado 
neste bloco de ágar e uma lamínula estéril foi colocada em cima do ágar. O sistema foi 
46 
 
armazenado a 37 ºC em uma placa de Petri estéril com um pedaço de algodão 
embebido em água glicerinada (Funder, 1968). 
 Após 10 dias de crescimento, a lamínula e o ágar foram retirados, o fungo foi 
corado com lactofenol e outra lamínula foi posta em cima da lâmina. A lâmina foi 
analisada em microscópio ótico. As hifas e estruturas de reprodução, assim como as 
características macroscópicas foram utilizadas para determinar o gênero e espécie do 
fungo filamentoso. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
47 
 
RESULTADOS E DISCUSSÃO 
 
5.1 – Produção e extração da esclerotiorina de Penicillium sclerotiorum 
 
 Penicillium sclerotiorum é um fungo filamentoso que apresenta coloração 
esverdeada. Geralmente, o meio utilizado para seu cultivo fica alaranjado após alguns 
dias, devido à produção de metabólitos secundários. Após três dias de cultivo em tubo 
com ágar batata inclinado, o fungo apresentou bom crescimento e esporulação (Figura 
18). 
 
 
Figura 18 – Penicillium sclerotiorum em ágar batata inclinado após 3 dias. Frente 
(A) e verso (B) do tubo. 
 
O meio base 1 foi escolhido por ter apresentado resultados satisfatórios em 
outros trabalhos desenvolvidos no laboratório relacionados a crescimento de fungos 
filamentosos (Bracarense, 2008; Carvalho, 2009). Este meio possui quantidades 
suficientes de fontes de carbono, nitrogênio, além de minerais necessários para o 
crescimento deste fungo. Após três dias neste meio, o fungo apresentava quantidade 
satisfatória de biomassa, sem indícios aparentes de contaminação. Os micélios 
estavam homogêneos, e o meio apresentava coloração alaranjada, sem turvação, o 
que, caso acontecesse, poderia ser um indício de contaminação por leveduras e/ou 
bactérias. 
 O próximo passo foi o cultivo deste fungo em uma escala maior, que foi obtido 
por cultivo em meio de cultura líquido em frascos erlenmeyer contendo um total de sete 
litros de meio de cultura. O meio foi dividido em vários recipientes com o objetivo de se 
48 
 
ter uma superfície de contato do meio de cultura com o ar maior, uma vez que o P. 
sclerotiorum é um micro-organismo aeróbio. O meio foi preparado com metade da 
concentração dos constituintes, com o objetivo de que os nutrientes se esgotassem 
mais rapidamente e os micro-organismos alcançassem mais rapidamente a fase 
estacionária, onde acontece a produção de metabólitos secundários. O crescimento foi 
realizado até o 21º dia, quando o meio de cultura apresentou uma forte coloração 
alaranjada. 
 Após a extração do conteúdo total de meio de cultura, foram obtidos 3,07 g de 
extrato. 
 
5.2 – Purificação da esclerotiorina 
 
A estrutura da esclerotiorina